CN111610272B - 一种液相色谱法分离测定小檗碱及其杂质的方法 - Google Patents

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CN111610272B CN202010503329.5A CN202010503329A CN111610272B CN 111610272 B CN111610272 B CN 111610272B CN 202010503329 A CN202010503329 A CN 202010503329A CN 111610272 B CN111610272 B CN 111610272B
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Abstract

本发明公开了一种通过高效液相色谱法分离测定小檗碱及其杂质的方法和用途，所述测定方法采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，其检测条件如下：色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相为0.03～0.08mol/L磷酸二氢铵‑乙腈，流动相pH为3.0～3.5，柱温：23～28℃，进样量：5～15μL，进样浓度：0.0005～2mg/mL，流速：0.8～1.2mL/min，检测波长：236nm，梯度洗脱。本发明方法精密度高，重复性好，回收率高，可以广泛用于不同来源的小檗碱原料药及其对应制剂的质量检测。

Description

一种液相色谱法分离测定小檗碱及其杂质的方法
技术领域
本发明属于药物分析领域，具体涉及通过高效液相色谱法分离测定小檗碱及其杂质的方法。
背景技术
小檗碱(Berberine)，是多种小檗碱属植物茎、根中主要的异喹啉生物碱，具有括抗炎、抗菌、抗肿瘤、保护神经、降糖、降脂等作用，被用来治疗一系列疾病，如肠道感染，肠胃炎等。小檗碱化学式为5，6-二氢-9，10-二甲氧苯并[g]-1，3-苯并二氧戊环[5，6-α]喹嗪，分子式为C20H18NO4，分子量为336.37，小檗碱的结构式为：
Figure BDA0002525617910000011
在小檗碱的生产和贮藏过程中，可能会由于起始物料和中间体去除不完全以及贮藏过程中生成的降解杂质而影响药物的纯度，这些影响药物纯度的物质称为有关物质。上述有关物质皆无治疗作用，还可能影响药物的稳定性和疗效，甚至危害人体健康。
化合物原料药可通过合成或天然产物提取获得，而两者在杂质的种类以及数量上存在一定区别。本方案的小檗碱原料，采用合成的方法获得。小檗碱在生产和贮藏过程中，可产生以下盐酸药根碱、盐酸巴马汀和杂质1～7的杂质，其结构式和化学式等信息如下表所示：
Figure BDA0002525617910000012
Figure BDA0002525617910000021
Figure BDA0002525617910000031
《中国药典2015年版》中关于盐酸小檗碱的有关物质的记载，使用高效液相色谱法(通则0512)试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.01mol/L磷酸二氢铵溶液(用磷酸调节pH值至2.8)-乙腈(75:25)为流动相；检测波长为345nm，检查盐酸药根碱和盐酸巴马汀。
岳清洪等人发表了《黄连的3D-HPLC特征指纹图谱研究》，该文献报导了一种液相方法，色谱柱为XtimateTM C18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为30mmol/L碳酸氢铵溶液(含0.1％三乙胺、0.7％氨水)-乙腈(梯度洗脱，(0～15min，10％→25％B；15～25min，25％→30％B；25～40min，30％→45％B))，检测波长为200～400nm，柱温为30℃，流速为1.0mL/min。用以标定木兰花碱、盐酸药根碱、盐酸非洲防己碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱7种生物碱类成分。
