CN111575341A - 一种利用巯丙基琼脂糖球负载尿酸酶和过氧化氢酶检测尿酸的方法 - Google Patents

一种利用巯丙基琼脂糖球负载尿酸酶和过氧化氢酶检测尿酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用巯丙基琼脂糖球负载尿酸酶和过氧化氢酶检测尿酸的方法。该方法以巯丙基琼脂糖球为载体，通过化学反应在巯丙基琼脂糖球的表面和内部负载尿酸酶和过氧化氢酶，形成检测微单元，然后将负载酶的巯丙基琼脂糖球固定在试纸上形成尿酸检测试纸条，对尿酸进行检测。本发明制备简单，反应条件温和，可以实现随时随地快速高效检测，并且价格低廉，使用安全，对临床尿酸监测和疾病诊断有重要指导意义。

Description

一种利用巯丙基琼脂糖球负载尿酸酶和过氧化氢酶检测尿酸 的方法
技术领域
本发明涉及医学体外诊断技术领域，具体涉及一种利用巯丙基琼脂糖球负载尿酸酶和过氧化氢酶检测尿酸的方法。
背景技术
尿酸是嘌呤类化合物代谢的终产物，通过血浆从肝脏运输到肾脏，其中70％的尿酸通过尿液排出体外，其余经肠道、皮肤和头发排出体外。人体血浆中尿酸的正常值为：150-400μM，尿液中尿酸的正常值为：1.4-4.4mM，血浆中尿酸浓度大于420μM被称为高尿酸血症，低于150μM被称为低尿酸血症。高尿酸血症的产生，一方面是因为体内产生尿酸过多，一方面是因为多余的尿酸不能及时随尿液排出体外。尿酸在血浆中过多的积累将导致痛风的产生，尿酸以针状晶体的形式在关节和毛细血管中沉积，导致病人异常疼痛，严重的可引发高血压、糖尿病、输尿管结石、肾结石和其它肾脏疾病等，甚至危及生命。而低尿酸血症则与罕见遗传学代谢病有关(如威尔逊氏病、范科尼氏综合症等)。因此，尿酸的检测有助于评估痛风和监测肾功能衰竭患者的状态，以及部分代谢疾病的初步判断，对临床诊断和治疗有重要意义。
目前，尿酸的检测分析方法有高效液相色谱法、荧光法、电化学方法和酶方法等。色谱法是最基本的检测方法，分离效果好，流动相简单，但样本处理过程繁琐，检测周期长，并且需要大型仪器，限制了其应用范围和场景。荧光法由于部分发色基团接近重合，可能存在相互干扰，导致数据不准确。电化学方法操作简单，成本低廉，灵敏度高，检出限低，但其要求的分离技术高，所需试剂和仪器昂贵难以普及。酶法分为紫外法和基于过氧化氢的尿酸间接测量法。紫外法的检测原理为：尿酸酶催化尿酸氧化还原反应后生成尿囊素和H2O2，通过检测293nm波长吸光度的变化来检测尿酸浓度，该方法反应时间长，吸光度的变化小，灵敏度低，现临床上一般作为备选方案。基于过氧化氢的尿酸间接测量法的原理为：尿酸在尿酸酶的催化下，被氧化生成过氧化氢，在过氧化氢酶的催化下能使发光底物发出光信号，该方法特异性好，准确度高，检测快速，但尿酸酶对反应条件高，无法回收继续利用，因此考虑采用酶固化的方法，将尿酸酶固定在基底上进行检测，可以提高酶的稳定性并且降低使用成本。
中国专利CN110108656A【一种介孔有机硅中空纳米球固定尿酸酶检测尿酸的方法】介绍了其合成的一步生长诱导腐蚀法介孔有机硅中空纳米球，利用该纳米球固定尿酸酶对血清尿酸进行检测，是对尿酸检测体系进行的有益尝试和补充，但其以紫外分光光度计检测吸光度的变化，会受到共存的其他组份的干扰，从而影响测定结果，此外其吸光度变化小，灵敏度较低，需要进一步改进。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种巯丙基琼脂糖球负载尿酸酶和过氧化氢酶检测尿酸的方法。目的在于提供一种能够简单快速实时检测尿酸的方法，方便检测者在家中自行检测，省去多次跑医院的繁琐流程。同时固定尿酸酶和过氧化氢酶的研究相对较少，过氧化氢酶的加入，不仅能够减轻尿酸氧化分解过程中产生的H2O2对酶的损伤，而且可以改变酶氧化的微环境，提高尿酸酶酶活力。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
首先，本发明提供一种尿酸检测试纸及其制备方法。
本发明所提供的尿酸检测试纸通过包括如下步骤的方法制备得到：
