CN111705077A - 番茄miR156e-3p基因在提高番茄低温抗性中的应用和植物过表达载体 - Google Patents

番茄miR156e-3p基因在提高番茄低温抗性中的应用和植物过表达载体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了番茄miR156e‑3p基因及其在植物低温抗性中的应用和植物过表达载体。所述的参与番茄低温调控的基因miR156e‑3p，其成熟体序列如SEQ ID NO.1所示，前体序列为SEQ ID NO.2所示。通过转基因手段构建番茄miR156e‑3p过表达植株和基因沉默植株，调控所述基因miR156e‑3p的表达水平来研究其对番茄低温抗性的调控机制。结果发现，miR156e‑3p基因沉默植株可以提高番茄的低温抗性，过表达植株的低温抗性降低。本发明为培育耐低温番茄新品种提供了基因资源，具有较好的潜在应用价值，为研究番茄植物应答逆境信号的机制和耐受不利环境的分子机理奠定理论基础。

Description

番茄miR156e-3p基因在提高番茄低温抗性中的应用和植物过 表达载体
技术领域
本发明涉及基因工程、分子生物学及生理学等领域，尤其涉及一种番茄miR156e-3p基因在提高番茄低温抗性中的应用和植物过表达载体。
背景技术
番茄(Solanum lycopersicum)这一园艺作物起源于热带、亚热带地区，喜温。番茄果实富含维生素和矿物质，既可鲜食作蔬菜又可作水果，对人体心血管系统的保护和日晒后皮肤的修复有重要作用，是当之无愧的“菜中之果”。番茄作为反季节蔬菜主要在冬春季进行设施栽培，其生长发育阶段为低温胁迫所造成的损失尤为严重，因此提高番茄应对不良环境的能力，培育抗性品种具有重要的实际生产意义。
近年来，随着全球气候的极端变化，低温逐渐成为作物生长发育的重要限制因素，对植物的正常生长和农业生产造成了极大的破坏。因此，探究蔬菜作物对低温的响应机制，剖析低温应答的关键因子，激活蔬菜作物的低温抗性，为耐低温植物的获得提供重要的理论支持，对保障蔬菜周年生产和商品供应、提高蔬菜产量、改善蔬菜品质和促进蔬菜产业可持续发展具有深远的科学意义和现实意义。
microRNA(miRNA)是一类内源性单链非编码RNA分子，其长度约为20-24个核苷酸，广泛存在于真核生物中。植物miRNA通过剪切mRNA或抑制翻译的方式，负调控其靶基因的表达，在细胞增殖分化、个体生长发育、抗逆胁迫等生理过程中发挥关键作用。几十年来，科学家在动植物中发现了数万个miRNA，miRBase在2018年10月记录到38589个miRNA前体序列信息，这些前体序列共产生48860个不同的成熟miRNA，其中在人类基因组中鉴定到2654个，在拟南芥中鉴定到428个。miRNA可以参与调控植物多种生理过程，然而番茄miRNA在低温胁迫中的作用及其调控机制均鲜见报道。
发明内容
本发明实施例的目的是提供一种番茄miR156e-3p基因在提高番茄低温抗性中的应用，以解决现有冬春季节低温胁迫严重影响番茄产量的问题。
为了达到上述目的，本发明实施例所采用的技术方案如下：
第一方面，本发明实施例提供番茄miR156e-3p基因在提高番茄低温抗性中的应用，通过利用STTM技术构建的干扰载体使得所述番茄miR156e-3p基因的表达水平下降，所述番茄miR156e-3p基因的成熟体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，前体核苷酸序列为SEQID NO.2所示。
其中，前体核苷酸序列(又称为前体miRNA)的DNA片段的序列长度为105bp。
进一步地，通过利用STTM技术使得所述番茄miR156e-3p基因的表达水平下降，包括：
提取番茄总RNA，反转录获得cDNA，以cDNA为模板，pre-F和pre-R为引物，扩增miR156e-3p前体序列，将扩增产物构建到植物过表达载体pFGC1008-HA上；其中，引物pre-F和pre-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和4所示；
利用STTM技术设计特异性引物tgt-F和tgt-R，以cDNA为模板进行PCR扩增，将所得扩增产物连接到pBWA(V)HS-amiRNA载体的Eco31I(BsaI)位点，构建出番茄miR156e-3p基因干扰载体；其中，特异性引物tgt-F和tgt-R的核苷酸序列如SEQ IN NO.5和6所示；
然后用获得的植物过表达载体和基因干扰载体分别转化农杆菌，随后用转化成功的农杆菌侵染番茄子叶并进行植物组织培养，筛选阳性植株，获得突变体番茄。
进一步地，植物过表达载体pFGC1008-HA为具有35S启动子的表达载体。
第二方面，本发明实施例还提供一种含有番茄miR156e-3p前体序列的植物过表达载体，所述番茄miR156e-3p前体序列如SEQ ID NO.2所示。
根据以上技术方案，本发明对首次构建的番茄miR156e-3p基因过表达和沉默植株在番茄低温胁迫中的应用进行抗性研究。通过低温处理实验，发现miR156e-3p基因在番茄低温响应中起负调控作用，沉默miR156e-3p基因可以提高番茄低温抗性，过表达miR156e-3p基因则番茄低温抗性降低。
本发明提供的miR156e-3p基因为培育耐低温番茄新品种提供了基因资源，具有较好的潜在应用价值，为研究番茄植物应答逆境信号的机制和耐受不利环境的分子机理奠定理论基础。
本发明构建突变体番茄，所述突变体番茄能够提高植物对低温胁迫的抗性。为了便于对突变体番茄植株进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物等。前面所述过表达载体pFGC1008中加入了HA标签蛋白，具备氯霉素抗性，pBWA(V)HS-amiRNA载体具备卡那霉素抗性。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为本发明实施例3中番茄miR156e-3p基因过表达株系#1、#2、#3和#6的miR156e-3p基因表达检测结果。
图2为本发明实施例3中番茄miR156e-3p基因沉默株系#1和#2的miR156e-3p基因表达检测结果。
图3为本发明实施例4中在常温与低温条件下，番茄野生型、miR156e-3p过表达株系#3和#6以及基因沉默株系在低温处理后的表型。
图4为本发明实施例4中在常温与低温条件下，番茄野生型、miR156e-3p过表达株系#3和#6以及基因沉默株系在低温处理后的相对电导率。
