CN111704670A

CN111704670A - 重组抗RANKL抗体IgG2型的二硫键异构体及其纯化方法

Info

Publication number: CN111704670A
Application number: CN202010828720.2A
Authority: CN
Inventors: 梅菲; 孙小伟; 任杰; 方鹏; 陈坤; 游猛; 谭小钉
Original assignee: Jiangsu Maiweikang New Drug Research And Development Co ltd; Maiwei Shanghai Biotechnology Co ltd
Current assignee: Jiangsu Maiweikang New Drug Research And Development Co ltd; Maiwei Shanghai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-08-18
Filing date: 2020-08-18
Publication date: 2020-09-25
Anticipated expiration: 2040-08-18
Also published as: CN111704670B

Abstract

本公开提供一种重组全人源抗RANKL单克隆抗体的纯化方法，以含有重组人源抗RANKL单克隆抗体IgG2型的细胞培养上清液为对象，采用亲和层析、低pH灭病毒、阴离子交换层析、阳离子交换层析、纳滤除病毒、超滤浓缩等步骤进行纯化。纯化后的重组全人源抗RANKL单克隆抗体IgG2型拮抗RANKL的生物活性达到或超过现有技术的抗RANKL抗体。对于纯化的重组全人源抗RANKL单克隆抗体IgG2型进一步通过由DTT和亚硫酸钠构成的氧化还原体系处理，制备均一的重组全人源抗RANKL单克隆抗体IgG2型二硫键异构体。

Description

重组抗RANKL抗体IgG2型的二硫键异构体及其纯化方法

技术领域

本发明属于抗体工程领域，具体涉及一种重组人源抗RANKL抗体IgG2型的纯化方法，特别是涉及一种重组抗RANKL抗体IgG2型的二硫键异构体及其纯化方法。

背景技术

RANKL（receptor activator of NF-kB ligand，核因子κB受体活化因子配体）是破骨细胞维持其结构、功能和存活所必需的一种跨膜或可溶性的蛋白。人类 RANKL 的mRNA 主要在骨骼、骨髓以及淋巴组织中，在骨骼中的主要作用为刺激破骨细胞的分化和活性，抑制破骨细胞的凋亡。地诺单抗（denosumab,又称AMC-162，商品名Prolia）是一种有独特作用机制的骨吸收抑制剂，其特异性靶向RANKL，抑制破骨细胞活化和发展，减少骨吸收，增加骨密度。2010年5月28日，欧盟委员会批准地诺单抗（Denosumab）用于绝经后妇女骨质疏松症和前列腺癌患者激素抑制相关骨丢失的治疗，还用于目前其他治疗方法无效或不能耐受的患者，以降低患者骨折的风险。2019年5月22日，NMPA有条件批准Denosumab（地舒单抗）上市，适应症骨巨细胞瘤不可手术切除或者手术切除可能导致严重功能障碍的成人和骨骼发育成熟的青少年患者治疗。我们前期已经开发了Denosumab的生物类似药（Biosimilar）重组人源抗RANKL单克隆抗体注射液，其适应症为治疗绝经后妇女的骨质疏松和预防肿瘤骨转移骨相关事件。所述重组全人源抗RANKL单克隆抗体，分子量为144.7kD，属于IgG2型抗体。

四个IgG亚类的二硫键结构建立于20世纪60年代。这些二硫键结构被称为经典的二硫键结构，因为它们被广泛接受。然而，大量IgG分子的详细表征揭示了重组和天然人IgG抗体中的几种新结构特征。尽管半胱氨酸残基应处于二硫键键合状态，但已在IgG抗体的所有亚类中检测到游离巯基。此外，二硫键易受化学修饰的影响，其可进一步产生结构变体，例如具有三硫键（trisulfide）或硫醚键（thioether）的IgG抗体。还观察到所有亚类的IgG形成三硫键。通过β-消除降解二硫键产生游离巯基二硫化物和脱氢丙氨酸。游离巯基和脱氢丙氨酸之间的进一步反应导致形成不可还原的交联物质。脱氢丙氨酸残基的水解有助于抗体铰链区（hinge region）的片段化。因此，这些二硫键变化对抗体结构，稳定性和生物学功能造成不期望的影响。

