CN111676152A - 一种多粘类芽孢杆菌lxdn-1及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于多粘类芽孢杆菌技术领域，具体涉及一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)LXDN‑1及其应用。公开了一种多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)LXDN‑1，所述多粘芽孢杆菌LXDN‑1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.18010，保藏日期是2019年6月19日。该菌株具有防治青枯病的作用。

Description

一种多粘类芽孢杆菌LXDN-1及其应用
技术领域
本发明涉属于多粘类芽孢杆菌技术领域，具体涉及一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)LXDN-1及其应用。
背景技术
花生是我国重要的经济和油料作物，中国是世界上最大的花生种植国和出口大国，在世界花生生产中占有极为重要的地位。中国花生种植面积约万占世界花生面积的20％，仅次于印度，总产、单产都列居世界第一。
花生青枯病(Pseudomonas solanacearum)于1950年首次在印度尼西亚报道，随后东南亚各国、南非一些国家和美国等多个国家均有过发生和流行的报道。我国关于花生青枯病报道始见于60年代后期，其广泛分布于各花生产区，每年全国实际发病面积在40万hm2以上，其中南方各省发病尤为严重，山东、辽宁、河北、河南等地也有发生，且部分地区危害逐渐加重。病株可在短期内迅速枯死。花生结荚后发病的田块一般减产，在结荚前发病的田块则可能绝收。其从苗期至收获期均可发病，以盛花期发病最严重。典型症状是植株急性调萎和维管束变褐色。发病初期，病株主莲顶梢第一、二片叶白天呈现失水性调萎，早晚尚可恢复，之后随着病情的发展则不再恢复，病株叶片自上而下逐渐萎焉，叶色暗淡，呈青绿色，最后病株枯死。一般从开始发病至植株枯死历时7-15d，少数约20d。病株主根尖端变褐色呈湿腐状，根瘤呈墨绿色。纵剖病株根茎部，可见维管束变浅褐色至黑褐色，直至茎顶和根部。横剖病株根茎部，可见环状排列的维管束呈褐色小点。用手挤压切口处，可见有污白色菌脓溢出。早期感病的植株，果柄和荚果变为黑褐色湿腐状，果仁不实。结荚期发病的植株，症状不如前期感病的明显。
由于芽孢杆菌既具有广阔的开发应用前景，开发新筛选的未定种的芽孢杆菌及对新菌株的防治青枯病作用进行鉴定是具有非常重要的意义的。
发明内容
针对现有技术存在的需求，本发明的目的是提供一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)LXDN-1，是一种全新筛选出来的株系，还提供了一种利用LXDN-1实施的防治青枯病的方法，具有明显的防治青枯病的作用，具有良好的应用前景。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)LXDN-1，2019年6月19日多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)LXDN-1由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，保藏号是CGMCC No.18010。
本发明提供一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)LXDN-1在抑制青枯菌中的应用。
本发明提供多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)LXDN-1在防治农作物产生青枯病中的应用。
本发明提供了一种青枯菌抑制剂，所述抑制剂含有多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)LXDN-1。
本发明提供了一种防治青枯病的固态组合物，所述组合物含有多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)LXDN-1。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)LXDN-1对真菌和细菌具有良好的防治效果，具有生长速度快、营养需求简单、有较强耐热性及抗逆性等优点，对人畜安全、无毒害、环境友好无污染。
附图说明
图1：多粘芽孢杆菌在LB培养基上的菌落形态实验室效果图。
图2：多粘芽孢杆菌LXDN-1与其他细菌16S rDNA构建的进化树图。
图3：I组多粘芽孢杆菌LXDN-1对花生青枯菌的抑制作用图。
图4：II组多粘芽孢杆菌LXDN-1对花生青枯菌的抑制作用图。
图5：III为清水做对照代替多粘芽孢杆菌LXDN-1对花生青枯菌实验结果图。
2019年6月19日多粘芽孢杆菌LXDN-1由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，保藏号是CGMCC No.18010。
具体实施方式
