CN111679027A - 一种液相色谱法分离测定格列吡嗪及其杂质的方法 - Google Patents

一种液相色谱法分离测定格列吡嗪及其杂质的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种通过高效液相色谱法分离测定格列吡嗪及其杂质的方法和用途，所述测定方法采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，其检测条件如下：色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相为：0.010～0.018mol/L磷酸二氢钾‑乙腈‑甲醇，用磷酸调节pH值至3.5～4.0，柱温：20～30℃，进样量：15～30μL，进样浓度：0.0003～2mg/mL，流速：0.8～1.2mL/min，检测波长：225nm，梯度洗脱。本发明方法精密度高，重复性好，回收率高，可以广泛用于不同来源的格列吡嗪原料药及其对应制剂的质量检测。

Description

一种液相色谱法分离测定格列吡嗪及其杂质的方法
技术领域
本发明属于药物分析领域，具体涉及通过高效液相色谱法分离测定格列吡嗪及其杂质的方法。
背景技术
格列吡嗪(Glipizide)，是第二代磺酰脲类口服降糖药，适用于经饮食控制及体育锻炼疗效不满意的轻、中度II型糖尿病患者。格列吡嗪化学式为1-环己基-3-{4-[2-(5-甲基吡嗪-2-酰胺)-乙基]苯磺酰}脲，分子式为C21H27N5O4S，分子量为445.54，格列吡嗪的结构式为：
Figure BDA0002586812580000011
在格列吡嗪的生产和贮藏过程中，可能会由于起始物料和中间体去除不完全以及贮藏过程中生成的降解杂质而影响药物的纯度，这些影响药物纯度的物质称为有关物质。上述有关物质皆无治疗作用，还可能影响药物的稳定性和疗效，甚至危害人体健康。
格列吡嗪在生产和贮藏过程中，可产生以下杂质A～L的杂质，其结构式和化学式等信息如下表所示：
表1格列吡嗪有关物质表*
Figure BDA0002586812580000012
Figure BDA0002586812580000021
Figure BDA0002586812580000031
*欧洲药典EP9.7记载杂质A～J，中国药典2015版记载杂质A，美国药典USP42记载杂质A，D，E。
许海涛发表了《格列吡嗪欧洲药典杂质来源分析汇总》，该文献对欧洲药典(EP9.0)中所罗列的9种杂质(杂质A～I)以及杂质K和M进行了汇总及分析，对于各个杂质的产生途径及来源进行了总结和分类，分别从合成工艺角度及格列吡嗪在外部环境条件下进行降解两个方面进行了阐述，阐明了各杂质的潜在来源。
《欧洲药典EP9.7》中关于格列吡嗪的有关物质的记载，使用高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶(0.25m×4.6mm，5μm)为填充剂；以水(醋酸调节pH至3.5)-乙腈为流动相，梯度洗脱，波长225nm，流速1.0mL/min，进样体积50μL，用以分离格列吡嗪与杂质A～J(除杂质B，杂质B需要使用气相色谱法测定)。
Figure BDA0002586812580000032
Figure BDA0002586812580000041
《中国药典2020版》中关于隔离吡嗪的有关物质的记载，使用高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶(0.25m×4.6mm，5μm)为填充剂，以0.1mol/L磷酸二氢钠溶液(用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.00±0.05)-甲醇(55:45)为流动相，梯度洗脱，波长225nm，进样体积20μL，用以分离格列吡嗪与杂质A。
《美国药典USP42》中关于隔离吡嗪的有关物质的记载，记载了两种使用高效液相色谱法分离分析相关杂质的方法，第一种，以十八烷基硅烷键合硅胶(4.6mm×25cm)为填充剂，以缓冲液-乙腈-甲醇(3：1：1)(缓冲液：4.0mL正丁胺加水至1000mL，磷酸调节pH至3.00±0.05)为流动相，波长280nm，流速1mL/min，进样体积35μL，柱温30℃，用以分离杂质A与杂质E；第二种，以十八烷基硅烷键合硅胶(4.6mm×25cm，5μm)为填充剂，以0.02M磷酸盐缓冲液-乙腈-甲醇(70:20:10)(0.02M磷酸盐缓冲液：2.84g无水磷酸氢二钠加水溶解至1000mL，磷酸调节pH至6.00±0.05)为流动相，波长225nm，流速1mL/min，进样体积10μL，柱温：40℃，用以分离格列吡嗪与杂质A，D，E。