刘晶晶等人发表了《与黄连功能对应的5种药效组分分析》，该文献报导了一种液相方法，流动相为A相：30mmol/L碳酸氢氨水溶液(含有0.7％氨水，0.1％三乙胺)，B相：乙腈；线性洗脱程序为0～15min 10％～20％B，15～20min 20％～25％B，20～25min 25％～30％B，25～40min 30％～45％B，40～45min 45％～10％B。检测波长356nm；进样量30μL，流速1mL/min；室温。用以分离分析盐酸药根碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马丁、盐酸小檗碱。
冯友龙等人发表了一种小檗碱高效液相色谱法色谱条件的优化，具体的色谱柱：Diamond Cl8柱、Phenomenex luna C18柱、Kromasil Cl8柱等品牌效果较好，流动相：是磷酸盐缓冲液，20mmol/L的磷酸二氢钾或磷酸二氢钠溶液，以磷酸调节pH值至一定数值(大多数为3.0～3.5，少有5.0者)，检测波长可选择265～270或345～350nm。
药根碱和巴马汀是小檗碱的结构类似物，杂质1、杂质2、杂质6和杂质7是小檗碱在合成过程中容易引入的杂质，杂质3是小檗碱的异构体杂质，杂质4和杂质5是小檗碱碱性条件下的降解杂质。申请人发现，以上专利或文献只能部分分离测定小檗碱与其杂质，并不能实现同时分离测定小檗碱与该九个杂质，且目前尚未见关于小檗碱与该九个杂质的同时分离测定方法，本发明从现有技术的不足出发，提供一种分析方法，能够准确，快速分离测定小檗碱与该九个杂质，且该方法灵敏度高，线性范围宽，在日常生产中起到控制小檗碱的质量、提高药品疗效、降低毒副作用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种通过高效液相色谱法分离测定小檗碱及其杂质的方法，该方法较现有技术公开的方法更具有普适性，表现为：采用该方法可以实现各杂质的同时分离，进而有利于实现对原料药或制剂中有关物质更准确的定性/定量分析，以及有利于实现对原料药或制剂在制备、贮存过程中潜在可能产生的未知杂质的有效质量控制。
本发明的上述目的通过以下技术方案予以实现：
本发明公开了一种通过高效液相色谱法分离测定小檗碱及其杂质的方法，所述测定方法采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，其检测条件如下：
流动相：
A相：0.03～0.08mol/L磷酸二氢铵，用磷酸调节pH值至3.0～3.5
B相：乙腈
柱温：23～28℃
进样量：5～15μL
进样浓度：0.0005～2mg/mL
流速：0.8～1.2mL/min
检测波长：236nm
所述测定方法包含以下步骤：
1)配制样品溶液：使用初始配比流动相配制含小檗碱及其杂质各0.0005～2mg/mL的溶液；
2)进样；
3)采用梯度洗脱法洗脱；
4)记录色谱图并进行分析。
所述高效液相色谱法分离测定小檗碱及其杂质的方法中梯度洗脱的设置是实现检测效果的重要技术关键。具体的，研究人员发现0至15min时使用等度洗脱可以有效分离杂质2和盐酸药根碱，但保持等度洗脱的情况下，无法分离其余的杂质，杂质各峰之间存在重合、包覆或者峰型不佳的现象，不利于杂质的定性及定量检测，因此在0至15min等度洗脱后，分梯度逐渐增加流动相的极性，最后洗脱较强保留的杂质，并保证相关洗脱峰的峰型及各峰的分离度，所述梯度洗脱设置如下：
阶段 V<sub>A相</sub>：V<sub>B相</sub> 洗脱时间
0 80:20～75:25 0min
1 80:20～75:25 0-15min
2 75:25～60:40 2-5min
3 60:40～50:50 3-7min
4 50:50～35:65 15-20min
5 50:50～35:65 5-15min
上述梯度洗脱设置中，所述洗脱时间指代该阶段洗脱所持续的时长，流动相的比例(VA相：VB相)指代到达该洗脱时间终点时流动相的比例，其中阶段0指代流动相的起始比例，即：在该洗脱时间段内，流动相的比例由前一个时间段的终点值变至本时间段的终点值，如无特指，本发明中所有梯度设置的解释均遵从于此。优选的，流动相的比例在洗脱时间内为匀速改变。
更具体的，上述梯度洗脱流动相的比例(VA相：VB相)为以下比例时，有利于较优的分离效果，如下：
阶段 V<sub>A相</sub>：V<sub>B相</sub> 洗脱时间
0 77:23 0min
1 77:23 9min
2 65:35 2min
3 55:45 4min
4 40:60 20min
5 40:60 15min