图5为本发明实施例4中在常温与低温条件下，番茄野生型、miR156e-3p过表达株系#3和#6以及基因沉默株系在低温处理后的PSII最大光化学效率(Fv/Fm)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。本发明旨在涵盖本发明公开的范围和精神内的其他更改和变型。
除非另有说明，本发明的实施将使用本领域技术人员显而易见的植物学常规技术、组织培养、分子生物学、生物生理生化、DNA重组及生物信息学技术。这些技术在文献中进行了充分解释。
实施例1：miR156e-3p基因过表达载体的构建
为了解植物响应低温的分子机制，从番茄基因组中克隆了miR156e-3p前体序列。根据编码区序列分析，设计特异性引物pre-F和pre-R，并在引物上分别加上限制性酶切位点(Asc I和BamH I)，序列如SEQ ID NO.3和4所示。用PrimerSTAR高保真酶PCR扩增miR156e-3p前体序列的DNA片段，然后对PCR扩增片段及载体进行酶切，将前体序列连接到pFGC1008-HA上，得到过表达载体。将上述重组质粒测序确认，所得的基因miR156e-3p前体核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。结果表明所克隆的序列与miRBase中公布的序列(MI0029110)一致。
实施例2：miR156e-3p基因干扰载体构建
短的串联靶标模拟Short tandem target mimic(STTM)，通过模拟靶标有效的降低内源microRNA的活性，是研究内源microRNA的有力工具。利用STTM技术设计特异性引物tgt-F和tgt-R，并在引物上分别加上限制性酶切位点Eco31I(BsaI),序列如SEQ ID NO.5和6所示。用PrimerSTAR高保真酶PCR扩增,回收100bp的电泳片段，然后对PCR扩增片段进行酶切，连接到pBWA(V)HS-amiRNA载体的Eco31I(BsaI)酶切位点。将上述重组质粒测序确认。
实施例3：番茄miR156e-3p基因过表达和沉默植株的构建与检测
将过表达载体pFGC1008::miR156e-3p-HA和基因干扰载体pBWA(V)HS-amiRNA(miR156e-3p)转化到农杆菌GV3101，并进行番茄子叶侵染，通过诱导愈伤，抗性诱导分化以及生根培养，获得组培苗，将T2代过表达种子和沉默种子分别进行氯霉素抗性和卡那霉素抗性的测试，选择3/4具有抗性而其余1/4没有抗性的株系，说明在该株系中连有目的基因的过表达载体或干扰载体并以单拷贝形式插入。将这些植株移出，再进行单株收种。
利用qRT-PCR技术验证过表达和基因沉默的阳性植株。结果显示，过表达植株检测到4个株系，miR156e-3p表达量相比于野生型上调3～40倍(图1)；沉默植株检测到2个株系，相比于野生型沉默效率达到70％～80％(图2)。
实施例4：miR156e-3p基因过表达和沉默植株的低温抗性检测
将五叶一心的野生型番茄幼苗和实施例3中所得的miR156e-3p过表达株系#3和#6和沉默株系#1在人工培养箱内进行25℃和4℃处理，低温处理7天后，将低温胁迫处理组与相同条件下未进行低温处理的对照组进行比较，进行表型拍摄、相对电导率测定和PSII最大光化学效率(Fv/Fm)测定。
植株相对电导率测定方法为：取番茄新鲜叶片0.3g，去除叶片表面污垢，去除主叶脉后剪成1cm宽的细条，随后经过ddH2O清洗3次，放置在盛有25mL ddH2O的50mL离心管中。在28℃、200rpm的摇床内震荡2h，用电导仪检测水溶液的电导率，记为EC1。将样品放置在95℃的水浴锅中水浴加热15min，经过30min室温静置后，用电导仪检测水溶液的电导率，记为EC2。相对电导率(REL)的计算方法参考公式：REL(％)＝EC1/EC2*100。
PSII最大光化学效率(Fv/Fm)测定方法为：将植株置于暗环境适应30min后，使用叶绿素荧光成像仪(IMAG-PAM；Heinz Walz，Germany)照射检测光(<0.5μmol m-2s-1)，测得最小荧光Fo，再照射饱和脉冲光(4000μmol m-2s-1)，测得最大荧光Fm。
荧光参数计算方法：PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)＝(Fm-Fo)/Fm。
结果显示，番茄沉默植株能够显著提高番茄的低温抗性(图3)，电导率显著低于野生型WT和miR156e-3p过表达植株(图4)。此外，沉默植株的Fv/Fm(图5)也高于野生型番茄(WT)，而过表达植株最低。由此可见，miR156e-3p在番茄低温响应中是一个负调控因子，沉默番茄miR156e-3p基因可以提高植物的低温抗性。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 番茄miR156e-3p基因在提高番茄低温抗性中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 1
gcttactctc tatctgtcac c 21
<210> 2
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tggtggtgat agaagagagt gagcacacat ggtgttttct tgcatgatgt ttatatatat 60
atatgcttga aactatgtgt gcttactctc tatctgtcac cccca 105
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggcgcgccgg cttatggaga tggatcaa 28
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgggatccct ccaagactct ttcacaac 28
<210> 5
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cagtggtctc acaacggtga cagatactag agagtaagcg ttgttgttgt tatggt 56
<210> 6
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cagtggtctc atacaggtga cagatactag agagtaagca ttcttcttct ttaga 55

