CN111763259A - 抗cd40抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请提供一种抗CD40抗体或其抗原结合片段及其用途。本申请还提供了包含所述抗CD40抗体或其抗原结合片段的多特异性抗体例如双特异性抗体、缀合物和组合物，及其在治疗疾病例如肿瘤中的用途。

Description

抗CD40抗体及其用途
技术领域
本发明涉及生物医疗领域。更具体地，本发明涉及抗CD40抗体及其用途，特别是在肿瘤治疗中的用途。
背景技术
癌症是目前导致人类死亡率最高的疾病之一。据世界卫生组织统计，2012年全球癌症发病和死亡病例数达到1400万和820万，中国新诊断癌症病例307万，死亡人数220万。近年，免疫检查点被认为是用于治疗各类恶性肿瘤的有效潜在靶点，而针对免疫检查点的抗体药物的研发受到了越来越多的关注。
CD40是一种糖基化的I型跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族（TNF-R）成员，广泛表达于多种细胞表面，包括免疫细胞（如B细胞、单核细胞和树突状细胞等）和非免疫细胞（如上皮细胞、内皮细胞、间质细胞、血小板等）。进一步的研究发现CD40在肿瘤细胞中也有广泛表达，在肿瘤早期因其凋亡前活性和引起免疫反应的能力能阻止肿瘤的发生，但肿瘤晚期由于免疫防御的丧失，CD40可促进肿瘤血管的生成，反而促进与肿瘤侵润和转移有关基因的表达。其配体CD40L（又称CD154）是一种II型跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子超家族（TNF）成员，CD40L主要存在于活化的CD4+ T细胞表面。
CD40-CD40L作为体内特异性免疫反应系统重要的一对共刺激分子，在体液免疫和细胞免疫中均起着重要作用，不仅在B细胞、树突状细胞的分化、成熟中有重要作用，而且在多种细胞因子的产生、表达中也起着重要作用。研究表明CD40-CD40L信号途径与多种免疫疾病相关，包括X连锁高免疫球蛋白M综合症、动脉粥样硬化、炎症性肠病、睡眠呼吸暂停综合征、川崎病和肿瘤等。体外试验和动物模型都已证实抗CD40抗体通过阻断CD40与CD40L的相互作用及其产生的免疫反应，或与其它共刺激信号通路联合阻断、或联合DST或西罗莫司的使用，可有效的抑制器官移植中的排斥反应，并可减轻或治疗多种自身免疫性疾病；而CD40抗体激动剂则能有效激活体内的抗肿瘤免疫反应，与已有的免疫检查点药物联合使用在能够更好地引起抗肿瘤免疫反应。
因此，研发适用范围更广、能够更高效靶向CD40-CD40L信号通路的抗体药物，将为多种肿瘤和免疫系统相关疾病的治疗提供可能，具有巨大的应用潜力和市场价值。
发明内容
本发明提供了一种特异性结合CD40蛋白的抗体或其抗原结合部分，其中，所述CD40蛋白是来自于人或者其他灵长目动物CD40蛋白或者是嵌合CD40蛋白，其中，所述嵌合CD40蛋白的胞外区的部分或者全部来自于人或者其他灵长目动物。优选的，其他灵长目动物包括各种猴类，例如长尾猴、猕猴、狒狒、山魈等等，更优选的，所述猕猴包括恒河猴、食蟹猕猴、蛮猴等等。
优选的，嵌合CD40蛋白是人源化CD40蛋白（hCD40），所述人源化CD40蛋白的胞外区的部分或者全部来自于人，更为优选的，所述人或者人源化CD40蛋白如SEQ ID NO.43或者46所示。
优选的，所述抗体或其抗原结合部分包括重链可变区和轻链可变区。
更优选的，所述重链可变区包含VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，所述VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3包含下列组中的一种或者多种：
（1）所述VHCDR1-3分别与SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的同源性；
（2）所述VHCDR1-3分别与SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 14和SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的同源性；
（3）所述VHCDR1-3分别与SEQ ID NO. 25、SEQ ID NO. 26和SEQ ID NO.27所示的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的同源性；
（4）所述VHCDR1-3分别与SEQ ID NO. 31、SEQ ID NO. 32和SEQ ID NO.33所示的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的同源性；
和，所述轻链可变区包含VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含下列组的一种或者多种：
（1）所述VLCDR1-3分别与SEQ ID NO.10、SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的同源性；
（2）所述VLCDR1-3分别与SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 17和SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的同源性；
（3）所述VLCDR1-3分别与SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO. 29和SEQ ID NO.30所示的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的同源性；
（4）所述VLCDR1-3分别与SEQ ID NO. 34、SEQ ID NO. 35和SEQ ID NO.36所示的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的同源性。
更优选的，所述重链可变区和轻链可变区的CDR1-3如下列组中的一组所示：
（1）所述重链可变区的VHCDR1-3分别如SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 9所示，以及，轻链可变区的VLCDR1-3分别如SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO.12所示；
（2）所述重链可变区的VHCDR1-3分别如SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 14和SEQ ID NO.15所示，以及，轻链可变区的VLCDR1-3分别如SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 17和SEQ ID NO.18所示；
（3）所述重链可变区的VHCDR1-3分别如SEQ ID NO.25、SEQ ID NO. 26和SEQ ID NO.27所示，以及，轻链可变区的VLCDR1-3分别如SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO. 29和SEQ ID NO.30所示；或者，
（4）所述重链可变区的VHCDR1-3分别如SEQ ID NO.31、SEQ ID NO. 32和SEQ ID NO.33所示，以及，轻链可变区的VLCDR1-3分别如SEQ ID NO. 34、SEQ ID NO. 35和SEQ ID NO.36所示。
更为优选的，本发明的抗体或其抗原结合部分，重链可变区包含与SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列至少具有同源性为90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的氨基酸序列，以及，所述轻链可变区包括与SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列至少具有同源性为90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的氨基酸序列；
或者
