CN111662827A - 一种筛选产油丝状真菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种筛选产油丝状真菌的方法，其中，一种适用于产油丝状真菌的氯化三苯基四氮唑PDA培养基，其包括，配置马铃薯琼脂培养基；加入三氯生和氯化三苯基四氮唑，使得马铃薯琼脂培养基含有5mg/L三氯生和0.5g/L氯化三苯基四氮唑；一种筛选产油丝状真菌的方法，其为：取土壤于无菌水中，震荡1～3h后稀释菌液；将所述菌液涂布在氯化三苯基四氮唑PDA培养基上，分离产油丝状真菌和/或产油丝状真菌孢子，纯化即得菌体。本发明通过优选得配置培养基、筛选产油丝状真菌，并对其进行脂质提取，获得了提高了油脂的获得效率。

Description

一种筛选产油丝状真菌的方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种筛选产油丝状真菌的方法。
背景技术
产油丝状真菌是一类可以高产油脂的丝状真菌，可用来生产多种多不饱和脂肪酸。多不饱和脂肪酸具有多种重要的功能，如：缓解炎症、治疗糖尿病、预防心脑血管疾病、维持人类正常的认知功能等，对人类的营养与健康具有重要的意义。因此快速高效地筛选出生长性状优良的、具有自主知识产权的产油丝状真菌，并将其应用于商业化生产意义深远。
目前筛选产油丝状真菌的传统方法有低温筛选法、菌落微缩法、抗性筛选法等，但是传统方法传统筛选方法存在诸多弊端，无法做到快速、高效地定向筛选产油丝状真菌，不能大规模进入工业化生产。因此，建立一种高效的筛菌策略，快速筛选生长性状优良的高产多不饱和脂肪酸的丝状真菌具有重要意义。
脂肪酸合成酶(FAS)是生物体内源性脂肪酸合成过程的关键酶，它通过催化乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A而生成长链脂肪酸。FAS包括乙酰基转移酶(AT)、丙二酰基转移酶(MT)、B一酮脂酰合酶(KS)、B一酮脂酰还原酶(KR)、p-羟脂酰脱水酶(HD)、烯脂酰还原酶(ER)及硫酯酶(TE)等7个功能域。它可分为I型和Ⅱ型两种亚型，真菌和哺乳动物中的FAS属I型，细菌和植物中的FAS属Ⅱ型。
三氯生，学名“二氯苯氧氯酚”，常态为白色或灰白色晶状粉末，稍有酚臭味。不溶于水，易溶于无水乙醇等有机溶剂。三氯生是以FabI为靶点的抗生素类抑制剂，其抗菌机制在于特异性地抑制脂肪酸合成酶(FAS)的烯脂酰还原酶(ER)，因此三氯生不只是具有抑制脂肪酸合成酶活性较弱的菌种正常生长特性的抗生素类抑制剂，还是高效广谱抗菌剂，对革兰氏阳性菌、阴性菌、酵母及病毒均有杀灭和抑制作用。氯化三苯基四氮唑(TTC)易溶于水，具有被丝状真菌细胞内脱氢酶还原后生成红色的三苯基甲臢(Triphenyl formazan，TF)的特性，也可通过与细胞内脱饱和酶的活性的氧化还原反应生成红色的TF来直观体现，进而可以初步判定细胞内脱氢酶和脱饱和酶的活性。因此氯化三苯基四氮唑(TTC)可以根据反应前后丝状颜色转化速度及颜色深浅的不同作为筛选产油丝状真菌的指示剂。
因此在含有三氯生和氯化三苯基四氮唑(TTC)的PDA培养基中，能够正常生长的菌种是油脂量占生物量的较大百分比的丝状真菌。本发明结合使用指示剂TTC及抗性筛选因子三氯生，建立了一种新的筛菌策略，能够快速、高效地从土样中筛选高产PUFAs的丝状真菌，旨在为基础研究和商业化生产油脂提供良好的出发菌株。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。
因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种筛选产油丝状真菌的方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种适用于产油丝状真菌的氯化三苯基四氮唑PDA培养基，其包括，配置马铃薯琼脂培养基；加入三氯生和氯化三苯基四氮唑，使得马铃薯琼脂培养基含有5mg/L三氯生和0.5g/L氯化三苯基四氮唑。
