CN104337819B - 白桦脂酸衍生物在制备抑制t细胞分化的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了白桦脂酸衍生物在制备抑制T细胞分化、缓解炎症、缓解骨损伤的药物中的应用。本发明BA及其衍生物能抑制T细胞分化，在自身免疫性疾病中具抗炎效果而缓解炎症，可用于制备治疗自身免疫性疾病如类风湿性关节炎和实验性脑脊髓炎等疾病的药物。

Description

白桦脂酸衍生物在制备抑制T细胞分化的药物中的应用

技术领域

本发明属于药物应用技术领域，具体涉及白桦脂酸衍生物在制备抑制T细胞分化的药物中的应用。

背景技术

自身免疫性疾病是一种机体对自身抗原发生免疫反应进而引起自身组织受损所引起的一种疾病。根据功能障碍范围可分为器官特异性自身免疫性疾病和系统性自身免疫性疾病，器官特异性自身免疫性疾病包括多发性硬化、胰岛素依赖型糖尿病等，它的功能障碍仅限于某一器官；系统性自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎、系统性多斑狼疮等，最终会造成多个器官受损。

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)，是一种慢性的系统性自身免疫疾病。它的主要表现为炎性滑膜炎，由炎症所引起的关节红肿、疼痛和僵直，进而对关节造成破坏。类风湿性关节炎的发生率为全世界人口的1％，通常发生在25-55岁的人群中而且女性发病率明显高于。在美国，大约有150万人患有RA，而且这个数据还在增加，直接或间接用于治疗RA的花费估算就要200亿美元左右。而针对RA的治疗，最初主要采用类固醇类药物和抗类风湿的药物DMARDs，如甲氨蝶呤MTX等。目前，采用一些生物制剂来抑制TNF这条信号通路(抗TNF抗体)已被认为是更有效的治疗手段。虽然这种生物制剂治疗可以减慢疾病的进程、减少炎症和改善关节炎的症状，但是它的花费是传统药物MTX的300倍左右。所以开发更多高效简便的治疗药物是很有必要的。

胶原诱导的关节炎(Collagen-induced arthritis，CIA)具有与人类RA相似的免疫以及病理学特征，作为研究人类RA的动物模型已经被广泛的应用于研究RA的发病机理、寻找新的药物靶点以及治疗RA新型药物的开发。CIA是以特异性致敏的CD4⁺T细胞介导为主的，一种炎性细胞浸入关节腔并分泌大量的炎性细胞因子从而造成关节软骨和骨损伤的自身免疫性疾病。用于诱导实验性关节炎的主要抗原有完全弗氏佐剂(CFA)、卵蛋白、II型胶原(CII)、朴日斯烷(PLA)、辅剂(IFA)、二甲基双十八烷基铵(DDA)溴化物、链球菌、蛋白多糖和软骨低聚体基质蛋白(COMP)等。而CIA作为一种抗原诱导关节炎的发生是比较常见的动物模型，首先是Trentham等首次发现50％的RA患者血清中存在有抗II型胶原的自身抗体。Foidart等则报道，多发性软骨炎患者体内具有抗天然II型胶原的抗体。这些现象提示II型胶原可诱导体内产生关节炎性质的自身免疫反应。在CIA的研究中发现II型胶原免疫小鼠或者大鼠能够模拟多种类型的RA临床病程，现在II型胶原已被广泛应用于诱导CIA模型。

多发性硬化(Multiple Sclerosis，MS)是一种中枢神经系统慢性自身免疫疾病。它的主要特点是炎症、脱髓鞘和轴突缺失。在西方MS是造成青壮年神经性残疾中仅次于外伤的第二大因素，通常发生在20-40岁的青壮年中而且女性发病率明显高于男性。MS病人会经历多种的神经病学的症状和体征，包括感觉的灵敏度改变、刺痛和四肢麻痹(感觉迟钝或感觉异常)、肌无力、抽筋、肌肉痉挛或者行动困难；协调和平衡能力差；说话、吞咽困难。MS患者在初次发病后会有明显的缓解，但是容易复发。多次复发后会导致患者运动障碍，甚至是瘫痪，大大影响了患者的生活质量。目前治疗MS的药物主要是针对IFN-β信号通路，如Mitoxantrone和Natalizumab，但它们都有较严重的副作用。

