CN111690614B - 一种标准化肿瘤动物模型的建立方法及培养装置 - Google Patents

一种标准化肿瘤动物模型的建立方法及培养装置 Download PDF

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Abstract

本发明实施例公开了一种标准化肿瘤动物模型的建立方法及培养装置，包括以下步骤：将3D细胞环培养模具进行预处理后放入细胞培养皿中；在细胞培养皿的空间内按照不同的顺序倾斜转动3D细胞环培养模具，在3D细胞环培养模具上培养瘤细胞分布均一的3D肿瘤细胞环；将3D肿瘤细胞环在体外培养至成型后移植进入动物组织内再次培养，3D肿瘤细胞环的瘤细胞在动物组织的建模处双向生长，直至肿瘤生长成型；本方案细胞流失少，成瘤率高，成瘤均一稳定，大大减少建模所需的细胞数量和建模成本，是一种高效、简单、可靠、可操作性强，经济实惠的肿瘤建模方法。

Description

一种标准化肿瘤动物模型的建立方法及培养装置
技术领域
本发明实施例涉及生物医学技术领域，具体涉及一种标准化肿瘤动物模型的建立方法及培养装置。
背景技术
恶性肿瘤是危害人类健康的最大杀手，全世界科学家一直在尝试找到对抗恶性肿瘤的最佳治疗方法。肿瘤研究一直是全世界最为关注的领域。目前的肿瘤基础研究领域包括体外对肿瘤细胞的研究和体内对肿瘤动物模型的研究。
目前最常用的肿瘤动物模型为小鼠模型，建立肿瘤模型的方法主要有细胞悬液注射法、细胞悬液凝胶混合注射法和组织块移植法等模型建立方法，现有的这些肿瘤动物模型建立方法还存在的缺点如下：
细胞悬液注射法存在细胞存活率低、细胞损失多、成瘤率不一致、需要细胞数量大、成瘤时间不稳定等缺点；细胞悬液基质胶混合注射法存在单位体积基质胶载细胞数量有限、基质胶内细胞活力受影响等问题；组织块瘤细胞数目不均一、杂细胞污染、成瘤稳定性差、成瘤一致性无法控制等缺点。
发明内容
为此，本发明实施例提供一种标准化肿瘤动物模型的建立方法及培养装置，以解决现有技术中存在组织块瘤细胞数目不均一、成瘤稳定性差、成瘤一致性无法控制等缺点的问题。
为了实现上述目的，本发明的实施方式提供如下技术方案：
一种标准化肿瘤动物模型的建立方法，包括如下步骤：
步骤100、将3D细胞环培养模具进行预处理后放入细胞培养皿中；
步骤200、在细胞培养皿的空间内按照不同的顺序倾斜转动3D细胞环培养模具，在3D细胞环培养模具上培养瘤细胞分布均一的3D肿瘤细胞环；
步骤300、将3D肿瘤细胞环在体外培养至成型后移植进入动物组织内再次培养，3D肿瘤细胞环的瘤细胞在动物组织的建模处双向生长，直至肿瘤生长成型。
作为一种优选方案，在步骤200中，肿瘤细胞在3D细胞环培养模具内培养，并在所述双层附着环上形成三维环形分布的肿瘤细胞生长空间，具体实现步骤为：
步骤201、对3D细胞环培养模具进行封闭化处理；
步骤202、将3D细胞环培养模具送入恒温恒湿培养箱中进行培养；
步骤203、依据3D细胞环培养模具的形状对肿瘤细胞进行均匀化处理，使得肿瘤细胞均匀分布在3D细胞环培养模具内。
作为一种优选方案，在步骤203中，对3D细胞环培养模具上培养的肿瘤细胞均匀化处理的具体步骤为：
在双层附着环的两个培养凹槽内投放初始瘤细胞；
在细胞培养皿内按时注入更换培养液，顺次选择转动两个相邻的翘动杆，双层附着环顺次在不同的倾斜方位定时培养，瘤细胞沿着双层附着环的倾斜方向均一化生长。
