CN115754026A - 一种同时测定达格列净二甲双胍含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种同时测定达格列净二甲双胍含量的方法，该方法采用反相高效液相色谱法，分离测定了达格列净二甲双胍缓释片中达格列净和二甲双胍的含量。本方法分离度良好，溶剂不干扰检测，方法专属性良好，且该检测方法简便﹑快速﹑准确﹑灵敏度高﹑重复性好以及准确度好，可以快速准确地进行达格列净二甲双胍缓释片中达格列净和盐酸二甲双胍含量的定性及定量分析，保证本品质量的可控性。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析领域，具体涉及一种同时测定达格列净二甲双胍含量的方法。
背景技术
目前，治疗II型糖尿病的常用药物有双胍类、磺酰脲类、a-葡萄糖甘酶抑制剂、噻唑烷二酮类等传统药物以及钠-葡萄糖同向转运体-2(SGLT-2)抑制剂类、二肽基肽酶-IV(DDP-IV)抑制剂等新型降糖药。钠-葡萄糖同向转运体-2(SGLT-2)为主要表达在肾脏近端小管中的蛋白质，主要作用为在肾小管对尿液中滤过的葡萄糖进行重吸收。
盐酸二甲双胍分子式为C4H11N5·HCl，分子量为165.62，结构式如式i所示。盐酸二甲双胍为高溶解性、低渗透性药物，主要作用于胰岛外组织，抑制肠吸收葡萄糖，增加外周组织对葡萄糖的利用，减少肝糖原异生，从而达到降低血糖的目的。由于盐酸二甲双胍降糖作用明显，不引起低血糖，可明显降低餐后高血糖，适合II型糖尿病患者，是治疗II型糖尿病的一线药物，同时它还改善胰岛素抗性等，因此在临床得到广泛应用。
达格列净分子式为C21H25ClO6·C3H8O2·H2O，分子量为502.98，结构式如式ii所示。达格列净为SGLT-2抑制剂，通过抑制SGLT-2来减少滤过葡萄糖的重吸收，降低肾(葡萄)糖阈值，增加尿液中葡萄糖的排泄。
达格列净和盐酸二甲双胍分别属于钠-葡萄糖同向转运体-2(SGLT-2)抑制剂类和双胍类，二者降糖机制不同，联合用药具有协同作用，还能够减少不良反应。目前上市的复方达格列净二甲双胍缓释片，商品名为Xigduo XR，用于治疗成人II型糖尿病。
发明内容
本发明的目的在于运用同一高效液相色谱体系同时进行达格列净二甲双胍缓释片中达格列净和盐酸二甲双胍的含量测定。
为实现上述目的，本发明的技术方案是：一种同时测定达格列净二甲双胍含量的方法，其特征在于，所述方法为高效液相色谱法，采用具有反相、阴离子和阳离子交换功能的混合固定相色谱柱。
在一些实施方案中，所述色谱柱采用带电荷纳米高分子微球的高纯多孔球形硅胶颗粒为固定相；在一些典型的实施方案中，所述色谱柱为Thermo Acclaim Trinity P1规格为：3mm×150mm，3μm。
在一些实施方案中，所述的方法采用磷酸二氢铵缓冲溶液-乙腈混合溶液为洗脱液，按等度洗脱。
在一些实施方案中，所述磷酸二氢铵缓冲溶液浓度为16g/L～18g/L，在一些典型的实施方案中，所述磷酸二氢铵缓冲溶液浓度为17g/L。
在一些实施方案中，所述磷酸二氢铵缓冲溶液是磷酸二氢铵水溶液。
在一些实施方案中，所述磷酸二氢铵缓冲溶液pH值为4.7～5.2；在一些典型的实施方案中，所述磷酸二氢铵缓冲溶液的pH为5.0。
在一些实施方案中，所述磷酸二氢铵缓冲溶液的pH由三乙胺调节。
在一些实施方案中，所述磷酸二氢铵缓冲溶液与乙腈的比例为75:25～71:29，在一些典型的实施方案中，所述磷酸二氢铵缓冲溶液与乙腈的比例为73:27。
在一些实施方案中，所述洗脱液的流速为每分钟0.6～1.0ml，在一些典型的实施方案中，所述洗脱液的流速为每分钟0.8ml。
在一些实施方案中，所述色谱柱柱温为32～38℃；在一些典型的实施方案中，所述色谱柱柱温为35℃。
在一些实施方案中，所述方法为带有二极管阵列检测器的高效液相色谱法，达格列净检测波长为218～222nm、盐酸二甲双胍检测波长为253～257nm；在一些典型的实施方案中，达格列净检测波长为220nm、盐酸二甲双胍检测波长为255nm。
另一方面，本发明提供了一种同时测定达格列净二甲双胍含量的方法，其特征在于：
所述分析方法是在高效液相色谱仪上进行的；其采用同时具有反相、阴离子和阳离子交换功能的混合固定相色谱柱；
所述分析方法采用二极管阵列检测器，达格列净检测波长为220nm、盐酸二甲双胍检测波长为255nm；