实验性自身免疫脑脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis，EAE)具有与人类MS相似的免疫以及病理学特征，作为研究人类MS的动物模型已经被广泛的应用于研究MS的发病机理、寻找新的药物靶点以及治疗MS新型药物的开发。EAE是以特异性致敏的CD4⁺T细胞介导为主的，一种中枢神经系统内浸润单核细胞及髓磷脂鞘缺失为特点的自身免疫性疾病。用于诱导EAE的主要抗原有髓鞘碱性蛋白(MBP)、蛋白脂蛋白(PLP)、少突状胶质细胞糖蛋白(MOG)和髓磷脂相关糖蛋白等。虽然MOG在中枢神经系统髓磷脂鞘蛋白中只占0.01-0.05％，但由于它存在于少突状胶质细胞的最外层，因此具有很高免疫原性。在EAE的研究中发现MOG或其多肽片段免疫小鼠或者大鼠能够模拟多种类型的MS临床病程，而且作为唯一既能引起脱髓鞘反应又能引起T细胞反应的中枢神经系统髓鞘蛋白，现在被广泛应用于诱导EAE模型。

目前的研究中关于自身免疫性疾病的发生机制中有提到，T细胞的不平衡分化在发病过程中起着很重要的作用。T细胞在不同的细胞因子的作用下向不同的T细胞亚群(Th1、Th2、Th17和Treg)分化，而Th17细胞的分化在自身免疫性疾病的发生发展中起着非常重要的作用。由Th17所分泌的细胞因子IL-17可以和RANKL\M-CSF共同作用诱导破骨细胞的分化，另外，IL-17作为一类促炎性细胞因子可以促进炎症反应，加快自身免疫性疾病的进程。因此，针对IL-17信号通路来开发自身免疫性疾病药物可能具有较好的前景。

发明内容

本发明提出了如式(1)、式(2)、式(3)、式(4)所示的白桦脂酸衍生物在制备抑制T细胞分化的药物的应用。

本发明还提出了如式(1)、式(2)、式(3)、式(4)所示的白桦脂酸衍生物在制备缓解炎症的药物中的应用。

本发明还提出了如式(1)、式(2)、式(3)、式(4)所示的白桦脂酸衍生物在制备缓解骨损伤的药物中的应用。

本发明中，所述抑制T细胞分化的药物抑制促炎性细胞因子的产生。

本发明中，所述抑制T细胞分化的药物抑制促炎性细胞因子的分泌而上调调节性细胞因子的分泌，并调控T细胞的平衡。

本发明中，所述抑制T细胞分化的药物用于治疗的自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎、胶原诱导的关节炎、多发性硬化、实验性脑脊髓炎。

本发明中，所述抑制T细胞分化的药物作为自身免疫性疾病药物单独使用，或与其他药物联合使用。

本发明中，所述抑制T细胞分化维持T细胞的平衡。

本发明中，所述抑制破骨细胞分化药物可抑制生理病变组织中破骨细胞活化和功能。

本发明中，所述药物用于预防和/或治疗实验性脑脊髓炎、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病。

本发明中，BA及其衍生物既可作为抗炎药物：抗实验性脑脊髓炎和类风湿性关节炎等药物单独使用，也可以和其他药物联合使用。

白桦脂酸属于三萜类的化合物，本发明通过筛选发现将BA的结构式在五环三萜的最左侧引入了一个吡唑环，如，XJ479，改善了化合物的理化性质，一方面增加了它的水溶性，另一方面也增加了化合物抑制T细胞分化的能力。本发明中，式(1)所示的白桦脂酸衍生物(XJ479)与通常白桦脂酸在结构上的区别，见以下：

本发明通过两种小鼠自身免疫性疾病模型，胶原诱导的关节炎模型(Collagen-induced arthritis，CIA)和实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmuneencephalomyelitis，EAE)来分别模拟类风湿性关节炎和多发性硬化症，发现该化合物能很好的缓解和改善炎症和疾病严重程度的治疗效果，本发明药物可用于包括类风湿性关节炎和多发性硬化症在内的自身免疫性疾病的治疗。