1)以巯丙基琼脂糖球为载体，通过化学反应在巯丙基琼脂糖球的表面和内部负载尿酸酶和过氧化氢酶，得到负载有尿酸酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球，即检测微单元；
2)将所述负载有尿酸酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球(检测微单元)固定在试纸上，得到尿酸检测试纸。
上述方法步骤1)中，所述负载有尿酸酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球通过包括如下步骤的方法制备得到：
(1)用水浸泡巯丙基琼脂糖球使其吸水膨胀，用三(2-羧乙基)膦(TCEP)或者二硫苏糖醇(DTT)与吸水膨胀后的巯丙基琼脂糖球反应，得到TCEP或DTT处理过的激活的巯丙基琼脂糖球；用三(2-羧乙基)膦(TCEP)或者二硫苏糖醇(DTT)与尿酸酶溶液反应，得到TCEP或DTT处理过的尿酸酶溶液；用三(2-羧乙基)膦(TCEP)或者二硫苏糖醇(DTT)与过氧化氢酶溶液反应，得到TCEP或DTT处理过的过氧化氢酶溶液；
(2)向TCEP或DTT处理过的激活的巯丙基琼脂糖球中加入TCEP或DTT处理过的尿酸酶溶液，反应，得到负载有尿酸酶的巯丙基琼脂糖球，向得到的负载有尿酸酶的巯丙基琼脂糖球中加入TCEP或DTT处理过的过氧化氢酶溶液，反应，得到负载尿酸酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球。
其中，步骤(1)中，所述巯丙基琼脂糖球具体可为
Figure BDA0002559415660000021
6B；
所述巯丙基琼脂糖球为干燥的巯丙基琼脂糖球；尺寸范围可为45-165微米，平均尺寸大小可为90微米；
所述水具体可为双蒸水；
所述巯丙基琼脂糖球与水的配比可为：1ml:3ml-1ml:10ml；
所述浸泡可为浸泡过夜；浸泡后巯丙基琼脂糖球的体积大概是干燥状态下体积的3倍；
所述三(2-羧乙基)膦(TCEP)为三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液；
所述三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液中TCEP的浓度可为0.01-10mM，具体可为0.1mM或0.5mM，所用溶剂可为10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液；
所述二硫苏糖醇(DTT)为二硫苏糖醇(DTT)溶液；
所述二硫苏糖醇(DTT)溶液中DTT的浓度可为1-100mM，所用溶剂可为10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液；
所述尿酸酶溶液的浓度可为1-1000μg/ml，具体可为50μg/ml，其中尿酸酶的酶活为≥2units/mg；所用溶剂可为10mM PBS(pH7.4)，
所述过氧化氢酶溶液的浓度可为1-1000μg/ml，具体可为50μg/ml，其中过氧化氢酶的酶活为≥250units/mg；所用溶剂可为10mM PBS(PH7.4)；
所述反应的温度均为室温，时间均为5min-2h小时，具体可为1小时。
在进行(2)的操作前，还包括将所述TCEP或DTT处理过的激活的巯丙基琼脂糖球用缓冲液洗涤，去除多余的TCEP或DTT；所述缓冲液具体可为10mM PBS(pH7.4)；
步骤(2)中，TCEP或DTT处理过的激活的巯丙基琼脂糖球的巯丙基琼脂糖球与TCEP或DTT处理过的尿酸酶溶液中的尿酸酶、TCEP或DTT处理过的过氧化氢酶溶液中的过氧化氢酶的配比依次可为：200μL：1-1000μg：1-1000μg；
所述反应可为室温下旋转反应，所述反应的时间可为：0.2-3小时，具体可为1小时；
步骤(2)中，在激活的巯丙基琼脂糖球与TCEP或DTT处理过的尿酸酶反应后，还包括将所得体系用缓冲液洗涤，去除多余的尿酸酶，得到负载有尿酸酶的巯丙基琼脂糖球的操作；所述缓冲液具体可为10mM PBS(pH7.4)；