本发明的抗体或其抗原结合部分，重链可变区包含与SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列至少具有同源性为90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的氨基酸序列，以及，所述轻链可变区包括与SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列至少具有同源性为90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的氨基酸序列。
最为更优选的，所述重链可变区如SEQ ID NO. 1所示，以及，所述轻链可变区如SEQ ID NO. 2所示。或者，所述重链可变区如SEQ ID NO. 3所示，以及，所述轻链可变区如SEQ ID NO. 4所示。
优选的，本发明的抗体或其抗原结合部分，其中所述的抗体或其抗原结合部分为全抗体、双或多特异性抗体、双或多特异性单链抗体、单链抗体（scFv）、Fab、Fab’、F（ab’）2、线性抗体或Fv抗体，以及任何包含抗体结合域或同源的抗体结合域的多肽。其中，抗体结合域可以包括完整的重链和/或轻链CDR、完整的抗体的重链和/或轻链可变区、完整的全长重链和/或轻链、或者来自所述抗体的单个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。单链抗体包含一个重链可变区和一个轻链可变区。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段特异性结合人CD40（例如SEQ ID NO.43）、猴CD40（例如SEQ ID NO.45）或人源化嵌合CD40（例如SEQID NO.46）。
优选的，本发明的抗体或其抗原结合部分，使用蛋白免疫法或者DNA免疫法获得；进一步，所述的蛋白免疫法包括以上述人源化CD40蛋白为免疫原进行免疫获得抗体或其抗原结合部分；所述的DNA免疫法包括以编码上述人源化CD40蛋白的DNA质粒为免疫原进行免疫获得抗体或其抗原结合部分。
本发明的另一方面，提供一种分离的DNA，所述DNA编码上述的抗体或其抗原结合部分。
本发明的另一方面，提供一种载体，所述载体包括上述任意的DNA。
优选的，所述的载体能够在体内或体外或离体条件下表达。进一步优选的，所述的表达载体在体内细胞中持续高水平表达。优选的，所述的表达载体为原核表达载体、慢病毒表达载体、质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。进一步优选的，所述的原核表达载体为大肠杆菌系列。
本发明的另一方面，提供一种细胞，所述细胞包括上述核酸或者载体。
优选的，所述的细胞可以是真核的或者原核的。更优选的，所述的细胞可以为酵母细胞、293细胞、CHO细胞、大肠杆菌等。
本发明的另一方面，提供一种制备上述抗体或其抗原结合部分的方法，所述方法包括蛋白免疫法、DNA免疫法制备抗体或其抗原结合部分或者培养包含上述DNA或者载体的细胞。
优选的，所述的蛋白免疫法包括以上述人源化CD40蛋白为免疫原进行免疫获得抗体或其抗原结合部分；收集CD40免疫后非人动物的脾细胞，将收集的脾细胞与SP2/0细胞融合获得杂交瘤细胞，培养所述杂交瘤细胞，分离纯化上述抗体或其抗原结合部分。优选将杂交瘤细胞导入非人动物，以及收集非人动物腹水的步骤。
所述的DNA免疫法包括以编码上述人源化CD40蛋白的DNA质粒为免疫原进行免疫获得抗体或其抗原结合部分。
所述培养细胞的步骤包括培养包含上述DNA或者载体的细胞，获得特异性结合CD40的抗体或其抗原结合片段。
本发明的另一方面，提供了一种杂交瘤细胞的制备方法，所述的方法包括用人CD40免疫非人动物获得，收集CD40免疫后非人动物的脾细胞，将收集的脾细胞与SP2/0细胞融合获得杂交瘤细胞。
本发明的另一方面，提供一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞能产生上述抗体或其抗原结合部分。
优选的，所述的人或者人源化CD40蛋白经His标记。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选为啮齿类动物。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物为大鼠或小鼠。
本发明的另一方面，提供了一种T细胞抗原受体或CAR分子，所述的T细胞抗原受体或CAR分子包含上述抗CD40抗体或其抗原结合片段。
本发明的另一方面，提供一种抗体-药物缀合物，其包含与治疗剂共价结合的上述任意的抗体或其抗原结合片段。
本发明的另一方面，提供一种上述抗体或其抗原结合部分、上述分离的DNA、载体、细胞、T细胞抗原受体或CAR分子或上述抗体-药物缀合物在与CD40相关研究方面的应用。
优选的，所述应用包括评估CD40功能，检测CD40的表达、筛选药物、治疗疾病。优选的，所述检测为免疫组织化学检测。
优选的，所述应用不是疾病的诊断和治疗方法。
更优选的，所述应用包括在制备药物组合物或者检测试剂盒等中的用途。
在本发明的另一个方面，提供一种药物组合物或者检测试剂盒，其包含：上述的抗体或其抗原结合部分、上述分离的DNA、上述载体、上述细胞或者上述T细胞抗原受体或CAR分子；以及，可选的包括可药用载体或者检测试剂等等。
优选的，所述药物组合物中的抗体或其抗原结合部分可以是抗体偶联物或上述抗体-药物缀合物等。所述检测试剂盒可以是检测芯片。
优选的，所述可药用载体可以是一种也可以是多种，所述载体包括但不限于稀释剂、粘合剂、致湿剂、表面活性剂、润滑剂、崩解剂等等。
更优选的，所述药物组合物可包含在纳米载体、病毒载体、微胶囊、脂质体等中给予。
优选的，所述药物组合物联合其他药物进行治疗。
在本发明的另一个方面，本发明提供一种治疗疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的上述药物组合物。
优选的，所述方法包括将上述药物组合物联合其他药物进行疾病治疗。
进一步，所述疾病包括与CD40信号通路相关的疾病，例如X连锁高免疫球蛋白M综合症、动脉粥样硬化、炎症性肠病、睡眠呼吸暂停综合征、川崎病、自身免疫性疾病和肿瘤等等，所述肿瘤包括恶性肿瘤，例如癌症、肉瘤、血液系统恶性肿瘤等。在一个具体实施例，所述恶性肿瘤例如黑色素瘤、淋巴癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、头颈癌、结肠癌。
更优选的，本发明提供了一种联合治疗受试者中的恶性肿瘤的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的上述药物组合物，还包括向所述受试者施用治疗有效量的其它治疗恶性肿瘤的药剂或施用其它治疗恶性肿瘤的方法，例如化疗药物、手术治疗、放射治疗、生物治疗、中医中药治疗、微创治疗等等。
本发明的另一方面，提供了一种诱导免疫应答的方法，所述的方法包括向个体施加本发明所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段、上述的组合物或抗体偶联物。
本发明的另一方面，提供了一种CD40的检测方法，所述的检测方法包括将待检测样品与本发明所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段接触，然后检测CD40与抗CD40抗体或其抗原结合片段形成的复合物。
优选的，所述的检测方法为检测CD40的存在或含量。其中，所述的存在表示有无，所述的含量可以为表达量或蛋白浓度等。优选的，所述检测为免疫组织化学检测。
本发明的另一方面，提供了一种CD40相关的疾病的诊断方法，所述的诊断方法包括将待检测样品与本发明所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段接触，然后检测CD40与抗CD40抗体或其抗原结合片段形成的复合物。
除非本文另有定义，与本发明结合使用的科学和技术术语及其缩略语应具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。以下列举了本文中使用的部分术语和缩略语。
抗体：antibody，Ab；
免疫球蛋白：immunoglobulin，Ig；
重链：heavy chain，HC；
轻链：light chain，LC；
重链可变区：heavy chain variable domain，VH；