本发明的实验表明，BA及其衍生物能够抑制T细胞分化，也能够显著地抑制自身免疫疾病模型：EAE和CIA模型的缓解。同时研究发现，它们还可以缓解CIA小鼠的骨损伤。并且，本发明发现BA及其衍生物主要是通过抑制JAK-STAT这条信号通路来平衡T细胞的平衡。本发明涉及BA及其衍生物在制备抑制自身免疫疾病模型如胶原诱导的关节炎模型(Collagen-induced arthritis，CIA)和实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimentalautoimmune encephalomyelitis，EAE)中的功能研究，可用于制备治疗自身免疫性疾病如类风湿性关节炎和实验性脑脊髓炎等疾病的药物。

附图说明

图1表明实施例1的本发明BA衍生物抑制MOG特异性T细胞的增殖、抑制IL-17的表达。其中，图1A是白桦脂酸衍生物XJ479对MOG_35-55特异性T细胞增殖的抑制效果；图1B是XJ479对细胞因子IL-17的表达的抑制效果。

图2表明实施例2的本发明BA衍生物XJ479有效缓解CIA发病进程，降低关节病患部位炎性细胞的浸润，关节软骨和骨的损伤。其中，图2A是白桦脂酸衍生物XJ479对小鼠CIA发病临床评分的影响，图2B是XJ479对CIA发病小鼠脚掌厚度的影响，图2C是XJ479对CIA发病小鼠诱导率的影响，图2D是XJ479对小鼠骨损伤的改善效果，图2E是XJ479对炎性细胞的侵润和软骨损伤的改善效果。

图3表明实施例3的本发明BA衍生物XJ479有效缓解EAE发病，减少中枢神经系统炎性细胞的浸润。其中，图3A结果显示XJ479能预防小鼠EAE的发病，图3B结果显示XJ479能治疗小鼠EAE的发病。图3C是XJ479对炎性细胞侵润起到了改善效果。

图4表明实施例4的在CIA小鼠模型中本发明XJ479对正常小鼠和发病小鼠中的毒性实验及XJ479抑制II型胶特异性T细胞的增殖。其中，图4A是XJ479对正常小鼠脾淋巴细胞的活性实验，图4B是XJ479对CIA小鼠脾淋巴细胞的活性实验，图4C是XJ479对II型胶原特异性淋巴细胞增殖的抑制作用。

图5表明实施例5的本发明XJ479在小鼠体内的毒性试验检测及XJ479可以浓度梯度的抑制MOG特异性T细胞的增殖。其中，图5A是XJ479对小鼠体重影响，图5B是XJ479对MOG特异性淋巴细胞增殖的抑制作用。

图6表明实施例6中CIA小鼠中给予本发明XJ479后对T细胞因子的表达及分泌上的影响。其中，图6A是XJ479对IL17A、IL17F、IL22、RORα、RORγt相对RNA表达水平的影响，图6B是XJ479对IL10、FOXP3相对RNA表达水平的影响，图6C是XJ479对IL4、IL3相对RNA表达水平的影响，图6D是XJ479对细胞因子IL10、IL17A表达的影响。

图7表明实施例7的本发明XJ479能降低EAE小鼠中炎性细胞因子的释放，而促进调节性细胞因子的产生。其中，图7A是XJ479对IL4、IL5、IL13、IL10、FOXP3相对RNA表达水平的影响，图7B是XJ479对IL17A、IL17F、IL22、RORγt、RORα相对RNA表达水平的影响，图7C是XJ479对细胞因子IL6、IFN-γ、IL17表达的影响。

图8表明实施例8的本发明BA衍生物XJ479抑制促炎性T细胞的分化。

图9表明实施例9的本发明BA衍生物XJ479对JAK/STAT和NF-kB信号通路的调节作用。其中，图9A是XJ479对JAK2和STAT3蛋白表达的影响，图9B是XJ479对STAT3表达的影响，图9C是XJ479对STAT3入核的影响，图9D是XJ479抑制STAT5，STAT3磷酸化，且抑制RORγt的表达，图9E是XJ479分别对DNA与STAT5、STAT3蛋白结合的影响。