所述分析方法柱温为35℃；
所述分析方法以磷酸二氢铵缓冲溶液-乙腈混合溶液为洗脱液，等度洗脱，所述磷酸二氢铵缓冲液的浓度为17g/L，所述磷酸二氢铵缓冲溶液的pH为5.0，所述磷酸二氢铵缓冲溶液与乙腈的比例为73:27；
洗脱液的流速为每分钟0.8ml；
分别注入供试品溶液、对照品溶液；
通过外标法计算供试品中达格列净与二甲双胍的含量。
在一些特定的实施方案中，本发明提供了一种同时测定达格列净二甲双胍含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)供试品溶液配制：取达格列净二甲双胍缓释片适量，置玛瑙研钵中研细，全部转移至容量瓶中，加适量甲醇超声溶解，甲醇定容，精密量取上清液适量置于另一量瓶中，以17g/L磷酸二氢铵缓冲溶液(pH5.0)-乙腈(70:30)混合液稀释至刻度，摇匀，过滤，取滤液作为供试品溶液；
(2)对照品溶液的配制：精密称取达格列净和盐酸二甲双胍对照品各适量，以17g/L磷酸二氢铵缓冲溶液(pH5.0)-乙腈(70:30)混合液溶解并稀释，定容，摇匀，即得。
(3)供试品测定：采用ThermoAcclaim Trinity P1(3mm×150mm，3um)色谱柱；以17g/L磷酸二氢铵缓冲溶液(pH5.0)-乙腈(73:27)为流动相，洗脱液流速为每分钟0.8ml；柱温为35℃；采用二极管阵列检测器作为检测器，达格列净检测波长为220nm、盐酸二甲双胍检测波长为255nm；进样体积为3μl；分别量取供试品溶液、对照品溶液，分别注入液相色谱仪，进行等度洗脱，记录各色谱图；
(4)含量计算：
其中：校正因子f＝CR/AR；
CR表示达格列净/盐酸二甲双胍对照品溶液的浓度，mg/ml；
AR表示达格列净/盐酸二甲双胍对照品溶液的主峰面积；
At表示供试品溶液中达格列净/盐酸二甲双胍的主峰面积；
G表示达格列净/盐酸二甲双胍的标示量，mg；
N表示供试品稀释倍数。
本领域技术人员容易理解，在实施本发明过程中，本领域技术人员可以根据实际需求适当调整上述步骤的顺序且不影响测定方法的实施，例如对照品溶液和供试品溶液的配置顺序。
本发明中，适量是指在根据实验目的，各化合物的量均在其高效液相色谱仪的检测限或定量限范围内。
本发明中，稀释剂指17g/L磷酸二氢铵缓冲溶液(pH5.0)-乙腈(70:30)混合液。
本发明中，“mL”是指毫升；“mg”是指毫克；“μg”是指微克；“min”是指分钟。
本发明的有益效果：采用本发明提供的方法可以准确测定达格列净二甲双胍缓释片中达格列净和盐酸二甲双胍含量，分离度良好，溶剂不干扰检测，方法专属性良好，且该检测方法简便﹑快速﹑准确﹑灵敏度高﹑重复性好以及准确度好，可以快速准确地进行达格列净二甲双胍缓释片中达格列净和盐酸二甲双胍含量的定性及定量分析，保证本品质量的可控性。
附图说明
图1对照品与空白辅料溶液在检测器吸收波长为220nm色谱图的叠合图
图2对照品与空白辅料溶液在检测器吸收波长为255nm色谱图的叠合图
图3供试品溶液在检测器吸收波长为220nm的色谱图
图4供试品溶液在检测器吸收波长为255nm的色谱图
图5参考例1对照品溶液色谱图
具体实施方式：
下面的实施例可以使本专业的本领域技术人员更全面地理解本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
本发明所用盐酸二甲双胍对照品购自中国食品药品检定研究院，达格列净对照品产于南京正大天晴制药有限公司，达格列净二甲双胍缓释片产于南京正大天晴制药有限公司。
实施例1：专属性试验
稀释剂：称取17g磷酸二氢铵，加1升水溶解，用三乙胺调节pH至5.0，取该缓冲液700毫升与300毫升乙腈混合均匀，即得。
空白辅料溶液：取空白辅料(羟丙甲基纤维素、微晶纤维素、无水乳糖和交联聚维酮)共计500mg，置于100ml量瓶，加适量甲醇超声15分钟，甲醇定容，离心取上清液2.00ml置20ml量瓶中，稀释剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液作为空白辅料溶液。
