CN111685187A

CN111685187A - 一种高肽含量核桃乳的制备方法

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Publication number: CN111685187A
Application number: CN202010468091.7A
Authority: CN
Inventors: 陈业明; 裴昊铭; 周倩倩; 华欲飞; 孔祥珍; 张彩猛; 李兴飞
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-05-28
Filing date: 2020-05-28
Publication date: 2020-09-22

Abstract

本发明涉及一种高肽含量核桃乳的制备方法，首先去除生核桃的核桃衣，再进行去衣核桃仁的加水磨浆，过滤得到核桃浆，离心将核桃浆分成轻相、中间相和重相；将重相和全部或部分中间相混合均匀，得到核桃蛋白体系；利用乳酸菌产酸或人为调酸激活内源性蛋白酶，水解核桃蛋白生成肽，得到产品。本发明不使用任何有机溶剂和酶试剂，是一种绿色环保、成本低的蛋白加工技术；由于对于核桃自身内源性蛋白酶的利用，一方面，可增加相应产品的生理功能性，另一方面，可改善核桃蛋白的水溶性，从而可减少食品添加剂的使用；本发明所得高肽含量核桃乳在蛋白含量较高的前提下，可满足多种消费需求。

Description

一种高肽含量核桃乳的制备方法

技术领域

本发明属于油料的植物蛋白加工技术领域，具体地说涉及一种高肽含量核桃乳的制备方法。

背景技术

核桃是一种富含油脂的木本油料，核桃仁含65％～70％的油脂，富含多不饱和脂肪酸。除了油脂，核桃仁还含有约15％的蛋白质，富含精氨酸(14％左右)，是膳食精氨酸的良好来源。目前对核桃蛋白的利用形式主要包括坚果、核桃制油得到的饼粕和核桃乳。坚果是最初级的加工利用方式。核桃制油包括：1)简单的压榨工艺，得到核桃油和压榨饼，但是压榨饼一般呈现褐色(压榨时一般没有去衣处理)，并且残留较多的脂质，主要用做饲料，造成核桃蛋白的低值化；2)压榨和萃取的两段工艺，先通过压榨提取约80％的核桃油，再通过有机溶剂浸出或CO₂超临界萃取提取压榨饼中的剩余油脂。对于第二种工艺的第二段工序，如果使用有机溶剂浸出，会导致核桃饼粕的有机溶剂残留问题，加工时还需严格管理生产安全问题；如果使用CO₂超临界萃取，那么所得饼粕的品质较高，可以做成核桃蛋白粉或继续加工成核桃肽产品，但是设备要求高、成本较高，导致产品价格高。核桃乳是目前核桃蛋白利用一个非常成功的产品，但该类产品的蛋白含量一般只在0.6～0.7％左右，脂肪2％左右。另外，由于核桃蛋白的水溶性差，目前是通过一些较为剧烈的加工条件(如碱性pH)和多种食品添加剂的使用来实现核桃乳体系的稳定性。其中，碱性pH的使用，会导致蛋白中氨基酸的破坏，对于食品营养与安全具有潜在的威胁。随着生活水平的提高和对于营养健康的关注，人们的食物消费理念逐渐转向无添加或少添加食品添加剂。

乳酸菌发酵食物(如酸奶)可以产生良好的风味，并且具有促进健康的效果，目前市场上出现了发酵核桃乳产品，蛋白含量为1.2％，脂质含量达到了4％。同时，也需要多种食品添加剂进行稳定。

蛋白酶水解可改善核桃蛋白等水不溶性蛋白的溶解度，并且可以得到水解产物——肽，一方面具有易消化吸收的性质，另一方面，还具有一些生理功能性质。因此，市场上已经有了核桃肽产品。但是，核桃肽的生产由于需要使用商业蛋白酶和膜处理系统等，导致加工成本高，产品的价格高。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，本发明提供了一种高肽含量核桃乳的制备方法。本发明利用乳酸菌产酸或人为调酸激活内源性蛋白酶系，来水解核桃蛋白生成肽，一方面可使相应产品的生理功能性增强，另一方面还可改善核桃蛋白的水溶性，减少食品添加剂的使用；另外，可通过离心对高脂含量的核桃浆进行脱脂处理，得到低脂和高蛋白(肽)含量的核桃发酵乳产品。本发明加工工艺简单易行、成本低，不使用任何有机溶剂和商品酶制剂，所得产品具有生理功能性高、添加剂少的特点，可满足广大人民群众的消费能力和消费倾向，对于环保、大健康和经济效益具有积极意义。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：