进一步包括：将负载有尿酸酶的巯丙基琼脂糖球与TCEP或DTT处理过的过氧化氢酶反应后的体系缓冲液洗涤，去除多余的过氧化氢酶，得到负载尿酸酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球的操作；所述缓冲液具体可为10mM PBS(pH7.4)；
上述方法步骤2)中，所述试纸可为：玻璃纤维，其空隙在50-200微米之间；
上述方法步骤2)的操作为：将负载尿酸酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球滴加到检测试纸的检测区域内，或者将检测试纸的检测区域浸泡在含负载尿酸酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球中，使负载尿酸酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球负载到检测试纸里并固定好；
所述负载尿酸酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球以其溶液的形式滴加；
所述溶液通过向负载尿酸酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球中加入PBS制得，其中巯丙基琼脂糖球与PBS以体积比为1:2。
上述尿酸检测试纸在尿酸检测中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还提供一种体外检测尿酸的方法，包括如下步骤：将待测尿酸样品加入到检测试纸的检测区域，然后加入无色的显色底物溶液，反应，采集检测区域的颜色数据，将之导入颜色数据与尿酸浓度之间的关系式或将之与比色卡进行比对，得到待测尿酸的浓度值。
上述检测方法中，所述无色的显色底物溶液中的溶质可为3,3-二氨基联苯胺和氯化镍的混合物，溶剂可为10mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)；
其中3,3-二氨基联苯胺的质量浓度可为0.05％，氯化镍的质量浓度可为0.05％；
所述待测尿酸样品可为血尿酸或尿尿酸；
加入无色的显色底物溶液后的反应时间可为10分钟；
所述图像数据与尿酸浓度之间的关系式通过如下方法获得：首先用尿酸固体粉末配制系列已知浓度的标准尿酸溶液，将所述标准尿酸溶液依次加入到检测试纸的检测区域，然后加入无色的显色底物溶液，反应后，采集检测区域的颜色数据，通过图片三原色构建颜色数据(R,G,B)与尿酸浓度(C)之间的关系式：G/(R+G+B)＝0.0002C+0.3401，R2＝0.9918，即可(如图4所示)；其中，配制已知浓度的标准尿酸溶液所用的溶剂可为10mM的PBS(pH7.4)；
所述比色卡通过如下方法制备得到：首先用尿酸固体粉末配制系列已知浓度的标准尿酸溶液，将所述标准尿酸溶液依次加入到检测试纸的检测区域，然后加入无色的显色底物溶液，反应后，采集检测区域的颜色，得到不同尿酸浓度对应的颜色条带，制作成尿酸浓度-颜色标准比色卡，即可，其中，配制已知浓度的标准尿酸溶液所用的溶剂可为10mM的PBS(pH7.4)。
本发明的检测原理为：尿酸被尿酸酶快速催化反应生成过氧化氢和尿囊素，过氧化氢在过氧化氢酶的催化下能使无色的显色底物反应生成有色的沉淀并沉积在巯丙基琼脂糖球里，使巯丙基琼脂糖球的颜色从无色变为深蓝褐色，颜色的深浅和尿酸的浓度成正相关性，通过颜色数据与尿酸浓度之间的关系式或者比色卡实现对尿酸浓度的检测。
所述方法具有以下特征：
1、干燥的巯丙基琼脂糖球吸水膨胀，膨胀后的体积大约是干燥状态下的3倍，巯丙基琼脂糖球本身非常稳定，其表面的双硫键也非常稳定，可以较长时间的存放；
2、尿酸酶的活性容易受其反应产生的过氧化氢的抑制，从而影响其催化效率。通过双硫键的化学交联同时固定尿酸酶和过氧化氢酶可以保持固定化酶的稳定性和连续操作能力，快速消除尿酸酶的产物抑制，保障该酶促反应的顺利进行，有利于充分发挥多酶体系的协同催化作用，实现高效转化。