重链恒定区：heavy chain constant domain，CH；
轻链可变区：light chain variable domain，VL；
轻链恒定区：light chain constant domain，CL；
互补决定区：complementarity determining region，CDR，是指抗体的抗原互补结合区；
Fab片段：antigen binding fragment，Fab；
Fc片段：fragment crystallizable region，Fc；
单克隆抗体：monoclonal antibodies，mAbs；
抗体依赖性细胞毒作用：antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC；
补体依赖性细胞毒性作用：complement dependent cytotoxicity，CDC；
双特异性抗体：bispecific antibody，BsAb。
如本文所用，术语“抗体”指包含至少一个抗原识别位点并能特异性结合抗原的免疫球蛋白分子。本发明所提及的术语“抗体”以其最广泛的含义理解，并包含单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段、包含至少两个不同的抗原结合结构域的多特异性抗体（例如双特异性抗体）。抗体还包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体以及其它来源的抗体。本发明的抗体可以来源于任何动物，包括但不限于人、非人灵长类动物、小鼠或大鼠等的免疫球蛋白分子。抗体可以含有另外的改变，如非天然氨基酸，Fc效应子功能突变和糖基化位点突变。抗体还包括翻译后修饰的抗体、包含抗体的抗原决定簇的融合蛋白，以及包含对抗原识别位点的任何其它修饰的免疫球蛋白分子，只要这些抗体展现出所期望的生物活性。
根据抗体重链恒定区的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分为5类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其还可以进一步分成不同的亚类（同种型），如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IGA1、IGA2等。根据轻链氨基酸序列，可将轻链分类为λ链或κ链。本发明的抗体可以是任何种类（如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM）或亚类（如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2）。
术语“抗原结合片段”包括但不限于：Fab片段，其具有VL、CL、VH和CH1域；Fab'片段，其是在CH1域的C端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段；Fd片段，其具有VH和CH1域；Fd'片段，其具有VH和CH1域和在CH1域的C端的一个或多个半胱氨酸残基；Fv片段，其具有抗体的单一臂的VL和VH域；dAb片段，其由VH域或VL域组成；分离的CDR区；F(ab')2片段，其是包含由铰链区处的二硫桥连接的两个Fab'片段的二价片段；单链抗体分子(例如单链Fv；scFv)；具有两个抗原结合位点的"双抗体"，其包含同一多肽链中与轻链可变域(VL)连接的重链可变域(VH)；"线性抗体"，其包含一对串联Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，该区段与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区；和任何前述物质的修饰的形式，其保留了抗原结合活性。
如本文所用，术语“CDR”是指抗体可变序列内的互补决定区。对于每个可变区，在重链和轻链的每个可变区中有三个CDR，其称为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的确切边界根据不同的系统而不同定义。Kabat等人(Kabat et al, Sequences of Proteins ofImmunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987)和(1991))描述的系统不仅提供了适用于抗体可变区的明确的残基编号系统，而且还提供了限定三个CDR的残基边界。这些CDR可以称为Kabat CDR。每个互补决定区可以包含来自如由Kabat定义的“互补决定区”的氨基酸残基。Chothia等人(Chothia&Lesk, J. Mol. Biol,196:901-917 (1987)和Chothia et al., Nature 342:877-883 (−1989))发现，Kabat CDR内的某些子部分采用几乎相同的肽骨架构象，尽管在氨基酸序列水平上具有大的多样性。这些子部分分别称为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别表示轻链和重链区。这些区域可以称为Chothia CDR，其具有与Kabat CDR重叠的边界。还有其它CDR边界定义可以不严格遵循上述系统之一，但是仍将与Kabat CDR重叠，本文使用的方法可以利用根据任何这些系统定义的CDR，尽管优选实施方案使用Kabat或Chothia定义的CDR。如本文所用，“抗体可变区”是指抗体分子的轻链和重链中包括互补决定区(CDR，即CDR1、CDR2和CDR3)和框架区(FR)的氨基酸序列的部分。VH是指重链的可变域。VL是指轻链的可变域。
如本文所用的术语“嵌合抗体”是指其中可变区衍生自非人物种(例如衍生自啮齿动物)并且恒定区衍生自不同物种(例如人)的抗体。嵌合抗体可以通过抗体工程化生成。“抗体工程化”是一般用于抗体的不同种类的修饰的术语，并且用于抗体工程化的方法是本领域技术人员公知的。因此，嵌合抗体可以是遗传或工程化的重组抗体。生成嵌合抗体的方法是本领域技术人员已知的，并因此，嵌合抗体的生成可以通过除本文所述之外的其他方法进行。开发用于人类治疗应用的嵌合单克隆抗体以降低非人抗体(例如啮齿动物抗体)的预期抗体免疫原性。它们通常可含有非人(例如鼠或兔)可变区，其对感兴趣的抗原具有特异性，和人恒定抗体重链和轻链结构域。如在嵌合抗体的上下文中所用的术语“可变区”或“可变结构域”是指包含免疫球蛋白的重链和轻链两者的CDR和框架区的区域，如下所述。
如本文所用的术语“人源化抗体”是指遗传工程改造的非人抗体，其含有经修饰的人抗体恒定结构域和非人可变结构域，以含有与人可变结构域具有高水平的序列同源性。这可以通过将六个非人抗体CDR(其一起形成抗原结合位点)移植到同源人受体框架区(FR)上来实现。为了完全重建亲本抗体的结合亲和力和特异性，可能需要将框架残基从亲本抗体(即非人抗体)置换到人框架区中(回复突变)。因此，人源化抗体可以包含非人CDR序列，主要是人框架区，其任选地包含对非人氨基酸序列的一个或多个氨基酸回复突变，和完全人恒定区。任选地，可以应用另外的氨基酸修饰(其不一定是回复突变)，以获得具有优选特征的人源化抗体，例如亲和力和生化特性和/或可以在恒定区引入另外的氨基酸突变。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本均质的抗体群体获得的抗体，即构成群体的各抗体是相同的，除了可以少量存在的可能的天然存在的突变外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆制剂中的每种抗体针对抗原上相同的单一决定簇。如本文使用，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体，并且修饰语“单克隆抗体”不应被解释为需要通过任何特定方法生产抗体。
本发明所述的“施用”包括但不限于口服、肠给药、皮下注射、皮内注射、肌肉注射、动脉内注射、静脉注射、鼻腔给药、透皮给药、结膜下给药、腹腔内注射、眼球内给药、眼眶给药、眼球后给药、视网膜给药、脉络膜给药、鞘内注射等。
本发明所述的“有效量”是指在以单个或多个剂量给予至患者或器官或个体之后提供所希望的治疗的本发明所述的产品（优选抗CD40抗体或其抗原结合片段）的量或剂量。
