CN111670898A - 球虫卵囊冻存剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种球虫卵囊冻存剂及其制备方法与应用，本发明球虫卵囊冻存剂组份包括有十二烷基磺酸钠、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇、酒石酸、硫酸铵、蔗糖、果糖、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、标准PBS缓冲液和注射用水，配方合理，可以有效抑制冷冻保存过程中冰晶重结晶、调控冰晶形貌、降低冰晶生长速率，减小冰晶对球虫卵囊造成的损伤，同时磷脂分子可以吸附在球虫卵囊壁上，增强其耐冰损害能力，使得球虫卵囊能够长期于液氮中保存。而且相比于传统冻存剂不包含DMSO等毒性分子和价格昂贵的血清等组分，不仅避免了DMSO对球虫卵囊的毒性损害，还降低了生产成本，有效增强其在球虫疫苗领域的可应用性，利于广泛推广应用。

Description

球虫卵囊冻存剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及低温冻存技术领域，特别涉及一种球虫卵囊冻存剂及其制备方法与在球虫卵囊的应用。

背景技术

近年来，细胞、组织和器官的冷冻保存备受关注，冷冻保存技术的突破将为再生医学的发展提供强有力的理论和实验支撑。脱离母系环境的活性物质如细胞等在保存过程中由于新陈代谢等生命活动，消耗细胞内自身养分，其活性不可避免的随保存时间减弱，直至完全失活。极低的温度，通常为77K(-196℃，液氮的沸点)，可有效抑制甚至停止细胞内新陈代谢等生命活动，可以延长细胞的寿命，实现细胞的长久保存。超低温液氮保存已广泛应用于细胞(卵母细胞、红细胞、干细胞和精子等)、组织器等生物材料的冷冻保存。

超低温保存过程中不可控制的结冰会造成严重的机械损伤，从而造成细胞直接失活。传统的冷冻保存剂通常含有DMSO、甘油等小分子物质，这些物质可通过细胞膜进入细胞内部，增强细胞的玻璃化能力，使细胞在快速降温过程中直接进入玻璃态从而避免结冰对细胞产生的损伤。但玻璃态保存也存在两个重要的无法忽视的问题。首先，要实现这种玻璃态冷冻保存需要很高浓度的冷冻保存剂和极快的降温速度，但冷冻保存剂如DMSO具有细胞毒性，浓度越高对细胞危害越大；其次，细胞在复温过程中也会伴随着结冰和冰重结晶，目前常用的传统冷冻保存剂并不具有控制结冰和冰重结晶的效果，因此无法避免复温过程中的结冰和冰重结晶对细胞造成的损伤。这里说的重结晶是指冷冻保存或复温过程中以小冰晶消失为代价大冰晶继续长大的熟化过程，该过程会对冷冻保存的细胞等生物材料造成机械损伤。因此在冷冻保存剂中加入控冰分子，通过控制结冰和抑制冰晶重结晶是一种有效降低冷冻保存过程中冰晶对细胞的损伤的方案。

艾美尔球虫是一种常见寄生原虫，通过感染鸡、兔等动物在养殖场大范围传播，给养殖业带来巨大的经济损失，目前最有效的防治手段是通过活球虫疫苗(球虫卵囊)。因此，长期保存球虫和球虫活疫苗对艾美尔球虫的研究和防御十分重要。但由于球虫卵囊壁的存在，传统冷冻保存剂难以通过卵囊壁进入卵囊内部，无法避免超低温保存过程中结冰对球虫卵囊的伤害，传统的冷冻保存剂不适用于球虫卵囊的长期低温保存。此外，常规冷冻保存剂含有价格比较昂贵的血清，会大大增加球虫保存成本，不适用于此类成本较低的球虫疫苗保存。目前艾美尔球虫领域的冷冻保存的研究和专利都比较少，且各有问题。

如有公开号“CN107347873A”，名称为“一种艾美耳球虫冻存剂及冻存方法”的发明申请公开了一种艾美耳球虫冻存剂及冻存方法，所述冻存剂中包括冻存液和冷冻保护剂；所述冻存液中包括蔗糖、磷酸二氢钾、三水合磷酸氢二钾、L-谷氨酸和小牛血清蛋白；所述冷冻保护剂为二甲基亚砜或包括二甲基亚砜的组合物。其虽然能实现一定的保存效果，但是由于采用含有带有毒性的DMSO和比较昂贵的胎牛血清成份，不利于广泛推广应用。为此，球虫的低温冷冻保存是该领域面临的一大挑战和急需解决的问题。