以上各附图中，数据取平均值并加了标准差表示。两组之间比较采用Student t-test检验，当P＜0.05时具有统计学差异(*)，P＜0.01时为显著性统计学差异(**)，P＜0.001时为极显著性统计学差异(***)。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

本发明通过初步细胞模型筛选，从50种白桦脂酸(BA)的衍生物中通过MOG特异性T细胞的增殖及II型胶原特异性T细胞的增殖实验筛选到了4种能够显著抑制T细胞增殖的小分子化合物它们分别是XJ479(即本发明的式(1)白桦脂酸)、XJ482(即本发明的式(2)白桦脂酸)、XJ491(即本发明的式(3)白桦脂酸)和XJ551(即本发明的式(4)白桦脂酸)。本发明人分别用这四种小分子化合物检测对Th17细胞分泌的细胞因子IL-17的表达的影响，得到了XJ479和XJ551能有很好的抑制IL-17分泌的效果。进而我们选定XJ479和XJ551进行动物模型治疗的研究。最后确定XJ479对CIA和EAE部有较好的治疗效果。一方面XJ479属于五环三萜类化合物有显著地抗炎活性，提出了BA及其衍生物在制备抑制破骨细胞分化以及T细胞分化改善疾病的药物中的用途；另一方面XJ479对破骨细胞的分化有很明显的抑制。本发明经过体内破骨细胞分化的细胞模型验证和动物实验等，通过多种分子生物学手段，提出BA及其衍生物对于破骨细胞分化抑制效果的实验证据和改善实验动物小鼠的骨损伤的应用。本发明首次创新提出了BA及其衍生物在制备抑制T细胞分化及改善炎症严重程度等相关自身免疫性疾病的治疗和/或预防药物中的应用，包括在制备实验性脑脊髓炎和类风湿性关节炎等免疫调节异常疾病的治疗和/或预防药物中的应用。

实施例1：药物筛选

MTT全称为3-(4，5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3，5-di-phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名噻唑蓝，是一种黄颜色的染料。MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法，其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中。

方法：

(1)将2.5×10⁵脾脏淋巴细胞100μl接到96孔板中，每组设置3个复孔。

(2)体外加入MOG_35-55刺激(设置空白对照)终浓度为20μg/ml，加入不同浓度的药物。

(3)将细胞至于37℃，5％CO2培养箱中培养72小时。

(4)每孔加入20μl MTS，放入37℃，5％CO2培养箱中2-3个小时。

(5)用MDS M190酶标仪在波长490nm读数。

结果与评价：用MTS的方法检测MOG_35-55特异性T细胞的增殖，分离从EAE小鼠脾脏淋巴细胞在体外用MOG(20μg/ml)刺激48h。用不同浓度的BA和BA的衍生物处理48h。结果所示，式(1)所示的白桦脂酸衍生物XJ479和式(4)所示的XJ551在10μM时对MOG_35-55特异性增殖有明显的抑制作用(如图1A所示)。PCR进一步检测了BA的衍生物对IL-17分泌的影响，发现XJ479和XJ551有较好的抑制IL-17分泌的效果(如图1B所示)。同样地，通过本实施例方法得出本发明白桦脂酸衍生物的其他化合物，例如，如式(2)所示的XJ482、如式(3)所示的XJ491，具有对MOG_35-55特异性增殖有明显的抑制作用，以及具有较好的抑制IL-17分泌的效果，如图1A、1B所示。

同样地，在以下实施例2-9中，本发明白桦脂酸衍生物XJ482、XJ491、XJ551均具有与XJ479相同的效果。

实施例2：在CIA中给予XJ479可以缓解其发病的严重程度

原理：体内动物实验给予式(1)所示的白桦脂酸衍生物XJ479缓解CIA发病(炎症反应、软骨和骨损伤)