所述高效液相色谱法分离测定小檗碱及其杂质的方法中，流动相中磷酸二氢铵的浓度、以及pH也是决定分离效果的重要因素之一，具体的，当流动相中磷酸二氢铵浓度为0.03-0.08mol/L时，分离效果较好，峰型尖锐无分叉，用磷酸调节pH值为3.0～3.5时，峰型较好且对称，拖尾较轻，与本发明的其他检测条件诸如流动相、流速等相结合，整体分离度较好，而当pH大于3.5后，拖尾现象愈发明显，而在磷酸二氢铵中加入1.0％三乙胺则可减少拖尾现象。
更具体的，流动相中磷酸二氢铵浓度为0.05mol/L时，用磷酸调节pH值为3.2，检测效果最佳。
所述高效液相色谱法分离测定小檗碱及其杂质的方法中，柱温需要控制在23至28℃之间，过低的柱温会严重影响柱效，而过高的柱温则会损坏色谱柱；优选的，当所述高效液相色谱法分离测定小檗碱及其杂质的方法中柱温为25℃时，各成分的出峰时间及峰型峰最佳，检测效果最好。
所述高效液相色谱法分离测定小檗碱及其杂质的方法中，进样量需要控制在5～15μL，进样浓度需要控制在0.0005～2mg/mL，此时浓度与峰面积之间成线性关系，所述样品溶液使用初始配比流动相配制，初始配比流动相是指阶段0时配比的流动相，使用初始配比流动相配制样品溶液，可以避免溶剂效应的产生，减少峰的干扰现象；优选的，当所述进样量为10μL，进样浓度为0.0005～1mg/mL时，与本发明的其他检测条件诸如流动相、流速等相结合，单位检测的样品量可以最大程度的发挥流动洗脱的效果，有利于实现各成分峰分离，且检测结果最为准确。
所述高效液相色谱法分离测定小檗碱及其杂质的方法中，流动相的流速是实现检测效果的技术关键之一，具体的，流动相的流速过高会加快洗脱速度，缩短出峰时间，并且不利于实现分离效果，而过低的流速则会降低洗脱速度，在出峰时间延迟的同时也会拉宽各组分峰宽，同样不利于实现分离效果，也降低了检测效率；具体的，当流动相的流速控制在0.8～1.2mL/min时，所述方法兼顾检测效率和分离度，有利于实现最佳检测效果，更具体的，当流速为1.0mL/min时，检测效果最佳。
所述高效液相色谱法分离测定小檗碱及其杂质的方法中，色谱柱可以采用不同品牌的以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，具体的，所述色谱柱可为本领域常见的C18色谱柱，例如：YMC Triart C18色谱柱(4.6mm×150mm，3μm)，ACE Excel 3 SurperC18(4.6mm×150mm，3μm)等。
所述高效液相色谱法分离测定小檗碱及其杂质的方法中，所述杂质为盐酸药根碱、盐酸巴马汀、杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6以及杂质7中的一种或多种，所述杂质结构式为：
Figure BDA0002525617910000071
Figure BDA0002525617910000081
在本发明的一个优选的具体方案中，在本发明所述通过高效液相色谱法分离测定小檗碱及其杂质的方法中，所述杂质为盐酸药根碱、盐酸巴马汀、杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6以及杂质7中的一种或多种，所述杂质结构式为：
Figure BDA0002525617910000082
Figure BDA0002525617910000091
采用以下方式进行：
固定相：YMC Triart C18色谱柱(4.6mm×150mm，3μm)
流动相：
A相：0.05mol/L磷酸二氢铵-1.0％三乙胺，用磷酸调节pH值至3.2
B相：乙腈
柱温：25℃
进样量：10μL
进样浓度：0.0005～1mg/mL
流速：1.0mL/min
检测波长：236nm
所述测定方法包含以下步骤：
1)配制样品溶液：使用初始配比流动相配制含小檗碱及其杂质各0.0005～1mg/mL的溶液；
2)进样；
3)采用梯度洗脱法洗脱：
阶段 V<sub>A相</sub>：V<sub>B相</sub> 洗脱时间
0 77:23 0min
1 77:23 9min
2 65:35 2min
3 55:45 4min
4 40:60 20min
5 40:60 15min
4)记录色谱图并进行分析。
本发明所述的测定方法可以进一步用于小檗碱原料或其制剂的生产中，可对小檗碱原料或其制剂的质量进行控制，亦可用于小檗碱合成中的过程监控。
本发明相对于现有技术具有如下的有益效果：