本发明公开了一种多粘类芽孢杆菌及其用途，下面将通过具体实施例来详述本发明的特征和各个方面。除非特别指明，本发明中所用的试验方法和实验试剂为本领域技术人员所公知的方法和试剂。此外，实施方案应理解为说明性的，而不是要限定本发明的范围，对本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的培养基组分、含量、培养条件、分离加工条件进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
为了使本领域技术人员能够更好的理解本发明，下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
实施例一
本发明的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)LXDN-1，是从日照莒南健康花生根际土壤分离获得的，其已经于2019年6月19日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，保藏号是CGMCC No.18010。它是稀释土壤于LB平板，灭菌涂布恒温培养得到的，所述多粘类芽孢杆菌可以选自日照莒南健康花生根际土壤。
(一)多粘类芽孢杆菌LXDN-1的分离
称取5g日照莒南健康花生根际土壤放入45ml无菌水的三角瓶中，混匀，依次梯度稀释10-1-10-6土壤悬浊液，用微量移液器分别吸取不同稀释倍数的土壤悬液50μL于LB平板上，灭菌涂布器涂布均匀，将平板封口后倒置于28℃恒温培养箱中培养48h。挑取平板上的一批单菌落于LB固体培养基平板上画线倒置于28℃恒温培养箱培养1-2d。用对峙培养法筛选不同的细菌对花生青枯病菌是否有抑制作用，对选取的接抗菌进行分类鉴定。
(二)多粘类芽孢杆菌LXDN-1的形态观察
多粘芽孢杆菌LXDN-1革兰氏染色阳性，接触酶活性为阳性，V-P实验阳性，可降解淀粉、果胶和木聚糖，为发酵型菌株，可利用葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、木糖等糖类，能利用柠檬酸盐，还原硝酸盐，发生甲基红反应。
(三)生理生化特性
表1活性菌株LXDN-1的生理生化特征
Figure BDA0002510667530000031
注：“+”表示反应结果为阳性；“－”表示反应结果为阴性。
(四)多粘类芽孢杆菌LXDN-1的16S rDNA分子学鉴定
选取对真菌具有拮抗活性的细菌菌株，挑取10个相同的菌落，进行基因组DNA的提取，其提取方法主要参照TIANGEN TIANamp BACTERia DNA Kit试剂盒说明书进行，步骤如下：
(1)取细菌培养液1mL，10000rpm离心1min，尽量吸净上清；
(2)向菌体沉淀中加入200μL缓冲液GA，震荡至菌体彻底悬浮；
(3)加入4μLRNAase(100mg/mL)溶液，震荡15s，室温放置5min；
(4)向管中加入20μL蛋白酶K溶液，混匀；
(5)加入220μL缓冲液GB，震荡15s，70℃放置10min，离心以去除管盖内壁的水珠；
(6)加入220μL无水乙醇，充分震荡混匀15s，此时可能出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
(7)将上一步所得的溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱GB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30s，倒掉废液将吸附柱CB3中放入收集管中；
(8)向吸附柱CB3中放入500μL缓冲液GD(使用前检查是否加收入无水乙醇)，12000rpm离心30s，倒掉废液将吸附柱CB3中放入收集管中；
(9)向吸附柱CB3中放入700μL漂洗液PW(使用前检查是否加收入无水乙醇)，12000rpm离心30s，倒掉废液将吸附柱CB3中放入收集管中；
(10)向吸附柱CB3中放入500μL漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液将吸附柱CB3中放入收集管中；
(11)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
(12)将吸附柱CB3转入干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，-20℃保存。
PCR与序列测定
(1)提取的DNA参照TaKaRa公司的16s rDNA Bacterial Identification PCR Kit试剂盒说明书进行PCR扩增，其中正向引物为：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’(27F)，反向引物为：3’-CGCTTACCTTGTTACGACTT-5’(1492R)。PCR扩增条件如下：94℃预变性5min；94℃变性1min；53℃退火1min；72℃延伸90s；72℃后延伸5min，共30个循环。PCR产物采用1％琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后置于3UVTMTransilluminator(UVP,USA)下进行观察。通过电泳检测发现LXDN-1菌株16s rDNA片段大小约为1500bp，片段大小与试剂盒预期设计相符，扩增结果如SEQ ID NO.1所示。