作为本发明所述的适用于产油丝状真菌的氯化三苯基四氮唑PDA培养基的优选方案，其中：所述配置马铃薯琼脂培养基，其为采用糖、马铃薯提取物、琼脂，去离子水配置，115℃下灭菌20分钟；按质量份数计，所述糖类20份，所述马铃薯提取物4份，所述琼脂20份，所述去离子水900份。
作为本发明所述的适用于产油丝状真菌的氯化三苯基四氮唑PDA培养基的优选方案，其中：所述加入三氯生和氯化三苯基四氮唑，其为加入三氯生和氯化三苯基四氮唑溶液，所述糖类包括葡萄糖、蔗糖、低聚木糖、低聚果糖、水苏糖中的一种或几种。
作为本发明的另一方面，本发明提供一种筛选产油丝状真菌的方法，其包括：取土壤于无菌水中，震荡1～3h后稀释菌液；将所述菌液涂布在氯化三苯基四氮唑PDA培养基上，分离产油丝状真菌和/或产油丝状真菌孢子，纯化即得菌体。
作为本发明所述的筛选产油丝状真菌的方法的优选方案，其中：经检测，所述产油丝状真菌包括球毛壳霉和/或镰刀霉菌。
作为本发明的另一方面，本发明提供一种产油丝状真菌脂质的提取方法，其为：培养产油丝状真菌，冷冻干燥，得到冻干菌体；粉碎所述冻干菌体，加入盐酸进行震荡，冻融两次后冷却至室温，加入脂肪酸内标C15:0、甲醇及氯仿，振荡5min后置于离心机3000g离心3min，收集氯仿层。
作为本发明所述的产油丝状真菌脂质的提取方法的优选方案，其中：所述冻融其为在80℃、1h和-80℃、15min条件下进行。
作为本发明所述的产油丝状真菌脂质的提取方法的优选方案，其中：所述甲酯化为在60℃进行甲酯化3h，每隔半小时振荡一次。
作为本发明所述的产油丝状真菌脂质的提取方法的优选方案，其中：产油丝状真菌干菌体得率大于12.5g/L，油脂得率大于3.g/L，油脂含量大于24.5％。
本发明的有益效果：
本发明通过优选得配置培养基、筛选产油丝状真菌，并对其进行脂质提取，获得了提高了油脂的获得效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为球毛壳霉菌体形态的照片；
图2为菌体形态的照片；
图3为球毛壳霉系统发育树；
图4为镰刀霉菌系统发育树；
图5为球毛壳霉(左)与镰刀霉菌(右)GY斜面保藏培养图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
本发明通过选择邯郸地区的鸡场、果园和稻田的土样作为样品，从中分离出多株产油丝状真菌，并通过大量实验证明，分离出的丝状真菌均具有高产油脂的能力。因此建立一种快速、高效地定向筛选产油丝状真菌策略，对快速筛选生长性状优良的高产多不饱和脂肪酸的丝状真菌具有重要意义。为大规模进入工业化生产提供了有效途径。
根据表层土样采集法采集土样，采集采样面积5cm×5cm，采集地表下5～10cm处土样后自然风干，备用。自然风干后取1g土样于9mL的无菌水溶液中，120r/min振荡1h，振荡，然后使用生理盐水按照体积比1:10进行连续稀释。取10-1、10-2、10-3、10-4四个稀释梯度的菌液分别涂布在相应的选择培养基上涂布，涂布是在无菌环境下，各稀释梯度悬浮液取200uL涂布于选择培养基上,涂布好的培养基放置于28℃培养箱，避光培养。所述的分离产油丝状真菌是根据其生长速度以及菌落颜色(呈红色)深浅，排除未变色的菌落及浅红色菌落，采用菌丝边缘纯化法将形态不同的丝状真菌转接到PDA平板上，分离出产油丝状真菌，将产油丝状真菌的孢子保藏在-80℃条件下冻存。
实施例1：配制选择培养基
1.PDA培养基(马铃薯琼脂培养基)的配制：葡萄糖20g，马铃薯提取物4g，琼脂20g，补充去离子水至900mL，115℃下灭菌20分钟，待用。