本发明提供一种通过高效液相色谱法分离测定小檗碱及其杂质的方法，能控制小檗碱中的杂质含量，可实现小檗碱与各杂质的同时完全分离，其与各杂质的分离度均大于1.2，理论塔板数按小檗碱峰计算大于3000，在相同的信噪比3:1，进样体积为10μL时，检测限约为0.02μg/mL，线性范围的进样浓度约为0.0001～0.02mg/mL，线性范围广，精密度高，重复性好，回收率高。利用本发明的方法可以准确地进行原料药小檗碱及其制剂的有关物质的定量分析，从而保证了小檗碱及其制剂的质量可控性。
附图说明
图1是实施例1所得HPLC谱图。
图2是实施例2所得HPLC谱图。
图3是实施例3所得HPLC谱图。
图4是实施例4所得HPLC谱图。
图5是实施例5所得HPLC谱图。
图6是对比例1所得HPLC谱图。
图7是对比例2所得HPLC谱图。
图8是对比例3所得HPLC谱图。
图9是对比例4所得HPLC谱图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。
实施例1
仪器：Agilent 1260 InfinityⅡ；
固定相：YMC Triart C18色谱柱(4.6mm×150mm，3μm)；
流动相：
A相：0.05mol/L磷酸二氢铵-1.0％三乙胺，用磷酸调节pH值至3.2；
B相：乙腈；
柱温：25℃；
进样量：10μL；
流速：1.0mL/min；
检测波长：236nm；
流动相的配制：
A相：取磷酸二氢铵5.75g，加水溶解并稀释至1000mL，加入1.0％的三乙胺后再加入磷酸调节pH值至3.2；
B相：乙腈。
流动相梯度设置：
Figure BDA0002525617910000111
Figure BDA0002525617910000121
溶液配制：
空白溶剂：0.05mol/L磷酸二氢铵溶液(含1.0％三乙胺，用磷酸调节pH值至3.2-乙腈(77:23)(即初始配比流动相)；
杂质1储备溶液(100μg/mL)：取杂质1对照品10mg，精密称定，置100mL量瓶中，加初始配比流动相适量使溶解并稀释至刻度，即得；
杂质2储备溶液1(100μg/mL)：取杂质2对照品10mg，精密称定，置100mL量瓶中，加初始配比流动相适量使溶解并稀释至刻度，即得；
杂质3储备溶液1(100μg/mL)：取杂质3对照品10mg，精密称定，置100mL量瓶中，加初始配比流动相适量使溶解并稀释至刻度，即得；
杂质4储备溶液(300μg/mL)：取杂质4对照品30mg，精密称定，置100mL量瓶中，加初始配比流动相适量使溶解并稀释至刻度，即得；
杂质5储备溶液1(100μg/mL)：取杂质5对照品10mg，精密称定，置100mL量瓶中，加初始配比流动相适量使溶解并稀释至刻度，即得；
杂质6储备溶液(100μg/mL)：取杂质6对照品10mg，精密称定，置100mL量瓶中，加初始配比流动相适量使溶解并稀释至刻度，即得；
杂质7储备溶液1(100μg/mL)：取杂质7对照品10mg，精密称定，置100mL量瓶中，加初始配比流动相适量使溶解并稀释至刻度，即得；
盐酸小檗碱储备溶液(1mg/mL)(盐酸小檗碱定位溶液)：取盐酸小檗碱对照品10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加初始配比流动相适量使溶解并稀释至刻度，即得；
盐酸药根碱储备溶液(200μg/mL)：取盐酸药根碱对照品10mg，精密称定，置50mL量瓶中，加初始配比流动相适量使溶解并稀释至刻度，即得；
盐酸巴马汀储备溶液(200μg/mL)：取盐酸巴马汀对照品10mg，精密称定，置50mL量瓶中，加初始配比流动相适量使溶解并稀释至刻度，即得；
杂质2储备溶液2(40μg/mL)：精密量取杂质2储备液1 10mL置25mL量瓶中，用初始配比流动相稀释至刻度，混匀，即得；
杂质3储备溶液2(40μg/mL)：精密量取杂质3储备液1 10mL置25mL量瓶中，用初始配比流动相稀释至刻度，混匀，即得；
杂质5储备溶液2(40μg/mL)：精密量取杂质5储备液1 10mL置25mL量瓶中，用初始配比流动相稀释至刻度，混匀，即得；
杂质7储备溶液2(40μg/mL)：精密量取杂质7储备液1 10mL置25mL量瓶中，用初始配比流动相稀释至刻度，混匀，即得；
分离度溶液：称取盐酸小檗碱对照品20mg，精密称定，置20mL量瓶中，精密量取杂质1、4、6储备溶液、盐酸药根碱、盐酸巴马汀储备溶液各1mL，杂质2、3、5、7储备溶液2各1mL，置同一20mL量瓶中，用初始配比流动相稀释至刻度，混匀，即得；
各杂质定位溶液：精密量取杂质1、4、6储备溶液、盐酸药根碱、盐酸巴马汀储备溶液各1mL，杂质2、3、5、7储备溶液2各1mL，置不同20mL量瓶中，用初始配比流动相稀释至刻度，混匀，即得。