IgG2型分子重轻链是通过轻链的LC215同重链的HC136形成二硫键，两条重链通过各自的HC224、HC225、HC228及HC231间形成四对二硫键而构成四聚体。由于空间位置接近，IgG2分子二硫键会发生重排，LC215可同HC224间形成二硫键而重链上的HC136则可同HC224或HC225间形成二硫键，如图1所示。三种异构体分别命名为IgG2-A、IgG2-A/B及IgG2-B，其中IgG2-A/B为中间体。由于二硫键位置上的影响导致各异构体“压缩”程度上存在差异，表现为表观分子量上存在微弱的差异。抗体样品非还原CGE分析可检测到IgG2-A、IgG2-B两个异构体。有文献报道(Structural and Functional Characterization ofDisulfideIsoforms of the Human IgG2 Subclass THE JOURNAL OF BIOLOGICALCHEMISTRY VOL. 283, NO. 23, pp. 16206–16215, June 6, 2008)IgG2亚型抗体的二硫键异构体异构体在半胱氨酸/胱氨酸体系中二硫键会发生重排，从而促使异构体间互相转变。在半胱氨酸/胱氨酸缓冲体系中，IgG2-A趋向于形成IgG2-B；当缓冲体系中加入适量的变性剂如盐酸胍，IgG2-B趋向于形成IgG2-A。

尽管通常的抗体纯化方法是本领域常规技术手段，但在重组人源抗RANKL单克隆抗体的生产实践中，通过常规的蛋白质纯化方法难以获得单一高纯度峰，这表明抗体分子的结构存在不均一，HPLC色谱常出现双峰现象。对于治疗性抗体药物而言，抗体分子结构上的不均一不仅影响药物的稳定性、削弱治疗性能，甚至有可能带来不期望的不良反应，在通过药品审批的过程中也会带来更多的困难。因此，迫切需要提供一种针对前期开发的重组人源抗RANKL单克隆抗体分子的纯化方法，以消除双峰、提高抗体分子结构的均一性。

发明内容

为解决上述问题，本发明在优化重组人源抗RANKL单克隆抗体分子纯化方法的基础上，对HPLC的峰形、产生双峰的原因进行了具体分析，结合IgG2亚型抗体分子形成非经典二硫键的可能，推测造成HPLC双峰的原因在于重组产生的人源抗RANKL单克隆抗体存在不同的二硫键异构体。在采用常规蛋白质纯化方法难以对二硫键异构体进行拆分的情况下，尝试通过二硫键异构体转化的方式提高产品的均一度；进而优化了二硫键异构体的转化方法，最终成功获得了HPLC峰形均一的人源抗RANKL单克隆抗体IgG2-A异构体和IgG2-B异构体，生物活性试验结果表明人源抗RANKL单克隆抗体IgG2-A异构体的活性略低于IgG2-B异构体的活性。

具体而言：

一方面，本发明提供一种抗RANKL单克隆抗体的纯化方法，是以含有抗RANKL单克隆抗体的细胞培养上清液为对象，依次采用亲和层析、低pH灭病毒、阴离子交换层析、阳离子交换层析、纳滤除病毒、超滤浓缩等步骤进行纯化，获得纯化的抗RANKL单克隆抗体原液。

其中，所述抗RANKL单克隆抗体为重组人源抗RANKL抗体IgG2型。

进一步，本发明所述抗RANKL单克隆抗体的纯化方法，还包括对纯化的抗RANKL单克隆抗体进行二硫键异构体转化的步骤，其中所述转化是在包括二硫苏糖醇（DTT）和亚硫酸钠（Na₂SO₃）的反应体系中进行。

进一步，本发明所述抗RANKL单克隆抗体的纯化方法，其中，所述二硫键异构体转化步骤的反应体系中，重组人源抗RANKL抗体IgG2型的浓度为1-10mg/mL，DTT和Na₂SO₃的摩尔比为3-9：1，优选6：1。

进一步，本发明所述抗RANKL单克隆抗体的纯化方法，其中，所述二硫键异构体转化步骤的反应体系中，重组人源抗RANKL抗体IgG2型的浓度为3mg/mL，DTT的浓度为6mM、Na₂SO₃的浓度为1mM。

更进一步，本发明如上任一所述抗RANKL单克隆抗体的纯化方法，其中，所述二硫键异构体转化步骤的反应体系中还包含低浓度变性剂，所述低浓度变性剂选自1-2M尿素、0.5-1M盐酸胍，优选低浓度变性剂为0.9M盐酸胍。

可选的，所述二硫键异构体转化步骤的反应体系包含0.1-0.5M的缓冲液，优选0.2M的Tris-HCl缓冲液。

更进一步，本发明如上任一所述抗RANKL单克隆抗体的纯化方法，其中，

当所述二硫键异构体转化步骤的反应体系中不包含变性剂时，获得均一的重组人源抗RANKL抗体IgG2型的二硫键异构体为IgG2-B型。

当所述二硫键异构体转化步骤的反应体系中包含变性剂时，获得均一的重组人源抗RANKL抗体IgG2型的二硫键异构体为IgG2-A型。

更进一步，本发明如上任一所述抗RANKL单克隆抗体的纯化方法，其中，所述对纯化的抗RANKL单克隆抗体进行二硫键异构体转化的步骤是在2-8℃下处理24-72小时，优选4℃下处理48小时。