刘世坤等人发表了《格列吡嗪血药浓度测定及中国健康人体药动学研究》，该文献报导了一种反相高效液相色谱法测定人血浆中格列吡嗪浓度的方法，以及研究格列吡嗪片在中国健康人体的药物动力学。该方法以Kiomasal C18(4.6mm×125mm，5μm)为分析柱，乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(38:62，v/v)为流动相，流速为1.0mL/min，二极管阵列检测器(DAD)，检测波长为225nm，艾司唑仑为内标，测定血浆中格列吡嗪的浓度。
申请人发现，以上药典上的方法只能部分分离测定格列吡嗪及其杂质，但部分杂质间分离度小于1.5，影响积分计算，部分杂质峰型较差，未达到基线分离，且目前尚未见关于格列吡嗪与该十一个杂质的同时分离测定方法的报道。本发明从现有技术的不足出发，提供一种分析方法，能够准确，快速分离测定格列吡嗪与该十一个杂质，且该方法灵敏度高，线性范围宽，在日常生产中起到控制格列吡嗪的质量、提高药品疗效、降低毒副作用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种通过高效液相色谱法分离测定格列吡嗪及其杂质的方法，该方法较现有技术公开的方法更具有普适性，表现为：采用该方法可以实现格列吡嗪各杂质的同时分离，进而有利于实现对原料药或制剂中有关物质更准确的定性/定量分析，以及有利于实现对原料药或制剂在制备、贮存过程中潜在可能产生的未知杂质的有效质量控制。
本发明的上述目的通过以下技术方案予以实现：
一种通过高效液相色谱法分离测定格列吡嗪及其杂质的方法，所述测定方法采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，其检测条件如下：
流动相：
A相：0.010～0.018mol/L磷酸二氢钾，用磷酸调节pH值至3.5～4.0
B相：乙腈
C相：甲醇
柱温：20～30℃
进样量：15～30μL
进样浓度：0.0003～2mg/mL
流速：0.8～1.2mL/min
检测波长：225nm
所述测定方法包含以下步骤：
配制样品溶液：采用初始配比流动相作为溶剂配制格列吡嗪供试品溶液和含其杂质0.0003～2mg/mL的混合溶液；
进样；
采用梯度洗脱法洗脱；
记录色谱图并进行分析。
所述高效液相色谱法分离测定格列吡嗪及其杂质的方法中梯度洗脱的设置是实现检测效果的重要技术关键。具体的，研究人员发现0阶段0至8min时使用流动相A为80～60％、流动相B为30～20％、流动相C为10～5％，可以有效分离杂质A、D和F。待杂质F出峰后，保持该梯度下，无法有效分离剩余杂质，因此在1阶段3～6min时，提高有机相的比例，使用流动相A为60～40％、流动相B为35～25％、流动相C为25～15％，可有效分离杂质G、H、K和J。待杂质J出峰后，2阶段4～7min时保持流动相C甲醇的比例，增大乙腈的比例，具体为流动相A为42～35％、流动相B为40～33％、流动相C为25％，可以有效分离格列吡嗪与杂质E，加快洗脱时间且保证二者的分离度。同理，待杂质E出峰后，3阶段5～7min时使用流动相A为33～25％、流动相B为50～42％、流动相C为25％，可以有效分离杂质C，I和L。所述梯度洗脱设置如下：
阶段 V<sub>A相</sub>(％) V<sub>B相</sub>(％) V<sub>C相</sub>(％) 洗脱时间
0 80～60％ 30～20％ 10～5％ 0～8min
1 60～40％ 32～25％ 25～15％ 3～6min
2 42～35％ 40～33％ 25 4～7min
3 33～25％ 50～42％ 25 5～7min
上述梯度洗脱设置中，所述洗脱时间指代该阶段洗脱所持续的时长，流动相的比例(VA相：VB相：VC相，体积比)指代到达该洗脱时间终点时流动相的比例，其中阶段0指代流动相的起始比例，即：在该洗脱时间段内，流动相的比例由前一个时间段的终点值变至本时间段的终点值，如无特指，本发明中所有梯度设置的解释均遵从于此。杂质洗脱完毕后，流动相回调至初始流动相比例平衡，即可实现连续进样。流动相VA相(％)、VB相(％)、VC相(％)最终相加应为100％。优选的，流动相的比例在洗脱时间内为匀速改变。
更具体的，上述梯度洗脱流动相的比例(VA相：VB相：VC相)为以下比例时，有利于较优的分离效果，如下：