一种高肽含量核桃乳的制备方法，首先去除生核桃的核桃衣，再进行去衣核桃仁的加水磨浆，过滤得到核桃浆，离心将核桃浆分成轻相、中间相和重相；将重相和全部或部分中间相混合均匀，得到核桃蛋白体系；利用乳酸菌产酸或人为调酸激活内源性蛋白酶，水解核桃蛋白生成肽，得到产品。

作为优选，所述高肽含量核桃乳的制备方法，包括下述步骤：

(1)核桃去衣：挑选新鲜核桃在0～35℃水中浸泡1～10h，进行去衣，得到去衣核桃仁；

(2)核桃浆制备：在步骤(1)所得的去衣核桃仁中加水，磨浆，过滤得到核桃浆和核桃渣；

(3)核桃浆的分离：对步骤(2)所得核桃浆进行离心分离，得到轻相、中间相和重相；

(4)核桃蛋白体系的制备：对步骤(3)所得中间相和重相进行混合，得到蛋白浓度为1～6％的核桃蛋白体系；

(5)核桃蛋白体系的乳酸菌发酵和内源性蛋白酶水解：在步骤(4)中的核桃蛋白体系中加入配料和乳酸菌，35～45℃发酵3～9h，发酵过程中产酸激活内源性蛋白酶，再在40～70℃下酶解0～8h，使得核桃蛋白转化成肽，得到产品。

作为优选，步骤(5)采用人为调酸激活内源性蛋白酶，其具体步骤为：通过pH调节剂将步骤(4)中的核桃蛋白体系的pH调至4～5，内源性蛋白酶被激活，在40～70℃下酶解2～8h；回调pH至5.5～6.5后，加入配料和乳酸菌进行发酵，得到产品。

作为优选，步骤(2)中去衣核桃仁中加水使得核桃仁与水体积比为1：5～9，磨浆1～4min。

作为优选，核桃渣再加水进行1～3次的磨浆，并合并核桃浆。

作为优选，步骤(3)中离心转速为3000～8000rpm，时间为1～20min；离心设备选用串联的卧式螺旋离心机和碟式离心机，或三相离心机。

作为优选，pH调节剂为盐酸、维生素C、苹果酸、柠檬酸、柠檬汁、磷酸、乳酸、小苏打、苏打、磷酸三钠、氢氧化钠、氢氧化钾中的一种或两种以上的任意组合。

作为优选，配料包括下述质量分数的组分：2～6％蔗糖、1～3％葡萄糖和3～6‰果胶。

作为优选，核桃蛋白体系进行杀菌或灭菌处理，选用巴氏杀菌或高温瞬时杀菌。

作为优选，巴氏杀菌温度为70～100℃，时间15min～3h；高温瞬时杀菌温度135～140℃，时间3～8s。

相对于现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明不使用任何有机溶剂和酶试剂，是一种绿色环保、成本低的蛋白加工技术；由于对于核桃自身内源性蛋白酶的利用，一方面，可增加相应产品的生理功能性，另一方面，可改善核桃蛋白的水溶性，从而可减少食品添加剂的使用；本发明所得高肽含量核桃乳(蛋白质1.3～6％，脂质0.8～6％)在蛋白含量较高的前提下，可满足多种消费需求，对于环保、大健康和经济效益具有积极意义。

附图说明

图1是本发明实施例1中人为加酸(55℃，pH 4.3，6h)对内源性蛋白酶水解核桃蛋白的影响结果图；

图2是本发明实施例2中乳酸菌发酵(42℃，9h)对内源性蛋白酶水解核桃蛋白的影响结果图；

图3是本发明实施例3乳酸菌发酵(42℃，9h)及后续酶解(70℃，3h)对内源性蛋白酶水解核桃蛋白的影响结果图；

图4是本发明实施例4中内源性蛋白酶(60℃，pH 4.5，4h)对核桃蛋白的水解结果图；

图5是本发明实施例5中乳酸菌发酵(37℃，3h)和两段酶解(50℃，4h；70℃，1h)对内源性蛋白酶水解核桃蛋白的影响结果图

图6是本发明实施例8中pH对中间相中内源性蛋白酶水解核桃蛋白的影响结果图；

图7是本发明实施例8中温度对中间相中内源性蛋白酶水解核桃蛋白的影响结果图；

图8是本发明实施例8中pH对重相中内源性蛋白酶水解核桃蛋白的影响结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对发明作进一步说明，但发明的保护范围并不限于此。本领域的普通技术人员可以且应当知晓任何基于本发明实质精神的简单变化或者替换均应属于本发明所要求的保护范围。