进一步，本发明所述抗RANKL单克隆抗体的纯化方法，其中，所述重组人源抗RANKL抗体IgG2型的轻链可变区如SEQ ID NO:1所示，重链可变区如SEQ ID NO:2所示。

更进一步，本发明所述抗RANKL单克隆抗体的纯化方法，其中，所述纯化的抗RANKL单克隆抗体原液与相同浓度的商购地诺单抗（Denosumab）相比，具有80-130%的相对活性。

第二方面，本发明提供一种均一的、重组人源抗RANKL抗体IgG2型的二硫键异构体，其特征在于通过本发明第一方面所述抗RANKL单克隆抗体的纯化方法制备，并且重组人源抗RANKL抗体IgG2型的二硫键异构体为IgG2-A型或IgG2-B型。

为更好理解本发明，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。

术语“RANKL”，即Receptor Activator for Nuclear Factor-κ B Ligand （核因子κ B受体活化因子配体），又名为TNF-related activation-induced cytokine(TRANCE)，TNF相关激活诱导细胞因子；osteoprotegerin ligand (OPGL), 骨保护素配体osteoclast differentiation factor（ODF ），破骨细胞分化因子。

术语“特异性”是指在蛋白和/或其他生物异质群体中确定是否存在所述蛋白，例如本发明所述单抗与RANKL蛋白的结合反应。因此，在所指定的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，并且并不以显著的量与样本中存在的其它蛋白结合。

本文中的术语“抗体”意在包括全长抗体及其任何抗原结合片段(即，抗原结合部分)或单链。全长抗体是包含至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，重链和轻链由二硫键连接。各重链由重链可变区(简称VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域构成，即CH1、CH2和CH3。各轻链由轻链可变区(简称VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区还可以划分为称作互补决定区(CDR)的高变区，其由较为保守的框架区(FR)区分隔开。各VH和VL由三个CDR以及四个FR构成，从氨基端到羧基端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括多种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和传统补体系统的第一组分(C1q)。

术语“单克隆抗体”或“单抗”或“单克隆抗体组成”是指单一分子组成的抗体分子制品。单克隆抗体组成呈现出对于特定表位的单一结合特异性和亲和力。

本文中的术语，抗体的“抗原结合片段”(或简称为抗体部分)，是指抗体的保持有特异结合抗原能力的一个或多个片段。已证实，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。包含在抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1构成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含铰链区二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1构成的Fd片段；(iv)由抗体单臂VL和VH构成的Fv片段；(v)由VH构成的dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)；以及(vii)纳米抗体，一种包含单可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，它们可以通过重组法经由使两者成为单蛋白链的合成接头而连接，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fc(scFv)；参见例如Bird et al.，(1988)Science 242：423-426；and Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这些单链抗体也意在包括在术语涵义中。这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段可以通过与完整抗体相同的方式进行功能筛选。

本发明的抗原结合片段包括能够特异性结合RANKL的那些。抗体结合片段的实例包括例如但不限于Fab、Fab'、F（ab'）2、Fv片段、单链Fv（scFv）片段和单结构域片段。

Fab片段含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域（CH1）。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端处的少数残基的添加，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。通过切割在F（ab'）2胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸处的二硫键产生Fab'片段。抗体片段的另外化学偶联是本领域普通技术人员已知的。Fab和F（ab'）2片段缺乏完整抗体的片段可结晶（Fc）区，从动物的循环中更快速地清除，并且可能具有比完整抗体更少的非特异性组织结合（参见例如，Wahl等人，1983，J. Nucl. Med. 24:316）。

如本领域通常理解的，“Fc”区是不包含抗原特异性结合区的抗体的片段可结晶恒定区。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，Fc区由两个相同的蛋白质片段组成，衍生自抗体的两条重链的第二和第三恒定结构域（分别为CH2和CH3结构域）。IgM和IgE Fc区在每条多肽链中含有三个重链恒定结构域（CH2、CH3和CH4结构域）。