目前，艾美尔球虫和活球虫疫苗采用4℃保存，但保存期通常不超过6个月，而且需要每两个月对球虫疫苗的保种进行人工传代干预，费时费力从而增加疫苗成本。因此急需一种球虫卵囊冻存剂，通过控制冷冻保存过程中的结冰、抑制冰晶重结晶、调控冰晶形貌和生长速率，实现球虫卵囊的低温长期保存。

发明内容

针对上述不足，本发明的目的之一在于，提供一种配方合理，具有抑制结冰和冰晶重结晶、调控冰晶形貌等功能，从而降低冰晶对待保存样品的机械损害的球虫卵囊冻存剂。

本发明的目的之二在于，提供一种上述球虫卵囊冻存剂的制备方法。

本发明的目的之三在于，提供一种上述球虫卵囊冻存剂的应用。

为实现上述目的，本发明所提供的技术方案是：

一种球虫卵囊冻存剂，其包括以下质量百分含量的组份：十二烷基磺酸钠0.01％～1％、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-mPEG2000)0.01％～2％、酒石酸1％～5％、硫酸铵0.5％～3％、蔗糖2％～10％、果糖1％～5％、磷酸二氢钠0.1％～0.8％、磷酸氢二钠0.2％～1％、标准PBS缓冲液2％～5％，余量为注射用水。

所述十二烷基磺酸钠和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-mPEG2000)在水中会形成胶束，一方面可通过胶束的亲、疏水基团在搅拌过程中逐渐富集在球虫卵囊表面，减弱冷冻保存过程中产生的冰晶对卵囊造成机械损害；同时所述游离的胶束也具有抑制冰晶生长和冰的重结晶的能力，进一步减小冰晶带来的损伤。

所述酒石酸和硫酸铵可以通过选择性的吸附在冰晶表面，从而修饰冰晶形貌，减缓冰晶生长，抑制冰的重结晶，降低冷冻保存过程中暴涨的冰晶对卵囊造成的损害。

所述蔗糖和果糖可以通过亲水基团如羟基等与水相互作用，减少可结冰水的含量，降低冷冻保存过程中产生的冰晶含量。

所述磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和PBS缓冲液的作用在于调整新型冷冻保存剂的pH值，使其pH值处于适宜球虫卵囊冷冻保存的6.2～8.2之间。

本发明球虫卵囊冻存剂通过控制结冰、抑制复温过程中冰晶重结晶、调控冰晶形貌等减小冰晶对球虫卵囊的伤害；其次，同时还能通过与卵囊壁相互作用增强卵囊的耐冰损伤能力；再次，不包含DMSO等毒性分子，避免了DMSO对球虫的损害；最后，也不包含血清等价格昂贵的组分，降低了冷冻保存剂的成本，增强其在球虫疫苗领域的可应用性。

一种球虫卵囊冻存剂的制备方法，其包括以下步骤：

(1)预备以下质量百分含量的组份：十二烷基磺酸钠0.01％～1％、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇0.01％～2％、酒石酸1％～5％、硫酸铵0.5％～3％、蔗糖2％～10％、果糖1％～5％、磷酸二氢钠0.1％～0.8％、磷酸氢二钠0.2％～1％、标准PBS缓冲液2％～5％，余量为注射用水；

(2)往所述注射用水中加入十二烷基磺酸钠和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇获得第一混合物，搅拌第一混合物使其形成胶束；

(3)往所述第一混合物加入酒石酸、硫酸铵、蔗糖和果糖，搅拌到充分溶解，获得第二混合物；

(4)往所述第二混合物加入PBS缓冲液、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，调节冷冻保存液pH至6.2～8.2，制得球虫卵囊冻存剂。

