CN107347873B

CN107347873B - 一种艾美耳球虫冻存剂及冻存方法

Info

Publication number: CN107347873B
Application number: CN201710567585.9A
Authority: CN
Inventors: 索勋; 刘贤勇; 段春慧; 索静霞; 向碧琪; 郝振凯; 韩贞艳; 毕菲菲; 陶鸽如; 李超; 张思新; 王超越; 顾小龙; 汤新明; 胡丹丹; 于咏兰
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2017-07-12
Filing date: 2017-07-12
Publication date: 2021-02-19
Anticipated expiration: 2037-07-12
Also published as: CN107347873A

Abstract

本发明涉及一种艾美耳球虫冻存剂，所述冻存剂中包括冻存液和冷冻保护剂；所述冻存液中包括蔗糖、磷酸二氢钾、三水合磷酸氢二钾、L‑谷氨酸和小牛血清蛋白；所述冷冻保护剂为二甲基亚砜单体或包括二甲基亚砜的组合物。上述的冻存剂可分别制备成适用于孢子囊和卵囊冻存的冻存剂。采用本发明的冻存剂可将艾美耳球虫在液氮中长期进行保存，解决了艾美耳球虫需不断传代保种的不便。

Description

一种艾美耳球虫冻存剂及冻存方法

技术领域

本发明属于低温冻存研究领域，具体的涉及一种应用于艾美耳球虫的低温长期保存的冻存液。

背景技术

液氮温度(-196℃)是目前最佳冷冻保存温度。在-196℃时细胞生命活动几乎停止，但复苏后细胞结构和功能完好。有报道，人红细胞在液氮中保存12年仍未表现出明显的生理和生化功能的改变；胚脑细胞冻存在液氮中1年以后再复苏仍能保持生长和分化的特性。如果冷冻过程得当，一般生物样品在-196℃均可保存10年以上。

艾美耳球虫是一种常见的原虫，其感染鸡、兔、牛、羊等动物而造成的球虫病对养殖业带来巨大的经济损失,因而研究艾美耳球虫的生物学、疫苗及抗球虫药物具有重要的生产实践意义。球虫研究中需要获得大量的球虫病原体并能在实验室长期保存。因此，能否找到一种合适的冻存液而充分利用液氮长期保存的能力实现艾美耳球虫长期的超低温冻存，是艾美耳球虫研究者一直关注的问题。

目前，艾美耳球虫传统的保存方法即4℃低温保存。较常用的球虫保存液有两种：2.5％的重铬酸钾溶液，0.1mM的硫代硫酸钠溶液——前者用于保存具有感染性的孢子化卵囊，后者则用于较短时间保存未孢子化卵囊。保存时，向纯化好的孢子化卵囊中加入2.5％的重铬酸钾溶液(卵囊的最终浓度不超过1×10⁶/ml)，置于4℃冰箱中即可。

将孢子化卵囊置于2.5％的重铬酸钾溶液中，2-8℃条件下，虫体的感染性可保持1年左右。如果需要活力较高的虫体，保存时间则不超过3个月。因此在研究过程中，球虫需经常传代，既费时费力又容易造成污染。因此急需一种新型的艾美耳球虫保存方法来避免这一缺陷。

发明内容

本发明的目的是提供一种适用于艾美耳球虫的冻存剂，所述冻存剂中包括冻存液和冷冻保护剂；

所述冻存液中包括蔗糖、磷酸二氢钾、三水合磷酸氢二钾、L-谷氨酸和小牛血清蛋白；

所述冷冻保护剂为二甲基亚砜单体或包括二甲基亚砜的组合物。

优选的，每升所述的冻存液中，包括蔗糖70～80g；磷酸二氢钾0.2～0.7g；三水合磷酸氢二钾1～2g；L-谷氨酸0.6～1.2g；小牛血清蛋白5～15g。

更优选的，每升所述的冻存液中，包括蔗糖73～76g；磷酸二氢钾0.4～0.6g；三水合磷酸氢二钾1.5～1.7g；L-谷氨酸0.8～1.2g，小牛血清蛋白9～11g。