阶段 V<sub>A相</sub>(％) V<sub>B相</sub>(％) V<sub>C相</sub>(％) 洗脱时间
0 65 25 10 7min
1 50 30 20 5min
2 40 35 25 6min
3 30 45 25 6min
所述高效液相色谱法分离测定格列吡嗪及其杂质的方法中，流动相的浓度、以及pH也是决定分离效果的重要因素之一，具体的，当流动相磷酸二氢钾浓度为0.010～0.018mol/L时，保留能力分离效果较好，峰型对称，用磷酸调节pH值为3.5～4.0时，峰型较好无拖尾，与本发明的其他检测条件诸如流动相、流速等相结合，整体分离度较好，因此分离效果较好。更具体的，当流动相磷酸二氢钾浓度为0.015mol/L，用磷酸调节pH值至3.7分离时，效果最佳。所述磷酸可为一般市售磷酸。
所述高效液相色谱法分离测定格列吡嗪及其的方法中，柱温需要控制在20至30℃之间，过低的柱温会严重影响柱效，而过高的柱温则会损坏色谱柱；优选的，当所述高效液相色谱法分离测定格列吡嗪及其杂质的方法中柱温为25℃时，各成分的出峰时间及峰型最佳，检测效果最好。
所述高效液相色谱法分离测定格列吡嗪及其杂质的方法中，进样量需要控制在15～30μL，进样浓度需要控制在0.0003～2mg/mL，此时浓度与峰面积之间成线性关系，所述样品溶液使用初始配比流动相配制，初始配比流动相是指阶段0时配比的流动相，使用初始配比流动相配制样品溶液，可以避免溶剂效应的产生，减少峰的干扰现象；优选的，当所述进样量为20μL，进样浓度为0.0004～2mg/mL时，单位检测的样品量可以最大程度的发挥流动洗脱的效果，有利于实现各成分峰分离，且检测结果最为准确。
所述高效液相色谱法分离测定格列吡嗪及其杂质的方法中，流动相的流速是实现检测效果的技术关键之一，具体的，流动相的流速过高会加快洗脱速度，缩短出峰时间，并且不利于实现分离效果，而过低的流速则会降低洗脱速度，在出峰时间延迟的同时也会拉宽各组分峰宽，同样不利于实现分离效果，也降低了检测效率；具体的，当流动相的流速控制在0.8～1.2mL/min时，所述方法兼顾检测效率和分离度，有利于实现最佳检测效果，更具体的，当流速为1.0mL/min时，检测效果最佳。
所述高效液相色谱法分离测定格列吡嗪及其杂质的方法中，色谱柱可以采用不同品牌的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，具体的，所述色谱柱可为本领域常见的C18色谱柱，例如Agilent SB C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，Kromasil100-5 C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)或Welch Ultimate XB-C18色谱柱(250×4.6mm，5μm)等。
在本发明的一个优选的具体方案中，在本发明所述通过高效液相色谱法分离测定格列吡嗪及其杂质的方法，所述测定方法采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，其检测条件如下：
固定相：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×150mm，5μm)
流动相：
A相：0.015mol/L磷酸二氢钾，用磷酸调节pH值至3.7
B相：乙腈
C相：甲醇
柱温：25℃
进样量：20μL
进样浓度：0.0004～2mg/mL
流速：1.0mL/min
检测波长：225nm
所述测定方法包含以下步骤：
1)配制样品溶液：采用初始配比流动相作为溶剂配制格列吡嗪供试品溶液和含其杂质0.0004～2mg/mL的混合溶液；
2)进样；
3)采用梯度洗脱法洗脱：
阶段 V<sub>A相</sub>(％) V<sub>B相</sub>(％) V<sub>C相</sub>(％) 洗脱时间
0 65 25 10 7min
1 50 30 20 5min
2 40 35 25 6min
3 30 45 25 6min
4)记录色谱图并进行分析。
本发明所述的测定方法可以进一步用于格列吡嗪原料或其制剂的生产中，可对格列吡嗪原料或其制剂的质量进行控制，亦可用于格列吡嗪合成中的过程监控。
本发明相对于现有技术具有如下的有益效果：