如本文所用，术语“ 化疗药物”是指具有在治疗以异常细胞生长为特征的疾病中的治疗有用性的任何化学试剂。如本文所用的化学治疗剂包括化学剂和生物剂。这些试剂发挥功能以抑制癌细胞实现持续存活所依赖的细胞活性。化疗剂的类别包括烷化/生物碱剂、抗代谢物、激素或激素类似物，以及各种各样的抗新生物药物。
本发明所述的“诊断”是指以查明患者过去、诊断时或将来是否患有疾病或病症，或者是查明疾病的进展或将来可能的进展，或者是评估患者对治疗的反应。
本发明所述“治疗（treating）”（或“治疗（treat）”或“治疗（treatment）”）表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。
本发明所述的“和/或”包括择一列出的项目以及任何数量的项目组合。
本发明所述的“包括”或“包含”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响技术效果的其他指定成分或步骤。其在本申请中用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。
本发明所述的“个体”可以为人或非人动物。其中，所述的非人动物可以为非人哺乳动物，例如猴子、小鼠、兔子等等。
在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科或鼠总科超家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科（例如小鼠样仓鼠）、仓鼠科（例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠）、鼠总科（真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科（登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠）、刺睡鼠科（例如多刺睡鼠）和鼹形鼠科（例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠）家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠（鼠总科）、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、 C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠。
本发明所述的“肿瘤”选自白血病、淋巴瘤、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌（例如非小细胞肺癌等）、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自下组，该组由以下各项组成：急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自下组，该组由以下各项组成：霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；并且所述肉瘤选自下组，该组由以下各项组成：骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、腺泡状软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。
本发明的有益效果：本发明经过筛选得到的抗体或其抗原结合片段能够特异性的与人CD40结合,具有高亲和力，表现稳定。此外，本发明经筛选得到的结合CD40的抗体或其抗原结合片段能有效抑制肿瘤生长，并且个体用药安全，可用于治疗肿瘤及其它与CD40信号通路相关的疾病。
非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed. By Sambrook，FritschandManiatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II (D.N.Glovered.，1985)；Immunochemical Methods In Cell AndMolecular Biology (Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；HandbookOf Experimental Immunology，Volumes V (D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)。
以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。
下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：不同抗CD40抗体与人CD40之间结合的流式细胞检测结果，生理盐水（NC）用作阴性对照。
图2：不同抗CD40抗体与来源于不同物种的CD40蛋白以及嵌合CD40蛋白之间的流式细胞检测结果，生理盐水（NC）用作阴性对照。
图3：抗CD40抗体处理后，实验动物的体重随时间变化的折线图，其中，图3A为实验动物的体重的绝对值随时间的变化，图3B为实验动物的体重随时间的百分比变化，生理盐水（G1）用作阴性对照。
图4：抗CD40抗体处理后，实验动物体内的肿瘤体积随时间变化的折线图，生理盐水（G1）用作阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1. 抗体生成
通过使用重组人源化CD40蛋白（hCD40，SEQ ID NO：46）或编码重组人源化CD40蛋白的表达质粒免疫小鼠，和随后构建杂交瘤细胞的方法，获得了本发明的抗CD40单克隆抗体19-3B2（“3B2”）、19-10H3（“10H3”）和20-2C12（“2C12”）。根据制造商的说明，利用GE AKTA蛋白色谱全自动纯化仪（GE Healthcare）进行抗体纯化。上述抗体的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）的氨基酸序列如以下表1至表3所示。
3B2的重链CDR1、CDR2和CDR3和轻链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列示出在SEQ IDNO.7-12（Kabat编号）或SEQ ID NO.25-30（Chothia编号）中。
10H3的重链CDR1、CDR2和CDR3和轻链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列示出在SEQ IDNO.13-18（Kabat编号）或SEQ ID NO.31-36（Chothia编号）中。
2C12的重链CDR1、CDR2和CDR3和轻链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列示出在SEQ IDNO.19-24（Kabat编号）或SEQ ID NO.37-42（Chothia编号）中。
表1. 抗体的VH和VL序列
Figure 607723DEST_PATH_IMAGE001
表2. Kabat CDR序列
Figure 587181DEST_PATH_IMAGE003
表3. Chothia CDR序列
Figure 429235DEST_PATH_IMAGE005
实施例2. 抗体的结合检测
抗体与人CD40之间的结合作用
本实验用于检测抗CD40抗体对人CD40的结合能力。具体实验操作如下：取96孔细胞培养板，每孔加入表达人源化CD40蛋白的CHO-hCD40细胞（25μl，2x104细胞/孔）。将纯化腹水抗体按照50、5、0.5、0.05、0.005μg/ml的浓度进行稀释，每孔加入25μl，并于4℃静置30分钟。
在用磷酸缓冲盐水（PBS）洗涤两次之后，将50 μl 的FITC标记的抗小鼠IgG Fc抗体以1:100的稀释度添加到每个孔中，在4℃孵育30分钟，然后用PBS洗涤一次后，每孔加入200μl PBS并进行流式细胞分析。
从图1所示的结果可以看出，随着抗CD40抗体（19-3B2、19-10H3和20-2C12）浓度的增加，FITC标记荧光强度逐渐增加，表明本发明的抗CD40抗体可以与人CD40结合。
抗体交叉反应检测