测定：取定位溶液各10μL注入高效液相色谱仪，检出盐酸药根碱、盐酸巴马汀、杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6以及杂质7保留时间分别为8.233min、13.815min、11.273min、7.972min、12.172min、20.381min、18.743min、47.283min、9.822min。取盐酸小檗碱与杂质的混合溶液(分离度溶液)10μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见图1，盐酸小檗碱与盐酸药根碱、盐酸巴马汀、杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6以及杂质7的保留时间分别为15.447min、8.353min、13.920min、11.393min、8.080min、12.378min、20.593min、18.853min、47.393min、10.040min。本实施例的色谱条件可以有效区分盐酸小檗碱和盐酸药根碱等9个杂质的出峰，盐酸小檗碱与盐酸药根碱、盐酸巴马汀、杂质1～7达到基线分离，且基线平稳，不存在峰裂的情况，相邻色谱峰分离度大于1.2，专属性强，灵敏度高。实验中发现，流动相添加了适量三乙胺，可抑制峰型的拖尾现象，因此，盐酸小檗碱与盐酸药根碱、盐酸巴马汀、杂质1～7峰型良好，采用该方法可以实现对盐酸药根碱、盐酸巴马汀、杂质1～7的定性检测和定量检测，更有利于辨识与定位。
实施例2
仪器：Agilent 1260 InfinityⅡ；
固定相：YMC Triart C18色谱柱(4.6mm×150mm，3μm)；
流动相：
A相：0.03mol/L磷酸二氢铵-1.0％三乙胺，用磷酸调节pH值至3.0；
B相：乙腈；
柱温：23℃；
进样量：5μL；
流速：0.8mL/min；
检测波长：236nm；
流动相的配制：
A相：取磷酸二氢铵3.45g，加水溶解并稀释至1000mL，加入1.0％的三乙胺后再加入磷酸调节pH值至3.0；
B相：乙腈。
流动相梯度设置：
阶段 V<sub>A相</sub>：V<sub>B相</sub> 洗脱时间
0 80:20 0min
1 80:20 12min
2 75:25 3min
3 60:40 5min
4 50:50 20min
5 50:50 15min
溶液配制方法及测定方法参考实施例1进行，记录色谱图2。本实施例的色谱条件可以有效区分盐酸小檗碱和盐酸药根碱等杂质的出峰，盐酸小檗碱与盐酸药根碱、盐酸巴马汀、杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6以及杂质7的保留时间分别为21.773min、11.747min、19.193min、15.920min、11.333min、17.093min、28.107min、25.660min、50.540min，14.160min。盐酸小檗碱与盐酸药根碱、盐酸巴马汀、杂质1～7达到基线分离，专属性强，灵敏度高，采用该方法可以实现对盐酸药根碱、盐酸巴马汀、杂质1～7的定性检测和定量检测。
实施例3
仪器：Agilent 1260 InfinityⅡ；
固定相：YMC Triart C18色谱柱(4.6mm×150mm，3μm)；
流动相：
A相：0.08mol/L磷酸二氢铵-1.0％三乙胺，用磷酸调节pH值至3.5；
B相：乙腈；
柱温：28℃；
进样量：15μL；
流速：1.2mL/min；
检测波长：236nm；
流动相的配制：
A相：取磷酸二氢铵9.20g，加水溶解并稀释至1000mL，加入1.0％的三乙胺后再加入磷酸调节pH值至3.5；
B相：乙腈。
流动相梯度设置：
阶段 V<sub>A相</sub>：V<sub>B相</sub> 洗脱时间
0 75:25 0min
1 75:25 8min
2 60:40 2min
3 50:50 4min
4 35:65 20min
5 35:65 15min
溶液配制方法及测定方法参考实施例1进行，记录色谱图3。本实施例的色谱条件可以有效区分盐酸小檗碱和盐酸药根碱等杂质的出峰，盐酸小檗碱与盐酸药根碱、盐酸巴马汀、杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6以及杂质7的保留时间分别为14.373min、7.833min、12.933min、10.587min、7.540min、11.493min、19.020min、17.407min、47.013min，9.393min。盐酸小檗碱与盐酸药根碱、盐酸巴马汀、杂质1～7达到基线分离，专属性强，灵敏度高，采用该方法可以实现对盐酸药根碱、盐酸巴马汀、杂质1～7的定性检测和定量检测。