3、无色的显色底物DAB能与过氧化氢和过氧化氢酶反应生成蓝褐色沉淀，在球内发生反应生成沉淀的颗粒尺寸大于巯丙基琼脂糖球的空隙，刚好能够被“锁住”，沉积在巯丙基琼脂糖球的空隙中，通过反复水洗证实其沉淀不会洗出到溶液中，因此，在检测样本时不需要对反应微球进行清洗，可有效避免外界环境的干扰。反应产物在巯丙基琼脂糖球中的聚集，能够使得反应后的颜色更加集中，更容易观察和判断，方便在家中通过肉眼做初步判断。
4、显色底物的选择非常重要，其直接决定了显色后的颜色变化，进而影响对尿酸浓度的判断。与其他生成有色溶液的显色底物相比，DAB显色后生成了沉淀，而沉淀刚好能沉积在巯丙基琼脂糖球中，这是本发明的一大亮点。此外，我们在DAB溶液中添加了氯化镍NiCl2，构建一种增强型的显色溶液，能够使显色后生成的沉淀颜色加深为深蓝褐色，更容易识别观察，如果不添加NiCl2，生成的沉淀是淡黄色，颜色较浅，区分度较差。
5、本发明选择适当孔径的玻璃纤维做反应试纸条，它是一层层叠加的丝状结构，层与层之间有空隙，巯丙基琼脂糖球刚好能被其中的空隙“卡住”，被固定在试纸条里，作为检测区域。可以通过均匀滴加的方法使巯丙基琼脂糖球固定在检测试纸里，也可以直接把试纸放在饱和巯丙基琼脂糖球的混合液(巯丙基琼脂糖球和PBS的体积比为1:2)中，巯丙基琼脂糖球自动流动到检测试纸的空隙中并被固定住，形成检测区域。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明制备简单，反应条件温和，所需材料易获取，价格便宜可操作性强本发明与现有检测技术相比，不需要大型的仪器设备，不需要复杂的流程，可以很方便地在家里检测尿酸含量(包括血尿酸和尿尿酸)，动态检测尿酸含量变化，不必反复跑医院挂号检查等待结果。
两次巧妙使用“空隙大小”使得颜色变化更加明显。首先利用巯丙基琼脂糖球内部空隙，使得反应后生成的有颜色的沉淀能够聚集在球里，使颜色加深。其次利用检测试纸条(玻璃纤维)的层与层之间的空隙，使巯丙基琼脂糖球能够固定在试纸里，形成检测区域，便于检测操作和观察。
附图说明
图1为本发明制备的尿酸检测试纸的示意图；
图2为荧光显微镜下的巯丙基琼脂糖球(标记CY3荧光染料)和检测试纸(玻璃纤维)；
图3为本发明中的尿酸检测比色卡示意图，尿酸的浓度依次为300、200、100、50、25、12.5、5、0(检测体系中尿酸的终浓度)，单位μM。
图4为颜色数据(R,G,B)与尿酸浓度(C)之间的对应关系，G/(R+G+B)＝0.0002C+0.3401，R2＝0.9918
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明公开了一种利用巯丙基琼脂糖球负载尿酸酶和过氧化氢酶检测尿酸的方法。该方法以巯丙基琼脂糖球为载体，通过化学反应在巯丙基琼脂糖球的表面和内部负载尿酸酶和过氧化氢酶，形成检测微单元，然后将负载酶的巯丙基琼脂糖球固定在试纸上形成尿酸检测试纸条，，对尿酸进行检测。检测过程中，尿酸被尿酸酶快速催化反应生成过氧化氢和尿囊素，过氧化氢在过氧化氢酶的催化下能使无色的显色底物反应生成有色的沉淀并沉积在巯丙基琼脂糖球里，使巯丙基琼脂糖球的颜色从无色依次变成深蓝褐色，颜色的深浅和尿酸的浓度成正相关性，通过颜色数据与尿酸浓度之间的关系式或者比色卡实现对尿酸浓度的检测。
实施例1
检测试纸(如图1)制备流程：
a)首先将2ml双蒸水加入到0.2ml干燥的巯丙基琼脂糖球
Figure BDA0002559415660000061
6B(平均尺寸90μm)中浸泡过夜，巯丙基琼脂糖球吸水膨胀，其体积大概是干燥状态下体积的3倍。离心弃去上清液，将三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液分别与上述巯丙基琼脂糖球、尿酸酶溶液和过氧化氢酶溶液室温下反应1小时，使其双硫键打开。TCEP溶液的浓度为0.5mM，溶剂为10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液，尿酸酶溶液和过氧化氢酶溶液浓度为50μg/ml，溶剂为10mM PBS(pH7.4)；尿酸酶的酶活为≥2units/mg，过氧化氢酶的酶活为≥250units/mg。