实施例1

一种高肽含量核桃乳的制备方法，包括下述步骤：

(1)100g核桃在4℃下水浸泡10h，去衣，得到去衣核桃仁；

(2)去衣核桃仁清洗后，加水使总质量为600g，磨浆2min，过滤得到核桃浆I和核桃渣I；核桃渣I加入400g水，磨浆30s，过滤得到核桃浆II和核桃渣II；核桃浆I和II合并，得到核桃浆III(950g)；

(3)对核桃浆III进行离心(4000rpm，15min)，收集轻相(71g，固形物含量68％)、中间相(852g)和重相(约21g)；通过分析，轻相固形物和蛋白质含量分别为81.18％和0.63％(w/w)，中间相固形物和蛋白质含量为1.47％和0.38％，重相固形物和蛋白质含量为49.27％和41.86％；轻相、中间相和重相中的蛋白分别占核桃浆III总蛋白的3.6％、26.0％和70.4％；

(4)将中间相和重相混合均匀，得到核桃蛋白体系；

(5)利用苹果酸将pH调至4.3，内源性蛋白酶被激活；在55℃下酶解6h后，利用Na₃PO₄将其pH调至6.5，取1mL料液用于Tricine-SDS-PAGE分析；

添加4％蔗糖、2％葡萄糖和5‰果胶后，在沸水浴中杀菌15min，冷却至室温；

按照100mg/1000g料液的添加量添加乳酸菌，进行发酵(42℃，9h)和后熟(4℃，4h)，即得低脂高含肽核桃发酵乳。

该产品蛋白含量为1.4％，脂质含量为0.8％；口感清爽，具有良好的发酵风味，并具有淡淡的水果风味；该产品需要冷链运输和售卖。

人为加酸(55℃，pH 4.3，6h)对内源性蛋白酶水解核桃蛋白的影响结果如图1所示，通过Tricine-SDS-PAGE分析，中间相和重相混合物(泳道0)的主要蛋白是30-35kDa和21-25kDa，还含有少量其它蛋白；经过2h内源性蛋白酶的水解(pH 4，70℃)，料液(泳道E)中的主要蛋白条带强度大大减弱，30-35kDa蛋白条带强度减弱57％，21-25kDa蛋白条带强度减弱62％，水解产物主要为小于19kDa的肽和少量28kDa肽段。另外，对最终饮料的15％三氯乙酸(TCA)可溶性氮进行分析，结果显示，15％TCA可溶性氮含量占产品总氮含量的18％，而原始中间相和重相混合物中的15％TCA可溶性氮含量只占产品总氮含量的3％。注：15％TCA可溶性氮主要为小于1000Da的小肽成分。

实施例2

一种高肽含量核桃乳的制备方法，包括下述步骤：

(1)50g核桃在室温下浸泡4h，去衣，到去衣核桃仁；

(2)去衣核桃仁清洗后，加水使总质量为300g，磨浆1.5min，过滤得到核桃浆I和核桃渣I；核桃渣I加入200g水，磨浆0.5min，过滤得到核桃浆II和核桃渣II；核桃浆I和II合并，得到核桃浆III；

(3)在核桃浆III中加入3％蔗糖和3％葡萄糖，按照86mg/1000g料液的添加量添加乳酸菌，进行发酵(42℃，9h)，取1mL料液用于Tricine-SDS-PAGE分析；

(3)加入5‰果胶，20MPa下均质5min，高温瞬时灭菌(135℃，5s)，即得全脂含肽核桃乳。

该饮料蛋白含量为1.4％，脂质含量为6.1％；口感香浓细腻，外观洁白；该产品可常温运输和售卖。

乳酸菌发酵(42℃，9h)对内源性蛋白酶水解核桃蛋白的影响结果如图2所示，通过Tricine-SDS-PAGE分析，核桃浆III(泳道0)的主要蛋白是30-35kDa和21-25kDa，还含有少量其它蛋白；料液(泳道E)中的30-35kDa蛋白条带强度减弱19％，21-25kDa蛋白条带强度减弱38％。另外，对最终饮料的15％TCA可溶性氮进行分析，结果显示，15％TCA可溶性氮含量占饮料总氮含量的8％。

实施例3

一种高肽含量核桃乳的制备方法，包括下述步骤：

(1)100g核桃在4℃下水浸泡10h，去衣，得到去衣核桃仁；

(2)去衣核桃仁清洗后，加水使总质量为500g，磨浆2min，过滤得到核桃浆I和核桃渣I；核桃渣I加入300g水，磨浆0.5min，过滤得到核桃浆II和核桃渣II；核桃渣II加入200g水，得到核桃浆III和核桃渣III；将核桃浆I、核桃浆II和核桃浆III合并得到核桃浆IV；