本发明提供一种通过高效液相色谱法分离测定格列吡嗪及其杂质的方法，能控制格列吡嗪中的杂质含量，可实现格列吡嗪与各杂质的同时完全分离，其与各杂质的分离度均大于1.5，理论塔板数按格列吡嗪峰计算大于5000，在相同的信噪比约3:1，进样体积为20μL时，检测限约为0.02μg/mL，线性范围的进样浓度约为0.0001～0.02mg/mL，线性范围广，精密度高，重复性好，回收率高，且分析时间短，效率高。利用本发明的方法可以准确地进行原料药格列吡嗪及其制剂的有关物质的定量分析，从而保证了格列吡嗪及其制剂的质量可控性，且可提升日常原料药或制剂的相关分析工作效率。
附图说明
图1是实施例1所得HPLC谱图。
图2是实施例2所得HPLC谱图。
图3是实施例3所得HPLC谱图。
图4是实施例4所得HPLC谱图。
图5是实施例5所得HPLC谱图。
图6是对比例1所得HPLC谱图。
图7是对比例2所得HPLC谱图。
图8是对比例3所得HPLC谱图。
图9是对比例4所得HPLC谱图。
图10是对比例5所得HPLC谱图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。
实施例1
仪器：Agilent 1260InfinityII；
固定相：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×150mm，5μm)；
流动相：
A相：0.015mol/L磷酸二氢钾，用磷酸调节pH值至3.7；
B相：乙腈；
C相：甲醇；
柱温：25℃；
进样量：20μL；
流速：1.0mL/min；
检测波长：225nm；
流动相的配制：
A相：取磷酸二氢钾2.04g，加水溶解并稀释至1000mL，用磷酸调节pH值至3.7；
B相：乙腈；
C相：甲醇。
流动相梯度设置：
阶段 V<sub>A相</sub>(％) V<sub>B相</sub>(％) V<sub>C相</sub>(％) 洗脱时间
0 65 25 10 7min
1 50 30 20 5min
2 40 35 25 6min
3 30 45 25 6min
溶液配制：
稀释剂：0.015mol/L磷酸二氢钾(用磷酸调节pH值至3.7)-乙腈-甲醇(65:25:10)(即初始配比流动相)
格列吡嗪与各杂质对照品储备溶液(杂质A～L)：取格列吡嗪和杂质对照品各适量，分别置不同的50mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至50mL，摇匀，定量稀释制成每1ml中含格列吡嗪和各杂质100μg的溶液。
取格列吡嗪与各杂质对照品储备溶液(杂质A～L)作定位溶液。
分离度溶液：取格列吡嗪对照品约20mg，精密称定，置50mL量瓶中，加甲醇20mL溶解，精密量取各杂质对照品储备溶液适量，置同一50mL量瓶中，用稀释剂定量稀释制成每1mL含格列吡嗪0.4mg、杂质A 1.2μg、杂质E 0.4μg、其余各杂质0.6μg的混合溶液，作为分离度溶液。
测定：精密量取定位溶液20μL注入液相色谱仪，其中杂质A、杂质D、杂质F、杂质G、杂质H、杂质K、杂质J、格列吡嗪、杂质E、杂质C、杂质I和杂质L依次出峰，各成分峰之间的分离度均应符合要求，保留时间分别为4.521min、5.620min、6.168min、8.421min、9.200min、10.650mon、11.599min、15.756min、17.282min、18.921min、21.821min、22.774min。取分离度溶液20mL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见图1。格列吡嗪与杂质A、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L的保留时间分别为15.698min、4.469min、18.854min、5.521min、17.056min、6.132min、8.387min、9.123min、21.628min、11.543min、10.521min、22.625min。本实施例的色谱条件可以有效区分格列吡嗪和杂质A～L等12个杂质的出峰，格列吡嗪与杂质A～L达到基线分离，且基线平稳，不存在峰裂的情况，相邻色谱峰分离度大于1.5，专属性强，灵敏度高。实验中发现，流动相A相pH值为3.7时，格列吡嗪与各杂质峰峰型无前沿或拖尾，格列吡嗪与杂质A～L峰型良好，采用该方法可以实现对杂质A～G的定性检测和定量检测。采用本实施例的色谱条件，不仅可以有效区分格列吡嗪和杂质A～L的出峰，实现对格列吡嗪以及杂质A～L的定性检测和定量检测，更有利于辨识与定位，且出峰时间较短，更有利于提升日常原料药或制剂的相关分析工作效率。
实施例2
仪器：Agilent 1260InfinityII；