“Fv”片段是含有完整靶识别和结合位点的抗体的最小片段。该区域由以紧密的非共价结合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体（VH-VL二聚体）组成。在该构型中，每个可变结构域的三个CDR相互作用，以限定在VH-VL二聚体的表面上的靶结合位点。通常，六个CDR对抗体赋予靶结合特异性。然而，在一些情况下，甚至单个可变结构域（或仅包含对于靶特异性的三个CDR的Fv的一半）可以具有识别且结合靶的能力，尽管其亲和力低于整个结合位点。

“单链Fv”或“scFv”抗体结合片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。一般地，Fv多肽进一步包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，其致使scFv能够形成有利于靶结合的结构。

“人源抗体”包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括从人免疫球蛋白文库或动物中分离的抗体，所述动物对于一种或多种人免疫球蛋白是转基因的，并且不表达内源免疫球蛋白。人抗体可以通过本领域已知的各种方法制备，所述方法包括使用衍生自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法。参见美国专利号4,444,887和4,716,111；以及PCT公开WO 98/46645；WO 98/50433；WO 98/24893；WO 98/16654；WO 96/34096；WO96/33735；和WO 91/10741。还可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白，但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生人抗体。参见例如，PCT公开WO 98/24893；WO92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；和5,939,598。另外，使用与上述类似的技术，公司例如LakePharma，Inc.（Belmont，CA）或Creative BioLabs（Shirley，NY）可以从事于提供针对所选抗原的人抗体。可以使用被称为“引导选择”的技术生成识别所选表位的全人抗体。在该方法中，选择的非人单克隆抗体，例如小鼠抗体，用于引导识别相同表位的完全人抗体的选择（参见，Jespers等人，1988，Biotechnology 12:899-903）。

术语“EC50”，又叫半最大效应浓度，是指引起50％最大效应的抗体浓度。

术语“IgG2”，人IgG的亚型之一。根据重链结构、连接重链的二硫键数目和位置的不同，人IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4 4个亚型。IgG2的非经典二硫键结构首先在重组单克隆抗体（mAb）中鉴定，然后在人IgG2分子中得到证实。在这些出版物中，经典的二硫键结构被称为IgG2A，而两个主要的非结构经典结构称为IgG2B和IgG2-A / B，后者被认为是IgG2A和IgG2B之间的结构中间体（图1）。在细胞培养，体外培养与血清和患者血清中观察到从IgG2A形式到IgG2B的转化。分子动力学模拟研究表明，硫原子在链二硫键具有高度流动性并且可以非常接近。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：

第一，本发明针对前期研发的重组人源抗RANKL单克隆抗体分子的结构特点，提供了一套具体的纯化工艺。依次采用亲和层析、低pH灭病毒、阴离子交换层析、阳离子交换层析、纳滤除病毒、超滤浓缩等步骤获得纯化的抗RANKL单克隆抗体原液，纯度和活性能够达到甚至超过商购Denosumab的水平。

第二，本发明对于抗RANKL单克隆抗体原液HPLC色谱双峰的形成原因进行了分析，在采用常规抗体分离纯化方法难以对双峰进行分离的情况下，结合IgG2亚型抗体分子形成非经典二硫键的可能，推测造成HPLC双峰的原因在于重组产生的人源抗RANKL单克隆抗体存在不同的二硫键异构体，尝试通过二硫键异构体转化的方式提高产品的均一度。

第三，对重组人源抗RANKL抗体IgG2型进行二硫键异构体转化的方法进行了优化，改良了现有技术常用的半胱氨酸/胱氨酸系统，采用了DTT/亚硫酸钠转化系统结合蛋白变性剂，成功提高了重组人源抗RANKL抗体IgG2型的分子结构均一度。当所述二硫键异构体转化步骤的反应体系中不包含变性剂时，获得均一的重组人源抗RANKL抗体IgG2型的二硫键异构体为IgG2-B型；当所述二硫键异构体转化步骤的反应体系中包含变性剂时，获得均一的重组人源抗RANKL抗体IgG2型的二硫键异构体为IgG2-A型。并意外发现，重组人源抗RANKL抗体IgG2型的非典型二硫键异构体为IgG2-B，与典型二硫键异构体2A相比具有更高的生物活性。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：

图1：IgG2型抗体三种异构体示意图。

图2a：商购Denosumab（lot:1041075）与工作参考品(lot:20140301)的生物学活性量效曲线比较，Denosumab IC50=1.03ng/ml,R²=0.9976;工作参考品IC50=1.11ng/ml,R²=0.99402。

图2b：原液(lot:20131201)与工作参考品(lot:20140301)的生物学活性量效曲线比较，原液 IC50=1.07ng/ml,R²=0.99851;工作参考品IC50=1.33ng/ml,R²=0.99803。