(3)对核桃浆IV进行离心(5000rpm，10min)，得到轻相、中间相和重相；

(4)将重相和中间相混合均匀，得到核桃蛋白体系；

(5)添加3％蔗糖和3％葡萄糖，按照120mg/1000g料液的添加量添加乳酸菌，进行发酵(42℃，9h)；在70℃下酶解3h后，取1mL料液用于Tricine-SDS-PAGE分析；

加入5‰果胶，20MPa均质5min，即得稳定的高含肽核桃乳；

该核桃乳蛋白含量为1.3％，脂质含量为0.8％；具有淡淡的发酵风味；该产品需要冷链运输和售卖。

乳酸菌发酵(42℃，9h)及后续酶解(70℃，3h)对内源性蛋白酶水解核桃蛋白的影响结果如图3所示，通过Tricine-SDS-PAGE分析，中间相和重相混合物(泳道0)的主要蛋白是30-35kDa和21-25kDa，还含有少量其它蛋白；经过发酵(42℃，9h)及后续酶解(70℃，3h)，料液(泳道E)中的主要蛋白条带强度大大减弱，30-35kDa蛋白条带强度减弱38％，21-25kDa蛋白条带强度减弱53％，水解产物主要为小于19kDa的肽和少量28kDa肽段。另外，对最终产品的15％TCA可溶性氮进行分析，结果显示，15％TCA可溶性氮含量占产品总氮含量的15％。

实施例4

一种高肽含量核桃乳的制备方法，包括下述步骤：

按照实施例3的步骤，得到轻相、中间相和重相；

在重相中加入部分中间相使得混合物的蛋白含量为3.7％，利用苹果酸将pH调至4.5，内源性蛋白酶被激活；

在60℃下酶解4h后，利用NaOH将其pH调至6.5，取1mL料液用于Tricine-SDS-PAGE分析；

添加3％蔗糖、3％葡萄糖和4‰果胶后，100℃杀菌15min，冷却至室温；

按照80mg/1000g料液的添加量添加乳酸菌，进行发酵(42℃，9h)和后熟(4℃，4h)，即得高肽含量核桃乳。

该产品蛋白含量为3.6％，脂质含量为2.2％；口感饱满，呈流动的稠厚状态，具有良好的发酵风味，并具有淡淡的水果风味；该产品需要冷链运输和售卖。

内源性蛋白酶(60℃，pH 4.5，4h)对核桃蛋白的水解结果如图4所示，通过Tricine-SDS-PAGE分析，部分中间相和重相混合物(泳道0)的主要蛋白是30-35kDa和21-25kDa，还含有少量其它蛋白；经过4h内源性蛋白酶的水解(pH4.5，60℃)，料液(泳道E)中的主要蛋白条带强度大大减弱，30-35kDa蛋白条带强度减弱44％，21-25kDa蛋白条带强度减弱57％，水解产物主要为小于19kDa的肽和少量28kDa肽段。另外，对最终产品的15％TCA可溶性氮进行分析，结果显示，15％TCA可溶性氮含量占产品总氮含量的16％。

实施例5

一种高肽含量核桃乳的制备方法，包括下述步骤：

(1)100g核桃在室温下水浸泡5h，去衣，得到去衣核桃仁；

(2)去衣核桃仁清洗后，加水使总质量为500g，磨浆2.5min，过滤得到核桃浆I和核桃渣I；核桃渣I加入500g水，磨浆0.5min，过滤得到核桃浆II和核桃渣II；将核桃浆I和核桃浆II合并得到核桃浆III；

(3)对核桃浆III进行离心(6000rpm，8min)，得到轻相、中间相和重相；

(4)将中间相和重相混合均匀，得到核桃蛋白体系；

(5)添加2％蔗糖和4％葡萄糖；按照140mg/1000g料液的添加量添加乳酸菌，进行发酵(37℃，3h)，此时pH降至4.8；

在50℃酶解4h后，加入5‰果胶并混匀，再在70℃酶解1h后，即得高含肽核桃乳，取1mL进行Tricine-SDS-PAGE分析；

该产品蛋白含量为1.3％，脂质含量为0.8％；具有良好的发酵风味；该产品需要冷链运输和售卖。

乳酸菌发酵(37℃，3h)和两段酶解(50℃，4h；70℃，1h)对内源性蛋白酶水解核桃蛋白的影响结果如图5所示，通过Tricine-SDS-PAGE分析，部分中间相和重相混合物(泳道0)的主要蛋白是30-35kDa和21-25kDa，还含有少量其它蛋白；经过发酵(42℃，3h)、热处理(50℃，4h)和热处理(70℃，1h)后，料液(泳道E)中的30-35kDa蛋白条带强度减弱61％，21-25kDa蛋白条带强度减弱66％，水解产物主要为小于10kDa的肽，28kDa肽段产物在所有实施例中最少。对最终核桃发酵乳的15％TCA可溶性氮进行分析，结果显示，15％TCA可溶性氮含量占产品总氮含量的20％。

