CN111566481A - 微创收集探头及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于使用分子分析来评定来自受试者的多个组织部位的组织样本的方法和设备。在某些方面,各实施例的设备允许对液体组织样本进行微创收集并递送所述样本以进行质谱分析。
Description
本申请要求2017年11月27日提交的第62/591179号美国临时专利申请和2018年3月8日提交的第62/640385号美国临时专利申请的权益,这两项申请通过引用全部并入本文。
本发明是在美国国立卫生研究院授予的政府拨款号R00 CA190783的支持下完成的。政府对这项发明享有一定的权利。
技术领域
本发明一般涉及医药、分子生物学和生物化学领域。更具体地说,它涉及使用质谱法评估组织样本的方法和设备。
背景技术
临床诊断通常是在患者治疗过程的其他几个阶段,通过评估术前、术中和术后的组织样本来完成。组织评估对癌症患者的诊断和治疗至关重要。例如,切除组织的术中病理学评估通常用于各种癌症手术的诊断和手术边缘评估。切除的组织标本被送到附近的房间,通常被称为“冷冻室”,用于组织制备、染色和评估。组织标本被冷冻、切片、染色,并由专业病理学家用光学显微镜进行检查,后者仔细评估手术边缘是否含有癌细胞(阳性边缘)或不含癌细胞(阴性边缘)。虽然术中冰冻切片分析在临床实践中已经进行了几十年,但它提出了许多挑战。冷冻伪影发生在组织加工过程中,干扰组织结构和细胞形态,从而使病理解释复杂化,导致分析不可靠和主观。此外,某些肿瘤细胞由于其不典型的生长模式和形状而很难识别。分子方法可以提供对组织样本的高度准确和潜在的实时评估。将分子技术与微创外科技术或非侵入性技术相结合,可以提供一种高精度、低创伤的组织和手术样本评估和诊断方法。然而,到目前为止,还没有开发出足够的设备或方法来对组织样本进行有效的分子评估。
发明内容
在第一实施例中,提供了一种获得质谱图形的方法,包括使用探针将固定或离散体积的溶剂施加到测定位置(例如,组织部位);使用探针收集应用的溶剂以获得液体样品;并对液体样品进行质谱分析。在另一实施例中,提供一种用于评估组织样品的方法,该方法包括从受试者中的多个组织部位获得多个液体样品,并使多个液体样品接受质谱法。
还有一个实施例提供了用于获取或产生样本的装置(例如来自组织)用于质谱分析,所述装置包括:包含溶剂的室;气体供应(例如,加压气体供应);质谱仪;包括贮存器、第一导管、第二导管和第三导管的探头,其中:该储层与第一导管、第二导管和第三导管流体连通;第一(溶剂)导管与腔室流体连通;第二(气体)导管与气体供应流体连通;第三(收集)导管与质谱仪流体连通。在一些方面,气体供应可以是加压气体供应。在一些方面,探头是或包含在外科器械的套管中。在进一步的方面,手术器械可以是腹腔镜、套管针、活检引导件或多腔导管。在某些方面,手术器械是手动操作的。在其他方面,手术器械是机械的。
在更进一步的方面,探头包括探头远端,并且探头远端包括挡板,挡板可闭合以防止流体传递到所述探头外部。在一些方面,挡板是可膨胀以防止流体传递到探头外部的球囊。在某些方面,球囊可用气体或液体进行膨胀。在特定方面,挡板是可闭合以防止流体传递到探头外部的门。在其他方面,挡板配置为可多次打开和闭合。挡板可以手动或机械控制。在若干方面,第一导管、第二导管或第三导管的长度大于1米。在另外的方面中,第一导管与第三导管流体连通;并且第二导管与第三导管流体连通。在进一步的具体方面中,第一导管设置在第三导管内。在其他方面,第二导管设置在第三导管内。