分别将恒河猴CD40蛋白（rmCD40，SEQ ID NO：45）的编码序列，小鼠CD40蛋白（mCD40，SEQ ID NO：44）的编码序列和人鼠嵌合CD40（鼠CD40蛋白的胞外区域用人源蛋白片段替换）蛋白（chiCD40，SEQ ID NO：46）的编码序列转入CHO细胞内进行蛋白表达，用于抗体交叉反应的检测。
具体实验操作如下：取96孔细胞培养板，每孔加入上述表达不同CD40蛋白的CHO细胞（25μl，2x104细胞/孔），再分别加入25ul腹水纯化的抗CD40抗体（1μg/ml），并于4℃静置30分钟。将96孔细胞培养板以1200rpm离心5分钟，使用PBS洗涤两次。随后，每孔加入50μl的1：100稀释的抗小鼠IgG Fc-FITC，并于4℃静置30分钟。随后，将96孔细胞培养板以1200rpm离心5分钟，使用PBS洗涤一次后，每孔加入200μl PBS并进行流式细胞分析。
从图2所示的结果可以看出，两种抗CD40抗体（19-10H3和19-3B2）与鼠源CD40蛋白没有交叉反应，但与猴源CD40蛋白和人鼠嵌合CD40蛋白有较强的交叉反应。
抗体亲和力检测
随后，利用Biacore T200（Biacore）的Protein A传感芯片捕获抗体的方法，检测这些抗CD40抗体与hCD40-His（爱必信制备）结合的亲和力。
具体实验操作如下：将抗CD40抗体19-3B2、19-10H3和20-2C12注入传感芯片（10μl/min，25s），蛋白捕获为45-65RU。然后将hCD40-His蛋白分别以200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625或0.78125nM的浓度注入传感芯片（30μl/min，100-400s），解离时间为300-1000s。用pH2.0的甘氨酸（30μl/min，10-20s）再生芯片后读取检测结果。动力结合速率（Kinetic association rates, kon）和动力解离速率（Kinetic dissociation rates,koff）可通过Bioacore T200测评软件进行1：1朗缪尔结合模型拟合获得（(Karlsson, R.Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B., 1994. Methods Enzymology 6. 99-110）。亲和力速率常数KD=koff/kon，所有抗体亲和力检测拟合结果参见表4。
表4. 抗CD40抗体亲和力检测
Figure 886761DEST_PATH_IMAGE006
实施例3.抗体的体内药效检测
为了检测抗CD40抗体的体内药效，使用了CD40基因人源化小鼠（B-hCD40）制备肿瘤动物模型。该小鼠表达人鼠嵌合CD40蛋白（SEQ ID NO. 46），其中鼠CD40蛋白的胞外区被人源序列替换：鼠CD40蛋白（SEQ ID NO. 44）的第20-192位氨基酸被人CD40蛋白（SEQ ID NO.43）的第20-192位氨基酸替换。该B-hCD40小鼠模型为CD40单抗药物的临床前动物实验提供了新的检测方法，极大地提高了临床实验的可预测性（参见PCT申请号PCT/CN2018/091845和中国申请号201810622839.7，上述文献通过引用整体并入本文）。
肿瘤动物模型的制备过程如下：在B-hCD40小鼠体内通过皮下注射接种鼠MC-38细胞（结肠癌细胞）。待肿瘤体积达到150 ± 50 mm3后，将小鼠随机分成抗CD40抗体给药组和对照组（生理盐水）进行肿瘤抑制药效实验。通过腹腔注射给药。每周定期测量小鼠体重和肿瘤体积2次。肿瘤体积（mm3）=0.5x长径x短径2。基于小鼠的体重计算给药剂量（0.3mg/kg或3mg/kg）。
肿瘤生长抑制率（the tumor growth inhibition percentage, TGI）计算公式：TGI（%）= [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100，其中Ti是治疗组第i天的平均肿瘤体积；T0是治疗组第0天的平均肿瘤体积；Vi是对照组第i天的平均肿瘤体积；V0是对照组第0天的平均肿瘤体积。使用T-检验进行统计学分析。当TGI%大于60%时，表示对肿瘤生长具有显著抑制效果。P< 0.05表示统计结果具有显著差异。
取5-8周龄的B-hCD40小鼠，皮下接种MC38细胞（5x105/只），待肿瘤体积达到150± 50 mm3后随机分为4组，每组6只。给药组分别用抗CD40抗体19-3B2、19-10H3和20-2C12通过腹腔注射给药处理，剂量为3mg/kg，对照组注射生理盐水。每周第2、5天给药。每周2次测量小鼠的体重和肿瘤体积，3周后结束实验。如图3A和图3B所示，对照组和给药组小鼠的平均体重在整个实验周期都稳定增长，且组间无明显差异，表明抗CD40抗体给药后没有对小鼠产生明显的毒性。如图4中的结果所示（分组后21天的肿瘤体积数据），与对照组相比，给药组中肿瘤的生长都受到不同程度的抑制。以下表5显示了各组的TGI%结果。
表5. 肿瘤生长抑制率
Figure DEST_PATH_IMAGE007
上述结果表明，本发明的抗CD40抗体19-10H3和19-3B2都显示出肿瘤抑制效果，其中19-3B2具有最好的肿瘤抑制效果。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
序列表
<110> 北京百奥赛图基因生物技术有限公司
<120> 抗CD40抗体及其用途
<130> 1
<160> 46
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Ile Gln Leu Gln Gln Pro Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ile Ile Val Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Pro Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Asn Pro Tyr Tyr Gly Ser Ile Arg Tyr Asn Ser Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Asp
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ser Ser Met Asp Gly Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr
20 25 30
Gly Asn Thr Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Ser Arg Ala Ser Asn Leu Asp Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 3
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ser Arg Asp Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Ile Val Ser Arg Asp Thr Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Val Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Thr Gly Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Asp Val Val Met Arg Gln Glu Thr Val Ser Leu Gln Phe Ser Ala Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Trp Asp Arg Phe Ser Gln Ser Leu Ile Asn Ser
20 25 30
Lys Arg Asn Thr Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Arg Ile Tyr Lys Ala Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Arg Met Glu Gly Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Tyr Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Cys Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 5