对照品溶液：取达格列净和盐酸二甲双胍对照品各适量，精密称定，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml中约含达格列净10μg、盐酸二甲双胍1mg的溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液：取5片达格列净二甲双胍缓释片，置玛瑙研钵中研细，全部转移至500ml量瓶中，加适量甲醇超声15分钟，甲醇定容，离心取上清液2.00ml置20ml量瓶中，稀释剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液作为供试品溶液。
色谱条件：采用ThermoAcclaim Trinity P1(3mm×150mm，3um)色谱柱；以17g/L磷酸二氢铵缓冲溶液(pH5.0)-乙腈(73:27)为流动相，洗脱液流速为每分钟0.8ml；柱温为35℃；采用二极管阵列检测器作为检测器，达格列净检测波长为220nm、盐酸二甲双胍检测波长为255nm；进样体积为3μl。
试验方法：精密量取空白辅料溶液、对照品溶液各3μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。空白辅料溶液与对照品溶液色谱图的叠合图见图1～图2。
结果表明：辅料对两组分的检测无干扰，专属性良好。
实施例2：线性与范围
溶液配制：取达格列净与盐酸二甲双胍对照品各适量，用稀释剂溶解并稀释制成每毫升约含达格列净2μg(盐酸二甲双胍0.2mg)、达格列净5μg(盐酸二甲双胍0.5mg)、达格列净8μg(盐酸二甲双胍0.8mg)、达格列净10μg(盐酸二甲双胍1mg)、达格列净12μg(盐酸二甲双胍1.2mg)、达格列净15μg(盐酸二甲双胍1.5mg)的线性溶液(相当于供试品浓度20％、50％、80％、100％、120％和150％)。
试验方法：按实施例1的色谱条件，精密量取上述线性溶液各3μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程。
结果表明，达格列净的线性回归方程为y＝1.0629×107x–7.7372×102(γ＝0.9999)，浓度在0.00203mg/ml～0.0152mg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系，盐酸二甲双胍线性回归方程为y＝1.3343×106x+2.0710×104(γ＝0.9999)，浓度在0.1992mg/ml～1.494mg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系。
实施例3：准确度
对照品溶液：取达格列净和盐酸二甲双胍对照品各适量，精密称定，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml中约含达格列净10μg、盐酸二甲双胍1mg的溶液，作为对照品溶液。
80％回收率溶液：取达格列净对照品约10mg，盐酸二甲双胍对照品约0.8g，空白辅料约500mg，精密称定，同置一100ml量瓶中，加甲醇适量，超声15分钟，甲醇定容，离心取上清液2.00ml置20ml量瓶中，稀释剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液作为80％回收率溶液。平行配制3份。
100％回收率溶液：取达格列净对照品约12.5mg，盐酸二甲双胍对照品约1g，空白辅料约500mg，精密称定，同置一100ml量瓶中，加甲醇适量，超声15分钟，甲醇定容，离心取上清液2.00ml置20ml量瓶中，稀释剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液作为100％回收率溶液。平行配制3份。
120％回收率溶液：取达格列净对照品约15mg，盐酸二甲双胍对照品约1.2g，空白辅料约500mg，精密称定，同置一100ml量瓶中，加甲醇适量，超声15分钟，甲醇定容，离心取上清液2.00ml置20ml量瓶中，稀释剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液作为120％回收率溶液。平行配制3份。
试验方法：按实施例1的色谱条件，取对照品溶液及回收率溶液各3μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算回收率，试验结果见表1～表2。
表1达格列净准确度试验结果
