CN111621564A - 一种鉴定有效肿瘤新抗原的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定有效肿瘤新抗原的方法。所述方法为：将肿瘤突变蛋白形成的新多肽与MHC的结合能力进行预测，筛选出在某种特定MHC存在时与该种MHC亲和力较高的蛋白新多肽群；将多肽群按照突变位置进行分类，主要分为锚定位点突变类、非锚定位点MHC接触类、TCR接触类；将锚定位点突变类的新多肽根据突变前后的氨基酸种类变化分为四类，选择其中TCR接触类、非锚定位点MHC接触类和锚定位点突变类中的非倾向性氨基酸突变为倾向性氨基酸的新多肽群作为潜在的肿瘤新抗原。本发明所述方法较于以往单纯基于MHC亲和力预测得到的结果，准确性更高，适合作为临床肿瘤免疫疗法的基础性筛选方法。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定有效肿瘤新抗原的方法。
背景技术
肿瘤是生物体细胞突变所导致的细胞异常增殖疾病。恶性肿瘤由于致死率较高，至今仍是世界范围内的医学难题。目前，临床恶性肿瘤治疗主要以外科手术切除、放疗、化疗、靶向治疗为主。但是，外科手术切除、放疗和化疗方法具有预后较差，副作用大等缺点。而靶向治疗虽然副作用较小，但治疗价较为昂贵且易于引发肿瘤耐药性，因而限制了其后续大规模的临床应用。
近年来，随着二代测序技术和基于机器学习的多肽-组织相容性复合体(p-MHC)亲和力预测技术的发展，使得肿瘤免疫疗法得以成为新一代的肿瘤治疗方案。具体来说，肿瘤免疫治疗的核心环节即为激活人体自身的毒性T细胞(CD8+T cell)，攻击携带体细胞突变的肿瘤细胞。在这个过程中涉及到三个功能元件：肿瘤突变多肽(neopeptide)，组织相容性复合物(MHC)，T细胞受体(TCR)。其中，肿瘤突变多肽可以被肿瘤细胞表面的MHC所展示，这种p-MHC形成的复合体可以被携带TCR的T细胞所识别和特异性杀伤。但是，人体内自身存在的可以特异性识别某种p-MHC的T细胞数量较少，有时在没有人为干预的情况下并不能起到良好的识别和杀伤肿瘤的效果。这就需要通过临床辅助手段，找到可以被T细胞识别的肿瘤突变多肽，在体外激活病人自体T细胞后回输病人，或者将肿瘤突变多肽片段制作成疫苗进行注射，以期获得较强的抗肿瘤免疫反应。
然而从个体水平上来讲，肿瘤突变数量众多，很难快速准确地找到具有免疫原性，即能被病人自体MHC提呈并被T细胞识别的突变抗原(neoantigen)。因此，开发出一种快速且准确的新抗原鉴定方法，是肿瘤免疫治疗中一个亟待解决的关键问题。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种鉴定有效肿瘤新抗原的方法。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：
一种鉴定有效肿瘤新抗原的方法，包括如下步骤：
(1)取肿瘤组织与正常组织样本，分别进行全基因组或外显子组测序，对比计算得到肿瘤组织的突变位置，截取以突变位置为中心的多肽片段，输入至MHC结合预测算法中，预测出各多肽片段与MHC亚型的亲和能力，选出与MHC亚型亲和能力较高的、包含肿瘤组织突变位置的多肽片段；
(2)将步骤(1)所得多肽片段按照突变位置功能分为三类：锚定位点突变类多肽、非锚定位点MHC接触类多肽和TCR接触类多肽；
(3)进一步基于锚定位点突变类多肽的野生型氨基酸和突变型氨基酸进行分类，具体分为：非倾向性(non-preferential)氨基酸突变为倾向性(preferential)氨基酸类(Nto P)、非倾向性氨基酸突变为非倾向性氨基酸类(N to N)、倾向性氨基酸突变为倾向性氨基酸类(P to P)、和倾向性氨基酸突变为非倾向性氨基酸(P to N)；
(4)挑选出所述多肽片段中TCR接触类、非锚定位点MHC接触类和锚定位点突变类中的非倾向性氨基酸突变为倾向性氨基酸作为新多肽群，所述新多肽群即为具有免疫原性潜力的肿瘤靶标。
上述方案中，步骤(1)所述截取以突变位置为中心的多肽片段的长度为8～11个氨基酸。
上述方案中，步骤(1)所述MHC结合预测算法为为基于神经网络的MHC-多肽亲和力预测，本发明所述MHC结合预测算法采用NetMHC 4.0。
上述方案中，步骤(1)所述选出与MHC亚型的亲和力为大于0、小于等于500nM，包含肿瘤组织突变位置的多肽片段。