最优选的，每升所述的冻存液中，包括蔗糖74.6g；磷酸二氢钾0.5g；三水合磷酸氢二钾1.6g；L-谷氨酸0.9g，小牛血清蛋白10g。

作为本申请最优选的实例，每升所述的冻存液中，包括蔗糖74.6210g；磷酸二氢钾0.5171g；三水合磷酸氢二钾1.6335g；L-谷氨酸0.9079g，小牛血清蛋白10.0000g。

优选的，所述二甲基亚砜单体在所述冷冻保护剂中的体积分数为7～9％。这种冻存剂适用于孢子囊的冻存。本申请中的二甲基亚砜单体即为二甲基亚砜。

利用上述的冻存剂对艾美耳球虫的孢子囊进行冻存的过程中，将孢子囊以2×10⁶个/mL～3×10⁶个/mL的浓度悬于所述的冻存剂中，然后再转入液氮中进行冻存。

优选的，所述包括二甲基亚砜的组合物为二甲基亚砜和甘油的组合物。

优选的，所述二甲基亚砜在所述冻存剂中的体积分数为7～10％，所述甘油在所述冻存剂中的体积分数为9～14％。这种冻存剂适用于卵囊的冻存。

利用上述的冻存剂对艾美耳球虫的卵囊进行保护的方法，冻存的过程中，将卵囊以1×10⁵～3×10⁶个/mL的浓度悬于上述的冻存剂中，然后再转入液氮中进行冻存。

上述方法中，将卵囊或孢子囊悬于冻存剂中后，将上述悬有卵囊或孢子囊的冻存剂装入冻存盒，放入-80℃的冰箱至少5h后，转入液氮保存。

作为一种优选方案，本发明所述的冻存剂包括冻存液和二甲基亚砜。

所述二甲基亚砜占所述冻存剂总体积的7-10％，所述冻存液占冻存剂总体积的90-93％。

每升所述的冻存液中，包括蔗糖74.6g；磷酸二氢钾0.5g；三水合磷酸氢二钾1.6g；L-谷氨酸0.9g，小牛血清蛋白10g；

利用上述的冻存剂对孢子囊进行冻存的方法包括如下步骤：

1)将孢子囊以2×10⁶个/mL～3×10⁶个/mL的浓度悬于所述的冻

存剂中；

2)将上述悬有孢子囊的冻存剂装入冻存盒，放入-80℃的冰箱至少5h后，转入液氮保存。

作为另一种优选方案，本发明所述的冻存剂包括冻存液、二甲基亚砜和甘油；

所述二甲基亚砜占所述冻存剂总体积的7-10％，所述甘油占所述冻存剂总体积的9-14％，剩余为冻存液。

利用上述的冻存剂对卵囊进行冻存的方法包括如下步骤：

1)将卵囊以1×10⁵～3×10⁶个/mL的浓度悬于所述的冻存剂中；

2)将上述悬有卵囊的冻存剂装入冻存盒，放入-80℃的冰箱至少5h后，转入液氮保存。

本发明的另一目的是保护本发明所述的冻存液在艾美耳球虫冻存中的应用。

优选的，本发明所述的冻存液在冻存禽类艾美耳球虫或哺乳类艾美耳球虫中的应用。

本发明所述的卵囊在进行冷冻前需进行如下的纯化预处理：

1)取略高于所需卵囊量的孢子化卵囊液(纯化有损失，可按回收率为50％计算)离心沉淀(3600rpm,5min*)；

2)加3～5倍沉淀体积的饱和盐水重悬沉淀，离心，吸取含卵囊的上层液体(3600rpm,5min*)；

3)加至少5倍上层液体的蒸馏水离心沉淀卵囊(3600rpm,5min*)；

4)加3-5倍沉淀体积的次氯酸钠溶液(有效氯浓度≥6.25％)重悬沉淀，冰浴5min(期间摇匀2-3次)，离心(3600rpm,5min*)，上清转移至新的离心管；

5)加至少5倍上清体积的蒸馏水离心沉淀卵囊(3600rpm,5min*)，重复3次以上至离心管中无明显“消毒液”气味，所得沉淀用重铬酸钾溶液或PBS溶液重悬(卵囊在PBS溶液中，4℃条件下可保存数周，长时间保存建议使用重铬酸钾溶液保存)计数后进行进一步操作或保存于4℃，备用。

