CN112369410A - 卵囊壁破壁剂组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种卵囊壁破壁剂组合物及其制备方法与应用，本发明卵囊壁破壁剂组合物组份包括有异丙醇、蛋白酶K、聚乙二醇、柠檬酸钠、葡萄糖、蔗糖、氯胺T、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、标准PBS缓冲液和注射用水，配方合理，本发明卵囊壁破壁剂组合物中的有效成份能与卵囊壁结构中的角质蛋白、糖蛋白、磷脂等主要成份相互作用并破坏其致密排列的刚性结构，使之形成允许冷冻保存材料通过的孔道结构，实现仅在轻度破坏卵囊壁结构的基础上增加卵囊渗透性，从而增强卵囊内玻璃化能力和抑制结冰能力，减少冰晶损害，延长低温保存时间，有效扩展了冷冻保存方案在含有卵囊的生物的领域的可应用性。

Description

卵囊壁破壁剂组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及低温冻存技术领域，特别涉及一种卵囊壁破壁剂组合物及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，细胞、组织和器官的冷冻保存迅速发展，冷冻保存技术的突破将为再生医学、胚胎干细胞治疗、切片病理检测、疫苗和细胞药品等产品的保存等领域的发展提供强有力的理论和实验支撑。脱离原生母系环境的活性物质如细胞等在保存过程中由于新陈代谢等生命活动，消耗细胞内自身养分，其活性不可避免的随着保存时间延长而减弱，直至完全失活。极低的温度，通常为77K(-196゜C，液氮的沸点)，通过有效减慢甚至停止细胞内新陈代谢等生命活动，可以延长细胞的寿命，实现细胞等物质的长久保存。

目前普遍采用玻璃化冷冻法，将细胞等生物材料置于玻璃化冷冻保存试剂中平衡后，直接投入到液氮中，使细胞内外液体迅速进入玻璃化状态。玻璃化冷冻保存试剂通常含有较高浓度的DMSO、甘油等小分子物质，这些物质可通过细胞膜进入细胞内部，增强细胞内玻璃化能力，使细胞在快速降温过程中直接进入玻璃态从而避免结冰对细胞产生的损伤。此外，除了玻璃化冷冻法，近年来逐渐发展出一套新的冷冻保存策略，即冷冻保存剂的主要成份由具有控冰蛋白结构和功能的仿生冷冻材料，该冷冻保存剂具有控制结冰、抑制冰晶重结晶、调控冰晶形貌和降低冰晶生长速率等作用，进入细胞后通过调控冰晶演化实现细胞等物质在低温下长期保存。目前，已经实现冷冻保存的生物材料包括多种动物细胞和组织，例如血细胞、精子、卵细胞、胚胎、干细胞等，但是对于含有卵囊类活性生物的冷冻保存尚未取得显著进展，其中的关键桎梏在于卵囊壁的致密结构阻止冷冻保存材料进入卵囊内部。

球虫和隐孢子虫是近年备受关注的含有卵囊发育阶段的寄生原虫，卵囊对其感染性发育至关重要。球虫是一种能寄生在动物肠道上皮细胞内的原生动物，传染性强，危害性大，严重威胁禽、畜生命健康。目前，采用球虫疫苗是行之有效的防控办法，克服了使用化学药物成本高、用药时间长、易产生抗药性等弊端，具有一次免疫终身保护的优势。要充分发挥鸡球虫疫苗的作用，关键环节之一在于保证疫苗储存和运输过程中的质量稳定性。我国已研发和生产出国际领先的鸡球虫早熟选育弱毒疫苗，但其推广应用过程中均受到保存时效短和运输困难的限制。鸡球虫疫苗的主要成份是若干种球虫的孢子化卵囊，具有不耐低温的特性，通常需在2～8℃保存和运输，这导致保存期最多只有7个月，严重影响了疫苗的代际传递和大规模生产。