2.TTC(氯化三苯基四氮唑)溶液的配制：称取0.5gTTC加入到95mL去离子水中，振荡摇匀，待用。
3.三氯生溶液的配制：称取20mg三氯生药品粉末，加入20mL无水乙醇，充分溶解，配制成母液浓度为1mg/mL的三氯生溶液，待用。
4.选择培养基的配制：量取5mL的三氯生母液和95mL的TTC(氯化三苯基四氮唑)溶液分别加入到已灭菌完成的900mLPDA培养基中，振荡摇匀，使PDA培养基配制成含有5mg/L三氯生与0.5g/L氯化三苯基四氮唑(TTC)的选择培养基，待用。
实施例2：筛选产油丝状真菌
1.土样的采集
通过对邯郸地区的鸡场、果园和稻田的选择，据表层土样采集法采集土样后迅速装入自封袋封装，低温保存带回实验室，将土样自然风干后，对样品进行分析和产油丝状真菌的分离。
2.从土样中筛选产油丝状真菌
取1g土样于9mL的无菌水溶液中，120r/min振荡1h，然后使用生理盐水按照体积比1:10进行连续稀释。取10-1、10-2、10-3、10-4四个稀释梯度的菌液分别涂布在相应的选择培养基上涂布，分离产油丝状真菌，将产油丝状真菌的孢子在-80℃条件下冻存。
利用选择培养基共分离出5个分离株，通过观察菌落形态和结晶紫染色排除3个酵母，这样分离纯化后得到了2株丝状真菌，分别命名为菌株1-3和菌株2-2。
实施例3：菌株油脂粒染色与初步鉴定
1.菌落形态观察
将分离纯化后的菌株接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基，28℃培养至长出单菌落，观察菌株在培养基上的菌落形态特征。
2.菌丝处理
在无菌操作台中用镊子挑取筛选出的2株丝状真菌，经无菌水润洗一段时间后，用玻璃棒捣碎破坏，制作临时装片。
3.油脂粒染色
取0.3％苏丹黑-B 40μL-60μL染色10min，用水冲去染色剂后用滤纸将载玻片上的残水吸干，再用脱色剂75％酒精冲洗至无色，待载玻片干燥后用复染剂沙黄复染2min，用水冲洗玻片，晾干。
4.菌体形态观察
菌丝经苏丹黑-B染色后，被苏丹黑-B染色的脂肪粒呈现蓝黑色，细胞其他部位呈现被沙黄复染的紫红色。根据菌丝内脂肪粒的大小和着色深浅程度可初步判断油脂含量的多少，一般地，脂肪粒大且着色深的菌株油脂含量相对较高，因此可通过显微镜观察菌株的脂肪粒大小及着色深浅程度初步判断其油脂含量的多少。
通过对本发明所筛选出的丝状真菌经苏丹黑-B染色后由10×100显微镜观察，如图1菌株1-3菌体形态呈长柱状、椭圆状或不规则圆形，油脂粒呈淡蓝黑色，其他无油脂的部位则被沙黄染成淡紫红色；如图2菌株2-2菌体形态呈镰刀状，其中有油脂粒出现在镰刀分生孢子内大多为椭圆形或卵圆形呈现淡蓝黑色，其他没有油脂的地方被沙黄复染为紫红色。
通过对菌株1-3和菌株2-2的菌落及菌体形态的观察，菌株1-3初步鉴定为球毛壳霉，菌株2-2初步鉴定为镰刀霉菌，并通过对菌株1-3和菌株2-2进行的油脂粒染色结果表明两株菌含有较高含量的油脂，因此两株菌是具有一定研究意义的高产油脂真菌菌株。
实施例4：产油丝状真菌的鉴定
1.丝状真菌DNA的提取:(1)取200mg产油较多的丝状真菌菌丝，用无菌水润洗2次，经反复冷冻后充分研磨。(2)加入500uLTE buffer、500uL溶菌酶和1uL RNase A，37℃水浴1h。(3)加入1uL4M NaCl，10uL蛋白酶K和20uL20％SDS，55℃水浴15过夜。(4)加入500uLP:C:I，振荡混匀，12000×g，4℃离心5min。(5)吸取200uL上清于新无菌1.5mL离心管中，加入20uL 3M醋酸钠和600uL预冷无水乙醇，振荡混匀后置于-20℃下沉淀5min。(6)取出离心管后，12000×g，4℃离心5min后弃上清。(7)吸取600uL70％乙醇洗涤一次，12000×g，4℃离心5min后弃上清。(8)待风干后，用30-50uL无菌水回溶后于-20℃保存。