(2)根据预先设计的引物与预期扩增片段大小，结合Marker，目的片段在紫外灯下切割下来，用回收试剂盒Silica Bead DNA GelExtraction Kit进行DNA的回收。16s rDNA序列测定由青岛擎科生物技术有限公司进行序列测定。测定序列结果表明LXDN-1菌株的16s rDNA片段共有1518nt碱基对组成，序列表信息见SEQ ID No.3。通过BLAST程序将测定的序列与GenBank(NCBI，网站http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中的序列比较，然后从GenBank中获得和试验菌株序列相近种、属的16s rDNA序列进行确定。比对结果见图2，结果显示该活性菌株的16s rDNA序列GenBank基因库中芽孢杆菌属的多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)的16s rDNA序列高度同源，同源率达100％。构建发育树和同源性分析结果显示(图2)，菌株LXDN-1与芽孢杆菌属的多粘芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)(Accession No:MN744698)单独构成一个分支，进化上的距离最近，反映出它们之间亲缘关系最近，运用DANMAN软件分析得到二者同源性为99％。结合传统的生理生化特性鉴定以及16S rDNA序列分析的结果，判定菌株LXDN-1为多粘芽孢杆菌。
实施例二
制备含多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)LXDN-1的液态菌剂
1.多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)LXDN-1的活化及种子液的制备
多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)LXDN-1的活化：从多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)LXDN-1的冷冻干燥管中，用无菌接种针挑取部分菌粉至LB摇瓶中(250mL摇瓶，LB液体培养基装液量50ml)，在30℃、150r/min下培养24h后，LB培养基变浑浊。取菌液至LB固体培养基中划线培养24h-36h，多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)LXDN-1在LB固体培养基土生长良好，菌落白色或灰白色，表面不规则，不透明。
一级种子液的制备：挑取LB固体培养基上的单菌落接种于一级种子摇瓶中，摇瓶体积为250mL,LB液态培养基的装液量50mla将一级种子摇瓶在30℃、150r/min下培养24h，得到一级种子液。
二级种子液的制备：种子罐中的培养基配方(g/L)为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，用5mol/L NaOH调节PH值至7.0。将一级种子液接入种子罐中，接种量为1％-5％(V/V)，培养条件为：通气比1:1，搅拌转速为200r/min，培养温度30℃，罐压0.01MPa，培养时间为20h。培养结束时得到二级种子液，其活菌含量为1-3×108cfu/mL，此时菌体活力强。
2.发酵制备含有多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)LXDN-1的液态菌剂
发酵培养基配方(g/L)为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，用5mol/L NaOH调节PH值至7.0。
将发酵培养基置于发酵罐中，灭菌。
将多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)LXDN-1的二级种子液，按照接种量为1％-5％(V/V)接入发酵罐中，培养条件为：通气比为1:1、搅拌转速为150r/min、罐压0.01MPa、培养温度30℃、培养时间为48h，得到液态菌剂1。液态菌剂1中的活菌含量为30×108cfu/mL。
在发酵罐培养结束时，保证液态菌剂中的活菌含量为5-100×108cfu/mL的前提下，可以对发酵培养基和发酵培养条件进行调整。
发酵培养基选用LB培养基。
LB培养基配方(g/L)：胰蛋白陈10，酵母提取物5,NaCl10g，溶剂为水。
实施例三
制备含有多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)LXDN-1的固态菌剂
向实施例1制得的液态菌剂1(活菌含量为30×108cfu/mL)中加入高岭土，液态菌剂与高岭土的重量比为100:25。将该液固混合物搅拌30分钟后静置60分钟，利用输料泵将料液输入离心式喷雾塔中干燥后，得到的固态菌剂1。离心式喷雾塔中的干燥条件为：进风口温度为200℃，出风口温度为85℃。固态菌剂1中水含量为4％(W/W),t菌含量为60×108cfu/g。
干燥条件要满足：进风温度不高于250℃，出风口温度不高于100℃。
固态菌剂要满足：水含量不高于5％(W/W)，活菌含量为1×106-1×1012cfu/g。
液态菌剂也可以用板框浓缩过滤、再真空干燥后制各国态菌剂。