隐孢子虫是一种体积小于球虫的寄生原虫，与球虫相似，也用孢子化卵囊感染人和动物。它们广泛存在多种脊椎动物体内，是一种仅次于轮状病毒、能引起严重腹泻的肠病原体。隐孢子虫还是重要的机会致病性原虫，在免疫功能正常的宿主体内处于隐性感染状态，但当宿主免疫功能低下时，出现异常迅速增殖，引起危及生命的持续性腹泻和消瘦。目前的抗寄生虫药物对免疫缺陷和营养不良的人基本无效，治疗方法急需改进。因此对致病原虫隐孢子虫的研究十分迫切，但隐孢子虫卵囊保存期短，加上由于缺乏合适的低温保存方法，获得具有遗传特征的卵囊十分困难。目前，隐孢子虫的实验室菌株必须在活体动物(小鼠、小牛和仔猪)内保存，每隔6-8周进行传代繁殖，这不仅是一个昂贵且耗时的过程，而且限制了卵囊在不同实验室之间的共享和相关疫苗和治疗方法效果评价。

球虫和隐孢子虫等卵囊冷冻保存的难点在于其结构不同于细胞，卵囊壁致密且具有一定刚性，冷冻保存材料难以通过卵囊壁渗透进入卵囊内部，无法起到增加玻璃化能力或抑制结冰的效用，因此，不能避免低温保存过程中结冰对卵囊的损伤。因此急需一种新型的卵囊破壁剂，可以轻度破环卵囊壁结构使之形成一定的孔道，让冷冻保存材料通过孔道进入卵囊内部，从而实现含有卵囊类活性生物的低温长久保存。目前含有卵囊类活性生物的冷冻保存的研究和专利都比较少。含有卵囊类活性生物的低温冷冻保存是该领域面临的一大挑战和急需解决的问题，找到能轻度破环卵囊壁结构使得冷冻保存材料顺利进入卵囊内部的方式是关键。目前暂且没有成熟的方案能解决这一问题。

发明内容

针对上述不足，本发明的目的之一在于，提供一种配方合理，仅需要轻度破环卵囊壁结构便能使之形成允许冷冻保存材料进入其内的孔道，有效延长低温保存时间的卵囊壁破壁剂组合物。

本发明的目的之二在于，提供一种上述卵囊壁破壁剂组合物的制备方法。

本发明的目的之三在于，提供一种上述卵囊壁破壁剂组合物的应用。

为实现上述目的，本发明所提供的技术方案是：

一种卵囊壁破壁剂组合物，其包括以下质量百分含量的组份：异丙醇10％～50％、蛋白酶K 0.01％～0.1％、聚乙二醇0.1％～5％、柠檬酸钠0.1％～5％、葡萄糖0.5％～5％、蔗糖0.5％～10％、氯胺T 0.5％～8％、磷酸二氢钠0.1％～0.8％、磷酸氢二钠0.2％～1％、标准PBS缓冲液2％～5％，其为余注射用水。

一种卵囊壁破壁剂组合物的制备方法，其包括以下步骤：

(1)预备以下质量百分含量的组份：异丙醇10％～50％、蛋白酶K 0.01％～0.1％、聚乙二醇0.1％～5％、柠檬酸钠0.1％～5％、葡萄糖0.5％～5％、蔗糖0.5％～10％、氯胺T0.5％～8％、磷酸二氢钠0.1％～0.8％、磷酸氢二钠0.2％～1％、标准PBS缓冲液2％～5％，其余为注射用水；

(2)往所述注射用水中加入蛋白酶K、聚乙二醇和柠檬酸钠，搅拌溶解后，获得第一混合物；

(3)往所述第一混合物加入葡萄糖、蔗糖和氯胺T，搅拌溶解后，获得第二混合物；所述葡萄糖、蔗糖和氯胺T优选按由前至后的顺序依次加入。

(4)往所述第二混合物加入异丙醇，搅拌溶解后，获得第三混合物；

(5)往所述第三混合物加入标准PBS缓冲液、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，调节pH至6.8～7.4，制得卵囊壁破壁剂组合物。