作为一种优选方案，在步骤300中，将3D肿瘤细胞环移植到活体组织内部进行肿瘤细胞成型的具体步骤为：
步骤301、细胞培养皿在恒温恒湿培养箱培养48小时后，打开细胞培养皿，整体下推翘动杆使得翘动杆转动上顶培养皿，将双层附着环从培养液中浴出；
步骤302、利用镊子夹持双层附着环并将双层附着环转移至含有少量普通DMEM培养基的临时皿中。
步骤303、给5-6周龄待移植裸鼠予以5％水合氯醛腹腔麻醉。
步骤304、用剪刀纵行剪开裸鼠大腿远端外侧皮肤选定建模处，以镊子和尖刀分开大腿股骨远端外侧肌肉，显露股骨远端外侧面，尖刀刮除部分骨皮质，至显露出部分骨髓腔；
步骤305、用镊子侧向钩取临时皿中的1个双层附着环，转动双层附着环中的内细胞环使得内细胞环的培养凹槽与外细胞环的培养凹槽位于两个平面，将双层附着环移植到建模处，将建模处两侧肌肉和皮肤拉拢缝合，待裸鼠麻醉苏醒，放回饲养笼，观察肿瘤细胞在裸鼠内的生长情况。
作为一种优选方案，观察肿瘤细胞在裸鼠内的生长情况的具体步骤为：
术后一周开始观察裸鼠建模处的肿块大小及变化，绘制肿瘤生长曲线。术后2周行活体成像观察成瘤情况。
术后4周处死小鼠，取股骨肿瘤组织行微型CT检查和病例切片观察肿块大小和骨质破坏情况验证肿瘤组织。取肺组织行病理切片观察转移瘤情况验证恶性肿瘤的转移特性。
一种标准化肿瘤动物模型建立方法的培养装置，包括细胞培养皿和3D细胞环培养模具，所述细胞培养皿包括下容量腔体和上密封盖板，所述下容量腔体的侧周曲面设有若干均匀分布的U形切割开口，每个所述U形切割开口的底部均铰接有翘动杆，位于所述下容量腔体内部的所述翘动杆的末端设有实心球体，所述下容量腔体的侧周曲面在每个所述U形切割开口的两侧均设有竖向限位卡槽，所述上密封盖板的侧周曲面的内表面设有与所述竖向限位卡槽对应的插杆，所述上密封盖板利用所述插杆和所述竖向限位卡槽的固定作用提高所述下容量腔体和上密封盖板封装稳定性。
作为一种优选方案，所述上密封盖板的侧周曲面的外表面正对所述翘动杆的位置设有切割平面，所述切割平面上安装有框架板，所述框架板的板面活动安装有推拉齿轮，所述框架板与所述切割平面之间设有移板，所述推拉齿轮驱动所述移板上下移动以间接推动所述翘动杆绕铰接点转动。
作为一种优选方案，所述3D细胞环培养模具包括载位板，以及放置在所述载位板内部的双层附着环，所述载位板的底板设有若干条以所述载位板中心位置为原点的辐射凹槽，并且所述载位板的底板设有若干均匀分布的沥水孔，所述翘动杆末端的所述实心球体安装在所述辐射凹槽内并沿着所述辐射凹槽线性位移。
作为一种优选方案，所述翘动杆在所述上密封盖板的所述移板上下推动作用下绕铰接点转动，所述翘动杆共同将所述载位板顶起后取出所述双层附着环，相邻两个所述翘动杆间隔转动对所述载位板施加不平衡作用力，所述载位板倾斜后所述双层附着环上的瘤细胞沿着下斜方向生长间接实现瘤细胞数目的均一化处理。
作为一种优选方案，所述双层附着环包括外细胞环和内细胞环，所述内细胞环的外侧边通过沿着其直径分布的转动杆安插在所述外细胞环的内侧边，所述外细胞环、所述内细胞环的中心线以及所述外细胞环的侧曲面上均设有供癌细胞繁殖培养的培育凹槽。
本发明的实施方式具有如下优点：
(1)本发明构建具有3D结构的肿瘤细胞环，该细胞环具有完整未受破坏的细胞外基质和很好的细胞活力，能够像组织块移植一样将细胞环整块移植入成瘤区，所需细胞数量少，细胞流失少，成瘤率高，成瘤均一稳定，大大减少建模所需的细胞数量和建模成本；