上述方案中，步骤(2)所述分类依据是基于多肽的突变位置。具体来说，某一个肿瘤突变多肽可以被不同的MHC亚型所结合，并且结合方式不同，有些多肽的突变发生在与MHC蛋白结合的锚定位点，有些发生在与MHC结合但非锚定位点区域，其余的则发生在不与MHC结合的区域而是与TCR结合。
上述方案中，步骤(3)所述分类的依据是基于多肽突变位置的MHC倾向性变化情况。具体来说，MHC对与其结合的多肽氨基酸位点具有倾向性选择。我们首先以某一多肽突变位点是否为倾向性分别定义了某一多肽MHC结合区域的野生型和突变型的倾向性选择氨基酸；随后将这种从野生型到突变型的变化情况进行分类，主要分为：非倾向性(non-preferential)氨基酸突变为倾向性(preferential)氨基酸类(N to P)、非倾向性氨基酸突变为非倾向性氨基酸类(N to N)、倾向性氨基酸突变为倾向性氨基酸类(P to P)、和倾向性氨基酸突变为非倾向性氨基酸(P to N)四类。
本发明中的术语定义：
新多肽(新抗原)：肿瘤细胞内基因非同义突变所导致的对应蛋白序列中单氨基酸的替换，最终形成的一段具有突变的肽段；如果不确定其是否具有免疫原性，则称为新多肽；如果确定具有免疫原性称为新抗原。
MHC：主要组织相容性复合体，是一类具有提呈(或称识别)外源抗原分子的细胞膜蛋白复合体。MHC是获得性免疫的重要组成部分，一般可以与蛋白表面的抗原结合槽结合抗原多肽形成三元复合物后被T细胞识别，引起免疫反应。在同种不同个体中，MHC以不同的亚型呈现，因此MHC与组织相容性相关。
MHC抗原结合槽：MHC分子表面一般具有一个可以结合抗原分子的凹槽，以此可与抗原结合形成稳定的三元复合物。在抗原结合槽中，还分为几个不同的结合口袋用以结合抗原的不同区域。
锚定位点：多肽在结合MHC时，多肽中的某几位氨基酸会与MHC抗原结合区特异性紧密结合，这几位氨基酸在与MHC结合时提供了大部分结合力；不同的MHC亚型对多肽锚定位点的位置和种类具有很强的选择倾向性。锚定位点在不同的MHC亚型间存在差异。下表1展示了部分人源MHC亚型的存在的条件下，9肽的锚定位点、非锚定位点MHC接触区和TCR接触区情况。
MHC的选择倾向性：MHC会通过抗原结合槽中某几个口袋区(一般为2个，分布于结合槽首尾)倾向于选择抗原中某类或某几类氨基酸残基与之结合，该倾向性主要体现在MHC特定多肽结合口袋结合多肽的锚定位点时；该倾向性包括但不限于以氨基酸种类或MHC亲和力等方式展现。
锚定位点突变类多肽：该类多肽的突变氨基酸的侧链可以与某亚型MHC的多肽结合口袋区特异性结合，并且其突变氨基酸为该MHC-多肽复合体的形成贡献主要的亲和力。
非锚定位点MHC接触类多肽：该类多肽的突变氨基酸的侧链朝向MHC分子，但其突变氨基酸对该MHC-多肽复合体的形成不贡献主要的亲和力，一般用来占据MHC结合口袋区。
TCR接触类多肽：该类多肽的突变氨基酸的侧链朝向与MHC的多肽结合口袋区相反，其主要朝向T细胞受体方向，朝向T细胞受体的氨基酸侧链一般不与MHC接触，因而也不提供用以维持MHC-多肽复合物稳定的亲和力。
本发明有益效果：本发明所述方法优于传统的新抗原筛选方法，相较于传统方法，本发明所述方法可显著筛除预测的新抗原群中可能无免疫原性的部分，且错筛率很低；本发明所述方法在肿瘤临床精准免疫治疗中可以显著降低新抗原测试数量，缩短体外试验周期，尤其在是制作特异性肿瘤疫苗制剂和体外培养过继性T细胞的过程中具有较好的应用前景，适合作为临床肿瘤免疫疗法的基础性方法之一。
附图说明
图1为本发明所述的方法流程图。
图2为现已发表研究中的肿瘤新抗原中锚定位点突变多肽的统计情况；统计分为两个部分，左图为具有免疫原性的新抗原样本(n＝27)，右图为无免疫原性的突变多肽样本(n＝425)，基于本发明方法中对锚定位点突变类多肽的分类方法，分别将两个样本中的多肽分为N to P和非N to P两类，并对其占比情况进行统计，左图中深灰色部分代表N to P类多肽，浅灰色部分代表非N to P类多肽；右图与左图所代表的多肽分类情况一致。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