作为本发明的一种优选方案，所述聚乙二醇优选为聚乙二醇500(PEG500)。

所述异丙醇，蛋白酶K、聚乙二醇500(PEG500)和柠檬酸钠等关键成份能分别与卵囊壁结构中的角质蛋白、糖蛋白、磷脂等主要成份相互作用并破坏其致密排列的刚性结构，使之形成一定的孔道结构。

所述葡萄糖和蔗糖等成份主要作用在于为卵囊内的孢子囊提供营养成分以及缓冲异丙醇、蛋白酶等成份对孢子囊的破坏。

所述氯胺T是一种常用消毒剂，主要作用在于灭杀卵囊壁破壁剂组合物中的细菌，抑制细菌对卵囊造成损伤。

所述磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和标准PBS缓冲液等成份作用在于调整卵囊壁破壁剂组合物的pH值，使其pH值处于适宜卵囊冷冻保存的6.8～7.4之间。

一种上述的卵囊壁破壁剂组合物在卵囊的应用，其应用步骤如下：

(S1)获取纯化处理后的卵囊液，然后加入上述的卵囊壁破壁剂组合物，通过搅拌或涡旋混合，然后静置；

(S2)最后对卵囊的状态进行观察，取静置不同时间段的卵囊悬浮液置于显微镜下，观察卵囊形态变化并与空白组对照分析渗透情况。

所述步骤(S1)中的纯化步骤如下：

(Ⅰ)取卵囊液，进行离心、沉淀；

(Ⅱ)除去上清液，加入饱和盐水重悬沉淀，离心；

(Ⅲ)将含有卵囊液的上层液体移入装有注射水的离心管，再次离心，获得卵囊沉淀液；

(Ⅳ)将卵囊沉淀液移入装有注射水的离心管，重复上一步骤几次，优选为三次，最后获得不含有消毒液成分的卵囊液。

本发明的有益效果为：本发明卵囊壁破壁剂组合物的配方合理，其中的异丙醇、蛋白酶K、聚乙二醇和柠檬酸钠等关键成份能与卵囊壁结构中的角质蛋白、糖蛋白、磷脂等主要成份相互作用并破坏其致密排列的刚性结构形成允许冷冻保存材料通过的通道，即实现在轻度破坏卵囊壁结构的基础上，形成供冷冻保存材料通过的孔道来达到增加卵囊渗透性的目的，从而增强卵囊内玻璃化能力和抑制结冰能力，减少冰晶损害，实现低温长久保存。本发明提供的卵囊壁破壁剂组合物的制备方法的步骤简单，易于实现，能快速制备出仅需要轻度破环卵囊壁结构便能使之形成允许冷冻保存材料进入其内的孔道的卵囊壁破壁剂组合物。

下面结合实施例，对本发明进一步说明。

具体实施方式

实施例1：本实施例以增加巨型艾美尔球虫卵囊的渗透性为例进行说明，但不用来限制本发明的限制范围。比如艾美球虫卵囊、柔嫩艾美球虫卵囊、堆型艾美球虫卵囊、布氏艾美球虫卵囊、毒害艾美球虫卵囊、早熟艾美球虫卵囊、变位艾美球虫卵囊和隐孢子虫卵囊等。

(一)卵囊壁破壁剂组合物的制备：取80ml注射水放入置于4゜C水浴的烧杯中，放入搅拌子，转速调节至500rpm；加入蛋白酶K 0.02g、聚乙二醇500(PEG500)1g、柠檬酸钠0.5g，搅拌10分钟；依次加入葡萄糖1g、蔗糖0.5g、氯胺T 0.5g；加入异丙醇15g，搅拌15分钟；然后加入标准PBS缓冲液3ml、磷酸二氢钠0.3g和磷酸氢二钠0.7g，搅拌30分钟。