固定相：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×150mm，5μm)；
流动相：
A相：0.010mol/L磷酸二氢钾，用磷酸调节pH值至3.5；
B相：乙腈；
C相：甲醇；
柱温：20℃；
进样量：15μL；
流速：0.8mL/min；
检测波长：225nm；
流动相的配制：
A相：取磷酸二氢钾1.36g，加水溶解并稀释至1000mL，用磷酸调节pH值至3.5；
B相：乙腈；
C相：甲醇。
流动相梯度设置：
阶段 V<sub>A相</sub>(％) V<sub>B相</sub>(％) V<sub>C相</sub>(％) 洗脱时间
0 75 20 5 8min
1 60 25 15 6min
2 42 33 25 7min
3 33 42 25 7min
溶液配制方法及测定方法参考实施例1进行，记录色谱图2。本实施例的色谱条件可以有效区分格列吡嗪和杂质A～L等杂质的出峰，格列吡嗪与杂质A、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L的保留时间分别为18.012min、5.806min、21.958min、6.312min、19.887min、7.292min、9.225min、10.485min、25.021min、13.127min、12.065min、26.215min。格列吡嗪和杂质A～L达到基线分离，专属性强，灵敏度高，采用该方法可以实现对格列吡嗪和杂质A～L的定性检测和定量检测。
实施例3
仪器：Agilent 1260InfinityII；
固定相：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×150mm，5μm)；
流动相：
A相：0.018mol/L磷酸二氢钾，用磷酸调节pH值至4.0；
B相：乙腈；
C相：甲醇；
柱温：30℃；
进样量：30μL；
流速：1.2mL/min；
检测波长：225nm；
流动相的配制：
A相：取磷酸二氢钾2.45g，加水溶解并稀释至1000mL，加入磷酸调节pH值至4.0；
B相：乙腈；
C相：甲醇。
流动相梯度设置：
阶段 V<sub>A相</sub>(％) V<sub>B相</sub>(％) V<sub>C相</sub>(％) 洗脱时间
0 60 30 10 6min
1 43 32 25 5min
2 35 40 25 4min
3 25 50 25 5min
溶液配制方法及测定方法参考实施例1进行，记录色谱图3。本实施例的色谱条件可以有效区分格列吡嗪和杂质A～L等杂质的出峰，格列吡嗪与杂质A、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L的保留时间分别为12.855min、3.958min、16.281min、4.356min、14.126min、5.556min、6.783min、7.905min、17.345min、10.011min、8.902min、18.374min。格列吡嗪和杂质A～L达到基线分离，专属性强，灵敏度高，采用该方法可以实现对格列吡嗪和杂质A～L的定性检测和定量检测。
实施例4
仪器：Agilent 1260InfinityII；
固定相：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×150mm，5μm)；
流动相：
A相：0.013mol/L磷酸二氢钾，用磷酸调节pH值至3.6；
B相：乙腈；
C相：甲醇；
柱温：22℃；
进样量：18μL；
流速：0.9mL/min；
检测波长：225nm；
流动相的配制：
A相：取磷酸二氢钾1.77g，加水溶解并稀释至1000mL，用磷酸调节pH值至3.6；
B相：乙腈；
C相：甲醇。
流动相梯度设置：
阶段 V<sub>A相</sub>(％) V<sub>B相</sub>(％) V<sub>C相</sub>(％) 洗脱时间
0 71 22 7 8min
1 55 28 17 5min
2 41 34 25 7min
3 32 43 25 6min
溶液配制方法及测定方法参考实施例1进行，记录色谱图4。本实施例的色谱条件可以有效区分格列吡嗪和杂质A～L等杂质的出峰，格列吡嗪与杂质A、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L的保留时间分别为18.031min、6.004min、21.726min、6.722min、19.501min、7.583min、9.547min、10.732min、23.961min、12.671min、11.861min、25.021min。格列吡嗪和杂质A～L达到基线分离，专属性强，灵敏度高，采用该方法可以实现对格列吡嗪和杂质A～L的定性检测和定量检测。