实施例4
仪器：Agilent 1260 InfinityⅡ；
固定相：YMC Triart C18色谱柱(4.6mm×150mm，3μm)；
流动相：
A相：0.07mol/L磷酸二氢铵-1.0％三乙胺，用磷酸调节pH值至3.4；
B相：乙腈；
柱温：24℃；
进样量：8μL；
流速：0.9mL/min；
检测波长：236nm；
流动相的配制：
A相：取磷酸二氢铵8.05g，加水溶解并稀释至1000mL，加入1.0％的三乙胺后再加入磷酸调节pH值至3.4；
B相：乙腈。
流动相梯度设置：
阶段 V<sub>A相</sub>：V<sub>B相</sub> 洗脱时间
0 78:22 0min
1 78:22 10min
2 68:32 3min
3 58:42 5min
4 45:55 17min
5 45:55 10min
溶液配制方法及测定方法参考实施例1进行，记录色谱图4。本实施例的色谱条件可以有效区分盐酸小檗碱和盐酸药根碱等杂质的出峰，盐酸小檗碱与盐酸药根碱、盐酸巴马汀、杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6以及杂质7的保留时间分别为18.127min、9.540min、16.640min、13.447min、9.253min、14.660min、25.687min、22.180min、40.687min，11.420min。盐酸小檗碱与盐酸药根碱、盐酸巴马汀、杂质1～7达到基线分离，专属性强，灵敏度高，采用该方法可以实现对盐酸药根碱、盐酸巴马汀、杂质1～7的定性检测和定量检测。
实施例5
仪器：Agilent 1260 InfinityⅡ；
固定相：YMC Triart C18色谱柱(4.6mm×150mm，3μm)；
流动相：
A相：0.04mol/L磷酸二氢铵-1.0％三乙胺，用磷酸调节pH值至3.1；
B相：乙腈；
柱温：26℃；
进样量：12μL；
流速：1.1mL/min；
检测波长：236nm；
流动相的配制：
A相：取磷酸二氢铵4.60g，加水溶解并稀释至1000mL，加入1.0％的三乙胺后再加入磷酸调节pH值至3.1；
B相：乙腈。
流动相梯度设置：
阶段 V<sub>A相</sub>：V<sub>B相</sub> 洗脱时间
0 76:24 0min
1 76:24 8min
2 63:37 2min
3 52:48 3min
4 38:62 20min
5 38:62 15min
溶液配制方法及测定方法参考实施例1进行，记录色谱图5。本实施例的色谱条件可以有效区分盐酸小檗碱和盐酸药根碱等杂质的出峰，盐酸小檗碱与盐酸药根碱、盐酸巴马汀、杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6以及杂质7的保留时间分别为14.420min、7.860min、12.987min、10.620min、7.567min、11.533min、19.093min、17.467min、40.687min，9.427min。盐酸小檗碱与盐酸药根碱、盐酸巴马汀、杂质1～7达到基线分离，专属性强，灵敏度高，采用该方法可以实现对盐酸药根碱、盐酸巴马汀、杂质1～7的定性检测和定量检测。
对比例1
仪器：Agilent 1260 InfinityⅡ；
固定相：YMC Triart C18色谱柱(4.6mm×150mm，3μm)；
流动相：
A相：0.02mol/L磷酸二氢铵-1.0％三乙胺，用磷酸调节pH值至2.8；
B相：乙腈；
柱温：20℃；
进样量：4μL；
流速：0.7mL/min；
检测波长：236nm；
流动相的配制：
A相：取磷酸二氢铵2.30g，加水溶解并稀释至1000mL，加入1.0％的三乙胺后再加入磷酸调节pH值至2.8；
B相：乙腈。
流动相梯度设置：
阶段 V<sub>A相</sub>：V<sub>B相</sub> 洗脱时间
0 90:10 0min
1 90:10 11min
2 80:20 3min
3 70:30 6min
4 60:40 17min
5 60:40 10min
