CN103374526A - 一种球虫卵囊培养保存液及应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于兽医寄生虫领域，涉及一种球虫卵囊培养保存液及应用方法。其特征在于，该培养保存液以盐酸聚六亚甲基胍为主要成份。其应用方法为，从含球虫卵囊的鸡粪或者肠道组织中分离纯化新鲜的球虫卵囊，加入适量的盐酸聚六亚甲基胍溶液，调整卵囊密度，控制培养液深度，置于摇床中振荡培养。镜检，当卵囊孢子化率超过85％时，即可停止培养，收集卵囊，重新加入适量上述盐酸聚六亚甲基胍溶液，保存在4℃冰箱中即可。该培养保存液高效、长效、安全，对环境无污染，配制简单，成本低廉，是一种理想的球虫卵囊培养保存液。应用本发明提供的应用方法，操作简便，效率高，可实现自动化，适合于球虫卵囊的大规模培养保存。

Description

一种球虫卵囊培养保存液及应用方法

技术领域

本发明属于兽医寄生虫领域，涉及一种球虫卵囊培养保存液及应用方法。

背景技术

鸡球虫病(Coccidiosis)是一种由艾美耳属球虫寄生于鸡的肠道引起的具有重要经济意义的肠道寄生虫病，可降低增重和饲料报酬。本病分布很广，常呈地方流行性，给养鸡业带来很大威胁。长期以来，一直使用有效的药物来预防和治疗鸡球虫病，但这些药物的长期使用不可避免地导致了耐药虫株的产生，而且其在肉蛋内的残留也危及人类健康。而以鸡球虫病虫苗免疫为主的预防措施是控制球虫病的理想方法。与抗球虫药相比，应用鸡球虫病疫苗具有三大优势：一是无抗药性问题，预防鸡球虫病的效果更有保证；二是无药残和休药期问题，使用更安全；三是减少药费开支，降低养鸡生产成本。目前临床应用的鸡球虫疫苗都是不同配比的球虫孢子化活卵囊，其中上海市农业科学院畜牧兽医研究所研制的鸡球虫病疫苗2000年获得农业部颁发的新兽药证书。鸡球虫病疫苗的制备流程通常是先用不同的球虫种接种鸡，收集鸡粪和盲肠内容物中的新鲜球虫卵囊，培养成熟后配制球虫疫苗，保存待用。其关键除了作为核心的球虫虫种外，就是球虫卵囊的培养和保存。这是因为球虫卵囊的培养和保存在温度适宜的条件下，氧气对其正常发育和保持活力至关重要。因此，在球虫卵囊的培养过程中常常需要对培养液进行吹打或搅拌，以增加培养液的含氧量，同时为了防止微生物与球虫卵囊争夺有限的氧气，培养液常添加具有防腐消毒作用的物质来抑杀微生物，但又不能影响球虫卵囊正常的孢子化和活力。目前，球虫卵囊培养保存液最常用的是2.5％的重铬酸钾溶液(陈桂先，韦园园，陈汉忠，等.柔嫩艾美耳球虫广西南宁株的分离及鉴定[J].中国畜牧兽医，2010，37(9)：168-172.)。但重铬酸钾中的六价铬具有致癌性与细胞毒性，包括氧化应激、DNA损伤、细胞凋亡以及改变基因的表达(肖经纬.六价铬致DNA损伤机制的研究进展[J].国外医学卫生学分册，2006，33(2)：97-100.)。用重铬酸钾溶液作为球虫疫苗培养保存液，鸡接种后，六价铬就会排到环境中或在鸡体内沉积，进而导致环境污染和影响人类健康，因此研究开发可代替重铬酸钾的球虫卵囊培养保存剂对于保护环境、动物和人类的健康具有极其重要的意义。