b)将TCEP处理过的激活的巯丙基琼脂糖球用10mM PBS(pH7.4)缓冲液洗涤5遍，去除上清液。接着加入1.5mlTCEP处理过的激活的尿酸酶溶液室温旋转反应1小时，使尿酸酶负载到巯丙基琼脂糖球上。用10mM PBS(pH7.4)缓冲液洗涤5遍，去除上清液，然后加入1.5mlTCEP处理过的过氧化氢酶溶液室温旋转反应1小时，最后用10mM PBS(pH7.4)缓冲液洗涤5遍，去除上清液，得到负载尿酸酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球，并按照巯丙基琼脂糖球：PBS＝1:2的体积比加入PBS，得到负载尿酸酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球的PBS溶液，备份待用；
c)将负载酶的巯丙基琼脂糖球均匀滴加到检测试纸(玻璃纤维)的检测区域内，使巯丙基琼脂糖球能够充分负载到检测试纸里并固定好，形成尿酸检测区，如图1和图2所示，巯丙基琼脂糖球进入到玻璃纤维的空隙当中被“卡住”。
检测流程：
首先用尿酸固体粉末配制系列浓度的标准尿酸溶液，10、25、50、100、200、400、600，单位μM，溶剂是10mM的PBS(pH7.4)，将20μl不同浓度的标准尿酸溶液滴加到检测试纸条上，然后分别滴加0.05％DAB(含0.05％NiCl2，质量百分浓度)的混合溶液20μl(在加入20μl DAB后，使得其终浓度依次为5、12.5、25、50、100、200、300，单位μM)，反应10分钟。根据反应后得到检测试纸的颜色，并通过图片三原色(R,G,B)构建图像数据(图片三原色R,G,B)与尿酸浓度(C)之间的关系式，优化得到：G/(R+G+B)＝0.0002C+0.3401，R2＝0.9918。将滴加待测尿酸样品反应后检测试纸的颜色导入上述公式，计算出尿酸浓度，实现对尿液中尿酸含量的快速检测。
实施例2
检测试纸(如图1)制备流程：
a)首先将2ml双蒸水加入到0.2ml干燥的巯丙基琼脂糖球
Figure BDA0002559415660000071
6B中浸泡过夜，巯丙基琼脂糖球吸水膨胀，其体积大概是干燥状态下体积的3倍。离心弃去上清液，将二硫苏糖醇(DTT)溶液分别与上述巯丙基琼脂糖球、尿酸酶溶液和过氧化氢酶溶液室温下反应1小时，使其双硫键打开。DTT溶液的浓度为10mM，溶剂为10mM Tris-HCl溶液，尿酸酶溶液和过氧化氢酶溶液浓度为30μg/ml，溶剂为10mM PBS(PH7.4)；尿酸酶的酶活为≥2units/mg，过氧化氢酶的酶活为≥250units/mg。
b)将DTT处理过的激活的巯丙基琼脂糖球用10mM PBS(pH7.4)缓冲液洗涤5遍，去除上清液。接着加入1.5mlDTT处理过的激活的尿酸酶溶液室温旋转反应1小时，使尿酸酶负载到巯丙基琼脂糖球上。用10mM PBS(pH7.4)缓冲液洗涤5遍，去除上清液，然后加入1.5mlDTT处理过的过氧化氢酶溶液室温旋转反应1小时，最后用10mM PBS(PH7.4)缓冲液洗涤5遍，去除上清液，得到负载尿酸酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球，并按照巯丙基琼脂糖球：PBS＝1:2的体积比加入PBS，备份待用；
c)将尿酸检测试纸的检测区域浸泡在上述负载酶的巯丙基琼脂糖球的液体中，巯丙基琼脂糖球进入到玻璃纤维的空隙当中被“卡住”，使巯丙基琼脂糖球能够充分饱和负载到检测试纸里并固定好，形成尿酸检测区，如图1和图2所示。
检测流程：
首先用尿酸固体粉末配制系列浓度的标准尿酸溶液，10、25、50、100、200、400、600，单位μM，溶剂是10mM的PBS(pH7.4)，将20μl不同浓度的标准尿酸溶液滴加到检测试纸条上，然后分别滴加0.05％DAB(含0.05％NiCl2)的混合溶液20μl(在加入20μl DAB后，使得其终浓度依次为5、12.5、25、50、100、200、300，单位μM)，反应10分钟。根据反应后得到检测试纸的颜色，使用手机拍照，重复操作得到不同尿酸浓度对应的颜色条带，并制作成浓度-颜色标准比色卡，如图3，当检测实际尿酸含量的时候，把标准尿酸溶液换成尿液，根据检测试纸的颜色，与比色卡比对即可得到待检测尿酸的浓度，实现对尿液中尿酸含量的快速检测。