溶液配制方法及测定方法参考实施例1进行，记录色谱图6。本对比例的色谱条件不能有效区分盐酸小檗碱和盐酸药根碱等杂质的出峰，杂质2与盐酸药根碱峰型重叠，杂质6未出峰，部分色谱峰峰型较宽。经分析，该条件下梯度洗脱，流动相极性偏小，杂质间存在峰型重叠以及不出峰的现象。因此，采用该方法不可以实现对盐酸药根碱、盐酸巴马汀、杂质1～7的定性检测和定量检测。
对比例2
仪器：Agilent 1260 InfinityⅡ；
固定相：YMC Triart C18色谱柱(4.6mm×150mm，3μm)；
流动相：
A相：0.10mol/L磷酸二氢铵，用磷酸调节pH值至3.7；
B相：乙腈；
柱温：30℃；
进样量：20μL；
流速：1.4mL/min；
检测波长：236nm；
流动相的配制：
A相：取磷酸二氢铵11.50g，加水溶解并稀释至1000mL，加入1.0％的三乙胺后再加入磷酸调节pH值至3.7；
B相：乙腈。
流动相梯度设置：
阶段 V<sub>A相</sub>：V<sub>B相</sub> 洗脱时间
0 70:30 0min
1 70:30 8min
2 55:45 2min
3 45:55 2min
4 30:70 15min
5 30:70 15min
溶液配制方法及测定方法参考实施例1进行，记录色谱图7。本对比例的色谱条件不能有效区分盐酸小檗碱和盐酸药根碱等杂质的出峰，杂质2与盐酸药根碱峰型重叠，杂质1、杂质3与盐酸巴马汀峰型重叠，杂质5与盐酸小檗碱存在部分峰型重叠，部分峰型存在部分拖尾。经分析，该条件下梯度洗脱，流动相极性偏大，杂质间存在峰型重叠以及不出峰的现象，且pH值偏高，体系中没有加入三乙胺。因此，采用该方法不可以实现对盐酸药根碱、盐酸巴马汀、杂质1～7的定性检测和定量检测。
对比例3(参照中国药典2015版小檗碱有关物质的测定方法进行实验)
仪器：Agilent 1260 InfinityⅡ；
固定相：YMC Triart C18色谱柱(4.6mm×150mm，3μm)；
流动相：
A相：0.01mol/L磷酸二氢铵，用磷酸调节pH值至2.8；
B相：乙腈；
VA相：VB相＝75:25
柱温：25℃；
进样量：10μL；
流速：1.0mL/min；
检测波长：345nm；
流动相的配制：
A相：取磷酸二氢铵1.15g，加水溶解并稀释至1000mL，加入磷酸调节pH值至2.8；
B相：乙腈。
溶液配制方法参考实施例1进行，进样后采用固定比例流动相洗脱，记录色谱图8。结果显示，采用中国药典2015版小檗碱有关物质的测定方法进行实验，采用固定比例流动相洗脱，不能完全有效区分盐酸小檗碱和盐酸药根碱等杂质的出峰。部分杂质出峰时间延长，如杂质1，盐酸巴马汀，杂质5，部分杂质未能检出，经分析推断，可能存在峰型重叠，如杂质1和杂质3，而杂质4和杂质7由于流动相极性低的原因，未能检出。因此，采用中国药典2015版小檗碱有关物质的测定方法，仅能分离分析部分盐酸小檗碱中的杂质，不能达到完全有效区分的效果。
对比例4(参照《黄连的3D-HPLC特征指纹图谱研究》进行实验)
仪器：Agilent 1260 InfinityⅡ；
固定相：YMC Triart C18色谱柱(4.6mm×150mm，3μm)；
流动相：
A相：0.03mol/L碳酸氢铵溶液(含0.1％三乙胺、0.7％氨水)；
B相：乙腈；
柱温：30℃；
进样量：10μL；
流速：1.0mL/min；
检测波长：236nm；
流动相的配制：
A相：取碳酸氢铵2.37g，加水溶解并稀释至1000mL，加入1.0％的三乙胺后再加入0.7％氨水；
B相：乙腈。
流动相梯度设置：
阶段 V<sub>A相</sub>：V<sub>B相</sub> 洗脱时间
0 90:10 0min
1 75:25 15min
2 70:30 10min
3 65:45 15min
溶液配制方法参考实施例1进行，记录色谱图9。结果显示，采用《黄连的3D-HPLC特征指纹图谱研究》的测定方法进行实验，不能完全有效区分小檗碱和盐酸药根碱等杂质的出峰，杂质2与盐酸药根碱峰型重叠，杂质7，杂质1和杂质3峰型重叠，且由于流动相极性低的原因，杂质5，杂质4和杂质6未能出峰，整体出峰出峰时间延长，不利于有效分析小檗碱及其相关杂质。因此，采用《黄连的3D-HPLC特征指纹图谱研究》的测定方法，仅能分离分析部分盐酸小檗碱中的杂质，不能达到完全有效区分的效果。