一种上述的球虫卵囊冻存剂在球虫卵囊冷冻保存中的应用。应用步骤如下：

(S1)将球虫卵囊加入上述的球虫卵囊冻存剂中，进行搅拌或涡旋混合，静置后获得冷冻保存液；在所述步骤(S1)之前，预先对所述球虫卵囊进行纯化处理。所述纯化处理具体包括以下步骤：(Ⅰ)取球虫卵囊液，进行离心、沉淀；(Ⅱ)除去上清液，加入饱和盐水重悬沉淀、离心；(Ⅲ)将含有卵囊液体的上层液体移入装有注射水的离心管，再次离心，获得卵囊沉淀液；(Ⅳ)将卵囊沉淀液移入装有注射水的离心管，重复上一步骤三次，最后获得不含有消毒液成分的球虫卵囊液。

(S2)将冷冻保存液分装入冻存管，然后放入冻存盒；

(S3)将冻存盒放入程序控温仪中进行降温一段时间后转入液氮长期保存。

球虫卵囊在液氮中冻存一段时间后，需要进行复苏并观察卵囊状态，其包括如下步骤：

1)卵囊复苏：提前将水浴锅预热，将冻存管从液氮中取出后迅速放入水浴锅，待其复苏；

2)卵囊清洗：将融化的冻存液放入10倍体积的注射水内稀释，经涡旋混合，离心，取含有球虫卵囊的沉淀液，再次放入10倍体积的注射水内稀释、离心，此过程重复五次后，取球虫卵囊沉淀液重悬于2.5％的重铬酸钾溶液中。

3)卵囊状态观察：取卵囊悬浮液，置于显微镜下，观察卵囊结构完整性和卵囊内部孢子囊形态。

本发明的有益效果为：本发明球虫卵囊冻存剂的配方合理，可以有效抑制冷冻保存过程中冰晶重结晶过程、调控冰晶形貌、降低冰晶生长速率，减小冰晶对球虫卵囊造成的损伤，同时磷脂分子可以吸附在球虫卵囊壁上，增强其耐冰损害能力，使得球虫卵囊能够长期于液氮中保存。而且相对于传统球虫卵囊冻存剂不包含DMSO等毒性分子和价格昂贵的血清等组分，不仅避免了DMSO对球虫卵囊的损害，还降低了生产成本，有效增强其在球虫疫苗领域的可应用性，利于广泛推广应用。

本发明提供的球虫卵囊冻存剂的制备方法的步骤简单，易于实现，能快速制备出具有抑制结冰和冰晶重结晶、调控冰晶形貌等功能，从而降低冰晶对待保存样品的机械损害的球虫卵囊冻存剂。

下面结合附图与实施例，对本发明进一步说明。

附图说明

图1为PBS溶液对照组和本发明冻存液的冰晶重结晶实验结果。

图2为PBS溶液对照组和本发明冻存液的单晶冰生长实验结果。

图3为巨型艾美尔球虫卵囊经过本发明冻存液的冷冻保存的结果图。

具体实施方式

实施例1：本实施例以巨型艾美尔球虫卵囊的冷冻保存和复苏为例进行说明，但不用来限制本发明的限制范围。

(一)球虫卵囊冻存剂的制备：取90ml注射水放入置于4℃水浴的烧杯中，放入搅拌子，转速调节至500rpm；加入十二烷基磺酸钠0.2g、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-mPEG2000)0.8g，搅拌10分钟；依次加入酒石酸5g、硫酸铵2g、蔗糖9g、果糖5g标准PBS缓冲液5ml、磷酸二氢钠0.3g和磷酸氢二钠0.7g，搅拌30分钟。

(二)预处理卵囊，在巨型艾美尔球虫卵囊加入前需进行如下的纯化预处理：

1.取巨型艾美尔球虫卵囊液2ml离心(3000rpm，5min)沉淀；

2.除去上清液，加入2ml饱和氯化钠水溶液，离心(3000rpm，5min)；

3.将含有巨型艾美尔球虫卵囊液体的上层液取出，移入装有2ml注射水的离心管，再次离心(3000rpm，5min)，获得卵囊沉淀液；

4.将卵囊沉淀液移入装有2ml注射水的离心管，离心(3000rpm，5min)，此过程重复三次，最后获得不含有消毒液的球虫卵囊液。

将上述处理好的球虫卵囊液加入含3ml冷冻保存液的冻存管中涡旋搅拌60分钟，静置10分钟；

将含有球虫卵囊的冻存液分装入1ml冻存管，放入冻存盒内；

(三)球虫卵囊的冷冻保存：将上述冻存盒放入程序控温仪降温至-100℃，降温程序设定为：4℃～-25℃温度区间降温速率为2℃/min；-25℃～-100℃温度区间降温速率为15℃/min；