取液态菌剂1，加入其重量5％的硫酸铵水溶液，再加入液态菌剂重量3％的碳酸钙、1％的珍珠岩助滤，搅拌30分钟后静置60分钟，然后压入板框过滤机进行过滤。其中，硫酸铵、碳酸钙和珍珠岩都是助滤剂。
过滤条件为：过滤温度为40℃，过滤压力4kg/cm2，板框过滤的物料水分保持在30％(W/W)。
将板框过滤后得到的滤饼在80℃条件下进行真空干燥，得到水含量为4％(W/W),活菌含量为120×108cfu/g的固形物。
在固形物中，加入固形物重量4倍的高岭土，再加入固形物重量25％的十二烷基苯磺酸纳，混合均匀后粉碎即可得固态菌剂2。固态菌剂2中，活菌含量为22×108cfu/g。
实施例四
多粘类芽孢杆菌LXDN-1菌株抑制花生青枯病菌能力的测定
挑取LXDN-1及花生青枯病病原(Pseudomonas solanacearum)单菌落分别接种于LB培养基中28℃、200r/min培养12h，分别取100uL培养液转接于20mlLB培养基中，于摇床中28℃、180r/min培养至二者菌悬液浓度均达106cfu/mL。
实验分为I、II和III三组。
在无菌操作台中将三个LB平板培养基上均匀涂布50uL花生青枯病，即I、II和III三组。将LXDN-1培养液稀释至10-5，用镊子分别取3个直径为0.5cm圆形滤纸充分吸收LXDN-1培养液，放置于含青枯菌的LB培养基中，于28℃温室中倒置培养2-3天；用镊子分别取3个直径为0.5cm的圆形滤纸充分吸收清水，放置于III组含青枯菌的LB培养基中，于28℃温室中倒置培养2-3天。
在蘸有LXDN-1培养液的滤纸周围即I组和II组出现了明显的抑菌圈，抑菌圈直径为3cm，如图3和图4所示，在蘸有清水的滤纸周围没有出现抑菌圈。
实施例五
LXDN-1菌株对花生青枯病菌的盆栽防治试验
实验分为A组、B组和C组。
A组菌处理：取花育20号花生种子，在培养皿中催芽后栽种到装有灭菌土的花盆中，每个花盆种4粒种子，共接种20株花生，幼苗长到5-6片叶子后灌根接种生防菌，菌悬液浓度达106cfu/mL，每株接种10mL。
A组清水对照：另取20株花生在培养皿中催芽后栽种到装有灭菌土的花盆中，每个花盆种4粒种子，共接种20株花生，幼苗长到5-6片叶子后，加15mL清水作。
A组菌处理及清水对照均48h后接种花生靑枯病菌，接种青枯病菌菌液后5d开始记录花生植株生长和发病情况，持续观察15天。
防治效果％＝(对照发病率-处理发病率)/对照发病率*100％
表2：LXDN-1菌株对花生青枯病菌的盆栽防治效果
Figure BDA0002510667530000071
Figure BDA0002510667530000081
由实验结果可得：三组盆栽试验结果均显示LXDN-1菌株对花生青枯病菌有很好的防治作用，防治效果分别为41.2％，58.8％和58.8。平均防治效果为52.9％。LXDN-1对于防治花生青枯病具有较好的应用前景。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域熟练技术人员应当理解，这些仅是举例说明，实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 申请人山东省花生研究所
<120> 一种多粘类芽孢杆菌LXDN-1及其应用
<140> 2020104602049
<141> 2020-05-27
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1518
<212> DNA
<213> 多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa LXDN-1)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60
ggggttaatt agaagcttgc ttctaattaa cctagcggcg gacgggtgag taacacgtag 120
gcaacctgcc cacaagacag ggataactac cggaaacggt agctaatacc cgatacatcc 180
ttttcctgca tgggagaagg aggaaaggcg gagcaatctg tcacttgtgg atgggcctgc 240
ggcgcattag ctagttggtg gggtaaaggc ctaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg 300
agagggtgat cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag 360
tagggaatct tccgcaatgg gcgaaagcct gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg 420
ttttcggatc gtaaagctct gttgccaggg aagaacgtct tgtagagtaa ctgctacaag 480
agtgacggta cctgagaaga aagccccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg 540
tagggggcaa gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaagcg cgcgcaggcg gctctttaag 600