Claims (4)

1.番茄miR156e-3p基因在提高番茄低温抗性中的应用，其特征在于，通过利用STTM技术使得所述番茄miR156e-3p基因的表达水平下降，所述番茄miR156e-3p基因的成熟体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，前体核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过利用STTM技术使得所述番茄miR156e-3p基因的表达水平下降，包括：
提取番茄总RNA，反转录获得cDNA，以cDNA为模板，pre-F和pre-R为引物，扩增miR156e-3p前体序列，将扩增产物构建到植物过表达载体pFGC1008-HA上；其中，引物pre-F和pre-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和4所示；
利用STTM技术设计特异性引物tgt-F和tgt-R，以cDNA为模板进行PCR扩增，将所得扩增产物连接到pBWA(V)HS-amiRNA载体的Eco31I(BsaI)位点，构建出番茄miR156e-3p基因干扰载体；其中，特异性引物tgt-F和tgt-R的核苷酸序列如SEQ IN NO.5和6所示；
然后用获得的植物过表达载体和基因干扰载体分别转化农杆菌，随后用转化成功的农杆菌侵染番茄子叶并进行植物组织培养，筛选阳性植株，获得突变体番茄。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，植物过表达载体pFGC1008-HA为具有35S启动子的表达载体。
4.一种含有番茄miR156e-3p前体序列的植物过表达载体，所述番茄miR156e-3p前体序列如SEQ ID NO.2所示。
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