冻存盒经过-100℃保温5小时候，转入液氮保存。

(四)球虫卵囊的复苏：球虫卵囊在液氮中冻存10天后，进行复苏并观察卵囊状态，其包括如下步骤：

(1)卵囊复苏：提前将水浴锅预热并使得浴盆内液体稳定在37℃，将冻存管从液氮中取出后迅速放入37℃的水浴锅，在1-2分钟内融化；

(2)卵囊清洗：将融化的冻存液放入10ml的注射水内稀释，经涡旋混合后离心(3000rpm，5min)，取含有球虫卵囊的沉淀液，再次放入10ml的注射水内稀释、离心，此过程重复五次后，取球虫卵囊沉淀液重悬于2.5％的重铬酸钾溶液中。

(3)卵囊状态观察：取卵囊悬浮液，置于显微镜下，观察卵囊结构完整性和卵囊内部孢子囊形态。

参见图1，可以得知采用本发明冻存液形成的冰晶重结晶尺寸远小于PBS水溶液。需要说明的是，实际冷冻保存复温过程中冰的重结晶过程非常快，难以实现直接原位观察，图1为模拟复温过程中的冰晶重结晶实验，该方法是冷冻保存领域普遍接受的方法。

参见图2，可以得知采用本发明冻存液内单晶冰生长缓慢，且具有修饰形貌效果。单晶冰生长实验是研究控冰材料与冰相互作用的主要手段，正常溶液中的单晶冰生长各向同性表现出圆球性，而有控冰材料吸附在冰表面的单晶冰生长缓慢，且表现出特殊形状。

复苏结果表明：巨型艾美尔球虫经过新型冷冻保存剂10天的液氮冷冻保存后，形态没有改变，与新鲜卵囊对比没有明显差别。具体参见图3，为巨型艾美尔球虫卵囊采用本发明球虫卵囊冻存剂冷冻保存的结果，球虫卵囊形态完好，卵囊内孢子囊形态完好，保存效果好，实现了艾美尔球虫卵囊冷冻保存。

实施例2：本实施例与实施例1基本相同，区别点仅在于，球虫卵囊冻存剂包括以下质量百分含量的组份：十二烷基磺酸钠0.01％、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2％、酒石酸1％、硫酸铵3％、蔗糖5％、果糖3％、磷酸二氢钠0.5％、磷酸氢二钠0.8％、标准PBS缓冲液4％，余量为注射用水。

实施例3：本实施例与实施例1基本相同，区别点仅在于，球虫卵囊冻存剂包括以下质量百分含量的组份：十二烷基磺酸钠0.05％、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇0.9％、酒石酸4％、硫酸铵0.5％、蔗糖10％、果糖1％、磷酸二氢钠0.8％、磷酸氢二钠0.2％、标准PBS缓冲液3％，余量为注射用水。

实施例4：本实施例与实施例1基本相同，区别点仅在于，球虫卵囊冻存剂包括以下质量百分含量的组份：十二烷基磺酸钠0.5％、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇1％、酒石酸3％、硫酸铵1％、蔗糖2％、果糖4％、磷酸二氢钠0.1％、磷酸氢二钠1％、标准PBS缓冲液2％，余量为注射用水。

实施例5：本实施例与实施例1基本相同，区别点仅在于，球虫卵囊冻存剂包括以下质量百分含量的组份：十二烷基磺酸钠1％、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇0.05％、酒石酸3％、硫酸铵2.3％、蔗糖5％、果糖3％、磷酸二氢钠0.1％、磷酸氢二钠0.8％、标准PBS缓冲液5％，余量为注射用水。