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Gly Tyr Gly Asn Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Asn Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Asp Tyr Ile Ile Val
1 5
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Asn Ile Asn Pro Tyr Tyr Gly Ser Ile Arg Tyr Asn Ser Lys Phe Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Ser Ser Ser Met Asp Gly Leu Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr Gly Asn Thr Phe Met His
1 5 10 15
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Arg Ala Ser Asn Leu Asp Ser
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Trp Thr
1 5
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Asp Phe Tyr Met Glu
1 5
<210> 14
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Ala Ser Arg Asp Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Pro Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Asp Thr Gly Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 16
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Arg Phe Ser Gln Ser Leu Ile Asn Ser Lys Arg Asn Thr Tyr Ile His
1 5 10 15
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Lys Ala Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Tyr Gln Ser Thr His Val Pro Cys Thr
1 5
<210> 19
<211> 5
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<400> 19
Asp Thr Tyr Met His
1 5
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<211> 17
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
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Trp Gly Tyr Gly Asn Ser Leu Asp Tyr
1 5
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<211> 11
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<400> 22
Arg Ala Asn Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu His
1 5 10
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<211> 7
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Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
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Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Phe Thr
1 5
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<211> 10
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<400> 25
Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Ile Ile Val
1 5 10
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<211> 6
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1 5
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<211> 12
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1 5 10
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Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr Gly Asn Thr Phe Met His
1 5 10 15
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<211> 7
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Arg Ala Ser Asn Leu Asp Ser
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<211> 9
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Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Trp Thr
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<211> 10
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Gly Phe Ile Phe Ser Asp Phe Tyr Met Glu
1 5 10
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<211> 8
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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1 5
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<211> 10
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<400> 33
Asp Thr Gly Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