综上所述，本发明的分析方法可以同时检测到盐酸药根碱、盐酸巴马汀、杂质1～7等九个杂质，实现相关杂质的一次性有效分离，并可以进一步实现定性检测和定量检测，有利于小檗碱原料药及制剂的质量控制。现有技术公开的方法，只能部分分离测定小檗碱与其杂质，并不能实现同时分离测定小檗碱与该九个杂质。因此，本方案的检测方法较现有技术公开的检测方法，具有更高的普适性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种通过高效液相色谱法分离测定小檗碱及其杂质的方法，其特征在于测定方法采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，其检测条件如下：
流动相：
A相：0.05mol/L磷酸二氢铵，用磷酸调节pH值至3.2；
B相：乙腈
柱温：23~28℃
进样量：5~15μL
进样浓度：0.0005~2mg/mL
流速：0.8~1.2mL/min
检测波长：236nm
所述测定方法包含以下步骤：
1）、配制样品溶液：使用初始配比流动相配制含小檗碱及其杂质各0.0005~2mg/mL的溶液；
2）、进样；
3）、采用梯度洗脱法洗脱；
4）、记录色谱图并进行分析;
所述的色谱柱为YMC Triart C18色谱柱4.6mm×150mm，3μm；
流动相A相还含1.0%三乙胺；
所述梯度洗脱法洗脱中，洗脱梯度为：
阶段 V<sub>A相</sub>：V<sub>B相</sub> 洗脱时间 0 77:23 0min 1 77:23 9min 2 65:35 2min 3 55:45 4min 4 40:60 20min 5 40:60 15min
所述杂质为盐酸药根碱、盐酸巴马汀、杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6和杂质7，所述杂质结构式为：
代码 杂质名称 杂质结构 分子式 分子量 - 盐酸药根碱
Figure DEST_PATH_IMAGE002
 C<sub>20</sub>H<sub>20</sub>ClNO<sub>4</sub> 373.83 - 盐酸巴马汀
Figure DEST_PATH_IMAGE004
 C<sub>21</sub>H<sub>22</sub>ClNO<sub>4</sub> 387.86 杂质1 5,6-二氢-9-羟基-10-甲氧苯并[g]-1,3-苯并二氧戊环[5,6-α]喹嗪
Figure DEST_PATH_IMAGE006
 C<sub>19</sub>H<sub>16</sub>NO<sub>4</sub> 322.33 杂质2 5,6-二氢-10-甲氧基-11-羟基苯并[g]-1,3-苯并二氧戊环[5,6-α]喹嗪
Figure DEST_PATH_IMAGE008
 C<sub>19</sub>H<sub>16</sub>NO<sub>4</sub> 322.33 杂质3 5,6-二氢-10,11-二甲氧苯并[g]-1,3-苯并二氧戊环[5,6-α]喹嗪
Figure DEST_PATH_IMAGE010
 C<sub>20</sub>H<sub>18</sub>NO<sub>4</sub> 336.36 杂质4 5,6-二氢-9,10-二甲氧苯并[g]-1,3-苯并二氧戊环[5,6-α]喹嗪-13-氧代
Figure DEST_PATH_IMAGE012
 C<sub>20</sub>H<sub>17</sub>NO<sub>5</sub> 351.35 杂质5 5,6-二氢-9,10-二甲氧苯并[g]-1,3-苯并二氧戊环[5,6-α]喹嗪-8-酮
Figure DEST_PATH_IMAGE014
 C<sub>20</sub>H<sub>17</sub>NO<sub>5</sub> 351.35 杂质6 5,6-二氢-双[1,3]苯并二氧戊环[5,6-α]喹嗪
Figure DEST_PATH_IMAGE016
 C<sub>19</sub>H<sub>14</sub>NO<sub>4</sub> 320.32 杂质7 9,10-二甲氧苯并[g]-1,3-苯并二氧戊环[5,6-α]喹嗪
Figure DEST_PATH_IMAGE018
 C<sub>19</sub>H<sub>16</sub>NO<sub>4</sub> 334.34
。
2.根据权利要求1所述的通过高效液相色谱法分离测定小檗碱及其杂质的方法，其特征在于所述柱温为25℃，进样量为10μL，进样浓度为0.0005~1mg/mL，流速为1.0mL/min。
3.权利要求1或2所述的通过高效液相色谱法分离测定小檗碱及其杂质的方法在小檗碱原料或其制剂生产中的用途。
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