CN111686100B

CN111686100B - CQMU152在制备治疗Th17细胞介导自身免疫病药物中的应用

Info

Publication number: CN111686100B
Application number: CN202010513994.2A
Authority: CN
Inventors: 侯胜平; 谭珺; 刘焕
Original assignee: First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University
Priority date: 2020-06-08
Filing date: 2020-06-08
Publication date: 2021-08-17
Anticipated expiration: 2040-06-08
Also published as: CN111686100A

Abstract

本发明涉及一种乙基3‑(4‑(2‑苯甲酰胺基‑4‑(甲硫基)丁酰胺基)苯基)丙烯酸乙酯在制备治疗Th17细胞介导自身免疫病药物中的应用。本发明从Chembridge化合物库中筛选得到化合物，经实验表明：所述化合物在体外具有抑制Th17细胞分化的作用；在体内可以抑制Th17细胞的分化及IL‑17的产生，并减轻Th17细胞介导的实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)、实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、1型糖尿病等自身免疫病的临床症状，具有良好的应用前景。

Description

CQMU152在制备治疗Th17细胞介导自身免疫病药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，特别涉及一种乙基3-(4-(2-苯甲酰胺基-4-(甲硫基)丁酰胺基)苯基)丙烯酸乙酯(命名简称CQMU152)在制备治疗Th17细胞介导自身免疫病药物中的应用。

背景技术

作为Th细胞发现的第三个子集，Th17细胞是有效的组织炎症诱导细胞，参与了许多炎症和自身免疫性疾病的发病机制。Th17细胞不仅在宿主防御细菌和真菌感染方面发挥着重要作用，也在许多免疫相关疾病中发挥着重要作用，包括葡萄膜炎、银屑病、类风湿关节炎、多发性硬化症、炎性肠病和哮喘/气道炎症性疾病等。抗IL-17已被证明对多种人类疾病有良好的治疗效果。

在Th17细胞中，IL-17转录受Th17特异性转录调节因子RORγt调控。RORγt是一种配体依赖的转录因子，属于核激素受体超家族。目前非甾体类小分子RORγt反向激动剂的发现已成为治疗Th17介导的自身免疫性疾病的热门研究领域之一。其中，地高辛和熊果酸，作为两种天然产物，均通过选择性抑制RORγt来抑制IL-17的产生。但是，地高辛具有致癌和毒性副作用；熊果酸还可作用于RORγt以外的其他靶点如糖皮质激素受体等。因此，需要进一步的研究来寻找更加特异性的RORγt反向激动剂。

发明内容

本发明的目的是提供乙基3-(4-(2-苯甲酰胺基-4-(甲硫基)丁酰胺基)苯基)丙烯酸乙酯在制备治疗Th17细胞介导的自身免疫病的用途。经实验表明：CQMU152在体外具有抑制Th17细胞分化的作用；在体内可以抑制Th17细胞的分化及IL-17的产生，并减轻Th17细胞介导的实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)、实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)或1型糖尿病等自身免疫病的临床症状，具有良好的应用前景。

本发明所述的Th17细胞介导自身免疫病为葡萄膜炎症，或所述Th17细胞介导自身免疫病为1型糖尿病，或所述Th17细胞介导自身免疫病为脑脊髓炎。

用乙基3-(4-(2-苯甲酰胺基-4-(甲硫基)丁酰胺基)苯基)丙烯酸乙酯制备的药物以注射剂或输液剂给药。

用乙基3-(4-(2-苯甲酰胺基-4-(甲硫基)丁酰胺基)苯基)丙烯酸乙酯制备的药物用药量为每公斤体重每天20-50mg。

本发明所述的乙基3-(4-(2-苯甲酰胺基-4-(甲硫基)丁酰胺基)苯基)丙烯酸乙酯，英文名称为：

ethyl 3-(4-(2-benzamido-4-(methylthio)butanamido)phenyl)acrylate，分子式为：C₂₃H₂₆N₂O₄S，分子量为426.53，结构式为：

其类似物及衍生物也有类似性能。

本发明以RORγt为靶点，用乙基3-(4-(2-苯甲酰胺基-4-(甲硫基)丁酰胺基)苯基)丙烯酸乙酯，进行体外和体内验证。

申请人的实验验证，乙基3-(4-(2-苯甲酰胺基-4-(甲硫基)丁酰胺基)苯基)丙烯酸乙酯体在体外具有抑制Th17细胞分化的作用；在体内可以抑制Th17细胞的分化及IL-17的产生，并减轻Th17细胞介导的自身免疫病如实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)、实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、1型糖尿病的临床症状，并且靶点明确，毒副反应小，可用于制备治疗Th17细胞介导自身免疫病的药物。