实施例6

一种高肽含量核桃乳的制备方法，包括下述步骤：

(1)100g核桃在室温下水浸泡5h，去衣，得到去衣核桃仁；

(4)在重相中加入部分中间相使得混合物的蛋白含量为6％；

(5)利用维生素C将pH调至4.0，内源性蛋白酶被激活；在50℃下酶解2h后，利用Na₃PO₄将其pH调至4.5，在55℃下酶解2h，再利用Na₃PO₄将其pH调至5.0，60℃下酶解1h；

添加3％蔗糖、3％葡萄糖和3‰果胶后，在沸水浴中杀菌15min，冷却至室温；

按照140mg/1000g料液的添加量添加乳酸菌，进行发酵(42℃，9h)和后熟(4℃，4h)，即得高含肽核桃发酵乳。

该产品蛋白含量为5.9％，脂质含量为3.6％；产品为固态，具有良好的发酵风味；该产品需要冷链运输和售卖。

对最终核桃发酵乳的15％TCA可溶性氮进行分析，结果显示，15％TCA可溶性氮含量占产品总氮含量的19％。

实施例7

一种高肽含量核桃乳的制备方法，包括下述步骤：

(1)100g核桃在30℃下水浸泡3h，去衣，得到去衣核桃仁；

(2)去衣核桃仁清洗后，加水使总质量为600g，磨浆2.5min，过滤得到核桃浆I和核桃渣I；核桃渣I加入400g水，磨浆0.5min，过滤得到核桃浆II和核桃渣II；将核桃浆I和核桃浆II合并得到核桃浆III；

(3)对核桃浆III进行离心(4500rpm，10min)，得到轻相、中间相和重相；

(4)将中间相和重相进行混合；

(5)利用柠檬汁将pH调至4.5，内源性蛋白酶被激活；在60℃下酶解6h后，利用Na₃PO₄将其pH调至6.0；

添加2％蔗糖、3％葡萄糖和5‰果胶后，在沸水浴中杀菌15min，冷却至室温；

按照80mg/1000g料液的添加量添加乳酸菌，进行发酵(42℃，9h)和后熟(4℃，4h)，即得高含肽核桃发酵乳。

该产品蛋白含量为1.4％，脂质含量为2％；产品为液态，口感爽滑，具有良好的发酵风味；该产品需要冷链运输和售卖。

对最终核桃发酵乳的15％TCA可溶性氮进行分析，结果显示，15％TCA可溶性氮含量占产品总氮含量的18％。

注：可通过离心条件的调节，实现原始核桃乳不同程度的脱脂，如：在4500rpm的条件下，可通过缩短离心时间来实现脱脂程度减小；在工业上，可通过加大液料流量来实现脱脂程度减小。

实施例8

pH和温度对中间相和重相中内源性蛋白酶水解核桃蛋白的影响

按照实施例1的方法制取轻相、中间相和重相。通过LC-MS/MS对轻相、中间相和重相中的核桃内源性蛋白酶进行分析，结果如表1所示。

表1

注：√表示LC-MS/MS检测到了该种酶；X表示LC-MS/MS没有检测到该种酶。

中间相含有最多种类的蛋白酶：7种天冬氨酸蛋白酶，5种半胱氨酸蛋白酶，2种丝氨酸蛋白酶，1种寡肽酶，2种三肽基肽酶，8种氨肽酶，7种羧肽酶和1种二肽酶；上浮含有的蛋白酶种类次之：3种天冬氨酸蛋白酶，4种半胱氨酸蛋白酶，2种丝氨酸蛋白酶，2种三肽基肽酶，2种氨肽酶和4种羧肽酶；重相含有的蛋白酶种类最少：4种天冬氨酸蛋白酶，1种半胱氨酸蛋白酶，2种丝氨酸蛋白酶，2种三肽基肽酶，2种氨肽酶，3种羧肽酶和1种二肽酶。此结果说明，核桃浆含有丰富的内源性蛋白酶。