在某些特定方面,第一导管和第二导管设置在第三导管内。在进一步的方面,第一导管包括第一远端;第二导管包括第二远端;第三导管包括第三远端;第一远端和第二远端位于第三导管内。在一些方面,第三远端位于探头内。在另一方面,第一远端位于距探头远端第一距离处;第二远端位于距探头远端第二距离处;第三远端位于距探头远端第三距离处;第一距离大于第三距离;并且第二距离大于第三距离。在另外的方面,第一远端和第二远端在第三导管的样品收集区的近端终止。在某些方面,样品收集区位于第一远端和第二远端与第三远端之间。在进一步的具体方面,样品收集区经由第三导管与质谱仪流体连通。在一些另外的方面,装置进一步包括控制系统,控制系统配置为控制:溶剂流从腔室通过第一导管到达第一远端;气体流从气体供应通过第二导管流向第二远端;以及样本流经由第三导管到达质谱仪。
在更进一步的方面中,该装置可另外包括第四导管,其中第一导管、第二导管和第三导管各自与第四导管流体连通。在一些方面,装置可进一步包括第一阀门,第一阀门配置为控制第一导管与第四导管之间的流动;以及第二阀门,第二阀门配置为控制第二导管与第四导管之间的流动。在另一方面中,装置可进一步包括第三阀门,第三阀门配置为控制第三导管与第四导管之间的流动。在另外一些方面,气体供应向所述探头提供空气、氮气或二氧化碳。在某些方面,加压气体供应以介于0.1psig与5.0psig之间的压力向探头提供气体。在其他方面,加压气体供应以介于0.5psig与2.5psig之间的压力向探头提供气体。在具体方面,加压气体供应以小于100psig的压力向探头提供气体。在一些方面,用于实施例的装置中的气体可以由加压气体供应提供。在进一步的方面中,气体可以泵入装置中。同样,在一些方面,气体可以通过真空通过装置。在一些方面,质谱仪入口提供真空。在进一步的方面,采用另外的真空系统。在装置用于腹腔镜手术的某些方面,气体供应优选为加压气体供应。
在一些方面,溶剂包括水。在更具体的方面,溶剂包括无菌水。在若干方面,溶剂包括乙醇。在某些具体方面,溶剂包括含水混合物,含水混合物包含1%至25%的乙醇。
在更进一步的方面,探头包括追踪设备或染料以追踪探头的位置。在另外的方面,装置可进一步包括控制系统,控制系统配置为控制:溶剂流从腔室通过第一导管;气体流从气体供应通过第二导管;以及样本流通过第三导管到达质谱仪。在一些方面,控制系统配置为:将溶剂流控制在介于200微升/分钟与5000微升/分钟之间的流率达介于1秒与3秒之间的时间段;将气体流控制在介于0.1psig与15psig之间的流率达介于5秒与50秒之间的时间段;和/或控制所述样本流达介于5秒与50秒之间的时间段。在某些方面,控制系统包括启动溶剂流的程序。
在另外的方面,质谱仪与可提供样本分析的计算机进行电子通信。在一些方面,计算机提供样本分析的视觉或听觉读出。在进一步的方面,装置另外可包括与第三导管流体连通的废液容器。在某些方面,装置可进一步阀门,阀门配置为使流体从第三导管分流到废液容器。在其他方面,装置可进一步包括泵,泵配置为去除废液容器中的内容物。在更进一步的方面,装置可包括与第三导管流体连通的泵。在一些方面,泵被配置为提高第三导管内的内容物的速率。在几个方面中,装置可进一步包括联接到第三导管的加热元件。在特定方面,加热元件是加热丝。
在更进一步的方面,装置可包括与第三导管流体连通的电离设备。在某些方面,电离设备是电喷雾电离(ESI)设备。在其他方面,电离设备是大气压化学电离(APCI)设备。在一些方面,电离设备用于在质谱仪的入口近侧形成喷雾。在几个方面,第三导管不直接联接到质谱仪。在具体方面,装置可进一步包括与第三导管流体连通的文丘里(venturi)设备。在某些方面,装置不包括用于施加超声能或振动能的设备。