实施例3
负载酶的巯丙基琼脂糖球制备流程：
a)首先将2ml双蒸水加入到0.2ml干燥的巯丙基琼脂糖球
Figure BDA0002559415660000081
6B中浸泡过夜，巯丙基琼脂糖球吸水膨胀，其体积大概是干燥状态下体积的3倍。离心弃去上清液，将三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液分别与上述巯丙基琼脂糖球、尿酸酶溶液和过氧化氢酶溶液室温下反应1小时，使其双硫键打开。TCEP溶液的浓度为0.5mM，溶剂为10mM Tris-HCl溶液，尿酸酶溶液和过氧化氢酶溶液浓度为50μg/ml，溶剂为10mM PBS(PH7.4)。
b)将TCEP处理过的激活的巯丙基琼脂糖球用10mM PBS(pH7.4)缓冲液洗涤5遍，去除上清液。接着加入1.5mlTCEP处理过的激活的尿酸酶溶液室温旋转反应1小时，使尿酸酶负载到巯丙基琼脂糖球上。用10mM PBS(pH7.4)缓冲液洗涤5遍，去除上清液，然后加入1.5mlTCEP处理过的过氧化氢酶溶液室温旋转反应1小时，最后用10mM PBS(PH7.4)缓冲液洗涤5遍，去除上清液，得到负载尿酸酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球，并按照巯丙基琼脂糖球：PBS＝1:2的体积比加入PBS，备份待用；
检测流程：
首先用尿酸固体粉末配制系列浓度的标准尿酸溶液，10、25、50、100、200、400、600，单位μM，溶剂是10mM的PBS(PH7.4)，将200μl不同浓度的标准尿酸溶液分别加到1.5ml离心管内，然后每管加30μl负载尿酸酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球混合液，然后分别加入0.05％DAB(含0.05％NiCl2)的混合溶液170μl(在加入170μl DAB后，使得其终浓度依次为5、12.5、25、50、100、200、300，单位μM)，摇匀反应10分钟，最后把所有离心管静置，由于平均尺寸较大(90μm)，巯丙基琼脂糖球通过重力快速自然下沉，聚集在管底。根据反应后得到巯丙基琼脂糖球的颜色，使用手机拍照，重复操作得到不同尿酸浓度对应的颜色条带，并制作成浓度-颜色标准比色卡，如图3(从无色依次到深蓝褐色，颜色的深浅和尿酸的浓度成正相关性)。当检测实际尿酸含量的时候，把标准尿酸溶液换成血浆，根据反应后巯丙基琼脂糖球的颜色，与比色卡比对即可得到待检测血浆中尿酸的浓度，实现对血尿酸含量的快速检测。
实施例4
检测试纸(如图1)制备流程：
a)首先将2ml双蒸水加入到0.2ml干燥的巯丙基琼脂糖球
Figure BDA0002559415660000091
6B(平均尺寸90μm)中浸泡过夜，巯丙基琼脂糖球吸水膨胀，其体积大概是干燥状态下体积的3倍。离心弃去上清液，将三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液分别与上述巯丙基琼脂糖球、尿酸酶溶液和过氧化氢酶溶液室温下反应1小时，使其双硫键打开。TCEP溶液的浓度为0.1mM，溶剂为10mM Tris-HCl溶液，尿酸酶溶液和过氧化氢酶溶液浓度为50μg/ml，溶剂为10mM PBS(PH7.4)；尿酸酶的酶活为≥2units/mg，过氧化氢酶的酶活为≥250units/mg。
b)将TCEP处理过的激活的巯丙基琼脂糖球用10mM PBS(PH7.4)缓冲液洗涤5遍，去除上清液。接着加入1.0mlTCEP处理过的激活的尿酸酶溶液室温旋转反应1小时，使尿酸酶负载到巯丙基琼脂糖球上。用10mM PBS(PH7.4)缓冲液洗涤5遍，去除上清液，然后加入1.0mlTCEP处理过的过氧化氢酶溶液室温旋转反应1小时，最后用10mM PBS(PH7.4)缓冲液洗涤5遍，去除上清液，得到负载尿酸酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球，并按照巯丙基琼脂糖球：PBS＝1:2的体积比加入PBS，得到负载尿酸酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球的PBS溶液，备份待用；