2.丝状真菌ITS rDNA的PCR扩增：用Taq DNA聚合酶验证所用PCR反应体系：：7uLTaqmix聚合酶，1uL上游引物，1uL下游引物，3uLDNA模板，去离子水补至20uL。PCR反应参数：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1000bp/min，进行35个循环后72℃延伸10min。
3.PCR产物凝胶电泳:用稀释成1×的TAE缓冲液配制1％琼脂糖溶液，用微波炉加热溶解；加入DNA染料GelRed(1uL/20ml胶体积)，轻摇混匀后倒入制胶槽，插入合适的制胶梳子，胶凝固后拔出制胶梳子，将凝胶转移至装有1×TAE缓冲液电泳槽内；将待检测的DNA样品与6×LoadingBuffer混匀，用移液器点样；启动电泳仪，调节电压至100V-120V，电泳约30min-40min；关闭电泳仪，缓慢取出凝胶，用凝胶成像仪观察电泳结果并拍照保存。
4.ITS rRNA基因序列测定与系统发育分析：PCR产物用Thermo GeneJET PCRPurification kit(Thermo:#K0702)纯化后，由生工基因直接测序，扩增和测序均用通用引物ITS1和ITS4。将测序的基因序列用BLAST搜索程序在GenBank中进行序列相似性分析，用ClustalX进行多序列比对，用Kimura模型计算系统进化矩阵，用MEGA 5.0(MolecularEvolutionary Genetics Analysis)软件采用邻接法(Neighbor-Joining)聚类分析，并构建出系统进化树。
采用本发明筛选出的菌株1-3和菌株2-2的系统发育树分别见图3、图4。
由图3可知，菌株1-3与球毛壳霉聚于一支；由图4可知，菌株2-2与镰刀霉菌聚于一支，并且均具有较高的同源性。因此，菌株1-3被鉴定为球毛壳霉(chaetomium globosum)，与中国典型培养物保藏中心联合鉴定该菌种为球毛壳霉，保藏于中国典型培养物保藏中心,菌种保藏号为CCTCC M2016343，保藏日期2016年6月23日,保藏地点为中国武汉武汉大学；菌株2-2被鉴定为镰刀霉菌属，与中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心联合鉴定为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，株名为JSNL008-1,已保藏于,保藏编号为CGMCCNO.13688,保藏日期为2017年3月10日。
实施例5：产油丝状真菌脂质的提取与分析
(1)将应用本发明筛选出的球毛壳霉和镰刀霉菌的冻干菌体放入研钵中磨碎，称取30～50mg菌体粉末于提脂瓶中，加2mL4mol/L HCl振荡10s，混合体系置于80℃1h和-80℃15min反复冻融两次后冷却至室温，加入100μL脂肪酸内标C15:0(2mg/mL)、1mL甲醇及1mL氯仿，振荡5min后置于离心机3000g离心3min，收集氯仿层(下层)至新的提脂瓶，此步骤重复两次，合并的氯仿层用氮气吹干，加入1mL10％盐酸-甲醇溶液进行甲酯化(60℃，3h)，每隔半小时振荡一次，甲酯化结束后冷却至室温，加入1mL正己烷以及1mL饱和NaCl，振荡后3000g离心3min，吸出正己烷层(上层)，得到脂肪酸甲酯(Fatty acid methyl esters，FAMEs)。
(2)将得到的脂肪酸甲酯用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)进行分析。条件如下：气相柱Rt-wax(30m×0.25mm×0.25μm)，质谱仪(岛津UltraQP2010)。程序升温条件：初始40℃保持3min；以40℃/min的速率升温到120℃；以35℃/min的速率升温到190℃，保持5min；以5℃/min的速率升温至220℃，保持16min。进样方式为分流进样，分流比为10:1，进样量为1μL，氦气作为载气。设置进样器和检测器温度均为250℃。离子源温度为220℃，强度为70eV。