方法：雄性DBA/1J小鼠(6-8周)注射乳化完全的CII诱导CIA模型。设置三个组，每组小鼠为8只，除正常组小鼠外，所有小鼠皮下注射剂量100μg/只的抗原CII。免疫当天为第0天，第21天后进行二次免疫，第23天腹腔注射给予XJ479(20mg/kg/day，溶于50μl DMSO)，采用，相应对照组注射等量的50μl的DMSO。并且从第22天开始观察小鼠，记录小鼠发病的严重程度和小鼠关节肿胀程度。待小鼠达到发病高峰期后取材，麻醉后对不同组的小鼠后肢进行X-Ray拍照，关节切片TRAP染色检测小鼠的骨损伤情况。

结果与评价：结果见图2示，数据统计结果表明无论是临床评分、发病率和小鼠关节的肿胀程度，给药组较对照组在疾病的严重程度上都得到了明显的改善，如图2A、B和C所示，其中，图2A是白桦脂酸衍生物XJ479对小鼠CIA发病临床评分的影响，图2B是XJ479对CIA发病小鼠脚掌厚度的影响，图2C是XJ479对CIA发病小鼠诱导率的影响，图中横坐标为天数。XJ479处理组在发病高峰期第41天时的临床评分平均分值为1.5分，而Control组则为6.5分。图2D表示XJ479对小鼠骨损伤的改善效果，X-ray拍照观察骨损伤情况及小鼠后肢切片后进行TRAP染色的结果显示XJ479对骨损伤有很好的改善作用。图2E是XJ479对炎性细胞的侵润和软骨损伤的改善效果，HE染色的结果和番红O染色结果显示给予XJ479可以减少炎性细胞的侵润和软骨的损伤。

实施例3：在EAE中给予XJ479可以缓解其发病的严重程度

原理：体内动物实验给予式(1)所示的白桦脂酸衍生物XJ479缓解EAE发病(中枢神经系统中炎性细胞的侵润和缓解炎症反应)

方法：制备1)完全弗氏佐剂，向不完全弗氏佐剂中加入热灭活的结核分支杆菌(H37RA)使其终浓度为5mg/ml，充分混匀。2)MOG多肽：用1×PBS(PH7.2)溶解MOG，配成终浓度为3mg/ml。3)百日咳毒素(PTX)：用1×PBS(PH7.2)+50mM NaCl溶解PTX，配成终浓度。然后乳化抗原，将完全弗氏佐剂装入一只乳化管，套上三通阀。将等体积的溶解的MOG放入另一只乳化管，排除空气后和带有三通阀的完全弗氏佐剂对接，拧紧。在冰上来回推动1000次，将管中成分充分混匀成乳化状态。用冷水检验，将乳化后的抗原滴一滴于冷水上，静置观察抗原向四周呈网状慢速扩散即为乳化合格。

然后用雌性C57小鼠(10-12周)注射乳化完全的MOG诱导EAE模型。设置三个组，每组小鼠为10只(n＝10)。第0天，在每只小鼠背部两点进行皮下注射免疫，每点100μl。免疫后两小时之后腹腔注射PTX(4μg/ml)100μl/只。24小时之后再次给予PTX(4μg/ml)每只100μl。从第7天起每天观察小鼠，评分，记录小鼠发病的严重程度。待小鼠达到发病高峰期后取材，进行中枢神经系统切片染色。其中，在图3A中，从第一次注射MOG的前三天开始给药XJ479(20mg/kg/day)，如图三角形箭头所指，本组实验为预防EAE的发病实验。而在图3B中，在第七天时待小鼠已开始发生EAE时才开始给药XJ479(20mg/kg/day)，如图三角形箭头所指，因此，本组实验为治疗EAE的实验。

结果与评价：结果见图3示，图3A显示XJ479能预防小鼠EAE的发病，图3B显示XJ479能治疗小鼠EAE的发病，数据统计结果表明从临床评分看给药组较对照组在疾病的严重程度上部得到了明显的改善。图3C是XJ479对炎性细胞侵润起到了改善效果，HE染色的结果和Luxol fast blue染色结果显示给予XJ479可以减少炎性细胞的侵润。