tctggtgttt aatcccgagg ctcaacttcg ggtcgcactg gaaactgggg agcttgagtg 660
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ccagtggcga aggcgactct ctgggctgta actgacgctg aggcgcgaaa gcgtggggag 780
caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgaatgcta ggtgttaggg 840
gtttcaatac ccttggtgcc gaagttaaca cattaagcat tccgcctggg gagtacggtc 900
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tagatctttc cttcgggaca gaggagacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg 1080
tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta tgcttagttg ccagcaggtc 1140
gagctgggca ctctaagcag actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca 1200
aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtacta caatggccgg tacaacggga 1260
agcgaaggag cgatctggag ccaatcctag aaaagccggt ctcagttcgg attgtaggct 1320
gcaactcgcc tacatgaagt cggaattgct agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa 1380
tacgttcccg ggtcttgtac acaccgcccg tcacaccacg agagtttaca acacccgaag 1440
tcggtgaggt aaccgcaagg agccagccgc cgaaggtggg gtagatgatt ggggtgaagt 1500
cgtaacaagg tagccgga 1518

Claims (10)

1.一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)LXDN-1，其保藏编号为CGMCCNo.18010。
2.如权利要求1所述的一种多粘类芽孢杆菌，其特征在于：其16s rDNA的对应个核苷酸序列为SEQ ID NO.1所述。
3.如权利要求1所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)LXDN-1在抑制青枯菌和/或防治农作物产生青枯病中的应用。
4.以多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)LXDN-1为活性成分的菌剂，所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)LXDN-1的保藏号为CGMCC No.18009。
5.根据权利要求4所述菌剂，其特征在于：所述菌剂为液态，液态菌剂中多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)LXDN-1的含量为1×107-1×1011cfu/ml。
6.根据权利要求4所述菌剂，其特征在于：所述菌剂为固态，固态菌剂中多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)LXDN-1的含量为1×106-1×1012cfu/ml。
7.根据权利要求6所述的菌剂，其特征在于：所述固态菌剂还含吸附基质，所述吸附基质为载体或载体和助剂的混合物，所述载体选自高岭土、轻质碳酸钙、硅藻土、白碳黑中的一种或两种及以上的混合物，助剂选自十二烷基苯磺酸钠、木质素磺酸钠、烷基萘磺酸钠缩聚物中的一种或两种及以上的混合物。
8.一种制备权利要求5所述菌剂的方法，其特征在于：将多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)LXDN-1接种于培养基中，在28℃-30℃条件下培养24-72小时，得到液态菌剂。
9.根据权利要求8所述制备方法，其特征在于：所述培养基为胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，用NaOH调节PH值至7.0。
10.一种制备权利要求6或7所述菌剂的方法，其特征在于：将多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)LXDN-1接种于培养基中，在28℃-30℃条件下培养24h-72h,得到液态菌剂；在液态菌剂中加入吸附基质，干燥后即得固态菌剂或者将液态菌剂过滤、干燥后，加入吸附基质，混合后粉碎即得固态菌剂。
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