将330mL中间相分成11等份，将其中10份的pH用磷酸分别调至2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0和6.5，剩下的1份放入冰箱，作为对照；50℃水解2h，pH对中间相中内源性蛋白酶水解核桃蛋白的影响结果如图6所示，pH4.5(泳道F)时核桃蛋白水解效果最好，pH 4.0(泳道E)和5.0(泳道G)水解效果次之，pH 3.0(泳道C)和3.5(泳道D)水解效果再次之；未水解核桃蛋白(泳道0)含有45-70kDa、30-40kDa、21-26kDa、19kDa、14kDa、12kDa、10kDa和8kDa这些主要蛋白，在pH 4.5、50℃水解2h后，19kDa、14kDa和12kDa蛋白条带几乎全部消失，21-26kDa和30-40kDa蛋白条带强度也大大降低，45-70kDa、10kDa和8kDa蛋白条带也发生了一定程度的降低，生成了分子量小于8kDa的水解产物。

将180mL中间相的pH用磷酸调至4.5，分成6等份，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃下酶解2h。温度对中间相中内源性蛋白酶水解核桃蛋白的影响结果如图7所示，70-80℃时，虽然45-70kDa、30-40kDa和21-26kDa的条带强度减弱最多，但是生成了蛋白质聚合体(共价键链接的蛋白质聚集物)，另外，10kDa蛋白质的条带强度减弱很小，说明45-70kDa、30-40kDa和21-26kDa的条带强度的减弱应来源于2方面，1)内源性蛋白酶的水解，2)蛋白质聚合体的生成，导致一些蛋白无法进入分离胶；50-60℃时，所有条带强度减弱程度相当，不过，50℃时，10kDa条带减弱程度最大，并且基本不生成蛋白质聚合体，而60℃时，生成了少量蛋白质聚合物；30-40℃时，所有条带强度减弱程度较50-60℃低，并且温度越低，减弱程度越低。以上结果显示，50℃是内源性蛋白酶水解的最佳温度，60℃次之，然后是40℃和30℃；温度越高，会影响内源性蛋白酶活性，并生成蛋白质聚合体，不适宜长时间酶解。

在重相中加水，使得蛋白质含量为4％，搅拌均匀，分成11等份。将其中10份的pH用磷酸分别调至2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0和6.5，剩下的1份放入冰箱，作为对照；50℃水解2h，pH对重相中内源性蛋白酶水解核桃蛋白的影响结果如图8所示，重相中的核桃蛋白(泳道0)主要为30-35kDa和25kDa蛋白，少量23kDa、21kDa、19kDa和45-70kDa；pH2.0(泳道A)时，各个蛋白条带强度减弱程度最大，pH 4.5(泳道F)和pH 2.5(泳道B)次之；然后是pH 3.0(泳道C)，pH 5.0(泳道G)和pH 4.0(泳道E)；pH 5.5(泳道H)，pH 6.0(泳道I)和pH 6.5(泳道J)时核桃蛋白水解效果不明显。在pH 4.5时，生成了多条水解产物肽段：28kDa，17kDa，14.5kDa，12kDa，8kDa，6kDa，5kDa和小于5kDa的水解产物。可发现，pH 4.5时中间相和重相中的内源性蛋白酶都具有较佳的水解活性。

实施例9

水解时间对中间相和重相中内源性蛋白酶水解核桃蛋白生成小肽的影响

按照实施例1步骤制备轻相、中间相和重相。将中间相pH用磷酸调至4.5，为原始样品，其蛋白含量为0.35％。10mL在50℃水解2h后，得到水解样品I，立即加入15％TCA；10mL在50℃水解4h后，得到水解样品II，立即加入15％TCA；10mL在50℃水解6h后，得到水解样品III，立即加入15％TCA。取10mL原始样品，立即加入15％TCA。上述4种样品在4℃静置1h后，离心(8000rpm，20min)，得到它们的清液和沉淀，测定4个清液的蛋白含量，分别为0.04％，0.15％，0.17％和0.19％。该结果显示，原始中间相中小于1000Da的小肽含量只占总蛋白的11％，而水解样品I、水解样品II和水解样品III中小于1000Da的小肽含量分别占总蛋白的43％、49％和54％。

在上述重相中加适量水，搅拌均匀，并分成2等份；利用磷酸分别将它们的pH调至4.5和2.0，为原始样品a和原始样品b，它们的蛋白含量为3.7％。10mL原始样品a在50℃水解2h后，得到水解样品aa，立即加入15％TCA；10mL原始样品a在50℃水解4h后，得到水解样品ab，立即加入15％TCA；10mL原始样品a在50℃水解6h后，得到水解样品ac，立即加入15％TCA。取10mL原始样品a，加入TCA使之最终浓度为15％。上述4种样品在4℃静置1h后，离心(8000rpm，20min)，得到它们的清液和沉淀，测定4个清液的蛋白含量，分别为0.02％，0.14％，0.20％和0.22％。该结果显示，原始样品a中小于1000Da的小肽含量只占总蛋白的0.54％，而水解样品aa、水解样品ab和水解样品ac中小于1000Da的小肽含量分别占总蛋白3.77％、5.39％和5.93％。