图2c：原液(lot:20140201)与工作参考品(lot:20140301)的生物学活性量效曲线比较，原液 IC50=1.63ng/ml,R²=0.99072;工作参考品IC50=1.34ng/ml,R²=0.99888。

图3：抗RANKL单克隆抗体未处理原液毛细管电泳检测图。

图4：抗RANKL单克隆抗体原液用半胱氨酸/胱氨酸（15/1）处理后毛细管电泳检测图。

图5：抗RANKL单克隆抗体原液用半胱氨酸/胱氨酸（10/1）处理后毛细管电泳检测图。

图6：抗RANKL单克隆抗体原液用半胱氨酸/胱氨酸（5/1）处理后毛细管电泳检测图。

图7：抗RANKL单克隆抗体原液用半胱氨酸/胱氨酸（15/1）+盐酸胍处理后毛细管电泳检测图。

图8：抗RANKL单克隆抗体原液用半胱氨酸/胱氨酸（10/1）+盐酸胍处理后毛细管电泳检测图。

图9：抗RANKL单克隆抗体原液用半胱氨酸/胱氨酸（5/1）+盐酸胍处理后毛细管电泳检测图。

图10：抗RANKL单克隆抗体原液用DTT/GSSG（15/1）处理后毛细管电泳检测图。

图11：抗RANKL单克隆抗体原液用DTT/GSSG（10/1）处理后毛细管电泳检测图。

图12：抗RANKL单克隆抗体原液用DTT/GSSG（5/1）处理后毛细管电泳检测图。

图13：抗RANKL单克隆抗体原液用DTT/GSSG（15/1）+盐酸胍处理后毛细管电泳检测图。

图14：抗RANKL单克隆抗体原液用DTT/GSSG（10/1）+盐酸胍处理后毛细管电泳检测图。

图15：抗RANKL单克隆抗体原液用DTT/GSSG（5/1）+盐酸胍处理后毛细管电泳检测图。

图16：抗RANKL单克隆抗体未处理原液非还原毛细管凝胶电泳检测图。

图17：抗RANKL单克隆抗体未处理原液、DTT/Na₂SO₃处理、DTT/Na₂SO₃+盐酸胍处理非还原毛细管凝胶电泳检测对比图：三条电泳图由上到下，依次为未处理原液、DTT/Na₂SO₃处理、DTT/Na₂SO₃+盐酸胍处理。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。

实施例1：重组人源抗RANKL抗体IgG2型的分子结构。

申请人前期研发了重组人源抗RANKL单克隆抗体分子，其为人源化Ⅱ型IgG抗体，完整分子由两条重链和两条轻链构成，其氨基酸序列分别如下：

轻链（LC）：215个氨基酸；理论分子量：48,890.1 Da（SEQ ID NO:1）

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC($1)RASQSVRGRYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVFYC($1)QQYGSSPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVC($2)LLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYAC($2)EVTHQGLSSPVTKSFNRGEC($3)

重链（HC）：448个氨基酸；理论分子量(还原)：23,487.1 Da（SEQ ID NO:2）

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC($4)AASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC($4)AKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPC($3)SRSTSESTAALGC($5)LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTC($5)NVDHKPSNTKVDKTVERKC($6)C($7)VEC($8)PPC($9)PAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC($10)VVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKC($10)KVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC($11)LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC($11)SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

其中：$N表示配对的二硫键，N=1，2，3... 11，$1与$1配对，$2与$2配对，依次类推。

实施例2：重组人源抗RANKL抗体IgG2型原液的制备和生物学活性检测。

收获的细胞培养上清后经过以下处理:

2.1亲和层析

溶液

平衡缓冲液A1（20mmol/L PB pH6.8，0.15mol/L NaCl）

中间洗脱缓冲液A2（20mmol/L PB pH6.8，0.15mol/L NaCl 0.5% 聚山梨酯80）

平衡缓冲液A3（10mmol/L PB pH7.2）

洗脱缓冲液B（50mmol/L Na₂HPO₄ 50mmol/L柠檬酸，pH3.4）

层析操作

发酵液中间体测定pH、电导，确定pH在6.0-8.0，电导率在10-25mS/cm之间。如偏离此范围应用平衡缓冲液调节pH及电导率。

平衡柱子和上样：接上装好Protein A层析柱。设报警压力0.25MPa。流速150±20cm/h，先用5CV（柱体积）即23L纯化水冲洗层析柱然后用缓冲液 A1 平衡柱子（平衡1）2.5CV后上发酵液。控制发酵液的上样量，使填料的上样载量不超过35mg/mL。