(2)本发明方便镊子施力，保证镊子夹持时不打滑，从而保证细胞环转移时的稳定性，瘤细胞朝向不同方向生长，减少细胞环表面培养的瘤细胞在转移时的流失量，提高后期转移至动物组织内的成瘤率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为本发明实施方式中的肿瘤动物模型建立方法的流程示意图；
图2为本发明实施方式中的细胞培养皿的结构示意图；
图3为本发明实施方式中的3D细胞环培养模具被顶起的结构示意图；
图4为本发明实施方式中的双层附着环的结构示意图；
图5为本发明实施方式中3D细胞环与细胞悬液法建立肿瘤动物模型所需细胞数的对比图；
图6为本发明实施方式中3D细胞环与细胞悬液法建立肿瘤动物模型成瘤成功率的对比图；
图7为本发明实施方式中3D细胞环与细胞悬液法建立肿瘤动物模型成瘤时间的对比图；
图8为本发明实施方式中3D细胞环与细胞悬液法建立肿瘤动物模型成瘤均一性的对比图；
图9为本发明实施方式中的裸鼠股骨微型CT图；
图中：
1-下容量腔体；2-上密封盖板；3-U形切割开口；4-翘动杆；5-实心球体；6-竖向限位卡槽；7-插杆；8-切割平面；9-框架板；10-推拉齿轮；11-移板；12-载位板；13-双层附着环；14-辐射凹槽；15-沥水孔；
131-外细胞环；132-内细胞环；133-转动杆；134-培育凹槽。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1所示，本发明提供了一种标准化肿瘤动物模型的建立方法，本实施方式先利用3D肿瘤细胞环体外培养瘤细胞，然后再将肿瘤细胞环移植到实验活体内，3D肿瘤细胞环具有完整未受破坏的细胞外基质和很好的细胞活力，并且瘤细胞在细胞环均一化分布，且在移植过程中细胞流失量少，对后续快速进行3D肿瘤细胞环的体内移植成瘤的成功具有决定性的作用，方便快速高效建立肿瘤动物模型，体现出有别于传统二维培养的优势。
包括如下步骤：
第一步、将3D细胞环培养模具进行预处理后放入细胞培养皿中；
其中，对3D细胞环培养模具预处理的具体步骤为：
(1)将低温消毒灭菌处理好的3D细胞环培养模具放入细胞培养皿中；
(2)以行立体培养涂层的抗粘附试剂40ul加入3D细胞环培养模具的培养孔里面，待其静置20分钟；
(3)吸出抗粘附试剂，以室温放置的高糖DMEM培基润洗3D细胞环培养模具的培养槽。
第二步、在细胞培养皿的空间内按照不同的顺序倾斜转动3D细胞环培养模具，在3D细胞环培养模具上培养瘤细胞分布均一的3D肿瘤细胞环；
在此步骤中，如图2所示，所述细胞培养皿包括下容量腔体1和上密封盖板2，所述下容量腔体1的侧周曲面设有若干均匀分布的U形切割开口3，每个所述U形切割开口3的底部均铰接有翘动杆4，位于所述下容量腔体1内部的所述翘动杆4的末端设有实心球体5。
在本实施方式中，下容量腔体1内注入培养液，3D细胞环培养模具浸入培养液内进行瘤细胞培养，因此当翘动杆4转动时，将带动3D细胞环培养模具上下垂向移动，3D细胞环培养模具在上下移动过程中，实现浸入培养液和从培养液移出的功能，因此无需将镊子插进培养液中夹取3D细胞环培养模具，可降低镊子在培养液夹取3D细胞环培养模具产生的晃动感，确保3D细胞环培养模具转移的稳定性，进而降低3D细胞环培养模具转移时瘤细胞流失量。