上述实施例仅为本发明较好的实施方式，本发明不能一一列举出全部的实施方式，凡采用上述实施例之一的技术方案，或根据上述实施例所做的等同变化，均在本发明保护范围内。

本发明球虫卵囊冻存剂中的十二烷基磺酸钠和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-mPEG2000)在水中会形成胶束，一方面可通过胶束的亲、疏水基团在搅拌过程中逐渐富集在球虫卵囊表面，减弱冷冻保存过程中产生的冰晶对卵囊造成机械损害；同时所述游离的胶束也具有抑制冰晶生长和冰的重结晶的能力，进一步减小冰晶带来的损伤。酒石酸和硫酸铵可以通过选择性的吸附在冰晶表面，从而修饰冰晶形貌，减缓冰晶生长，抑制冰的重结晶，降低冷冻保存过程中暴涨的冰晶对卵囊造成的损害。所述蔗糖和果糖可以通过亲水基团如羟基等与水相互作用，减少可结冰水的含量，降低冷冻保存过程中产生的冰晶含量。所述磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和PBS缓冲液的作用在于调整新型冷冻保存剂的pH值，使其pH值处于适宜球虫卵囊冷冻保存范围值内。本发明球虫卵囊冻存剂通过控制结冰、抑制复温过程中冰晶重结晶、调控冰晶形貌等减小冰晶对球虫卵囊的伤害；其次，同时还能通过与卵囊壁相互作用增强卵囊的耐冰损伤能力；再次，不包含DMSO等毒性分子，避免了DMSO对球虫的损害；最后，也不包含血清等价格昂贵的组分，降低了冷冻保存剂的成本，利于广泛推广应用。

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制，采用与其相同或相似方法而得到的其它冷冻剂及其制备方法和应用，均在本发明保护范围内。

Claims (7)

1.一种球虫卵囊冻存剂，其特征在于，其包括以下质量百分含量的组份：十二烷基磺酸钠0.01％～1％、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇0.01％～2％、酒石酸1％～5％、硫酸铵0.5％～3％、蔗糖2％～10％、果糖1％～5％、磷酸二氢钠0.1％～0.8％、磷酸氢二钠0.2％～1％、标准PBS缓冲液2％～5％，余量为注射用水。

2.一种球虫卵囊冻存剂的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤：

(1)预备以下质量百分含量的组份：十二烷基磺酸钠0.01％～1％、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇0.01％～2％、酒石酸1％～5％、硫酸铵0.5％～3％、蔗糖2％～10％、果糖1％～5％、磷酸二氢钠0.1％～0.8％、磷酸氢二钠0.2％～1％、标准PBS缓冲液2％～5％，余量为注射用水；

(2)往所述注射用水中加入十二烷基磺酸钠和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇获得第一混合物，搅拌第一混合物使其形成胶束；

(3)往所述第一混合物加入酒石酸、硫酸铵、蔗糖和果糖，搅拌到充分溶解，获得第二混合物；

(4)往所述第二混合物加入PBS缓冲液、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，调节冷冻保存液pH至6.2～8.2，制得球虫卵囊冻存剂。

3.根据权利要求1所述的球虫卵囊冻存剂，其特征在于：所述酒石酸、硫酸铵、蔗糖和果糖按由前至后的顺序依次加入第一混合物。

4.一种权利要求1或2-3任意一项所述的球虫卵囊冻存剂在球虫卵囊冷冻保存中的应用。

5.根据权利要求4所述的球虫卵囊冻存剂在球虫卵囊冷冻保存中的应用，其特征在于，应用步骤如下：

(S1)将球虫卵囊加入权利要求1或2-3任意一项所述的球虫卵囊冻存剂中，进行搅拌或涡旋混合，静置后获得冷冻保存液；

(S2)将冷冻保存液分装入冻存管，然后放入冻存盒；

(S3)将冻存盒放入程序控温仪中进行降温一段时间后转入液氮长期保存。

6.根据权利要求4所述的球虫卵囊冻存剂在球虫卵囊冷冻保存中的应用，其特征在于，在所述步骤(S1)之前，预先对所述球虫卵囊进行纯化处理。

7.根据权利要求4所述的球虫卵囊冻存剂在球虫卵囊冷冻保存中的应用，其特征在于，所述纯化处理具体包括以下步骤：

(Ⅰ)取球虫卵囊液，进行离心、沉淀；

(Ⅱ)除去上清液，加入饱和盐水重悬沉淀、离心；

(Ⅲ)将含有卵囊液体的上层液体移入装有注射水的离心管，再次离心，获得卵囊沉淀液；

(Ⅳ)将卵囊沉淀液移入装有注射水的离心管，重复上一步骤三次，最后获得不含有消毒液成分的球虫卵囊液。

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