再平衡和洗脱：上完样后，先用2.5CV的A1平衡柱子，接着用2.0CV A2中间洗脱，接着用4CV A3再平衡柱子，最后用100%的B洗脱3.5CV，收集洗脱峰，当UV280nm吸收达到100mAU（蛋白浓度约为0.25mg/mL）时收集洗脱峰，当UV280nm吸收降至150mAU时停止收集，中间体记为MF2。洗脱完毕，重复上述操作至所有发酵液中间体上样洗脱。

2.2样品低pH处理，灭活病毒。

测定MF2的浓度，用1mol/L柠檬酸将pH调至pH3.4±0.1，测定样品电导确定电导<1.5mS/cm，如电导超过限值则用纯化水调节至允许范围，室温放置4小时。然后用2mol/LTris-HCl pH9.5将pH调至8.0±0.1。该步骤中间体记为LPH。

2.3阴离子交换层析。

溶液

平衡缓冲液A（20mmol/L Tris-HCl 40mmol/L NaCl pH8.0）

再生缓冲液B（20mmol/L Tris-HCl 1mol/L NaCl pH8.0）

层析操作

样品预处理：LPH加适量B将电导调至5.0±0.5mS/cm后准备上样。

平衡柱子和上样：接上装好的Q FastFlow层析柱。先用5 CV注射用水清洗层析柱，然后用1.5CV缓冲液B清洗层析柱，再用平衡缓冲液A平衡5CV后上样。填料的上样载量控制在75-125mg/mL。

再平衡和上样：采用收集流穿的模式，上样开始后当UV280nm吸收达到200mAU（此时流出液中TK006浓度约为0.5mg/mL）时开始收集流穿峰，上完样后用2 CV的平衡缓冲液A平衡柱子，当UV280nm吸收降至250mAU时停止收集，收集液记为QF1。

再生和保存层析柱：平衡缓冲液重新平衡后，用2 CV缓冲液B冲洗层析柱，然后用1.5 CV 0.5mol/L NaOH溶液以150cm/h的流速清洗层析柱后，泵入1.5CV 50mmol/L NaOH，室温放置备用。

2.4阳离子交换层析。

溶液

平衡缓冲液A（35.5mmol/L Na₂HPO₄ 16.0 mmol/L枸橼酸，pH5.3）

洗脱缓冲液 B（Buffer A+0.5mol/L NaCl）

层析操作

样品预处理：阴离子层析QF1样品用1mol/L 柠檬酸调pH至5.3±0.1，测定样品电导，用注射用水或缓冲液B将电导调至4.0-6.0mS/cm。

平衡柱子和上样：接上装好的SP FastFlow层析柱。先用5 CV注射用水清洗层析柱，再用1.5CV 缓冲液B清洗层析柱，然后用A平衡柱子2CV后上样。填料的上样载量控制在25-35mg/mL。

再平衡和上样：上完样后，用2CV的Buffer A平衡层析柱，然后用5-7 CV 35%B洗脱，当UV280nm吸收高于100mAU（蛋白浓度约为0.25mg/mL）时开始收集，降至300mAU时停止收集，样品记为SPF2。

层析柱的清洗与维护：样品洗脱完毕，用1.5 CV 100% 再生缓冲液冲清洗层析柱后，用1.5 CV 0.5mol/L NaOH溶液以150cm/h流速清洗然后泵入1.5 CV 50mmol/L NaOH，室温放置备用。

2.5纳滤去除病毒。

使用20nm纳滤膜对阳离子交换层析产物SPF2进行过滤，膜载量不超过2.72kg/m²，去除可能潜在的病毒。

2.6超滤浓缩。

超滤缓冲液配制：称取NaOH 42.5g（药用级），加入注射用水40kg将NaOH充分溶解；秤取冰醋酸 91.8g（药用级）加入到上述溶液中混匀；秤取山梨醇3910.0g（药用级），加入到上述溶液中混匀，加入注射用水定容至87.0kg，混匀后用4mol/L NaOH将pH调至5.2±0.1。实际配制量根据生产规模进行调整。

将纳滤收集产物用上述超滤缓冲液超滤置换缓冲液体系，使用截留分子量为30kD的超滤膜包，超滤置换缓冲体系完成后，继续超滤浓缩并用超滤缓冲液调整浓度至70mg/mL，经0.22μm滤膜除颗粒过滤后即为原液。