实施例5
仪器：Agilent 1260InfinityII；
固定相：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×150mm，5μm)；
流动相：
A相：0.017mol/L磷酸二氢钾，用磷酸调节pH值至3.8；
B相：乙腈；
C相：甲醇；
柱温：28℃；
进样量：28μL；
流速：1.1mL/min；
检测波长：225nm；
流动相的配制：
A相：取磷酸二氢钾2.31g，加水溶解并稀释至1000mL，用磷酸调节pH值至3.8；
B相：乙腈；
C相：甲醇。
流动相梯度设置：
阶段 V<sub>A相</sub>(％) V<sub>B相</sub>(％) V<sub>C相</sub>(％) 洗脱时间
0 62 28 10 7min
1 46 31 23 5min
2 37 38 25 5min
3 27 48 25 6min
溶液配制方法及测定方法参考实施例1进行，记录色谱图5。本实施例的色谱条件可以有效区分格列吡嗪和杂质A～L等杂质的出峰，格列吡嗪与杂质A、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L的保留时间分别为15.014min、3.901min、18.745min、4.128min、16.502min、5.256min、7.185min、8.425min、20.277min、10.185min、9.321min、22.154min。格列吡嗪和杂质A～L达到基线分离，专属性强，灵敏度高，采用该方法可以实现对格列吡嗪和杂质A～L的定性检测和定量检测。
对比例1
仪器：Agilent 1260InfinityII；
固定相：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×150mm，5μm)；
流动相：
A相：0.008mol/L磷酸二氢钾，用磷酸调节pH值至3.3；
B相：乙腈；
C相：甲醇；
柱温：18℃；
进样量：12μL；
流速：0.5mL/min；
检测波长：225nm；
流动相的配制：
A相：取磷酸二氢钾1.09g，加水溶解并稀释至1000mL，用磷酸调节pH值至3.3；
B相：乙腈；
C相：甲醇。
流动相梯度设置：
阶段 V<sub>A相</sub>(％) V<sub>B相</sub>(％) V<sub>C相</sub>(％) 洗脱时间
0 82 15 3 11min
1 70 20 10 6min
2 50 30 20 14min
3 40 40 20 5min
溶液配制方法及测定方法参考实施例1进行，记录色谱图6。本对比例的色谱条件不能有效区分格列吡嗪和杂质A～L等杂质的出峰，如图6所示，杂质L未能出峰，杂质E与格列吡嗪色谱峰不能完全分离，且部分峰型出现前沿。经分析，该条件下梯度洗脱，有机相比例较低，洗脱能力较弱，杂质间存在峰型重叠以及不出峰的现象，流动相pH值较低，导致前沿峰的出现。因此，采用该方法不可以实现对格列吡嗪、以及杂质A～L的定性检测和定量检测。
对比例2
仪器：Agilent 1260InfinityII；
固定相：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×150mm，5μm)；
流动相：
A相：0.02mol/L磷酸二氢钾，用磷酸调节pH值至4.2；
B相：乙腈；
C相：甲醇；
柱温：35℃；
进样量：35μL；
流速：1.3mL/min；
检测波长：225nm；
流动相的配制：
A相：取磷酸二氢钾2.72g，加水溶解并稀释至1000mL，用磷酸调节pH值至4.2；
B相：乙腈；
C相：甲醇。
流动相梯度设置：
阶段 V<sub>A相</sub>(％) V<sub>B相</sub>(％) V<sub>C相</sub>(％) 洗脱时间
0 53 32 15 5min
1 32 38 30 4min
2 25 45 30 4min
3 15 55 30 6min
溶液配制方法及测定方法参考实施例1进行，记录色谱图7。本对比例的色谱条件不能有效区分格列吡嗪和杂质A～L等杂质的出峰，如图7所示，杂质A与杂质D峰型重叠，格列吡嗪与杂质E峰型重叠，杂质C和杂质I峰型部分重叠，且部分峰型存在拖尾现象。经分析，该条件下梯度洗脱，有机相比例较高，洗脱能力较强，杂质间存在峰型重叠的现象，且pH值偏高，造成峰型拖尾，峰型较差。因此，采用该方法不可以实现对格列吡嗪、以及杂质A～L的定性检测和定量检测。