在进一步的实施例中,提供一种评估受试者组织样本的方法,包括(a)通过手术器械的套管将固定或离散体积的溶剂施加到受试者的组织部位;(b)收集施加的溶剂以获得液体样本;以及(c)对样本进行质谱分析。在一些方面,不将所述固定或离散体积的溶剂作为喷雾施加。在其他方面,将固定或离散体积的溶剂作为液滴施加。在某些方面,手术器械是腹腔镜、套管针或活检引导件。手术器械可以是手动操作的,也可以是机械的。
在进一步的方面,套管包括在具有探头远端的探头中,并且探头远端包括挡板,挡板可闭合以防止流体从探头的套管中流出。在一些方面,挡板是可膨胀以防止流体传递到探头外部的球囊。在具体方面,球囊可用气体进行膨胀。在某些方面,挡板是可闭合以防止流体传递到探头外部的门。例如,挡板可以是虹彩光圈、机械闭合、栅极或磁带。在一些方面,挡板可以手动控制或可以自动控制。例如,在一些方面,挡板可位于溶剂与组织部位接触预定时间段(例如,至少约1秒、2秒或3秒)后启动挡板的计时器上。在更进一步的方面,使用小于100psig的压力施加固定或离散体积的溶剂。在其他方面,使用小于10psig的压力施加固定或离散体积的溶剂。在一些方面,使用机械泵施加固定或离散体积的溶剂以使溶剂移动通过溶剂导管。在某些方面,收集施加的溶剂包括施加负压以将样本拉入收集导管和/或施加气压以将样本推入收集导管。在其他方面,收集施加的溶剂包括施加负压以将样本拉入收集导管并且施加正压以将样本推入收集导管。在某些具体方面,通过与收集导管分开的溶剂导管施加溶剂。在进一步的方面,通过与溶剂导管和收集导管分开的气体导管施加气压。在其他方面,施加气压以将样本推入收集导管包括施加小于100psig的压力。
在更进一步的方面,该方法不会对组织产生可检测到的物理损伤。在一些方面,该方法不涉及向组织施加超声能或振动能。在某些方面,溶剂可能是无菌的。在具体方面,溶剂可以是药学上可接受的制剂,并且进一步是水溶液,并且进一步是无菌水。在进一步的具体方面,溶剂基本上由水组成。在其他方面,溶剂包含约1%至20%的醇。在一些方面,醇包含乙醇。在另外的方面,溶剂的离散体积介于约0.1μL与100μL之间。在某些方面,溶剂的离散体积介于约1μL与50μL之间。在进一步的方面,在施加步骤之后介于0.1秒与30秒之间收集施加的溶剂。在另一方面,在施加步骤之后介于1秒与10秒之间收集施加的溶剂。在一些方面,组织部位是经手术评定的内部组织部位。
在更进一步的方面,方法另外包括从多个组织部位收集多个液体样本。在某些方面,用探头收集液体样本。在具体方面,在不同样本的收集之间洗涤探头。在一些方面,探头是一次性的,并且在不同样本的收集之间进行更换。在另一方面,探针包括收集尖端,并且进一步包括在收集液体样本之后从探头弹出收集尖端。在进一步的方面,多个组织部位包括2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个组织部位。在另一方面,多个组织部位围绕已经被手术切除的组织区段。在一些方面,切除的组织是肿瘤。在其他方面,该方法进一步被定义为术中或术后方法。在某些方面,质谱法包括环境电离MS。在某些具体方面,对样本进行质谱分析包括测定与组织部位对应的谱图。在进一步的方面,该方法还包括将谱图与参考谱图进行比较以识别包括患病组织的组织部位。还有一个方面包括切除被识别为包括患病组织的组织部位。在另一方面,使用根据上述实施例和方面的装置来执行该方法。
在进一步的方面,质谱仪与可提供样本分析的计算机进行电子通信。在某些方面,每个样本分析的结果由计算机的视觉或听觉输出提供。例如,计算机对每个样本的分析结果可以用不同颜色的光来表示,也可以用不同频率的声音来表示。在一些方面,质谱仪是一种移动式质谱仪。在进一步的方面,质谱仪可包括不间断电源(例如电池电源)。在更进一步的方面,质谱仪包括一个入口,该入口可被关闭以保持仪器真空。在更进一步的方面,质谱仪通过网状过滤器与探头分离(例如阻止污染)。