c)将负载酶的巯丙基琼脂糖球均匀滴加到检测试纸(玻璃纤维)的检测区域内，使巯丙基琼脂糖球能够充分负载到检测试纸里并固定好，形成尿酸检测区，如图1和图2所示，巯丙基琼脂糖球进入到玻璃纤维的空隙当中被“卡住”。
检测流程：将本发明尿酸检测体系与Sigma公司标准尿酸检测试剂盒(产品编号：MAK077)进行对比，检测尿液中尿酸含量，流程如下。
本发明体系：
首先用尿酸固体粉末配制系列浓度的标准尿酸溶液，10、25、50、100、200、400、600，单位μM，溶剂是10mM的PBS(PH7.4)，将20μl不同浓度的标准尿酸溶液滴加到检测试纸条上，然后分别滴加0.05％DAB(含0.05％NiCl2，)的混合溶液20μl(在加入20μl DAB后，使得其终浓度依次为5、12.5、25、50、100、200、300，单位μM)，反应10分钟。根据反应后得到检测试纸的颜色，并通过图片三原色(R,G,B)构建图像数据(图片三原色R,G,B)与尿酸浓度(C)之间的关系式，优化得到：G/(R+G+B)＝0.0002C+0.3401，R2＝0.9918。检测范围为10-200μM。
收集志愿者尿液，并用PBS(浓度10mM，PH：7.4)缓冲液进行稀释，分别稀释2，4，8，16，32，64倍，得到系列稀释尿液溶液。将20μl不同浓度的上述尿液原液及稀释溶液分别滴加到检测试纸条上，然后分别滴加0.05％DAB(含0.05％NiCl2)的混合溶液20μl，反应10分钟。反应后用智能手机拍照获取试纸上小球的颜色信息，并通过内置的图像数据(图片三原色R,G,B)与尿酸浓度(C)之间的关系式G/(R+G+B)＝0.0002C+0.3401，R2＝0.9918，计算出对应的尿酸浓度，再根据稀释倍数计算出原尿中的尿酸浓度，重复3次取平均值。
Sigma公司标准尿酸检测试剂盒：
首先将试剂盒中标准尿酸溶液(2mM)用配套的缓冲液稀释10倍，至浓度为0.2mM。然后分别滴加0，4，8，12，16，20μL的上述0.2mM的标准尿酸溶液至96孔板，并加入缓冲溶液使各孔体积达到50μL。按照缓冲液：尿酸探针：酶混合物＝46μL:2μL:2μL比例，配制检测混合试剂，加入到上述96孔板中，每孔加入50μL，使得每孔最终体积为100μL。混合均匀并放入37℃避光孵育30分钟。然后使用酶标仪检测荧光强度，激发光535nm，发射光587nm，制作荧光强度—尿酸浓度标准曲线，得到标准曲线方程为Y＝419.95X+1454.4，其中Y是荧光强度，X是尿酸浓度，回归系数R2＝0.9774。
收集志愿者尿液，并用PBS(浓度10mM，PH：7.4)缓冲液进行稀释，分别稀释2，4，8，16，32，64倍，得到系列稀释尿液溶液。然后分别滴加12μL的上述稀释尿液溶液至96孔板，并加入缓冲溶液使各孔体积达到50μL。按照缓冲液：尿酸探针：酶混合物＝46μL:2μL:2μL比例，配制检测混合试剂，加入到上述96孔板中，每孔加入50μL，使得每孔最终体积为100μL。混合均匀并放入37℃避光孵育30分钟。然后使用酶标仪检测荧光强度，激发光535nm，发射光587nm。根据上述得到的标准曲线方程，计算出不同稀释倍数下的尿酸浓度，再根据稀释倍数计算出原尿中的尿酸浓度，重复3次取平均值。
将本发明体系与Sigma公司标准尿酸检测试剂盒检测尿液中尿酸浓度进行对比，可得出不同稀释倍数下的原尿中标准尿酸浓度和本检测体系对比如下：
Figure BDA0002559415660000101
Figure BDA0002559415660000111
通过上表结果可以得出，在尿液稀释8倍的情况下，准确度最高可达99.1％，显示本发明方法具有很高的检测精度。

Claims (10)

1.一种制备尿酸检测试纸的方法，包括如下步骤：
1)以巯丙基琼脂糖球为载体，通过化学反应在巯丙基琼脂糖球的表面和内部负载尿酸酶和过氧化氢酶，得到负载有尿酸酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球，即检测微单元；