为了解决使用重铬酸钾作为球虫卵囊培养保存剂可能带来的环境污染和动物健康等问题，各国科学家一直在试图寻找其替代品。捷克的A.Kitandu用1％氯胺B(w/v)作为保存剂(Kitandu A，JuranováR，I.Influence ofvaccination of hens with attenuated oocysts ofEimeria tenella，E.necatrix，E.acervulina and E.maxima on protection of offspring against Eimeriainfection[J].ACTA VET.BRNO 2005，74：585-593.)，佛山正典生物技术有限公司的谭志坚等(谭志坚，翁亚彪.一种球虫卵囊培养液与保存液.中国专利，ZL200610034867.4[P].2008-02-06)发明了一种使用氯胺T溶液作为球虫卵囊培养液与保存液。氯胺是由次氯酸与胺、酰胺、亚胺或酰亚胺反应而产生。由于所用原料不同，而分为氯胺T、氯胺B与氯胺C。氯胺T化学名为甲苯磺酰氯胺钠盐，固体状态性质较稳定，但水溶液稳定性差。氯胺T是一种广谱杀菌剂，对细菌、病毒和真菌孢子都有较强的杀灭作用。其杀菌作用主要是由于氯胺T溶于水中产生次氯酸，放出活性氯。在水产养殖上常用于治疗细菌性疾病。由于次氯酸从氯胺释放的速度较慢，其杀菌效力较小，但作用时间较长。在碱性和大量有机物存在的环境中，杀菌作用减弱。因此，本品不能与碱和有机物混用，不能与任何裸露的金属容器接触，以防降低药效和产生药害(陈昌福.二氧化氯制剂是水产养殖用消毒剂的最佳选择(四)[J].渔业致富指南，2007，16：75-76.)。

发明内容

本发明的目的在于克服现有球虫卵囊培养保存液重铬酸钾溶液的安全性和潜在的环境污染及氯胺T溶液的性质不稳定等问题，获得一种安全高效、性质稳定的球虫卵囊培养保存液，并提供一种操作简便、宜于大规模应用的球虫卵囊培养方法。本发明对现有的数种安全的防腐消毒剂进行筛选，获得可作为球虫卵囊培养保存液的盐酸聚六亚甲基胍溶液。本发明还优化了盐酸聚六亚甲基胍溶液作为球虫卵囊培养保存液的浓度范围，并提供一种应用该培养保存液培养保存球虫卵囊的方法，大大简化了生产步骤，提高了工作效率。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

为了获得安全的球虫卵囊培养保存液，本发明在参考大量文献的基础上，应用微量培养法，对二氧化氯、过硫酸氢钾复合盐、盐酸聚六亚甲基胍(PHMG)、山梨酸钾、苯甲酸钠、过氧化镁、过氧化锌等溶液培养球虫卵囊的性能及其抑制菌能力进行了测定，筛选确定对球虫卵囊发育良好、抑菌能力较强的盐酸聚六亚甲基胍溶液作为本发明的球虫卵囊培养液。在此基础上对盐酸聚六亚甲基胍溶液的使用浓度进行了优化，发现在培养48h后，0.25％～1％浓度的盐酸聚六亚甲基胍培养液中球虫卵囊的孢子化率均超过88％，具有较好的球虫卵囊培养性能和抑菌能力，经济高效。

应用该溶液培养和保存球虫卵囊的方法如下：从含有球虫卵囊的鸡粪或者鸡肠道组织中分离新鲜的球虫卵囊，置培养器皿中，加入如上所述的盐酸聚六亚甲基胍溶液，调整卵囊密度为10⁶个/mL左右，培养液深度不超过1cm，用四层纱布盖紧瓶口。置于振荡摇床中，调整温度为28℃，转速为100rpm，培养24～72h。镜检，当卵囊孢子化率超过85％时，停止培养，离心收集卵囊，重新加入适量上述盐酸聚六亚甲基胍溶液，保存在4℃冰箱中即可。球虫卵囊孢子化率、抗菌活性，以及长期保存对球虫疫苗免疫保护力影响的研究均表明，本发明在球虫卵囊培养保存技术上取得了突破性的进展，为球虫卵囊疫苗的无害化培养保存和大规模生产、临床应用提供了可靠的技术支撑。