所述下容量腔体1的侧周曲面在每个所述U形切割开口3的两侧均设有竖向限位卡槽6，所述上密封盖板2的侧周曲面的内表面设有与所述竖向限位卡槽6对应的插杆7，所述上密封盖板2利用所述插杆7和所述竖向限位卡槽6的固定作用提高所述下容量腔体1和上密封盖板2封装稳定性。
上密封盖板2和下容量腔体1通过杆7和所述竖向限位卡槽6的匹配工作，保证下容量腔体1和上密封盖板2封装稳定性，且避免细胞培养皿整体转移时有培养液溢出。
所述上密封盖板2的侧周曲面的外表面正对所述翘动杆4的位置设有切割平面8，所述切割平面8上安装有框架板9，所述框架板9的板面活动安装有推拉齿轮10，所述框架板9与所述切割平面8之间设有移板11，所述推拉齿轮10驱动所述移板11上下移动以间接推动所述翘动杆4绕铰接点转动。
需要补充说明的是，上密封盖板2和下容量腔体1通过杆7和所述竖向限位卡槽6的匹配工作，也进一步确保移板11与翘动杆4的位置对应关系。
在本实施方式中，翘动杆4优选为3个，避免翘动杆4数目太多造成推动所述翘动杆4转动的复杂性，从而完成高效、简单、可靠、操作性强的细胞培养过程，在正常的培育过程中，3D细胞环培养模具浸入下容量腔体1的培养液内，推动移板11线性下移，移板11推动翘动杆4旋转，将3D细胞环培养模具从培养液中顶出。
如图3所示，3D细胞环培养模具包括载位板12，以及放置在所述载位板12内部的双层附着环13，所述载位板12的底板设有若干条以所述载位板12中心位置为原点的辐射凹槽14，并且所述载位板12的底板设有若干均匀分布的沥水孔15，所述翘动杆4末端的所述实心球体5安装在所述辐射凹槽14内并沿着所述辐射凹槽14线性位移。
所述翘动杆4在所述上密封盖板2的所述移板11上下推动作用下绕铰接点转动，翘动杆4转动操作分为以下两种情况：
第一种：相邻两个所述翘动杆4间隔转动对所述载位板12施加不平衡作用力，即按照顺时针或者逆时针的方向，选择两个移板11推动翘动杆4旋转，另一个翘动杆4保持初始状态，载位板12由水平状态变为倾斜状态，则双层附着环13上分布不均匀的瘤细胞沿着倾斜方向向下生长，即所述载位板12倾斜后所述双层附着环13上的瘤细胞沿着下斜方向生长间接实现瘤细胞数目的均一化处理。
第二种：所述翘动杆4共同将所述载位板12顶起后取出所述双层附着环13，双层附着环13从培养液中移出，此时利用镊子夹持双层附着环13与直接利用镊子安插进培养液夹持双层附着环13相比，双层附着环13表面附着的培养液少，方便镊子施力，保证镊子夹持时不打滑，从而保证双层附着环13转移时的稳定性，减少双层附着环13表面培养的瘤细胞在转移时的流失量，提高后期转移至动物组织内的成瘤率。
更优选的是，如图4所示，双层附着环13包括外细胞环131和内细胞环132，所述内细胞环132的外侧边通过沿着其直径分布的转动杆133安插在所述外细胞环131的内侧边，所述外细胞环131、所述内细胞环132的中心线以及所述外细胞环131的侧曲面上均设有供癌细胞繁殖培养的培育凹槽134。
在培养液内培育瘤细胞时，双层附着环13的外细胞环131和内细胞环132同步进行瘤细胞培育，本实施方式的双层附着环13形成用于肿瘤细胞培养的环形空间，在该形状和尺寸下的细胞环的活力达到最佳状态，体外培养条件下不会因为营养渗透障碍而出现细胞死亡。
而外细胞环131和内细胞环132通过转动杆133相对转动，外细胞环131和内细胞环132的培育凹槽134分别处于两个平面内，在移植到动物组织内时，外细胞环131和内细胞环132的培育凹槽134内的瘤细胞进行全面生长，提高成瘤率。