本发明所述的孢子囊由卵囊破壁得到，具体的，破壁的操作主要包括如下两种：

A玻璃珠震荡法

1)卵囊沉淀加入1-3ml PBS混匀后与玻璃珠按1:1混合于15ml离心管，于涡旋振荡器上破碎卵囊壁(限鸡球虫，鼠球虫和兔球虫可用1mm玻璃珠震荡)；期间取1微升研磨物不时镜检，镜检90％左右卵囊破碎时停止。

2)用移液器将孢子囊悬液(含有少量卵囊、卵囊残壁)从15ml离心管(含玻璃珠和孢子囊等混合液)中转移到10ml离心管[具体操作：用移液器吸取上层液体转移到10ml离心管中，再加1ml左右PBS吹吸，洗去玻璃珠间的破碎物，重复3次，离心沉淀(2500rpm,5min*)]；

3)用10mlPBS离心沉淀(2500rpm,5min*)，重复2次后转移到1.5ml离心管。

B研磨器研磨法

1)卵囊沉淀加入1ml高压过PBS,混匀后加入到高压过的研磨器中进行研磨，从研磨器中取1微升研磨物不时镜检，镜检90％左右卵囊破碎时停止；

2)将孢子囊悬液(含有少量卵囊、卵囊壁)从研磨器中转移到10ml离心管(2-3mlPBS清洗研磨器)，离心沉淀(2500rpm,5min*)；

3)用10mlPBS重悬，离心沉淀(2500rpm,5min*)，重复两次，转移到1.5ml离心管。

此步骤中所使用的玻璃珠震荡法破碎卵囊壁与研磨器研磨法相比均能达到较好的物理破碎效果，但玻璃珠震荡法具有更加简单方便损失少的优势。卵囊壁破碎后PBS清洗以减小酸度对于冻存的影响。

针对于已经纯化预处理的卵囊，在进行破壁前需进行清洗预处理，其具体操作为：纯化预处理后卵囊置于离心管内，离心沉淀(3600rpm,5min)；沉淀用高压过的PBS重悬后离心沉淀(3600rpm,5min)，重复3次。

此步骤中的卵囊清洗是为了洗去残存的重铬酸钾，并将pH调整到7-8左右，减小酸度对于冻存的影响。卵囊必须经次氯酸钠处理，尽量减小其他细菌对于冻存的影响。

即便卵囊未经过上述的纯化预处理，也需用次氯酸钠消毒后再进行破壁。

孢子囊或卵囊冻存一段时间后需进行进行复苏和传代，其包括如下步骤：

1、孢子囊复苏：遵循慢冻快融的原则，提前将37℃水浴锅预热，将冻存管从液氮取出，放入37℃水浴锅，在1-2min内融化。此步骤借鉴细胞复苏所遵循的原则：慢冻快融。因二甲基亚砜(DMSO)具有一定毒性，所以必须快速融化，以减少二甲基亚砜(DMSO)对孢子囊及卵囊的损害。

2、孢子囊及卵囊清洗：将融化的孢子囊或卵囊悬液转入10ml离心管内，加5mlPBS稀释后离心沉淀(孢子囊，2500rpm,5min*；卵囊，3600rpm,5min*)，弃去上清(冻存液)；再用1mlPBS吹起并混匀后转移至1.5ml的离心管内并用1mlPBS离心沉淀(孢子囊，2500rpm,5min*；卵囊，3600rpm,5min*)，重复2次。此步骤是为洗去残存冻存液，并使用合适的体积重悬孢子囊及卵囊以便复苏。

3、孢子囊及卵囊传代：1mlPBS重悬孢子囊及卵囊并计数；用1ml的注射器吸取所需剂量的孢子囊或卵囊悬液经口接种(10⁵/只)；接种完毕后(剩余适量)再次计数确保接种剂量无误。