实施例4：白桦脂酸衍生物XJ479的毒性试验及抑制II型胶原特异性淋巴细胞的增殖

原理：II型胶原和MOG特异性T细胞的激活和增殖是CIA和EAE的发病的必要条件。在CIA模型的建立过程中，我们在第0天以II型胶原作为一种抗原对小鼠在进行了第一次免疫以后体内会产生记忆T细胞，这些记忆T细胞在小鼠被给予第二次免疫以后会被大量的激活。前一阶段中，一方面当外来抗原进入机体后，有抗原递呈细胞DC捕获，传递给未分化的Th0细胞，并分泌大量的细胞因子使Th0细胞向不同的细胞亚群分化，如Th1、Th2、Th17和Treg等；另一方面，DC携带外来抗原传递给未成熟的B细胞，分泌IL-6、IL-10等使B细胞分化为浆细胞从而产生抗CII特异性的抗体来清除外来抗原，同时该过程也有很多趋化因子CXCL13、CCL21等的参与。这样，在体液免疫和细胞免疫的共同作用下，成熟的T细胞和B细胞产生的一些促炎性细胞因子和抗CII特异性的抗体共同作用于下游的一些靶细胞，如软骨细胞、破骨细胞、血管内皮细胞和滑膜成纤维细胞等。而T细胞中的TH17细胞分泌的IL-17和RANKL相互作用可以使破骨前体细胞分化发育为成熟的破骨细胞行使吃骨功能；巨噬细胞活化分泌的VEGF和bFGF作用于血管内皮细胞，使关节病患部位血管新生，为炎症反应的扩大加强从外界的营养供应。而关节软骨的主要成分为蛋白多糖和II型胶原，B细胞分化成熟后产生的抗II型胶原的抗体在清除外来抗原的同时也会将自身关节软骨中的II型胶原杀伤，从而造成了关节软骨处的病灶。而EAE模型主要是对中枢神经系统造成损伤，目前的研究中，EAE的发病过程中Th17在疾病的发生发展中也其着非常重要的作用。体内T细胞的平衡被打破是造成EAE发病的关键原因，主要是T细胞过度的向Th17的分化从而加大了促炎性细胞因子的分泌。

方法：从8-9周龄的正常的DBA/1J小鼠和诱导关节炎的小鼠中分离脾淋巴细胞：

取正常的DBA/1J小鼠和诱导类风湿性关节炎的小鼠的脾脏，用淋巴细胞分离液分离得到淋巴细胞，接板加入不同浓度的式(1)所示的白桦脂酸衍生物XJ479处理。于细胞培养箱中培养48h后MTS检测细胞活性，结果显示，无论是正常小鼠还是已经诱发关节炎的小鼠，J479的用药浓度在25μM以内没有明显的毒性。

CII特异性T细胞增殖和激活是CIA的发病的必要条件，我们检测了XJ479对CII特异性淋巴细胞增殖的影响，实验结果显示，当我们的II型胶原用量在20ug/ml的时候淋巴细胞的增殖效果最剧烈。在随后探究XJ479对淋巴细胞增殖影响的实验中显示XJ479能够浓度梯度的抑制II型胶原特异性淋巴细胞的增殖。

结果与评价：图4A是XJ479对正常小鼠脾淋巴细胞的活性实验，图4B是XJ479对CIA小鼠脾淋巴细胞的活性实验，图4C是XJ479对II型胶原特异性淋巴细胞增殖的抑制作用，根据图4实验结果显示，无论是在正常小鼠还是在CIA小鼠的脾淋巴细胞中，实验的结果显示XJ479没有明显的毒性。当II型胶原用量在20ug/ml时，XJ479能浓度梯度地抑制II型胶原特异性淋巴细胞的增殖。

实施例5：XJ479在EAE小鼠和给药组小鼠中的毒性及XJ479可以抑制MOG特异性T细胞的增殖

原理：MOG特异性T细胞的激活和增殖是EAE的发病的必要条件。

方法：从10-12周龄的EAE小鼠中分离脾淋巴细胞：

取EAE小鼠的脾脏，用淋巴细胞分离液分离得到淋巴细胞，加入MOG用量在20ug/ml刺激，并加入不同浓度的式(1)所示白桦脂酸衍生物XJ479处理。于细胞培养箱中培养48h后MTS检测细胞活性，结果显示XJ479能够浓度梯度的抑制MOG特异性淋巴细胞的增殖。