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<211> 16
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Arg Phe Ser Gln Ser Leu Ile Asn Ser Lys Arg Asn Thr Tyr Ile His
1 5 10 15
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1 5
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Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met His
1 5 10
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Trp Gly Tyr Gly Asn Ser Leu Asp Tyr
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Arg Ala Asn Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu His
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<400> 41
Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser
1 5
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Phe Thr
1 5
<210> 43
<211> 277
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 43
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
20 25 30
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
35 40 45
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu
50 55 60
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly
115 120 125
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
130 135 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145 150 155 160
Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln
165 170 175
Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu
180 185 190
Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile
195 200 205
Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn
210 215 220
Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp
225 230 235 240
Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His
245 250 255
Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser
260 265 270
Val Gln Glu Arg Gln
275
<210> 44
<211> 289
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus. musculus)
<400> 44
Met Val Ser Leu Pro Arg Leu Cys Ala Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val His Leu Gly Gln Cys Val Thr Cys Ser Asp Lys Gln Tyr Leu
20 25 30
His Asp Gly Gln Cys Cys Asp Leu Cys Gln Pro Gly Ser Arg Leu Thr
35 40 45
Ser His Cys Thr Ala Leu Glu Lys Thr Gln Cys His Pro Cys Asp Ser
50 55 60
Gly Glu Phe Ser Ala Gln Trp Asn Arg Glu Ile Arg Cys His Gln His
65 70 75 80
Arg His Cys Glu Pro Asn Gln Gly Leu Arg Val Lys Lys Glu Gly Thr
85 90 95
Ala Glu Ser Asp Thr Val Cys Thr Cys Lys Glu Gly Gln His Cys Thr
100 105 110
Ser Lys Asp Cys Glu Ala Cys Ala Gln His Thr Pro Cys Ile Pro Gly
115 120 125
Phe Gly Val Met Glu Met Ala Thr Glu Thr Thr Asp Thr Val Cys His
130 135 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Gln Ser Ser Leu Phe Glu Lys
145 150 155 160
Cys Tyr Pro Trp Thr Ser Cys Glu Asp Lys Asn Leu Glu Val Leu Gln
165 170 175
Lys Gly Thr Ser Gln Thr Asn Val Ile Cys Gly Leu Lys Ser Arg Met
180 185 190
Arg Ala Leu Leu Val Ile Pro Val Val Met Gly Ile Leu Ile Thr Ile
195 200 205
Phe Gly Val Phe Leu Tyr Ile Lys Lys Val Val Lys Lys Pro Lys Asp
210 215 220
Asn Glu Ile Leu Pro Pro Ala Ala Arg Arg Gln Asp Pro Gln Glu Met
225 230 235 240
Glu Asp Tyr Pro Gly His Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu
245 250 255
His Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile
260 265 270
Ser Val Gln Glu Arg Gln Val Thr Asp Ser Ile Ala Leu Arg Pro Leu
275 280 285
Val
<210> 45
<211> 278
<212> PRT
<213> 恒河猴(Macaca mulatta)
<400> 45
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val Tyr Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
20 25 30
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
35 40 45
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Ser Glu
50 55 60
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr Arg Cys His Gln His
65 70 75 80
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