本发明在操作的过程中需注意：

(1)配置好的冻存液可放入-20℃保存。

(2)二甲基亚砜(DMSO)现用现加(注意避光)。

(3)冻存盒提前拿出至少半小时恢复至室温。

(4)异丙醇使用3-5次后注意更换。

(5)由于某些试剂用量较少，为保证用量准确，冻存液配制至少100ml。

本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种艾美耳球虫的冻存剂，提出了一种艾美耳球虫冻存的方法。采用本发明的冻存剂可将艾美耳球的卵囊或孢子囊在液氮中长期进行保存，解决了艾美耳球虫需不断传代保种的不便。

附图说明

图1-4为鸡球虫孢子囊复苏结果

图1为堆型艾美耳球虫孢子囊复苏结果。A堆型艾美耳球虫冻存前孢子囊。B堆型艾美耳球虫冻存后孢子囊。C堆型艾美耳球虫孢子囊复苏结果。

图2为巨型艾美耳球虫孢子囊复苏结果。A巨型艾美耳球虫冻存前孢子囊。B巨型艾美耳球虫冻存后孢子囊。C巨型艾美耳球虫孢子囊复苏结果。

图3为柔嫩艾美耳球虫孢子囊复苏结果。A柔嫩艾美耳球虫冻存前孢子囊。B柔嫩艾美耳球虫冻存后孢子囊。C柔嫩艾美耳球虫孢子囊复苏结果。

图4为毒害艾美耳球虫孢子囊复苏结果。A毒害艾美耳球虫冻存前孢子囊。B毒害艾美耳球虫冻存后孢子囊。C毒害艾美耳球虫孢子囊复苏结果。

图5-8为兔球虫孢子囊复苏结果

图5为肠艾美耳球虫(早熟)孢子囊复苏结果。A肠艾美耳球虫(早熟)冻存前孢子囊。B肠艾美耳球虫(早熟)冻存后孢子囊。C肠艾美耳球虫(早熟)孢子囊复苏结果。

图6为斯氏艾美耳球虫孢子囊复苏结果。A斯氏艾美耳球虫冻存前孢子囊。B斯氏艾美耳球虫冻存后孢子囊。C斯氏艾美耳球虫孢子囊复苏结果。

图7为中型艾美耳球虫(早熟)孢子囊复苏结果。A中型艾美耳球虫(早熟)冻存前孢子囊。B中型艾美耳球虫(早熟)冻存后孢子囊。C中型艾美耳球虫(早熟)孢子囊复苏结果。

图8为大型艾美耳球虫孢子囊复苏结果。

图9为镰型艾美耳球虫孢子囊复苏结果。A镰型艾美耳球虫冻存前孢子囊。B镰型艾美耳球虫冻存后孢子囊。C镰型艾美耳球虫孢子囊复苏结果。

图10-13为鸡球虫卵囊复苏结果

图10为堆型艾美耳球虫卵囊复苏结果

图11为巨型艾美耳球虫卵囊复苏结果。

图12为柔嫩艾美耳球虫卵囊复苏结果。

图13为毒害艾美耳球虫卵囊复苏结果。

图14-17为兔球虫卵囊复苏结果

图14为肠艾美耳球(早熟)虫卵囊复苏结果。

图15为斯氏艾美耳球虫卵囊复苏结果。

图16为中型艾美耳球(早熟)虫卵囊复苏结果。

图17为大型艾美耳球虫卵囊复苏结果。

图18为镰型艾美耳球虫卵囊复苏结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1鸡球虫孢子囊冻存与复苏

本实施例涉及一种艾美耳球虫的冻存剂及用这种冻存剂进行冻存的方法。

该实施例中所使用的冻存剂包括冻存液和DMSO.

所述冻存液中具体包括：蔗糖74.6210g/L(0.2369M)；磷酸二氢钾0.5171g/L(0.0041M)；三水合磷酸氢二钾1.6335g/L(0.0078M)；L-谷氨酸0.9079g/L(0.0067M)；小牛血清蛋白10.0000g/L。

使用时在所述的冻存液中添加DMSO，所述DMSO在所述冻存剂中的体积分数为8％。

冻存和复苏包括如下步骤：将不同种鸡艾美耳球虫(堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫)孢子囊按照孢子囊冻存方法进行液氮冻存，具体为：