本发明提供的以盐酸聚六亚甲基胍溶液为主的球虫卵囊培养保存液及应用方法与现有的球虫卵囊培养保存液及应用方法相比，具有如下优点：

A本发明所述的盐酸聚六亚甲基胍球虫卵囊培养保存液，无色无味，不燃不爆，有极强的杀灭细菌和病毒的能力，且广谱高效，具有长期抑菌作用，对各种金属材料无腐蚀，可降解，对环境没有污染(黄新宇.盐酸聚六亚甲基胍消毒剂研究进展[J].中国卫生工程学，2005，4(5)：324-325.)，使用安全(陈明中，吴心勤，赵康涛，蔺红光，郑丽红，黄佳宁.含聚六亚甲基胍手消毒剂的毒性研究[J].中国卫生检验杂志，2009，19(12)：2776-2779.)。

B本发明所述的盐酸聚六亚甲基胍球虫卵囊培养保存液，用于培养球虫卵囊，孢子化率高，达到应用重铬酸钾或氯胺T和氯胺B作为球虫卵囊培养保存液的水平。

C本发明所述的盐酸聚六亚甲基胍球虫卵囊培养保存液，用于保存球虫卵囊，4℃保存10个月，免疫保护力与重铬酸钾培养保存液相当，稳定性好。

D本发明提供的应用盐酸聚六亚甲基胍球虫卵囊培养保存液培养球虫卵囊的方法，采用摇床振荡培养，不需要人工搅拌或吹打培养液，既保证了球虫卵囊发育需要的氧气，又简化了培养程序，提高了劳动效率，适合大规模培养。

具体实施方式

1.候选球虫卵囊培养保存液的筛选

本发明人大量查阅文献资料的基础上，优先选择了安全性能好的二氧化氯、过硫酸氢钾复合盐、盐酸聚六亚甲基胍、山梨酸钾、苯甲酸钠、过氧化镁、过氧化锌、氯胺T等溶液作为候选的球虫卵囊培养保存液，应用微量培养法，通过球虫卵囊的孢子化率和杀菌能力确定最优的球虫卵囊培养保存液。取24孔细胞培养板，每孔加入0.5mL配制好的成2倍使用浓度的溶液，再分别加入0.5mL新鲜制备的2×10⁴个/ml卵囊，每种溶液设三个重复，振摇培养板，使卵囊均匀悬浮，盖好培养板，28℃，100rpm振荡培养。分别于培养后24h，48h，72h，吸取20μL培养液。镜检，计数其中未孢子化卵囊的个数与已孢子化卵囊的个数，计算孢子化率。结果，培养后48和72小时，球虫卵囊孢子化率在85％以上的溶液有盐酸聚六亚甲基胍、重铬酸钾、氯胺T和氯胺B，各溶液间球虫卵囊孢子化率差异不显著(p＞0.05)，且这三种溶液均能完全杀灭培养液中可能污染的细菌，说明盐酸聚六亚甲基胍可用于代替重铬酸钾和氯胺T作为球虫卵囊的培养液。

2.盐酸聚六亚甲基胍溶液作为球虫卵囊培养保存液浓度的优化

应用微量培养法，通过球虫卵囊的孢子化率和杀菌能力确定盐酸聚六亚甲基胍溶液作为球虫卵囊培养保存的适宜浓度。取24孔细胞培养板，每孔加入0.5mL配制好的成2倍使用浓度的溶液，再分别加入0.5mL新鲜制备的2×10⁴个/ml卵囊，每种浓度设三个重复，振摇培养板，使卵囊均匀悬浮，盖好培养板，28℃，100rpm振荡培养。分别于培养后24h，48h，72h，56h，吸取20μL培养液。镜检，计数其中未孢子化卵囊的个数与已孢子化卵囊的个数，计算孢子化率。结果，柔嫩艾美耳球虫卵囊在0.0625％～8％浓度的盐酸聚六亚甲基胍培养液中，各浓度组间的孢子化率差异不显著(p＞0.05)，培养48h后，0.25％～1％浓度的盐酸聚六亚甲基胍培养液中球虫卵囊的孢子化率均超过88％(表1)。孢子化结束后，取适量培养液涂布营养琼脂平板，37℃培养三天后，除纯水对照组长满大片菌苔外，其余组都未见菌落形成，说明0.0625～8％PHMG溶液能完全能满足球虫卵囊培养液中抑杀细菌的要求。