所述3D细胞环培养模具体外培养的具体步骤为：
I、在3D细胞环培养模具的培养孔外周加入600ul培养液，细胞放入培养箱中静置孵育10-12小时，期间不要移动细胞培养皿。
II、其中培养液的制取步骤为：用高糖DMEM基础培基溶解0.25％甲基纤维素后，加入10％FBS，10ng/mlbFGF,10ng/mlPDGF，20ng/mlTGFβ和10uMY-27632即可得到细胞环专用培养基。
III、12小时后在培养孔内再加入600ul培养液入以补足营养，继续放入培养箱中培养；
IV、在培养箱中继续培养24-48小时，待细胞环分泌更多基质有更高强度。
综上所述，肿瘤细胞在3D细胞环培养模具内培养，并在所述双层附着环上形成三维环形分布的肿瘤细胞生长空间的具体实现步骤为：
1、对3D细胞环培养模具进行封闭化处理，并在下容量腔体1内加入600ul瘤细胞培育专用培养液；
2、将3D细胞环培养模具送入恒温恒湿培养箱中进行培养，静置孵育10-12小时，期间不要移动细胞培养皿；
3、依据3D细胞环培养模具的形状对肿瘤细胞进行均匀化处理，使得肿瘤细胞均匀分布在3D细胞环培养模具内，即先在双层附着环的两个培养凹槽内投放初始瘤细胞，在细胞培养皿内按时注入更换培养液，顺次选择转动两个相邻的翘动杆，双层附着环顺次在不同的倾斜方位定时培养，瘤细胞沿着双层附着环的倾斜方向均一化生长。
第三步、将3D肿瘤细胞环在体外培养至成型后移植进入动物组织内再次培养，3D肿瘤细胞环的瘤细胞在动物组织的建模处双向生长，直至肿瘤生长成型。
将3D肿瘤细胞环移植到活体组织内部进行肿瘤细胞成型的具体步骤为：
细胞培养皿在恒温恒湿培养箱培养48小时，待细胞环分泌更多基质有更高强度，打开细胞培养皿，整体下推翘动杆使得翘动杆转动上顶培养皿，将双层附着环从培养液中浴出；
利用镊子夹持双层附着环并将双层附着环转移至含有少量普通DMEM培养基的临时皿中。
给5-6周龄待移植裸鼠予以5％水合氯醛腹腔麻醉。
用剪刀纵行剪开裸鼠大腿远端外侧皮肤，以镊子和尖刀分开大腿股骨远端外侧肌肉，显露股骨远端外侧面，尖刀刮除部分骨皮质，至显露出部分骨髓腔；
用镊子侧向钩取临时皿中的1个双层附着环，转动双层附着环中的内细胞环使得内细胞环的培养凹槽与外细胞环的培养凹槽位于两个平面，将双层附着环移植到建模处，将建模处两侧肌肉和皮肤拉拢缝合，待裸鼠麻醉苏醒，放回饲养笼，观察肿瘤细胞在裸鼠内的生长情况。
本实施方式通过将使用3D细胞环建立肿瘤动物模型的每一步骤，与使用细胞悬液注射法建立肿瘤动物模型的每一步骤进行一一对比，来证明利用3D细胞环建立肿瘤动物模型的所需细胞数量少，细胞流失少，成瘤率高，成瘤均一稳定，大大减少建模所需的细胞数量和建模成本，具体的对比数据如图5至图8所示。
作为本发明的创新点，本实施方式并不是现有技术中常见利用镊子夹取细胞环，而是利用镊子侧向钩取双层附着环，钩取双层附着环时，瘤细胞在培育凹槽134体积内有限移动，并且此时将外细胞环和内细胞环相对转动时，培育凹槽134的开口处并不是直接垂直于地表面，从而这种方式同样可以减少双层附着环转移时的瘤细胞流失。
另外，将双层附着环移植到建模处时，所述内细胞环和外细胞环平面植入建模处，内细胞环和外细胞环的瘤细胞分别朝着不同的方向生长，因此内细胞环和外细胞环的瘤细胞面向不同的生长环境，即使其中一个细胞环上的瘤细胞存活率低下，而另一个细胞环上的瘤细胞同样保证较高的瘤细胞存活率。