1)将孢子囊以约2×10⁶个/mL的浓度悬于所述的冻存剂中；具体的，堆型艾美耳球虫(2×10⁶/ml)、巨型艾美耳球虫(2.25×10⁶/ml)、柔嫩艾美耳球虫(2.8×10⁶/ml)和毒害艾美耳球虫(1×10⁶/ml)。

之后将冻存的四种鸡球虫按照孢子囊及卵囊复苏方法进行复苏，分别以堆型艾美耳球虫(冻存57天)、巨型艾美耳球虫(冻存8天)、柔嫩艾美耳球虫(冻存40天)和毒害艾美耳球虫(冻存35天)为例进行复苏，每只鸡接种不同剂量孢子囊，3只/组，并对其孢子囊形态及排卵囊量进行比较。

复苏结果表明：以上四种鸡球虫孢子囊使用该球虫冻存剂冻存后孢子囊形态均未发生改变，复苏后对卵囊产量进行统计，堆型艾美耳球虫冻存57天后复苏接种1×10⁴个孢子囊即可产生8.8×10⁵个卵囊。而接种3×10⁵个孢子囊即产生3×10⁸个卵囊，因此该冻存剂对于堆型艾美耳球虫具有较好保存效果，建议复苏接种剂量为10⁴个(如图1)因虫种差异性，对于巨型艾美耳球虫而言，接种10⁵个孢子囊产生了10⁴～10⁵个不等的卵囊，因此该冻存剂对于巨型艾美耳球虫具有较好保存效果，建议复苏接种剂量为10⁵个(如图2)。而关于柔嫩艾美耳球虫的复苏，接种10⁴个孢子囊可产生10⁴个卵囊。而接种10⁵个孢子囊产生10⁶～10⁷个卵囊，因此该冻存剂对于柔嫩艾美耳球虫具有较好保存效果，建议复苏接种剂量为10⁵个及以上(如图3)。毒害艾美耳球虫复苏接种10⁵个即可检测到卵囊产出，而接种3×10⁵个及以上可获得足够量的卵囊(如图4)。

实验例2兔球虫孢子囊冻存与复苏

该实施例中所使用的冻存剂包括冻存液和DMSO.

冻存和复苏的方法包括如下步骤：将不同种兔艾美耳球虫孢子囊(斯氏艾美耳球虫、中型艾美耳球虫、肠艾美耳球虫、大型艾美耳球虫)按照上述孢子囊冻存方法进行液氮冻存。其具体为：

1)将孢子囊以约2×10⁶个/mL的浓度悬于所述的冻存剂中，具体的，斯氏艾美耳球虫(2×10⁶/ml)、中型艾美耳球虫(3×10⁶/ml)、肠艾美耳球虫(2.1×10⁶/ml)、大型艾美耳球虫(2×10⁶/ml)；

之后将冻存的四种兔球虫进行复苏，分别以斯氏艾美耳球虫(冻存17天)、中型艾美耳球虫(冻存14天)、肠艾美耳球虫(冻存43天)和大型艾美耳球虫(冻存120天)为例进行复苏，每组接种不同剂量孢子囊，1只/组。并对其孢子囊形态及排卵囊量进行比较。

复苏结果表明：以上四种兔球虫孢子囊使用该冻存剂冻存后孢子囊形态均未发生改变，复苏后对卵囊产量进行统计，肠艾美耳球虫冻存43天后复苏接种10⁵个孢子囊即可产生10⁶～10⁷个卵囊。这表明肠艾美耳球虫经液氮冻存后仍然具有较强活力(如图5)因虫种差异性，对于斯氏艾美耳球虫而言，接种10⁵个孢子囊产生了10⁸个卵囊(如图6)。而关于中型艾美耳球虫的复苏，接种10⁴个孢子囊可产生约10⁷个卵囊(如图7)。大型艾美耳球虫复苏即接种10⁵个孢子囊可获得10⁶～10⁷个卵囊(如图8)。因此对于四种兔球虫而言复苏10⁴个孢子囊即可产生足够量的卵囊。

实验例3鼠球虫孢子囊冻存与复苏

该实施例中所使用的冻存剂包括冻存液和DMSO.