表2盐酸二甲双胍准确度试验结果
结果表明：达格列净与盐酸二甲双胍的含量回收率平均值分别为99.1％、100.1％，均在98.0％～102.0％之间；RSD分别为0.3％、0.8％，均小于2.0％，方法准确度良好。
实施例4：精密度
4.1进样精密度
按实施例1的色谱条件，取“实施例1”项下的对照品溶液，连续进样6针，记录色谱图，计算峰面积及保留时间的RSD。结果见表3。
表3进样精密度试验结果
结果表明：连续进样6针，达格列净和盐酸二甲双胍的峰面积RSD均小于2.0％，保留时间RSD均小于1.0％；进样精密度良好。
4.2重复性
对照品溶液：取达格列净和盐酸二甲双胍对照品各适量，精密称定，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml中约含达格列净10μg、盐酸二甲双胍1mg的溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液：取5片达格列净二甲双胍缓释片，置玛瑙研钵中研细，全部转移至500ml量瓶中，加适量甲醇超声15分钟，甲醇定容，离心取上清液2.00ml置20ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液作为供试品溶液。同法配制6份。
按实施例1的色谱条件，精密量取对照品溶液、供试品溶液各3μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算达格列净和盐酸二甲双胍的含量。并分别计算6份含量结果的RSD，结果见表4。
表4重复性试验结果
结果表明：6份供试品溶液中，达格列净和盐酸二甲双胍的含量RSD均小于2.0％，该方法重复性良好。
4.3中间精密度
由不同操作人员，于不同时间，按实施例1的色谱条件，按重复性项下配制各溶液试验。结果见表5。
表5中间精密度试验结果
结果表明：12份供试品溶液中，达格列净和盐酸二甲双胍的含量RSD均小于2.0％，该方法中间精密度良好。
实施例5耐用性
对照品溶液及供试品溶液的配制同实施例1。
考察单一变量影响，分别通过单独改变流速、柱温、检测波长、有机相比例、磷酸二氢铵缓冲液的pH和盐浓度，其余条件保持与实施例1色谱条件一致，取空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各3μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。考察供试品溶液中达格列净和二甲双胍的含量，试验结果见下表。
结果表明：在系统参数变动的情况下，达格列净和盐酸二甲双胍的含量与实施例1色谱条件结果相比无明显变化，该方法耐用性良好。
实施例6：样品测定
对照品溶液：取达格列净和盐酸二甲双胍对照品各适量，精密称定，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml中约含达格列净10μg、盐酸二甲双胍1mg的溶液，作为对照品溶液。同法配两份。
供试品溶液：取5片不同批次达格列净二甲双胍缓释片，置玛瑙研钵中研细，全部转移至500ml量瓶中，加适量甲醇超声15分钟，甲醇定容，离心取上清液2.00ml置20ml量瓶中，溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液作为供试品溶液。每批次同法配两份。
按实施例1的色谱条件，精密量取空白辅料溶液、对照品溶液及各批次供试品溶液各3μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法计算达格列净和盐酸二甲双胍的含量。结果见表6。
表6样品测定结果
参考例1
溶液配制同实施例6中的对照品溶液和供试品溶液配制。各配制两份。
色谱条件：WatersμBondapak C18(10um，3.9×300mm)为色谱柱，以0.5g/LNaCl和0.5g/L庚烷磺酸钠(用磷酸调节pH至3.85)混合溶液-乙腈(90：10)为流动相，等度洗脱。流速为每分钟1.0ml，柱温30℃，检测波长218nm，进样体积10μl。
测定法：分别取各溶液15μl，照上述色谱条件测定，记录色谱图。
结果如图5所示：盐酸二甲双胍保留时间约6.6分钟，达格列净在20min内未出峰。
Claims (10)