在术后一周开始观察裸鼠建模处的肿块大小及变化，绘制肿瘤生长曲线；术后2周行活体成像观察成瘤情况；术后4周处死小鼠，取股骨肿瘤组织行微型CT检查和病例切片观察肿块大小和骨质破坏情况验证肿瘤组织，具体的CT检查结果如图9所示，具体为成瘤4周后裸鼠股骨微型CT，所示下段股骨未肿瘤所致骨质破坏；取肺组织行病理切片观察转移瘤情况验证恶性肿瘤的转移特性。
由于前述肿瘤细胞环有别于传统细胞注射成瘤的独特优点，该细胞环在倾斜转动定时培育时，提高瘤细胞在细胞环上的均一化分布，细胞环被顶起后用镊子侧向钩出，将细胞环一分为二相对转动，瘤细胞分布在两个表面上，操作方便简单，防止细胞环夹持不稳定而滑落，并且同时夹持处的瘤细胞液没有二次损坏，降低瘤细胞丢失量。
另外细胞环的转运也很简便，可以整体移植到成瘤部位，细胞环在组织中的附着力良好，没有细胞悬液注射过程中产生的细胞流失，因此细胞存活率高。此外，由于移植到成瘤部位的细胞没有流失，存活率高，因此在体内存活下来的细胞数量能够保持高度一致，所以形成的肿瘤均一性高，生长速度一致，也就是肿瘤模型的起始状态相近，这非常有利于标准化肿瘤模型的制备。更重要的是，由于该肿瘤模型成瘤率高，特定的细胞株成瘤稳定，可以大大减少不成功的成瘤裸鼠的浪费，减少了实验动物的消耗，降低了实验和科研成本。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种标准化肿瘤动物模型的培养装置，其特征在于，包括细胞培养皿和3D细胞环培养模具，所述细胞培养皿包括下容量腔体(1)和上密封盖板(2)，所述下容量腔体(1)的侧周曲面设有若干均匀分布的U形切割开口(3)，每个所述U形切割开口(3)的底部均铰接有翘动杆(4)，位于所述下容量腔体(1)内部的所述翘动杆(4)的末端设有实心球体(5)，所述下容量腔体(1)的侧周曲面在每个所述U形切割开口(3)的两侧均设有竖向限位卡槽(6)，所述上密封盖板(2)的侧周曲面的内表面设有与所述竖向限位卡槽(6)对应的插杆(7)，所述上密封盖板(2)利用所述插杆(7)和所述竖向限位卡槽(6)的固定作用提高所述下容量腔体(1)和上密封盖板(2)封装稳定性；
其中，所述3D细胞环培养模具包括载位板(12)，以及放置在所述载位板(12)内部的双层附着环(13)，所述载位板(12)的底板设有若干条以所述载位板(12)中心位置为原点的辐射凹槽(14)，并且所述载位板(12)的底板设有若干均匀分布的沥水孔(15)，所述翘动杆(4)末端的所述实心球体(5)安装在所述辐射凹槽(14)内并沿着所述辐射凹槽(14)线性位移；
标准化肿瘤动物模型的建立方法，包括如下步骤：
步骤100、将3D细胞环培养模具进行预处理后放入细胞培养皿中；
步骤200、在细胞培养皿的空间内按照不同的顺序倾斜转动3D细胞环培养模具，在3D细胞环培养模具上培养瘤细胞分布均一的3D肿瘤细胞环；
步骤300、将3D肿瘤细胞环在体外培养至成型后移植进入动物组织内再次培养，3D肿瘤细胞环的瘤细胞在动物组织的建模处双向生长，直至肿瘤生长成型。
2.根据权利要求1所述的一种标准化肿瘤动物模型的培养装置，其特征在于，在步骤200中，在3D细胞环培养模具上培养瘤细胞分布均一的3D肿瘤细胞环，具体实现步骤为：
步骤201、对3D细胞环培养模具进行封闭化处理；
步骤202、将3D细胞环培养模具送入恒温恒湿培养箱中进行培养；