图1为本发明所述的方法流程图，图2为现已发表研究中的肿瘤新抗原中锚定位点突变多肽的统计情况：统计分为两个部分，左图为具有免疫原性的新抗原样本(n＝27)，右图为无免疫原性的突变多肽样本(n＝425)；基于本发明方法中对锚定位点突变类多肽的分类方法，分别将两个样本中的多肽分为N to P和非N to P两类，并对其占比情况进行统计；左图中深灰色部分代表N to P类多肽，浅灰色部分代表非N to P类多肽；右图与左图所代表的多肽分类情况一致。图2的统计结果可以覆盖已鉴定的大部分新抗原研究中的锚定位点突变多肽。基于统计结果分析，可以看出在具有免疫原性的锚定位点突变多肽中，非倾向性氨基酸突变为倾向性氨基酸类(N to P)多肽占据绝对数量(约96％)，且具有极显著差异(P<0.001)；在无免疫原性的锚定位点突变多肽中，N to P类多肽比例(约58％)与非N to P多肽比例(42％)无显著性差异。值得注意的是，免疫原性的锚定位点突变多肽中存在一例(占总样本数量约4％)非N to P类多肽。经分析相关文献后发现，此例样本中野生型多肽和突变型多肽均可以引起病人体内的免疫反应，由此我们可以认为该例样本鉴定过程中，病人的免疫系统存在一定程度的“失调”。在排除本例的前提下，具有免疫原性的锚定位点突变多肽中N to P的多肽比例接近100％。我们可以由以上分析得出结论，在预测肿瘤新抗原过程中，可以淘汰掉预测结果中的锚定位点突变多肽群中的非N to P的多肽。该淘汰过程也间接地提升了新抗原预测的准确率。
下表1为部分人源MHC亚型条件下，9肽的锚定位点、非锚定位点MHC接触区和TCR接触区情况以及锚定位点的氨基酸选择倾向性。PΩ位代表9肽的C末端，即第九位氨基酸。
表1人源MHC亚型9肽的锚定位点、非锚定位点MHC接触区和TCR接触区情况及锚定位点的氨基酸选择倾向性
实施例1
按照突变位置对多肽进行分类：
(1)取肿瘤组织与正常组织样本，分别进行全基因组或外显子组测序；
(2)对比计算得到肿瘤组织的突变位置；
(3)截取以突变位置为中心，左右各12个残基的25肽多肽片段(也可适当增加或减少长度)；
(4)将截取后的片段输入到MHC结合预测算法中，本实施例以NetMHC 4.0为例；
(5)将输出结果(预测结合力较高的)中包含突变位置的多肽选出；
(6)对上述多肽进行分类，分类的依据是突变位置的类型，分为锚定位点突变类，非锚定位点MHC接触类和TCR接触类。
本实施例以人源黑色素瘤突变蛋白PLEKHM2为例，NetMHC 4.0预测得到的突变多肽序列LTDDRLFTCY(野生型多肽为LTDDRLFTCH，最后一位由组氨酸(His)突变为酪氨酸(Tyr))具有较好的与人源MHC亚型HLA-A*01：01的结合能力(NetMHC4.0预测结果为8.87nM)。多肽以第三位和最后一位作为锚定位点与HLA-A*01：01亚型结合。统计HLA-A*01:01在第三位和最后一位的多肽残基倾向性，统计可知第三位倾向使用天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)，最后一位倾向使用酪氨酸(Tyr)，基于我们上述的分类规则，此例中野生型多肽LTDDRLFTCH最后一位为非倾向性，突变型多肽LTDDRLFTCY最后一位为倾向性突变。同时该多肽又满足其为锚定位点突变多肽的要求。故该预测多肽可作为肿瘤新抗原的候选多肽。
进一步的文献数据证明(DOI:10.1038/nm.3161)此新抗原LTDDRLFTCY可以被具有HLA-A*01:01的病人的体细胞提呈，并激活CD8+T细胞；野生型多肽LTDDRLFTCH在同等条件下不能激活T细胞。
实施例2
本实施例以人源黑色素瘤突变蛋白TNR为例，NetMHC 4.0预测得到的突变多肽序列FWLVDLLPST(野生型多肽为FRLVDLLPST，第二位由野生型精氨酸(Arg)残基突变为色氨酸(Trp)具有较好的与人源MHC亚型HLA-A*02：01的结合能力(NetMHC4.0预测结果为45.1nM)。
一般来说，多肽以第二位和最后一位作为锚定位点与HLA-A*02：01亚型结合。统计HLA-A*02:01在第二位和最后一位的多肽残基倾向性，可知第二位倾向使用亮氨酸(Leu)，最后一位倾向使用缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)和异亮氨酸(Ile)。
此例中，突变多肽FWLVDLLPST的突变位置为第二位。基于上述分类规则，可将本多肽归为锚定位点突变类新多肽。此外，本例中野生型多肽FRLVDLLPST第二位为非倾向性，突变型多肽FWLVDLLPST第二位为非倾向性突变，因而可继续将其细分为非倾向性氨基酸突变为非倾向性氨基酸类(N to N)类。我们认为本例中的新多肽可能不具有免疫原性。