2.7活性检测。

核因子NF-κB受体活化因子配体（RANKL）能够结合NF-κB受体活化因子（RANK），从而促进RAW264.7细胞分化为破骨细胞，表达抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）；本样品能够特异性识别与结合RANKL，通过检测TRAP催化其底物Para-nitrophenyl phosphate (pNPP)产生的光密度值来间接判断TK006拮抗RANKL的活性。对三批原液20131201、20140201、20140301和商购Denosumab的活性检测结果如表1，图2a-2c所示。结果表明三批样品和商购Denosumab对照品均具有明显抑制RANKL-兔Fc刺激RAW264.7细胞分化的作用，并且抑制作用呈量效关系。其IC50值在0.5-3.5ng/ml范围内。在同一块板内平行分析显示，本样品和商购Denosumab对RANKL-兔Fc的抑制曲线完全平行，本试验三批样品与商购Denosumab具有等效或更高的生物学活性。

表1.三批原液和商购Denosumab的相对生物学活性

实施例3：利用胱氨酸/半胱氨酸系统处理重组人源抗RANKL抗体IgG2型。

3.1仪器

表2.仪器设备列表

3.2溶液配制

表3.溶液配制表

3.3实验方法。

S1:将批号20140301样品（32.0mg/ml）用0.2 mol/L Tris-HCl稀释至3mg/ml；

S2: 将批号20140301样品（32.0mg/ml）用0.2 mol/L Tris-HCl稀释至3mg/ml，并加入半胱氨酸及胱氨酸，终浓度分别为15mM和 1mM ；10mM和1mM；5mM和1mM；

S3: 将批号20140301样品（32.0mg/ml）用0.2 mol/L Tris-HCl 0.9M盐酸胍溶液稀释至3mg/ml，加入半胱氨酸及胱氨酸，终浓度分别为15mM和 1mM ；10mM和1mM；5mM和1mM；

将上述S1-S3置于4度冰箱放置48小时；反应结束后样品脱盐（脱盐填料His TrapDesalting，GE批10246708，柱体积5ml）置换至10mM Tris-HCl pH8.0溶液，送检CE检测。

结果如表4，图3-9所示。

表4.胱氨酸/半胱氨酸系统处理重组人源抗RANKL抗体IgG2型

表4，图3-9的结果表明在多组半胱氨酸和胱氨酸的比例下均不能制备出纯度较高的二硫键异构体，基于上述试验结果可知，胱氨酸/半胱氨酸的氧化还原体系不适合所述人源抗RANKL单克隆抗体IgG2型二硫键异构体的制备和转化。

实施例4：利用DTT/GSSG系统处理重组人源抗RANKL抗体IgG2型。

4.1溶液配制

表5.溶液配制表

4.2实验方法。

1）S1: 将批号20140301样品（32.0mg/ml）用0.2 mol/L Tris-HCl稀释至3mg/ml；

2）S2: 将批号20140301样品（32.0mg/ml）用0.2 mol/L Tris-HCl稀释至3mg/ml，并加入DTT及氧化型谷胱甘肽，终浓度分别为15mM和 1mM ；10mM和1mM；5mM和1mM；

3）S3:将批号20140301样品（32.0mg/ml）用0.2 mol/L Tris-HCl 0.9M盐酸胍溶液稀释至3mg/ml，加入DTT及氧化型谷胱甘肽，终浓度分别为15mM和 1mM ；10mM和1mM；5mM和1mM；

4）将上述样品置于4度冰箱放置48小时；反应结束后样品脱盐置换至10mM Tris-HClpH8.0溶液，送检CE检测。结果如表6，图10-15所示。

表6. DTT/GSSG系统处理重组人源抗RANKL抗体IgG2型

表6，图10-15的结果表明在在多组DTT和氧化型谷胱甘肽的比例下不能制备出纯度较高的二硫键异构体，几乎每种组合差异不明显。

实施例5：利用DTT/Na₂SO₃系统处理重组人源抗RANKL抗体IgG2型。

5.1实验方法

样品采用批号20140301的浓缩样品（70mg/ml，SEC纯度为99.0%），其非还原CGE如图16所示，根据图16可知重组人源抗RANKL抗体IgG2型样品中明显存在分子大小差异的两种异构体。根据文献，前面的峰为IgG2-A后者为IgG2-B。样品分别按以下三组方式进行处理：