1.一种同时测定达格列净二甲双胍含量的方法，其特征在于，所述方法为高效液相色谱法，采用具有反相、阴离子和阳离子交换功能的混合固定相色谱柱。
2.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述色谱柱采用带电荷纳米高分子微球的高纯多孔球形硅胶颗粒为固定相；在一些典型的实施方案中，所述色谱柱为ThermoAcclaim Trinity P1规格为：3mm×150mm，3μm。
3.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于：采用磷酸二氢铵缓冲溶液-乙腈混合溶液为洗脱液，按等度洗脱；优选地，所述磷酸二氢铵缓冲溶液与乙腈的比例为75:25～71:29，更优选地，所述磷酸二氢铵缓冲溶液与乙腈的比例为73:27。
4.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述磷酸二氢铵缓冲溶液浓度为16g/L～18g/L，优选地，所述磷酸二氢铵缓冲溶液浓度为17g/L；优选地，所述磷酸二氢铵缓冲溶液是磷酸二氢铵水溶液。
5.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述磷酸二氢铵缓冲溶液pH值为4.7～5.2；优选地，所述磷酸二氢铵缓冲溶液的pH为5.0；优选地，所述磷酸二氢铵缓冲溶液的pH由三乙胺调节。
6.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于：洗脱液的流速为每分钟0.6～1.0ml，优选地，所述洗脱液的流速为每分钟0.8ml。
7.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述色谱柱柱温为32～38℃；优选地，所述色谱柱柱温为35℃。
8.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述方法为带有二极管阵列检测器的高效液相色谱法，达格列净检测波长为218～222nm、盐酸二甲双胍检测波长为253～257nm；优选地，达格列净检测波长为220nm、盐酸二甲双胍检测波长为255nm。
9.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述分析方法是在高效液相色谱仪上进行的；其采用同时具有反相、阴离子和阳离子交换功能的混合固定相色谱柱；
所述分析方法采用二极管阵列检测器，达格列净检测波长为220nm、盐酸二甲双胍检测波长为255nm；
所述分析方法柱温为35℃；
所述分析方法以磷酸二氢铵缓冲溶液-乙腈混合溶液为洗脱液，等度洗脱，所述磷酸二氢铵缓冲液的浓度为17g/L，所述磷酸二氢铵缓冲溶液的pH为5.0，所述磷酸二氢铵缓冲溶液与乙腈的比例为73:27；
洗脱液的流速为每分钟0.8ml；
分别注入供试品溶液、对照品溶液；
通过外标法计算供试品中达格列净与二甲双胍的含量。
10.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)供试品溶液配制：取达格列净二甲双胍缓释片适量，置玛瑙研钵中研细，全部转移至容量瓶中，加适量甲醇超声溶解，甲醇定容，精密量取上清液适量置于另一量瓶中，以17g/L磷酸二氢铵缓冲溶液(pH5.0)-乙腈(70:30)混合液稀释至刻度，摇匀，过滤，取滤液作为供试品溶液；
(2)对照品溶液的配制：精密称取达格列净和盐酸二甲双胍对照品各适量，以17g/L磷酸二氢铵缓冲溶液(pH5.0)-乙腈(70:30)混合液溶解并稀释，定容，摇匀，即得。
(3)供试品测定：采用Thermo Acclaim Trinity P1(3mm×150mm，3um)色谱柱；以17g/L磷酸二氢铵缓冲溶液(pH5.0)-乙腈(73:27)为流动相，洗脱液流速为每分钟0.8ml；柱温为35℃；采用二极管阵列检测器作为检测器，达格列净检测波长为220nm、盐酸二甲双胍检测波长为255nm；进样体积为3μl；分别量取供试品溶液、对照品溶液，分别注入液相色谱仪，进行等度洗脱，记录各色谱图；
(4)通过外标法计算供试品中达格列净和盐酸二甲双胍的含量。
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