对比例3(参考欧洲药典9.7版格列吡嗪有关物质的测定方法进行实验)
仪器：Agilent 1260InfinityII；
固定相：BDS Hypersil C18，(0.25m×4.6mm，5μm)；
流动相：
A相：水(醋酸调节pH至3.5)；
B相：乙腈；
柱温：25℃；
进样量：50μL；
流速：1.0mL/min；
检测波长：225nm；
流动相梯度设置：
Figure BDA0002586812580000151
Figure BDA0002586812580000161
溶液的配制：
稀释剂：乙腈：水(醋酸调节pH值至3.5)＝75:25(即初始配比流动相)
格列吡嗪与各杂质对照品储备溶液(杂质A～L)：取格列吡嗪和杂质对照品各适量，分别置不同的50mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至50mL，摇匀，定量稀释制成每1ml中含格列吡嗪和各杂质100μg的溶液。
取格列吡嗪与各杂质对照品储备溶液(杂质A～L)作定位溶液。
分离度溶液：取格列吡嗪对照品约20mg，精密称定，置50mL量瓶中，加甲醇20mL溶解，精密量取各杂质对照品储备溶液适量，置同一50mL量瓶中，用稀释剂定量稀释制成每1mL含格列吡嗪0.4mg、杂质A1.2μg、杂质E 0.4μg、其余各杂质0.6μg的混合溶液，作为分离度溶液。
测定：精密量取定位溶液50μL注入液相色谱仪，其中杂质A、杂质D、杂质F、杂质G、杂质H、杂质K、杂质J、杂质E、杂质C、杂质I依次出峰。取分离度溶液20μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图8，如图8所示，杂质K与杂质J峰型存在部分重叠，格列吡嗪与杂质E峰型存在部分重叠，两杂质间分离度均小于1.5，影响积分计算，杂质L未能检测到，且各杂质检测时间相对本实验实施例较长，因此，欧洲药典9.7版格列吡嗪有关物质的测定方法不能完全有效实现格列吡嗪、以及杂质A～L的定性检测和定量检测。
对比例4
仪器：Agilent 1260InfinityII；
固定相：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×150mm，5μm)；
流动相：
A相：0.015mol/L磷酸二氢钠，用磷酸调节pH值至3.7；
B相：乙腈；
C相：甲醇；
柱温：25℃；
进样量：20μL；
流速：1.0mL/min；
检测波长：225nm；
流动相的配制：
A相：取磷酸二氢钠1.80g，加水溶解并稀释至1000mL，用磷酸调节pH值至3.7；
B相：乙腈；
C相：甲醇。
流动相梯度设置：
阶段 V<sub>A相</sub>(％) V<sub>B相</sub>(％) V<sub>C相</sub>(％) 洗脱时间
0 65 25 10 7min
1 50 30 20 5min
2 40 35 25 6min
3 30 45 25 6min
溶液配制方法及测定方法参考实施例1进行，记录色谱图9。结果显示，杂质D与杂质F，杂质H和杂质K，格列吡嗪与杂质E峰型重叠，存在峰型重叠的杂质分离度均小于1.5，影响积分计算。经分析，磷酸二氢钾与磷酸二氢钠两者离子强度不一样，缓冲盐中的钠离子使部分杂质保留时间缩短，提前出峰，因此，造成部分杂质间的峰型重叠。
对比例5
仪器：Agilent 1260InfinityII；
固定相：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×150mm，5μm)；
流动相：
A相：0.015mol/L磷酸二氢钾，用磷酸调节pH值至3.7；
B相：乙腈；
柱温：25℃；
进样量：20μL；
流速：1.0mL/min；
检测波长：225nm；
流动相的配制：
A相：取磷酸二氢钾2.04g，加水溶解并稀释至1000mL，用磷酸调节pH值至3.7；
B相：乙腈。
流动相梯度设置：
阶段 V<sub>A相</sub>(％)：V<sub>B相</sub>(％) 洗脱时间
0 75:25 7min
1 70:30 6min
2 65:35 11min
3 55:45 8min
溶液配制方法及测定方法参考实施例1进行，记录色谱图10。本对比例的色谱条件不能有效区分格列吡嗪和杂质A～L等杂质的出峰，如图10所示，杂质K与杂质J峰型重叠，杂质C与杂质I未能检出。经分析，该条件下梯度洗脱，有机相比例较低，洗脱能力相对较弱，杂质间存在峰型重叠的现象或未能检出，整体出峰时间较长。因此，采用该方法不可以实现对格列吡嗪、以及杂质A～L的定性检测和定量检测。