冻存和复苏的方法包括如下步骤：将鼠球虫孢子囊--镰型艾美耳球虫孢子囊按照上述孢子囊冻存方法进行液氮冻存。其具体为：

1)将孢子囊以2×10⁶个/mL的浓度悬于所述的冻存剂中；

之后将冻存16天后的镰型艾美耳球虫进行复苏。复苏后的镰型艾美耳球虫进行计数后经口接种2只昆明鼠，每组接种不同剂量孢子囊，并对其排卵囊量进行比较。

复苏结果表明：冻存前后孢子囊形态均较完整。，复苏后对卵囊产量进行统计，镰型艾美耳球虫冻存16天后复苏接种10³～10⁴个孢子囊即可产生10⁵个卵囊。因此该冻存剂对于镰型艾美耳球虫具有较好保存效果，建议复苏接种剂量为10⁴个孢子囊(如图9)。

实验例4鸡球虫卵囊冻存与复苏

该实施例中所使用的冻存剂包括冻存液、DMSO和甘油。

使用时在所述的冻存液中添加DMSO和甘油，所述DMSO在所述冻存剂中的体积分数为8％，所述甘油在冻存剂中的体积分数为12％。

将不同种鸡艾美耳球虫卵囊(柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫)按照上述卵囊冻存方法进行液氮冻存。其具体为：

1)将卵囊以约3×10⁶/ml的浓度悬于所述的冻存剂中，具体的，柔嫩艾美耳球虫(1.8×10⁶/ml)、堆型艾美耳球虫(2.3×10⁶/ml)、巨型艾美耳球虫(3×10⁶/ml)、毒害艾美耳球虫(3×10⁶/ml)；

之后将冻存的四种鸡球虫卵囊冻存后分别进行复苏，分别以堆型艾美耳球虫(冻存7天)、巨型艾美耳球虫(冻存15天)、柔嫩艾美耳球虫(冻存21天)和毒害艾美耳球虫(冻存30天)为例进行复苏，每组接种不同剂量卵囊，3只/组。并对其排卵囊量进行比较。

复苏结果表明：鸡球虫卵囊经改良的球虫冻存剂冻存复苏后，形态并未发生改变，仍具有完整卵囊形态，复苏后分别对卵囊产量进行统计：堆型艾美耳球虫经液氮冻存7天后接种10⁵个即可产生10⁷个左右的卵囊，因此改良后的冻存剂对于堆型艾美耳球虫具有较好保存效果(如图10)。因虫种不同，巨型艾美耳球虫冻存后复苏发现接种10⁵个复苏卵囊后可产生10⁶个卵囊(如图11)。柔嫩艾美耳球虫卵囊冻存后的产量即接种10⁵个冻存卵囊后有约10⁶个卵囊产生(如图12)，具有较高的卵囊产量。对于毒害艾美耳球虫的复苏，接种10⁵个冻存后的卵囊后有约10⁵～10⁶个卵囊产生(如图13)。因此对于以上四种鸡球虫，建议接种10⁵个及以上冻存卵囊进行复苏。

实验例5兔球虫卵囊冻存与复苏

该实施例中所使用的冻存剂包括冻存液、DMSO和甘油。

将不同种兔艾美耳球虫卵囊(斯氏艾美耳球虫、中型艾美耳球虫、大型艾美耳球虫和肠艾美耳球虫)按照上述卵囊冻存方法进行液氮冻存。具体为：

1)将卵囊以约2～3×10⁶个/mL的浓度悬于所述的冻存剂中；具体的，斯氏艾美耳球虫(1.5×10⁶/ml)、中型艾美耳球虫(2.5×10⁶/ml)、大型艾美耳球虫(3×10⁶/ml)和肠艾美耳球虫(2×10⁶/ml)，

之后将冻存的四种兔球虫卵囊分别进行复苏，分别以大型艾美耳球虫(冻存7天)、中型艾美耳球虫(冻存15天)、斯氏艾美耳球虫(冻存21天)和肠艾美耳球虫(冻存30天)为例进行复苏，每组接种不同剂量卵囊，1只/组，并对其排卵囊量进行比较。