(二)预处理卵囊，在巨型艾美尔球虫卵囊加入前需进行如下的纯化预处理：

1.取巨型艾美尔球虫卵囊液2ml离心(3000rpm，5min)沉淀；

2.除去上清液，加入2ml饱和氯化钠水溶液，离心(3000rpm，5min)；

3.将含有巨型艾美尔球虫卵囊液体的上层液取出，移入装有2ml注射水的离心管，再次离心(3000rpm，5min)，获得卵囊沉淀液；

4.将卵囊沉淀液移入装有2ml注射水的离心管，离心(3000rpm，5min)，离心步骤过程重复三次，最后获得不含有消毒剂成分的球虫卵囊液。

将上述处理好的球虫卵囊液等分后分别加入含3ml卵囊壁破壁剂组合物的冻存管(A组)和含3ml等渗氯化钠溶液的冻存管(B组)，涡旋搅拌10、30、60分钟后，取出后置于显微镜下观察球虫卵囊的形态、统计球虫卵囊体积，分析其渗透性变化。

结果表明：巨型艾美尔球虫卵囊经过卵囊壁破壁剂组合物浸泡后体积明显缩小，而等渗氯化钠溶液中的巨型艾美尔球虫卵囊体积没有明显变化，表明本发明卵囊壁破壁剂组合物能有效破坏卵囊壁，使得卵囊内成分渗透到卵囊壁外面，换言之，卵囊壁外面的成分也可以进入到卵囊内部。

参见表1，表1为巨型艾美尔球虫卵囊经过卵囊壁破壁剂组合物(A)和等渗氯化钠溶液(B)浸泡后体积随时间的变化。表1中数据为50个球虫卵囊体积的统计平均，这里取新鲜球虫体积为1。

表1

	0min.	10min.	30min.	60min.
					A	1	0.93	0.81	0.58
B	1	0.98	1.01	0.97

实施例2：本实施例与实施例1基本相同，区别点仅在于，卵囊壁破壁剂组合物包括以下质量百分含量的组份：异丙醇30％、蛋白酶K 0.01％、聚乙二醇500(PEG500)2％、柠檬酸钠3％、葡萄糖5％、蔗糖6％、氯胺T 5％、磷酸二氢钠0.5％、磷酸氢二钠0.5％、标准PBS缓冲液5％，注射用水45.99％。

实施例3：本实施例与实施例1基本相同，区别点仅在于，卵囊壁破壁剂组合物包括以下质量百分含量的组份：异丙醇50％、蛋白酶K 0.01％、聚乙二醇500(PEG500)0.1％、柠檬酸钠0.1％、葡萄糖0.5％、蔗糖10％、氯胺T 8％、磷酸二氢钠0.8％、磷酸氢二钠1％、标准PBS缓冲液2％，注射用水27.49％。

实施例4：本实施例与实施例1基本相同，区别点仅在于，卵囊壁破壁剂组合物包括以下质量百分含量的组份：异丙醇50％、蛋白酶K 0.01％、聚乙二醇500(PEG500)0.1％、柠檬酸钠0.1％、葡萄糖0.5％、蔗糖10％、氯胺T 8％、磷酸二氢钠0.8％、磷酸氢二钠1％、标准PBS缓冲液2％，注射用水27.49％。

实施例5：本实施例与实施例1基本相同，区别点仅在于，卵囊壁破壁剂组合物包括以下质量百分含量的组份：异丙醇25％、蛋白酶K 0.07％、聚乙二醇500(PEG500)4％、柠檬酸钠3％、葡萄糖5％、蔗糖0.5％、氯胺T 5％、磷酸二氢钠0.6％、磷酸氢二钠0.2％、标准PBS缓冲液4％，注射用水52.63％。

实施例6：本实施例与实施例1基本相同，区别点仅在于，卵囊壁破壁剂组合物包括以下质量百分含量的组份：异丙醇10％、蛋白酶K 0.1％、聚乙二醇500(PEG500)5％、柠檬酸钠5％、葡萄糖3％、蔗糖5％、氯胺T 0.5％、磷酸二氢钠0.1％、磷酸氢二钠0.8％、标准PBS缓冲液5％，注射用水65.5％。