10mL原始样品b在50℃水解2h后，得到水解样品ba，立即加入15％TCA；10mL原始样品b在50℃水解4h后，得到水解样品bb，立即加入15％TCA；10mL原始样品b在50℃水解6h后，得到水解样品bc，立即加入15％TCA。取10mL原始样品b，立即加入15％TCA。上述4种样品在4℃静置1h后，离心(8000rpm，20min)，得到它们的清液和沉淀，测定4个清液的蛋白含量，分别为0.02％，0.03％，0.03％和0.03％。该结果显示，原始样品b中小于1000Da的小肽含量只占总蛋白的0.54％，水解样品ba、水解样品bb和水解样品bc中小于1000Da的小肽含量也只占总蛋白的0.81％。结果说明，pH 2水解不利于重相中核桃蛋白水解生成小于1000Da的小肽。

实施例10

菌种对发酵核桃乳pH和口感的影响

100g核桃清洗干净后，在室温下浸泡5h，进行去衣；去衣核桃仁利用水冲洗干净后，加水使得去衣核桃仁和水的质量为500g，磨浆2min，过滤得到核桃浆I和核桃渣I；核桃渣I中加入500g水，磨浆30s，过滤得到核桃浆II和核桃渣II；将核桃浆I和核桃浆II合并得到核桃浆III；对核桃浆III进行离心处理(5000rpm，10min)，分离得到轻相、中间相和重相，将中间相和重相混合均匀，得到低脂核桃浆。

在上述低脂核桃浆中加入4％蔗糖和1.5％葡萄糖，混合均匀后，分成2等份；按照86mg干菌种/1000g低脂核桃浆的比例，利用菌种A(丹尼斯克YO-MJ型混合乳酸菌)和菌种B(科汉森FD-DV.S CH1型混合乳酸菌)给上述2等份样品进行接种和摇匀；进行发酵(42℃，9h)和后熟(4℃，6h)；对于发酵和后熟过程中的pH变化进行监测，发酵和后熟过程中低脂核桃浆pH的变化趋势结果如表2所示。

表2

结果显示，菌种B的产酸能力优于菌种A，菌种B在6h之前就可以达到pH4.5，而菌种A则需要6h达到pH 4.5；不过，菌种A的发酵风味优于菌种B。由此可知，不同菌种对于最终产品的口感和酸度产生影响。

实施例11

果胶添加量对发酵核桃乳稳定性的影响

按照实施例1得到轻相、中间相和重相，将中间相和重相混合均匀，得到低脂核桃浆；在低脂核桃浆中加入4％蔗糖和1.5％葡萄糖，搅拌均匀后，分成5等份；分别加入1‰、2‰、3‰、4‰、5‰的果胶，搅拌40min直至溶解完全；按86mg干菌种/1000g低脂核桃浆进行接种，搅拌均匀；进行发酵(42℃，8h)和后续热处理(70℃，1h)；果胶添加量为1‰-4‰的体系，均发生一定程度的沉淀，而5‰没有发生沉淀。

实施例12

脱脂对发酵核桃乳口感风味的影响

按照实施例1制备核桃浆III。将核桃浆III分成两份，一份450g(体系1)，另一份500g；对500g这份核桃浆进行离心(4000rpm，15min)，得到轻相(36g)、中间相(440g)和重相(11g)；将中间相和重相混合均匀，得到低脂核桃浆(体系2)；在体系1和体系2中加入4％蔗糖、1.5％葡萄糖和5‰果胶，搅拌混匀；按照86mg干菌粉/1000g料液的接种量进行接种和发酵(42℃，9h)，接着后续热处理(70℃，1h)。

体系1的发酵产品色泽乳白，口感香浓饱满，核桃味明显；而体系2的发酵产品的口感清爽。

实施例13

pH回调剂对于发酵核桃乳口感和风味的影响

按照实施例1得到轻相、中间相和重相，将中间相和重相混合得到料液I。用磷酸调整料液I的pH至4.5，50℃下酶解6h，得到料液II；将料液II分成4等份，为料液IIa、料液IIb、料液IIc和料液IId，分别利用NaOH、Na₂CO₃、NaHCO₃和Na₃PO₄将它们的pH回调到6.5；分别加入4％蔗糖和2％葡萄糖，搅拌均匀；再分别加入5‰果胶，搅拌均匀；杀菌(100℃，15min)，冷却后，按照86mg干菌种/1000g料液的添加量，进行接种和发酵(42℃，9h)，后熟(4℃，6h)得到产品。