综上所述，本发明的分析方法可以同时检测到格列吡嗪与杂质A～L等十一个杂质，不仅实现相关杂质的一次性有效分离，可以进一步实现定性检测和定量检测，有利于格列吡嗪原料药及制剂的质量控制，还可以快速分离分析格列吡嗪与其相关杂质，省时高效。本发明的分析方法，可分离分析目前格列吡嗪的绝大多数已知杂质，较现有技术公开的检测方法，具有更高的普适性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种通过高效液相色谱法分离测定格列吡嗪及其杂质的方法，所述测定方法采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，其检测条件如下：
流动相：
A相：0.010～0.018mol/L磷酸二氢钾，用磷酸调节pH值至3.5～4.0
B相：乙腈
C相：甲醇
柱温：20～30℃
进样量：15～30μL
进样浓度：0.0003～2mg/mL
流速：0.8～1.2mL/min
检测波长：225nm
所述测定方法包含以下步骤：
1)配制样品溶液：采用初始配比流动相作为溶剂配制格列吡嗪供试品溶液和含其杂质0.0003～2mg/mL的混合溶液；
2)进样；
3)采用梯度洗脱法洗脱；
4)记录色谱图并进行分析。
2.根据权利要求1所述的通过高效液相色谱法分离测定格列吡嗪及其杂质的方法，其特征在于，所述的色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×150mm，5μm)。
3.根据权利要求1所述的通过高效液相色谱法分离测定格列吡嗪及其杂质的方法，其特征在于，所述流动相A相中磷酸二氢钾浓度为0.015mol/L。
4.根据权利要求1所述的通过高效液相色谱法分离测定格列吡嗪及其杂质的方法，其特征在于，所述pH值为用磷酸调节pH值至3.7。
5.根据权利要求1所述的通过高效液相色谱法分离测定格列吡嗪及其杂质的方法，其特征在于，所述梯度洗脱法洗脱，洗脱梯度为：
阶段 V<sub>A相</sub>(％) V<sub>B相</sub>(％) V<sub>C相</sub>(％) 洗脱时间 0 80～60％ 30～20％ 10～5％ 0～8min 1 60～40％ 32～25％ 25～15％ 3～6min 2 42～35％ 40～33％ 25 4～7min 3 33～25％ 50～42％ 25 5～7min
。
6.根据权利要求5所述的通过高效液相色谱法分离测定格列吡嗪及其杂质的方法，其特征在于，所述梯度洗脱法洗脱，洗脱梯度为：
阶段 V<sub>A相</sub>(％) V<sub>B相</sub>(％) V<sub>C相</sub>(％) 洗脱时间 0 65 25 10 7min 1 50 30 20 5min 2 40 35 25 6min 3 30 45 25 6min
。
7.根据权利要求1所述的通过高效液相色谱法分离测定格列吡嗪及其杂质的方法，其特征在于，所述柱温为25℃，进样量为20μL，进样浓度为0.0004～2mg/mL，流速为1.0mL/min。
8.一种通过高效液相色谱法分离测定格列吡嗪及其杂质的方法，所述测定方法采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，其检测条件如下：
固定相：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×150mm，5μm)
流动相：
A相：0.015mol/L磷酸二氢钾，用磷酸调节pH值至3.7
B相：乙腈
C相：甲醇
柱温：25℃
进样量：20μL
进样浓度：0.0004～2mg/mL
流速：1.0mL/min
检测波长：225nm
所述测定方法包含以下步骤：
1)配制样品溶液：采用初始配比流动相作为溶剂配制格列吡嗪供试品溶液和含其杂质0.0004～2mg/mL的混合溶液；
2)进样；
3)采用梯度洗脱法洗脱：
阶段 V<sub>A相</sub>(％) V<sub>B相</sub>(％) V<sub>C相</sub>(％) 洗脱时间 0 65 25 10 7min 1 50 30 20 5min 2 40 35 25 6min 3 30 45 25 6min
4)记录色谱图并进行分析。
9.权利要求1至8任意一项所述的测定方法在格列吡嗪原料或制剂生产中的用途。
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