进一步的文献数据证明(DOI:10.1038/nature22991)此新多肽在HLA-A*02：01阳性条件下不能激活CD8+T细胞；其对应野生型多肽在同等条件下也不能激活T细胞。
实施例3
本实施例以人源黑色素瘤突变蛋白HAUS3为例，NetMHC 4.0预测得到的突变多肽序列ILNAMIAKI(野生型多肽为ILNAMITKI，第七位由野生型苏氨酸(Thr)残基突变为丙氨酸(Ala)具有较好的与人源MHC亚型HLA-A*02：01的结合能力(NetMHC4.0预测结果为48.1nM)。
9肽与HLA-A*02：01亚型结合时，其第三位和第七位作为非锚定位点MHC接触位。此例中，突变多肽ILNAMIAKI的突变位置为第七位。基于上述分类规则，可将本多肽归为非锚定位点MHC接触类新多肽。我们认为本例中的新多肽可能具有免疫原性。
进一步的文献数据证明(DOI:10.1038/nm.3161)此新多肽在HLA-A*02：01阳性条件能激活CD8+T细胞；其对应野生型多肽在同等条件下不能激活T细胞。
实施例4
本实施例以人源黑色素瘤突变蛋白API5为例，NetMHC 4.0预测得到的突变多肽序列LLQCTQQAV(野生型多肽为LLQCTRQAV，第六位由野生型精氨酸(Arg)残基突变为谷氨酰胺(Gln)具有较好的与人源MHC亚型HLA-A*02：01的结合能力(NetMHC4.0预测结果为101.96nM)。
9肽与HLA-A*02：01亚型结合时，其第一、四、五、六、八位作为TCR接触位。此例中，突变多肽LLQCTQQAV的突变位置为第六位。基于上述分类规则，可将本多肽归为TCR接触类新多肽。我们认为本例中的新多肽可能具有免疫原性。
进一步的文献数据证明(DOI:10.1126/science.aad1253)此新多肽在HLA-A*02：01阳性条件能激活CD8+T细胞；其对应野生型多肽在同等条件下不能激活T细胞。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种鉴定有效肿瘤新抗原的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）取肿瘤组织与正常组织样本，分别进行全基因组或外显子组测序，对比计算得到肿瘤组织的突变位置，截取以突变位置为中心的多肽片段，输入至人类MHC I类的结合预测算法中，预测出各多肽片段与MHC亚型的亲和力，选出与MHC亚型亲和能力较高的、包含肿瘤组织突变位置的多肽片段；
（2）将步骤（1）选出的多肽片段按照突变位置的功能分为三类：锚定位点突变类、非锚定位点MHC接触类和TCR 接触类；
（3）进一步基于锚定位点突变类多肽的野生型氨基酸和突变型氨基酸进行分类，具体分为：非倾向性（non-preferential）氨基酸突变为倾向性（preferential）氨基酸类（N toP）、非倾向性氨基酸突变为非倾向性氨基酸类（N to N）、倾向性氨基酸突变为倾向性氨基酸类（P to P）、和倾向性氨基酸突变为非倾向性氨基酸（P to N）；
（4）挑选出所述多肽片段中TCR接触类、非锚定位点MHC接触类和锚定位点突变类中的非倾向性氨基酸突变为倾向性氨基酸作为新多肽群，所述新多肽群即为具有免疫原性潜力的肿瘤靶标。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述截取以突变位置为中心的多肽片段的长度为8~11个氨基酸。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述MHC结合预测算法为基于神经网络的MHC-多肽亲和力预测。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述选出与MHC亚型的预测亲和力为大于0、小于等于500 nM，包含肿瘤组织突变位置的多肽片段。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述分类依据是多肽的突变位置。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述分类的依据是多肽突变位置的MHC倾向性变化。
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