2)将所述负载有尿酸酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球(检测微单元)固定在试纸上，得到尿酸检测试纸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述负载有尿酸酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球通过包括如下步骤的方法制备得到：
(1)用水浸泡巯丙基琼脂糖球使其吸水膨胀，用三(2-羧乙基)膦(TCEP)或者二硫苏糖醇(DTT)与吸水膨胀后的巯丙基琼脂糖球反应，得到TCEP或DTT处理过的激活的巯丙基琼脂糖球；用TCEP或者DTT与尿酸酶溶液反应，得到TCEP或DTT处理过的尿酸酶溶液；用TCEP或者DTT与过氧化氢酶溶液反应，得到TCEP或DTT处理过的过氧化氢酶溶液；
(2)向TCEP或DTT处理过的激活的巯丙基琼脂糖球中加入TCEP或DTT处理过的尿酸酶溶液，反应，得到负载有尿酸酶的巯丙基琼脂糖球，向得到的负载有尿酸酶的巯丙基琼脂糖球中加入TCEP或DTT处理过的过氧化氢酶溶液，反应，得到负载尿酸酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述巯丙基琼脂糖球为
Figure FDA0002559415650000011
6B；尺寸范围为45-165微米，平均尺寸为90微米；
步骤(2)中，TCEP或DTT处理过的激活的巯丙基琼脂糖球的巯丙基琼脂糖球与TCEP或DTT处理过的尿酸酶溶液中的尿酸酶、TCEP或DTT处理过的过氧化氢酶溶液中的过氧化氢酶的配比依次为：200μL：1-1000μg：1-1000μg；
尿酸酶的酶活为≥2units/mg；
过氧化氢酶的酶活为≥250units/mg。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述试纸为：玻璃纤维，其空隙在50-200微米之间；
上述方法步骤2)的操作为：将负载尿酸酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球滴加到检测试纸的检测区域内，或者将检测试纸的检测区域浸泡在含负载尿酸酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球的中，使负载尿酸酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球负载到检测试纸里并固定，即可。
5.由权利要求1-4中任一项所述方法制备得到的尿酸检测试纸。
6.权利要求5所述的尿酸检测试纸在尿素检测中的应用。
7.一种体外检测尿酸的方法，包括：将待测尿酸样品加入到权利要求5所述的尿酸检测试纸的检测区域，然后加入无色的显色底物溶液，反应，采集检测区域的颜色数据，将之导入颜色数据与尿酸浓度之间的关系式或将之与比色卡进行比对，得到待测尿酸的浓度值。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述无色的显色底物溶液中的溶质为3,3-二氨基联苯胺和氯化镍的混合物，溶剂为10mM的Tris-HCl缓冲液；
其中，3,3-二氨基联苯胺的质量浓度为0.05％，氯化镍的质量浓度为0.05％；
所述待测尿酸样品为血尿酸或尿尿酸。
9.根据权利要求7或8所述方法，其特征在于：所述图像数据与尿酸浓度之间的关系式通过如下方法获得：首先用尿酸固体粉末配制系列已知浓度的标准尿酸溶液，将所述标准尿酸溶液依次加入到检测试纸的检测区域，然后加入无色的显色底物溶液，反应后，采集检测区域的颜色数据，通过图片三原色构建颜色数据与尿酸浓度之间的关系式，即可。
10.根据权利要求7-9中任一项所述方法，其特征在于：所述比色卡通过如下方法制备得到：首先用尿酸固体粉末配制系列已知浓度的标准尿酸溶液，将所述标准尿酸溶液依次加入到检测试纸的检测区域，然后加入无色的显色底物溶液，反应后，采集检测区域的颜色，得到不同尿酸浓度对应的颜色条带，制作成尿酸浓度-颜色标准比色卡，即可。
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