结果与评价：图5A是XJ479对小鼠体重影响，根据图5实验结果显示，在EAE组和给药组小鼠中，两组小鼠的体重没有很大的差异，结果表明XJ479没有明显毒性。图5B是XJ479对MOG特异性淋巴细胞增殖的抑制作用，且当MOG用量在20ug/ml时，XJ479能浓度梯度地抑制MOG特异性淋巴细胞的增殖。

实施例6：CIA小鼠中给予XJ479后对T细胞因子的表达及分泌上的影响。

原理：不同的T细胞亚群会分泌出不同的T细胞因子，有促炎性的细胞因子，它们可使炎症反应加剧，而一些调节性的细胞因子则对疾病有一定的调节和保护作用。

方法：体外将小鼠的脾淋巴细胞接板于6cm的皿中(约1×10⁷个细胞/皿)，体外加入20ug/ml的CII进行刺激并加入不同浓度的药物处理后收集RNA样进行相关marker的检测；同时收集血清进行相关细胞因子的检测。

结果与评价：图6A是XJ479对IL17A、IL17F、IL22、RORα、RORγt相对RNA表达水平的影响，图6B是XJ479对IL10、FOXP3相对RNA表达水平的影响，图6C是XJ479对IL4、IL3相对RNA表达水平的影响，图6D是XJ479对细胞因子IL10、IL17A表达的影响。根据图6的结果显示在RNA中用Q-PCR的方法(图6A、B和C)和ELISA方法(图6D)检测细胞因子的表达，式(1)所示的白桦脂酸衍生物XJ479能抑制由Th17细胞分泌的细胞因子IL-17A和IL-17F的表达，而对调节性T细胞分泌的IL-10和IL-4则有一定程度的上调。

实施例7：XJ479能降低EAE小鼠中炎性细胞因子的释放，促进调节性细胞因子的产生。

原理：不同的T细胞亚群会分泌出不同的T细胞因子，有促炎性的细胞因子，它们可以使炎症反应加剧，一些调节性的细胞因子则对疾病有一定的调节和保护作用。

方法：体外将小鼠的脾淋巴细胞接板于6cm的皿中(约1×10⁷个细胞/皿)，体外加入20ug/ml的MOG进行刺激并加入不同浓度的药物处理后收集RNA样进行相关marker的检测；同时收集血清进行相关细胞因子的检测。

结果与评价：图7A是XJ479对IL4、IL5、IL13、IL10、FOXP3相对RNA表达水平的影响，图7B是XJ479对IL17A、IL17F、IL22、RORγt、RORα相对RNA表达水平的影响，图7C是XJ479对细胞因子IL6、IFN-γ、IL17表达的影响。根据图7的结果显示在RNA中用Q-PCR的方法(图7A和B)和ELISA方法(图7C)检测细胞因子的表达，式(1)所示的白桦脂酸衍生物XJ479能抑制由Th17细胞分泌的细胞因子IL-17A和IL-17F的表达，而对调节性T细胞分泌的IL-10和IL-4则有一定程度的上调。

实施例8：BA及其衍生物XJ479抑制促炎性T细胞的分化

原理：CIA和EAE发病主要是由于T细胞的不平衡所引起的，病态过程中T细胞过度的向Th17细胞分化而使由Th17细胞分泌的促炎性细胞因子IL-17的分泌大量增加。从而加剧了炎症反应过程。

方法：免疫磁珠法分离出CD4+细胞，铺板于48孔板1×10⁶个细胞1ml培养基后加入不同的诱导条件向不同的T细胞亚群分化，于37℃，5％的CO₂培养箱中分化3天。用胞内染色的方法检测Th1和Th17的分化情况。

结果与评价：结果见图8。实验结果如图8所示：体外分离出CD4+T细胞，加入不同的诱导因子向着不同的T细胞亚群分化，同时给予不同的药物浓度。结果显示，XJ479经BA改造后，对于促炎性的Th1和Th17细胞较BA有更好的抑制效果，在Th1细胞的分化中XJ479抑制率为50％，BA在相同的用药浓度下则没有明显的抑制效果；而在Th17细胞的分化中，BA在用药浓度为10uM时虽然也有50％的抑制效率，但是经BA改造后的XJ479抑制率已达到90％较Con组而言。结果表明式(1)所示的白桦脂酸衍生物XJ479比其母体化合物BA有更加明显抑制Th1和Th17细胞分化的作用。