采用本发明筛选出的球毛壳霉干菌体得率12.54g/L，油脂得率3.08g/L，油脂含量24.56％。镰刀霉菌干菌体得率13.35g/L，油脂得率4.75g/L，油脂含量35.58％。因此采用本发明筛选得到两株丝状真菌中油脂量占生物量的较大百分比，均为具有研究价值的高产油脂真菌菌株。
表1菌体脂质中脂肪酸的质量分数
Figure BDA0002466954610000081
实施例6：产油丝状真菌的纯化与保藏
1.球毛壳霉和镰刀霉菌的纯化
依据菌落颜色大小以及生长状态，筛选指示剂会对产油丝状真菌染成深浅不一的红色，将含有产油丝状真菌的平板培养皿挑选出，常温保存待用。配制分离纯化所用培养基，加入的筛选指示剂TTC浓度仍为0.05％，加入的生长抑制剂三氯生浓度为5mg/L，其他条件完全相同。将挑选出的菌落，用镊子夹取菌丝或者菌落根部，放入准备好的纯化培养基中，在28℃中培养3天，每天观察其生长状态。纯化好的菌落应该无杂菌，只有一种菌株，重复上述操作步骤直至达到要求。
2.球毛壳霉和镰刀霉菌的保藏
采用GY斜面保藏的方法，将纯化好的菌株用接种环取少量菌丝接种于GY试管斜面培养基中，放在28℃培养箱中培养3-4天，长出丰富的菌丝后在4℃中保藏并记录好保藏菌种名称。保藏试管如图5所示。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (9)

1.一种适用于产油丝状真菌的氯化三苯基四氮唑PDA培养基，其特征在于：包括，
配置马铃薯琼脂培养基；
加入三氯生和氯化三苯基四氮唑，使得马铃薯琼脂培养基含有5mg/L三氯生和0.5g/L氯化三苯基四氮唑。
2.如权利要求1所述的适用于产油丝状真菌的氯化三苯基四氮唑PDA培养基，其特征在于：所述配置马铃薯琼脂培养基，其为采用糖、马铃薯提取物、琼脂，去离子水配置，115℃下灭菌20分钟；
按质量份数计，所述糖类20份，所述马铃薯提取物4份，所述琼脂20份，所述去离子水900份。
3.如权利要求1所述的适用于产油丝状真菌的氯化三苯基四氮唑PDA培养基，其特征在于：所述加入三氯生和氯化三苯基四氮唑，其为加入三氯生和氯化三苯基四氮唑溶液，所述糖类包括葡萄糖、蔗糖、低聚木糖、低聚果糖、水苏糖中的一种或几种。
4.一种利用权利要求1～3任一所述的氯化三苯基四氮唑PDA培养基筛选产油丝状真菌的方法，其特征在于：取土壤于无菌水中，震荡1～3h后稀释菌液；
将所述菌液涂布在氯化三苯基四氮唑PDA培养基上，分离产油丝状真菌和/或产油丝状真菌孢子，纯化即得菌体。
5.如权利要求4所述的筛选产油丝状真菌的方法，其特征在于：经检测，所述产油丝状真菌包括球毛壳霉和/或镰刀霉菌。
6.一种产油丝状真菌脂质的提取方法，其特征在于：培养产油丝状真菌，冷冻干燥，得到冻干菌体；
粉碎所述冻干菌体，加入盐酸进行震荡，冻融两次后冷却至室温，加入脂肪酸内标C15:0、甲醇及氯仿，振荡5min后置于离心机3000g离心3min，收集氯仿层。
7.如权利要求6所述的产油丝状真菌脂质的提取方法，其特征在于：所述冻融其为在80℃、1h和-80℃、15min条件下进行。
8.如权利要求6或7所述的产油丝状真菌脂质的提取方法，其特征在于：所述甲酯化为在60℃进行甲酯化3h，每隔半小时振荡一次。
9.如权利要求1～5或7任一所述的产油丝状真菌脂质的提取方法，其特征在于：产油丝状真菌干菌体得率大于12.5g/L，油脂得率大于3.g/L，油脂含量大于24.5％。
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