附图说明

图1为Th17细胞流式比例结果图，其中，Control组表示未干预，CQMU152表示化合物干预后的流式结果；

图2为化合物的双荧光素酶计算结果，图中，纯黑柱表示空白组，横条纹表示DMSO对照组，竖条纹表示化合物干预组；

图3为化合物体内干预后EAU小鼠的临床及病理评分结果，图中，圆点表示空白组，方块表示安慰剂组，三角形表示化合物干预组；

图4为化合物干预后EAU小鼠的脾脏Th17细胞比例结果，图中，圆点表示空白组，方块表示安慰剂组，三角形表示化合物干预组；

图5为化合物干预后EAE小鼠的临床及病理评分结果，图中，圆点表示空白组，方块表示安慰剂组，三角形表示化合物干预组；

图6为两种化合物干预后1型糖尿病小鼠的进食量，饮水量及造模后第7天糖尿病发病率，图中，圆点表示空白组，方块表示安慰剂组，三角形表示化合物干预组；纯黑柱表示空白组，横条纹表示安慰剂组，竖条纹表示化合物干预组。

具体实施方式

本发明实施例涉及的试剂、细胞、仪器：

实施例1乙基3-(4-(2-苯甲酰胺基-4-(甲硫基)丁酰胺基)苯基)丙烯酸乙酯体外抑制初始CD4⁺T细胞向Th17细胞分化结果

1.实验方法：

1)小鼠处死后75％乙醇浸泡，超净台内解剖分离出脾脏至滤网。

2)用5ml注射器橡胶头研磨后用PBS冲洗过滤。收集过滤液至15ml离心管。

3)以350*g离心力在4℃下离心10分钟，弃上清，加入细胞体积5倍量的红细胞裂解液，轻轻吹散后，放置2分钟，再以350*g的离心力在4℃下离心5分钟，弃上清。

4)加入与红细胞裂解液同等量的冷PBS，轻轻吹散后，以350*g的离心力在4℃下离心2分钟，弃上清，计数，并重复清洗一次。

5)避光操作，按照Miltenyi的小鼠naive CD4⁺T细胞分离试剂盒的说明书步骤分离初始T细胞计数，按每孔0.5*10^6个细胞量种于用小鼠抗CD3和小鼠抗CD28包被的24孔板中，加入IL-1β(20ng/ml)，IL-6(25ng/ml)，IL-23(20ng/ml)，TGF-β(3ng/ml)诱导分化Th17细胞，并同时加入化合物干预。培养3天后收集细胞进行Th17细胞流式检测。

2.实验结果：两种化合物均可以在体外稳定抑制初始CD4⁺T细胞向Th17细胞的分化，抑制率达50％以上。结果参见图1。

实施例2乙基3-(4-(2-苯甲酰胺基-4-(甲硫基)丁酰胺基)苯基)丙烯酸乙酯与靶点RORγt的结合测试结果

1.实验方法：

采取双荧光素酶的方法(Yang X O,et al.T helper 17 lineagedifferentiation is programmed by orphan nuclear receptors ROR alpha and RORgamma.Immunity 28,29-39(2008))，构建RORγt过表达质粒及IL-17启动子报告质粒。分未加报告基因的空载组，报告基因+RORγt过表达质粒+DMSO的对照组及报告基因+RORγt过表达质粒+化合物干扰的实验组三组，将质粒转导如293T工程细胞中。16小时后换液加入DMSO/化合物干扰。表达2天。

48小时后按照promega的双荧光素酶检测试剂盒步骤裂解细胞，检测萤火虫及海肾荧光值，进行计算统计。

2.实验结果：CQMU152被证明以RORγt为靶点。结果参见图2。

实施例3乙基3-(4-(2-苯甲酰胺基-4-(甲硫基)丁酰胺基)苯基)丙烯酸乙酯体内对小鼠EAU的疾病严重程度的影响

1.实验方法：

抗原制备：用微量天平称取5mg的IRBP_651-670粉末盛放于EP管中，用移液器在盛装IRBP的EP管中加入含有2％DMSO的1ml无菌PBS，于振荡器上震荡加速溶解，随后在转速离心器上以3000r/min离心30s以排出管内气泡，配制成浓度为5mg/ml的IRBP溶液，置于4℃保存备用。

用戊巴比妥钠麻醉20只小鼠,将100ul(即500ng)IRBP溶液(5mg/ml)与100ul含5mg/ml结核分枝杆菌的完全弗氏佐剂通过无菌三通管连接后充分混匀成白色乳剂后，再用以上总体积200ul的混液分别在每只小鼠的颈背部，双侧腋窝，双侧大腿和尾根部行皮下注射。随后腹腔注射溶于200ul无菌PBS的1ug百日咳毒素。

造模后第9天，在裂隙灯下观察小鼠的前房情况，观察到有早期前房症状(睫状出血、结膜充血等)出现的小鼠标记为造模成功鼠，未出现症状小鼠则淘汰。将造模成功鼠随机分为空白组(5只)，安慰剂组(6只)，化合物处理组(6只)。然后对化合物处理组小鼠分别腹腔注射25mg/kg化合物(溶解在DMSO中，用30％PEG300+1％Tween-80+ddH₂O稀释后使用)。安慰剂组小鼠用同比例不含化合物的稀释溶剂腹腔注射同等量液体。连续注射5天。