Na₃PO₄回调pH：口感和风味最佳，略酸，让人愉悦，口感清爽，发酵风味佳、色泽佳；NaOH回调pH：口感和风味次之；Na₂CO₃回调pH：口感和风味再次之；NaHCO₃回调pH：口感和风味差，有明显的苦味，色泽较深。

本发明旨在生产蛋白含量高(1.3％-6％)的核桃乳产品，并且可通过离心条件的调节对核桃乳进行不同程度的脱脂，可获得不同脂质含量(0.8％-6.1％)的核桃乳；尤为重要的是：通过乳酸菌发酵产酸激活核桃内源性蛋白酶，对核桃蛋白进行水解生成分子量较小的肽段；或通过人为加酸激活内源性蛋白酶，对核桃蛋白进行水解生成分子量较小的肽段，再回调pH，进行乳酸菌发酵，得到具有良好风味和高肽含量的核桃乳。在较佳的条件下(如实施例5)，可使60％以上的核桃主要蛋白(30kDa-35kDa，21kDa-25kDa)发生水解，生成20kDa以下的肽段产物，其中，10kDa以下的肽段占绝大多数；另外，小于1000Da的小肽可占到总蛋白的20％。

本发明不使用任何有机溶剂和酶试剂，是一种绿色环保、成本低的蛋白加工技术；由于对于核桃自身内源性蛋白酶的利用，一方面，可增加相应产品的生理功能性，另一方面，可改善核桃蛋白的水溶性，从而可减少食品添加剂的使用；本发明所得高肽含量核桃乳(蛋白质1.3～6％，脂质0.8～6％)在蛋白含量较高的前提下，可满足多种消费需求，如，注重香浓细腻口感的消费者可选择脂质含量较高的核桃乳产品，而对于脂质有抵触的消费者可选择低脂含量的核桃乳产品，等等。

最后需要说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种高肽含量核桃乳的制备方法，其特征在于：首先去除生核桃的核桃衣，再进行去衣核桃仁的加水磨浆，过滤得到核桃浆，离心将核桃浆分成轻相、中间相和重相；将重相和全部或部分中间相混合均匀，得到核桃蛋白体系；利用乳酸菌产酸或人为调酸激活内源性蛋白酶，水解核桃蛋白生成肽，得到产品。

2.根据权利要求1所述高肽含量核桃乳的制备方法，其特征在于包括下述步骤：

(4)核桃蛋白体系的制备：对步骤(3)所得中间相和重相进行混合，得到核桃蛋白体系；

3.根据权利要求2所述高肽含量核桃乳的制备方法，其特征在于步骤(5)采用人为调酸激活内源性蛋白酶，其具体步骤为：通过pH调节剂将步骤(4)中的核桃蛋白体系的pH调至4～5，内源性蛋白酶被激活，在40～70℃下酶解2～8h；回调pH至5.5～6.5后，加入配料和乳酸菌进行发酵，得到产品。

4.根据权利要求2或3所述高肽含量核桃乳的制备方法，其特征在于：步骤(2)中去衣核桃仁中加水使得核桃仁与水体积比为1：5～9，磨浆1～4min。

5.根据权利要求4所述高肽含量核桃乳的制备方法，其特征在于：核桃渣再加水进行1～3次的磨浆，并合并核桃浆。

6.根据权利要求2或3所述高肽含量核桃乳的制备方法，其特征在于：步骤(3)中离心转速为3000～8000rpm，时间为1～20min。

7.根据权利要求3所述高肽含量核桃乳的制备方法，其特征在于：pH调节剂为盐酸、维生素C、苹果酸、柠檬酸、柠檬汁、磷酸、乳酸、小苏打、苏打、磷酸三钠、氢氧化钠、氢氧化钾中的一种或两种以上的任意组合。

8.根据权利要求2或3所述高肽含量核桃乳的制备方法，其特征在于：配料包括下述质量分数的组分：2～6％蔗糖、1～3％葡萄糖和3～6‰果胶。

9.根据权利要求2或3所述高肽含量核桃乳的制备方法，其特征在于：得到产品前进行杀菌或灭菌处理，选用巴氏杀菌或高温瞬时杀菌。

10.根据权利要求9所述高肽含量核桃乳的制备方法，其特征在于：巴氏杀菌温度为70～100℃，时间15min～3h；高温瞬时杀菌温度135～140℃，时间3～8s。