上述实施例仅为本发明较好的实施方式，本发明不能一一列举出全部的实施方式，凡采用上述实施例之一的技术方案，或根据上述实施例所做的等同变化，均在本发明保护范围内。

在使用时，本发明卵囊壁破壁剂组合物中的异丙醇、蛋白酶K、聚乙二醇和柠檬酸钠等关键成份能与卵囊壁结构中的角质蛋白、糖蛋白、磷脂等主要成份相互作用并破坏其致密排列的刚性结构，使之形成允许冷冻保存材料通过的孔道结构，实现仅在轻度破坏卵囊壁结构的基础上增加卵囊渗透性的目的，从而增强卵囊内玻璃化能力和抑制结冰能力，减少冰晶损害，延长低温保存时间。

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制，采用与其相同或相似方法而得到的其它组合物及其制备方法和应用，均在本发明保护范围内。

Claims (9)

1.一种卵囊壁破壁剂组合物，其特征在于，其包括以下质量百分含量的组份：异丙醇10％～50％、蛋白酶K 0.01％～0.1％、聚乙二醇0.1％～5％、柠檬酸钠0.1％～5％、葡萄糖0.5％～5％、蔗糖0.5％～10％、氯胺T 0.5％～8％、磷酸二氢钠0.1％～0.8％、磷酸氢二钠0.2％～1％、标准PBS缓冲液2％～5％，其余为注射用水。

2.根据权利要求1所述的卵囊壁破壁剂组合物，其特征在于：所述聚乙二醇为聚乙二醇500。

3.一种卵囊壁破壁剂组合物的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤：

(1)预备以下质量百分含量的组份：异丙醇10％～50％、蛋白酶K 0.01％～0.1％、聚乙二醇0.1％～5％、柠檬酸钠0.1％～5％、葡萄糖0.5％～5％、蔗糖0.5％～10％、氯胺T0.5％～8％、磷酸二氢钠0.1％～0.8％、磷酸氢二钠0.2％～1％、标准PBS缓冲液2％～5％，其余为注射用水；

(2)往所述注射用水中加入蛋白酶K、聚乙二醇和柠檬酸钠，搅拌溶解后，获得第一混合物；

(3)往所述第一混合物加入葡萄糖、蔗糖和氯胺T，搅拌溶解后，获得第二混合物；

(4)往所述第二混合物加入异丙醇，搅拌溶解后，获得第三混合物；

(5)往所述第三混合物加入标准PBS缓冲液、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，调节pH至6.8～7.4。

4.根据权利要求3所述的卵囊壁破壁剂组合物，其特征在于：所述聚乙二醇为聚乙二醇500。

5.根据权利要求1所述的卵囊壁破壁剂组合物，其特征在于：所述步骤(3)中的葡萄糖、蔗糖和氯胺T按由前至后的顺序依次加入。

6.一种权利要求1-2或3-5任意一项所述的卵囊壁破壁剂组合物在卵囊的应用。

7.根据权利要求6所述的卵囊壁破壁剂组合物在卵囊的应用，其特征在于，应用步骤如下：

(S1)获取纯化处理后的卵囊液，然后加入权利要求1-2或3-5中任意一项所述的卵囊壁破壁剂组合物，通过搅拌或涡旋混合，然后静置；

(S2)取静置不同时间段的卵囊悬浮液置于显微镜下，观察卵囊形态变化并与空白组对照分析渗透情况。

8.根据权利要求7所述的卵囊壁破壁剂组合物在卵囊的应用，其特征在于，所述步骤(S1)中的纯化步骤如下：

(Ⅰ)取卵囊液，进行离心、沉淀；

(Ⅱ)除去上清液，加入饱和盐水重悬沉淀，离心；

(Ⅲ)将含有卵囊液的上层液体移入装有注射水的离心管，再次离心，获得卵囊沉淀液；

(Ⅳ)将卵囊沉淀液移入装有注射水的离心管，重复上一步骤几次，最后获得不含有消毒液成分的卵囊液。

9.根据权利要求8所述的卵囊壁破壁剂组合物在卵囊的应用，其特征在于，在所述步骤(Ⅳ)中重复的步骤为三次。