步骤203、依据3D细胞环培养模具的形状对肿瘤细胞进行均匀化处理，使得肿瘤细胞均匀分布在3D细胞环培养模具内。
3.根据权利要求2所述的一种标准化肿瘤动物模型的培养装置，其特征在于，在步骤203中，对3D细胞环培养模具上培养的肿瘤细胞均匀化处理的具体步骤为：
在双层附着环的两个培养凹槽内投放初始瘤细胞；
在细胞培养皿内按时注入更换培养液，顺次选择转动两个相邻的翘动杆，双层附着环顺次在不同的倾斜方位定时培养，瘤细胞沿着双层附着环的倾斜方向均一化生长。
4.根据权利要求1所述的一种标准化肿瘤动物模型的培养装置，其特征在于，在步骤300中，将3D肿瘤细胞环移植到活体组织内部进行肿瘤细胞成型的具体步骤为：
步骤301、细胞培养皿在恒温恒湿培养箱培养48小时后，打开细胞培养皿，整体下推翘动杆使得翘动杆转动上顶培养皿，将双层附着环从培养液中取出；
步骤302、利用镊子夹持双层附着环并将双层附着环转移至含有少量普通DMEM培养基的临时皿中；
步骤303、给5-6周龄待移植裸鼠予以5％水合氯醛腹腔麻醉；
步骤304、用剪刀纵行剪开裸鼠大腿远端外侧皮肤选定建模处，以镊子和尖刀分开大腿股骨远端外侧肌肉，显露股骨远端外侧面，尖刀刮除部分骨皮质，至显露出部分骨髓腔；
步骤305、用镊子侧向钩取临时皿中的1个双层附着环，转动双层附着环中的内细胞环使得内细胞环的培养凹槽与外细胞环的培养凹槽位于两个平面，将双层附着环移植到建模处，将建模处两侧肌肉和皮肤拉拢缝合，待裸鼠麻醉苏醒，放回饲养笼，观察肿瘤细胞在裸鼠内的生长情况。
5.根据权利要求4所述的一种标准化肿瘤动物模型的培养装置，其特征在于，观察肿瘤细胞在裸鼠内的生长情况的具体步骤为：
术后一周开始观察裸鼠建模处的肿块大小及变化，绘制肿瘤生长曲线，术后2周行活体成像观察成瘤情况；
术后4周处死小鼠，取股骨肿瘤组织行微型CT检查和病例切片观察肿块大小和骨质破坏情况验证肿瘤组织，取肺组织行病理切片观察转移瘤情况验证恶性肿瘤的转移特性。
6.根据权利要求1所述的一种标准化肿瘤动物模型的培养装置，其特征在于，所述上密封盖板(2)的侧周曲面的外表面正对所述翘动杆(4)的位置设有切割平面(8)，所述切割平面(8)上安装有框架板(9)，所述框架板(9)的板面活动安装有推拉齿轮(10)，所述框架板(9)与所述切割平面(8)之间设有移板(11)，所述推拉齿轮(10)驱动所述移板(11)上下移动以间接推动所述翘动杆(4)绕铰接点转动。
7.根据权利要求6所述的一种标准化肿瘤动物模型的培养装置，其特征在于，所述翘动杆(4)在所述上密封盖板(2)的所述移板(11)上下推动作用下绕铰接点转动，所述翘动杆(4)共同将所述载位板(12)顶起后取出所述双层附着环(13)，相邻两个所述翘动杆(4)间隔转动对所述载位板(12)施加不平衡作用力，所述载位板(12)倾斜后所述双层附着环(13)上的瘤细胞沿着下斜方向生长间接实现瘤细胞数目的均一化处理。
8.根据权利要求7所述的一种标准化肿瘤动物模型的培养装置，其特征在于，所述双层附着环(13)包括外细胞环(131)和内细胞环(132)，所述内细胞环(132)的外侧边通过沿着其直径分布的转动杆(133)安插在所述外细胞环(131)的内侧边，所述外细胞环(131)、所述内细胞环(132)的中心线以及所述外细胞环(131)的侧曲面上均设有供癌细胞繁殖培养的培育凹槽(134)。
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