复苏结果表明：兔球虫卵囊经改良的球虫冻存剂冻存后，形态并未发生改变，仍具有完整卵囊形态，复苏后分别对卵囊产量进行统计：肠艾美耳球虫经液氮冻存30天后接种10⁵个即可产生10⁶个左右的卵囊，因此改良后的冻存剂对于堆型艾美耳球虫具有较好保存效果(图14)。斯氏艾美耳球虫冻存后21天复苏发现接种10⁵个复苏卵囊后可产生10⁷个卵囊(如图15)，仍具有较强活力。中型艾美耳球虫卵囊冻存15天后复苏的产量即接种10⁴个冻存卵囊后有约10⁶个卵囊产生(如图16)，具有较高的卵囊产量。对于大型艾美耳球虫的复苏，接种10⁵个冻存后的卵囊后有约10⁶个卵囊产生(如图17)。因此对于以上四种兔球虫，建议接种10⁵个及以上冻存卵囊进行复苏。

实验例6---鼠球虫卵囊冻存与复苏

该实施例中所使用的冻存剂包括冻存液、DMSO和甘油。

使用时在所述述的冻存液中添加DMSO和甘油，所述DMSO在所述冻存剂中的体积分数为8％，所述甘油在冻存剂中的体积分数为12％。

将鼠球虫卵囊按照上述卵囊冻存方法进行液氮冻存，具体为：

1)将卵囊以3×10⁶个/mL的浓度悬于所述的冻存剂中；

之后将冻存的鼠球虫卵囊(冻存17天)进行复苏，每组接种不同剂量卵囊，3只/组，并对其排卵囊量进行比较。

复苏结果表明：鼠球虫卵囊经改良的球虫冻存剂冻存后，形态并未发生改变，仍具有完整卵囊形态，复苏后分别对卵囊产量进行统计：镰型艾美耳球虫经液氮冻存17天后接种10⁴个即可产生10⁵个左右的卵囊，因此改良后的冻存剂对于镰型艾美耳球虫具有较好保存效果，建议复苏接种剂量为10⁴个(图18)。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种艾美耳球虫冻存剂，其特征在于，所述冻存剂由冻存液和冷冻保护剂组成；

所述冻存液中的有效成分由蔗糖、磷酸二氢钾、三水合磷酸氢二钾、L-谷氨酸和小牛血清蛋白组成；

每升所述的冻存液的有效成分如下：蔗糖70~80g；磷酸二氢钾0.2~0.7g；三水合磷酸氢二钾1~2g；L-谷氨酸 0.6~1.2g；小牛血清蛋白5~15g；

所述冷冻保护剂为二甲基亚砜单体或为由二甲基亚砜和甘油组成的组合物；

当所述冷冻保护剂为二甲基亚砜单体时，所述二甲基亚砜单体在所述冻存剂中的体积分数为7~9%；

当所述冷冻保护剂为由二甲基亚砜和甘油组成的组合物时，所述二甲基亚砜在所述冻存剂中的体积分数为7~10%，所述甘油在所述冻存剂中的体积分数为9~14%。

2.根据权利要求1所述的冻存剂，其特征在于，每升所述的冻存液中的有效成分如下：蔗糖73~76g；磷酸二氢钾0.4~0.6g；三水合磷酸氢二钾1.5~1.7g；L-谷氨酸 0.8~1.2g，小牛血清蛋白9~11g。

3.权利要求1~2任一项所述冻存剂在艾美耳球中冻存中的应用。

4.一种利用权利要1或2所述冻存剂进行冻存的方法，其特征在于，当所述冷冻保护剂为二甲基亚砜单体时，将孢子囊以2~3×10⁶个/mL的浓度悬于所述冻存剂中，然后转入液氮保存。

5.一种利用权利要求1或2所述冻存剂进行冻存的方法，其特征在于，当所述冷冻保护剂为由二甲基亚砜和甘油组成的组合物时，将卵囊以1×10⁵-3×10⁶个/mL 的浓度悬于所述冻存剂中，然后转入液氮保存。

6.根据权利要求4或5所述的冻存方法，其特征在于，将悬有孢子囊或卵囊的冻存剂装入冻存盒，放入-80℃的冰箱至少5h后，转入液氮保存。