实施例9：XJ479对JAK/STAT信号通路的调节作用

原理：细胞因子IL-6、IL-21和IL-23激活的JAK/STAT3信号通路主要是调控Th17细胞的分化，IL-2激活的JAK3/STAT5调控Treg细胞分化。CIA和EAE属于T细胞的失衡所引起的疾病。故此探究影响T细分化相关蛋白的表达情况。

方法：体外我们将小鼠脾脏淋巴细胞用淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞以后，接板于培养箱培养24小时收取蛋白样，采用WB的方法和免疫组化的方法检测启动T细胞活化的JAK、STAT蛋白表达情况。体内关节切片免疫组化染色检测与T细胞分化相关蛋白的表达。Chip assay分析STAT3、STAT5与下游IL-17的结合情况。将发病高峰期时，分离EAE小鼠脾脏淋巴细胞，体外加入MOG(20μg/ml)刺激，同时加入式(1)所示的白桦脂酸衍生物XJ479，24小时后收集细胞，进行体内和体外的chip实验分析。另外本发明还在分离了EAE组和给药组小鼠的脾脏淋巴细胞用EMSA的方法检测了p65的入核情况。

结果与评价：图9A是XJ479对JAK2和STAT3蛋白活性的影响，图9B是XJ479对磷酸化的STAT3表达的影响，图9C是XJ479对STAT3入核的影响，图9D是XJ479抑制STAT5，STAT3磷酸化，且抑制RORγt的表达，图9E是XJ479分别对DNA与STAT5、STAT3蛋白结合的影响。根据图9所示，调控Th17活化的JAK2和STAT3蛋白的表达在体外II型胶原刺激的情况下有很高的表达，加入不同的XJ479药物浓度可以抑制这两种蛋白的表达；调控Th1活化的STAT1也有类似的结果(图9A)。体内我们也对CIA组和给药组的小鼠进行关节切片免疫组织化学的STAT3染色，发现XJ479确实可以降低STAT3在关节滑膜中的表达(图9B)。Chip实验结果显示体内XJ479可以抑制DNA与STAT3蛋白的结合；而体外实验中XJ479促进了DNA与STAT5的结合，抑制DNA与STAT3蛋白的结合(图9E)。在EAE小鼠和给药组小鼠中分离脾淋巴细胞EMSA的方法检测STAT3的入核，实验结果显示给药组能明显降低STAT3的入核(图9C)。

综上所述，本发明BA衍生物能够作为炎症反应的免疫抑制剂，缓解炎症的严重程度并对骨损伤进行缓解，在制备预防、延缓或治疗由破骨细胞介导的类风湿性关节炎和炎症反应介导的实验性脑脊髓炎等相关疾病中具有重要用途。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

Claims (8)

1.白桦脂酸衍生物在制备缓解、预防或治疗自身免疫性疾病的药物中的应用，其特征在于，所述白桦脂酸衍生物如式(1)、式(2)、式(3)、或式(4)所示：

其中，所述自身免疫性疾病为类风湿性关节炎、胶原诱导的关节炎、多发性硬化、实验性脑脊髓炎。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述白桦脂酸衍生物用于抑制II型胶原特异性T细胞的增殖。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述白桦脂酸衍生物用于抑制JAK2、STAT1、STAT3蛋白的表达。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述白桦脂酸衍生物用于抑制DNA与STAT3蛋白的结合，促进DNA与STAT5的结合。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述白桦脂酸衍生物用于缓解骨损伤。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述白桦脂酸衍生物用于抑制T细胞的分化。

7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述白桦脂酸衍生物用于抑制促炎性细胞因子的产生，上调调节性细胞因子的分泌，并调控T细胞的平衡。

8.根据权利要求1～7之任一项所述的应用，其特征在于，所述药物单独使用，或与其他药物联合使用。