3.长期保存对球虫疫苗免疫保护力的影响

分别用0.25％、1％盐酸聚六亚甲基胍溶液和2.5％重铬酸钾溶液配制鸡柔嫩艾美耳球虫疫苗，4℃保存，分别于保存后2、4、6、8、10、12个月，口服免疫6日龄雏鸡，每组15只，另设空白对照组和感染对照组，称重，免疫后第2周，除空白对照组外，用柔嫩艾美耳球虫强毒株攻毒，5×10⁴卵囊/羽。每天观察和记录鸡只的发病、血便和死亡情况。攻毒后第7天，称重，剖检，检查盲肠病变并记分。最后取盲肠内容物计数克卵囊含量(OPG)。12个月保存期内，与应用2.5％重铬酸钾相比，应用0.25％和1％盐酸聚六亚甲基胍保存的球虫疫苗在相对增重率、病变值、卵囊值、存活率等指标方面均差异不显著(p＞0.05)，而且应用2.5％重铬酸钾、0.25％和1％盐酸聚六亚甲基胍保存的球虫疫苗在保存后的10个月其抗球虫指数均大于160，说明仍保持较好的免疫保护力。

4.应用0.25％盐酸聚六亚甲基胍溶液大规模培养保存鸡球虫卵囊

从含有球虫卵囊的鸡盲中分离新鲜的柔嫩艾美尔球虫卵囊，加入0.25％盐酸聚六亚甲基胍溶液，调整卵囊密度为1×10⁶个/mL左右，加入三角培养瓶中，使培养液深度不超过1cm，用四层纱布盖紧瓶口。置于振荡摇床中，调整温度为28℃，转速为100rpm，培养48h。镜检，卵囊孢子化率达89.02％，停止培养，离心收集卵囊，重新加入适量上述盐酸聚六亚甲基胍溶液，保存在4℃冰箱中即可。

5.应用0.5％盐酸聚六亚甲基胍溶液大规模培养保存鸡球虫卵囊

从含有球虫卵囊的鸡盲中分离新鲜的柔嫩艾美尔球虫卵囊，加入0.5％盐酸聚六亚甲基胍溶液，调整卵囊密度为1×10⁶个/mL左右，加入三角培养瓶中，使培养液深度不超过1cm，用四层纱布盖紧瓶口。置于振荡摇床中，调整温度为28℃，转速为100rpm，培养48h。镜检，卵囊孢子化率达88.78％，停止培养，离心收集卵囊，重新加入适量上述盐酸聚六亚甲基胍溶液，保存在4℃冰箱中即可。

6.应用1％盐酸聚六亚甲基胍溶液大规模培养保存鸡球虫卵囊

从含有球虫卵囊的鸡粪中分离新鲜的柔嫩艾美尔球虫卵囊，加入1％盐酸聚六亚甲基胍溶液，调整卵囊密度为1×10⁶个/mL左右，加入三角培养瓶中，使培养液深度不超过1cm，用四层纱布盖紧瓶口。置于振荡摇床中，调整温度为28℃，转速为150rpm，培养48h。镜检，卵囊孢子化率为90.26％，停止培养，离心收集卵囊，重新加入适量上述盐酸聚六亚甲基胍溶液，保存在4℃冰箱中即可。

表1不同浓度PHMG溶液对柔嫩艾美耳球虫卵囊孢子化率的影响

Claims (4)

1.一种球虫卵囊培养保存液，其特征在于该培养保存液为聚六亚甲基胍溶液。

2.一种如权利要求1所述的球虫卵囊培养保存液的应用方法如下：

(1)分离新鲜球虫卵囊；

(2)加入聚六亚甲基胍溶液，调整球虫卵囊浓度；

(3)置于摇床中，振荡培养；

(4)镜检孢子化率，4℃冰箱保存。

3.根据权利要求1所述的一种球虫卵囊培养保存液，其特征在于该培养保存液中聚六亚甲基胍的浓度为0.0625％～8％，最优为0.25％～1％。

4.根据权利要求2所述的球虫卵囊培养保存液的应用方法，其特征在于置于摇床中，振荡培养，摇床中的温度28℃，转速为100rpm。