85 90 95
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Leu His Cys Met
100 105 110
Ser Glu Ser Cys Glu Ser Cys Val Pro His Arg Ser Cys Leu Pro Gly
115 120 125
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
130 135 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145 150 155 160
Cys Arg Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln
165 170 175
Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Gln
180 185 190
Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Cys Leu Gly Ile Leu Phe Val Ile
195 200 205
Leu Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Asn
210 215 220
Asp Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Leu
225 230 235 240
Asp Asp Leu Pro Gly Ser Asn Pro Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu
245 250 255
His Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile
260 265 270
Ser Val Gln Glu Arg Gln
275
<210> 46
<211> 289
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
Met Val Ser Leu Pro Arg Leu Cys Ala Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
20 25 30
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
35 40 45
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu
50 55 60
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His
65 70 75 80
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
85 90 95
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr
100 105 110
Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly
115 120 125
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
130 135 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145 150 155 160
Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln
165 170 175
Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu
180 185 190
Arg Ala Leu Leu Val Ile Pro Val Val Met Gly Ile Leu Ile Thr Ile
195 200 205
Phe Gly Val Phe Leu Tyr Ile Lys Lys Val Val Lys Lys Pro Lys Asp
210 215 220
Asn Glu Ile Leu Pro Pro Ala Ala Arg Arg Gln Asp Pro Gln Glu Met
225 230 235 240
Glu Asp Tyr Pro Gly His Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu
245 250 255
His Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile
260 265 270
Ser Val Gln Glu Arg Gln Val Thr Asp Ser Ile Ala Leu Arg Pro Leu
275 280 285
Val

Claims (10)

1.一种特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述抗体或其抗原结合部分包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，所述轻链可变区包含VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，所述重链可变区和轻链可变区的CDR1-3如下列组中的一组所示：
（1） 所述重链可变区的VHCDR1-3分别如SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO.9所示，以及，轻链可变区的VLCDR1-3分别如SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO.12所示；或者，
（2） 所述重链可变区的VHCDR1-3分别如SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 14和SEQ IDNO. 15所示，以及，轻链可变区的VLCDR1-3分别如SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 17和SEQ IDNO. 18所示。
2. 如权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述重链可变区如SEQID NO. 1所示，以及，所述轻链可变区如SEQ ID NO. 2所示，或者，所述重链可变区如SEQID NO. 3所示，以及，所述轻链可变区如SEQ ID NO. 4所示。
3.如权利要求1-2任意所述的抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述的抗体或其抗原结合片段特异性结合人CD40。
4.一种分离的DNA，其特征在于，所述DNA编码权利要求1-3任意所述的抗体或其抗原结合部分。
5.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求4所述的DNA。
6.一种细胞，其特征在于，所述细胞包括权利要求4所述的DNA或者权利要求5所述的载体。
7.一种权利要求1-3任意所述的特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分的制备方法，其特征在于，所述方法包括培养权利要求6所述的细胞，获得特异性结合CD40的抗体或其抗原结合片段。
8.一种抗体-药物缀合物，其包含与治疗剂共价结合的权利要求1-3任意所述的抗体或其抗原结合片段。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-3任意的特异性结合CD40的抗体或其抗原结合部分，或权利要求8所述的抗体-药物缀合物，以及可药用载体，所述药物组合物用于治疗CD40信号通路相关的疾病。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述CD40信号通路相关的疾病包括肿瘤。
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