S1：样品用0.2M Tris-HCl稀释至3mg/ml；

S2：样品用0.2M Tris-HCl稀释至3mg/ml，并加入DTT及亚硫酸钠，终浓度分别为6mM和1mM；

S4：样品用0.2M Tris-HCl、0.9M 盐酸胍溶液稀释至3mg/ml，加入DTT及亚硫酸钠，终浓度分别为6mM和1mM；

上述三个样品置于4℃冰箱中放置48小时；反应结束后样品脱盐置换至10mM Tris-HClpH8.0溶液中备分析。结果如图17所示。

图17结果表明，样品在DTT/Na₂SO₃系统中反应48小时后，不存在盐酸胍的条件下重组人源抗RANKL抗体IgG2型样品的二硫键异构体基本转化为IgG2-B型（中间曲线），当盐酸胍存在下则基本转化为IgG2-A型（下边曲线）。从电泳图中即使无法判断两种异构体的转变是否完全，但能够证明所述重组人源抗RANKL抗体的确存在两种异构体。经过DTT/Na₂SO₃系统处理后与未处理原液相比，显著提高了重组人源抗RANKL抗体IgG2型样品的均一性。

5.2异构体活性检测。

对5.1中批号20140301所述重组人源抗RANKL抗体IgG2型的两种异构体生物活性进行分析，结果表明S2（不存在盐酸胍的条件下）获得的IgG2-B型IC50值为3.00ng/mL；S1（存在盐酸胍的条件下）获得的IgG2-A型IC50值为2.89ng/mL。IgG2-A型的生物学活性略低于IgG2-B型。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 迈威（上海）生物科技股份有限公司；江苏迈威康新药研发有限公司

<120> 重组抗RANKL抗体IgG2型的二硫键异构体及其纯化方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Gly Arg

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Val Phe Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Arg Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 2

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Pro Gly Thr Thr Val Ile Met Ser Trp Phe Asp Pro Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys

210 215 220

Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

Claims

1.一种抗RANKL单克隆抗体的纯化方法，其特征在于：以含有抗RANKL单克隆抗体的细胞培养上清液为对象，依次采用亲和层析、低pH灭病毒、阴离子交换层析、阳离子交换层析、纳滤除病毒、超滤浓缩等步骤进行纯化，获得纯化的抗RANKL单克隆抗体原液，其中，所述抗RANKL单克隆抗体为重组人源抗RANKL抗体IgG2型。

2.如权利要求1所述抗RANKL单克隆抗体的纯化方法，其特征在于：还包括对纯化的抗RANKL单克隆抗体进行二硫键异构体转化的步骤，其中所述转化是在包括二硫苏糖醇（DTT）和亚硫酸钠（Na₂SO₃）的反应体系中进行。

3.如权利要求2所述抗RANKL单克隆抗体的纯化方法，其特征在于：所述二硫键异构体转化步骤的反应体系中，重组人源抗RANKL抗体IgG2型的浓度为1-10mg/mL，DTT和Na₂SO₃的摩尔比为3-9：1。

4.如权利要求2所述抗RANKL单克隆抗体的纯化方法，其特征在于：所述二硫键异构体转化步骤的反应体系中，重组人源抗RANKL抗体IgG2型的浓度为3mg/mL，DTT的浓度为6mM、Na₂SO₃的浓度为1mM。

5.如权利要求2-4任一所述抗RANKL单克隆抗体的纯化方法，其特征在于：所述二硫键异构体转化步骤的反应体系中还包含低浓度变性剂，所述低浓度变性剂选自1-2M尿素、0.5-1M盐酸胍。

6.如权利要求2-4任一所述抗RANKL单克隆抗体的纯化方法，其特征在于：当所述二硫键异构体转化步骤的反应体系中不包含变性剂时，获得均一的重组人源抗RANKL抗体IgG2型的二硫键异构体为IgG2-B型；当所述二硫键异构体转化步骤的反应体系中包含变性剂时，获得均一的重组人源抗RANKL抗体IgG2型的二硫键异构体为IgG2-A型。

7.如权利要求2-4任一所述抗RANKL单克隆抗体的纯化方法，其特征在于：所述对纯化的抗RANKL单克隆抗体进行二硫键异构体转化的步骤是在2-8℃下处理24-72小时，优选4℃下处理48小时。

8.如权利要求1所述抗RANKL单克隆抗体的纯化方法，其特征在于所述重组人源抗RANKL抗体IgG2型的轻链可变区如SEQ ID NO:1所示，重链可变区如SEQ ID NO:2所示。

9.如权利要求1或8所述抗RANKL单克隆抗体的纯化方法，其特征在于所述纯化的抗RANKL单克隆抗体原液与相同浓度的商购地诺单抗（Denosumab）相比，具有80-130%的相对活性。

10.一种均一的、重组人源抗RANKL抗体IgG2型的二硫键异构体，其特征在于通过权利要求1-8任一所述方法制备，并且重组人源抗RANKL抗体IgG2型的二硫键异构体为IgG2-A型或IgG2-B型。