2.实验结果：CQMU152降低了EAU小鼠的临床及病理评分，起到减轻疾病严重程度的作用。结果参见图3。

实施例4乙基3-(4-(2-苯甲酰胺基-4-(甲硫基)丁酰胺基)苯基)丙烯酸乙酯体内对Th17细胞分化的影响结果

1.实验方法：

15只小鼠造模后第14天处死，75％乙醇浸泡，超净台内解剖分离出脾脏至滤网。

用5ml注射器橡胶头研磨后用PBS冲洗过滤。收集过滤液至15ml离心管。

以350*g离心力在4℃下离心10分钟，弃上清，加入估算细胞体积5倍量的红细胞裂解液，轻轻吹散后，放置2分钟，再以350*g的离心力在4℃下离心5分钟，弃上清。

加入与红细胞裂解液同等量的冷PBS，轻轻吹散后，以350*g的离心力在4℃下离心2分钟，弃上清，计数，并重复清洗一次。

每一只小鼠取1*10^6个细胞进行Th17流式检测。

2.实验结果：CQMU152在体内用药后，检测脾脏Th17细胞流式结果发现与体外结果相同地，也能抑制体内Th17细胞的分化。结果参见图4。

实施例5乙基3-(4-(2-苯甲酰胺基-4-(甲硫基)丁酰胺基)苯基)丙烯酸乙酯体内对小鼠EAE的疾病严重程度的影响

1.实验方法：

抗原制备：用微量天平称取2mg的MOG_35-55粉末盛放于EP管中，用移液器在盛装MOG的EP管中加入含有2％DMSO的1ml无菌PBS，于振荡器上震荡加速溶解，随后在转速离心器上以3000r/min离心30s以排出管内气泡，配制成浓度为2mg/ml的IRBP溶液，置于4℃保存备用。

用戊巴比妥钠麻醉20只小鼠,将100μl(即200ng)MOG溶液(2mg/ml)与100ul含5mg/ml结核分枝杆菌的完全弗氏佐剂通过无菌三通管连接后充分混匀成白色乳剂后，再用以上总体积200ul的混液分别在每只小鼠的双侧颈背部，双侧腹股沟行皮下注射。随后腹腔注射溶于200ul无菌PBS的200ng百日咳毒素。

造模后第13天，观察小鼠的尾巴及四肢情况，观察到有早期症状(尾无力，后肢瘫痪等)出现的小鼠标记为造模成功鼠，未出现症状小鼠则淘汰。将造模成功鼠随机分为空白组(4只)，安慰剂组(4只),化合物处理组(4只)。然后对化合物处理组小鼠分别腹腔注射25mg/kg化合物(溶解在DMSO中，用30％PEG300+1％Tween-80+ddH₂O稀释后使用)。安慰剂组小鼠用同比例不含化合物的稀释溶剂腹腔注射同等量液体。连续注射5天。

2.实验结果：CQMU152均可以降低EAE小鼠的临床及病理评分，减轻疾病的严重程度。结果参见图5。

实施例6乙基3-(4-(2-苯甲酰胺基-4-(甲硫基)丁酰胺基)苯基)丙烯酸乙酯体内减轻小鼠1型糖尿病的疾病严重程度

1.实验方法：

18只小鼠禁食12小时后，现配STZ溶液造模(避光，冰上保存)。配制0.1mol/L的柠檬酸钠缓冲液，将STZ粉末溶于其中，配成10mg/ml的STZ溶液，并无菌过滤。

小鼠称重后，以200mg/kg量快推STZ溶液。观察2小时后，以5％葡萄糖水以1g/kg量灌胃。观察7天。

将小鼠随机分为空白组(6只)，安慰剂组(6只)，化合物处理组(6只)，在造模前1天及造模后第2-4天对化合物处理组小鼠分别腹腔注射25mg/kg化合物(溶解在DMSO中，用30％PEG300+1％Tween-80+ddH₂O稀释后使用)。安慰剂组小鼠用同比例不含化合物的稀释溶剂腹腔注射同等量液体。

2.实验结果：CQMU152减轻了1型糖尿病小鼠的多饮多食等临床症状。

结论：乙基3-(4-(2-苯甲酰胺基-4-(甲硫基)丁酰胺基)苯基)丙烯酸乙酯在体内外都能抑制Th17细胞的分化，并能减轻Th17细胞介导的自身免疫病的严重程度。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围。如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或同等替换的，均应涵盖在本发明的权利要求的保护范围中。

Claims

1.一种乙基3-（4-（2-苯甲酰胺基-4-（甲硫基）丁酰胺基）苯基）丙烯酸乙酯在制备治疗Th17细胞介导自身免疫病药物中的应用，所述Th17细胞介导自身免疫病为葡萄膜炎症。

2.乙基3-（4-（2-苯甲酰胺基-4-（甲硫基）丁酰胺基）苯基）丙烯酸乙酯在制备治疗Th17细胞介导自身免疫病为1型糖尿病药物中的应用。

3.乙基3-（4-（2-苯甲酰胺基-4-（甲硫基）丁酰胺基）苯基）丙烯酸乙酯在制备治疗Th17细胞介导自身免疫病为脑脊髓炎药物中的应用。

4.权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于：所述药物以注射剂或输液剂给药。

5.权利要求4述的应用，其特征在于：所述药物用药量为每公斤体重每天20-50mg。