在一些方面,贮存器配置为形成溶剂滴。在某些方面,加压气体供应以介于0.1psig与5.0psig之间的压力向探头提供气体。在进一步的方面,加压气体供应以介于0.5psig与2.5psig之间的压力向探头提供气体。在几个方面,加压气体供应为探头提供空气。在其他方面,加压气体供应向探头提供惰性气体,诸如氮气或二氧化碳。在一些方面,根据实施例使用的气体供应处于大气压。例如,用于输送气体的导管可由装置周围的大气供应。
在另外的方面,装置进一步包括泵,泵配置为将溶剂从腔室转移到第一导管。在进一步的方面,装置可包括第一阀门,第一阀门配置为控制流体从第三导管到达质谱仪。在一些方面,当第一阀门处于打开位置时,第三导管处于真空状态。在其他方面,装置可包括第二阀门,第二阀门配置为控制通过第二导管的气体流(例如加压气体)。
在某些方面,溶剂可包括水和/或乙醇。在若干方面,探头由聚二甲基硅氧烷(PDMS)和/或聚四氟乙烯(PTFE)形成。在一些方面,探头是一次性的。在具体方面,探头可包括可弹出的收集尖端(例如,能够从探针中弹出)。在进一步的方面,探头包括追踪设备以追踪探头的位置。在一些方面,贮存器的容积在1微升到500微升之间、在1微升到100微升之间或在2微升到50微升之间。在另外的方面,贮存器的容积在5.0微升到20微升之间。
在更进一步的方面,装置可另外包括控制系统,控制系统配置为控制:溶剂流(例如固定或离散体积的溶剂流)从腔室通过第一导管到达贮存器;气体流从气体供应通过第二导管到达贮存器;以及样本流从贮存器通过第三导管到达质谱仪。在一些方面,控制系统配置为:将溶剂流控制在介于100微升/分钟与5000微升/分钟之间(例如200微升/分钟与400微升/分钟)的流率达介于1秒与3秒之间的时间段;将气体流控制在介于1psig与10psig之间的流率达介于10秒与15秒之间的时间段;和/或控制样本流达介于10秒与15秒之间的时间段。例如,在一些方面,控制系统包括用于启动溶剂流的触发器或按钮。在进一步的方面,控制系统包括踏板(即可通过脚动作操作的踏板),以启动溶剂流。熟练的技术人员将认识到,第一和/或第二导管的长度可以调整以适合系统的特定用途。在又一方面,控制系统配置为控制:溶剂流(例如固定时间段的流速)从腔室通过第一导管到达存贮器。在进一步的方面,实施例的装置不包括用于产生超声能或振动能(例如足以扰乱组织的量)的设备。
进一步的实施例提供了一种评估受试者组织样本的方法,包括将溶剂施加到受试者的组织部位,收集施加的溶剂以获得液体样本,以及对样本进行质谱分析。在某些方面,溶剂可能是无菌的。在一些方面,溶剂是药学上可接受的制剂。在具体方面,溶剂是含水溶液。例如,溶剂可以是无菌水或基本上由水组成。在其他方面,溶剂可包含约1%至5%、10%、15%、20%、25%或30%的醇。在一些方面,溶剂包含0.1%至20%的醇、1%至10%的醇或1%至5%、1%至10%的醇(例如乙醇)。在一些情况下,醇可能是乙醇。
在一些方面,将溶剂施用于组织包括将离散体积的溶剂施用于组织部位。在一些方面,溶剂被施用于单个液滴中。在进一步的方面中,溶剂被施用于从1到10的离散数量的液滴中。在一些实施例中,溶剂经由与气体无关的通道施加到来自贮存器的样本上。在进一步的实施例中,在低压下将溶剂施加到样本上。例如,在一些方面,通过机械泵施加溶剂,使得溶剂以最小的力施加到组织部位(例如,移动到与组织部位接触的贮存器中),从而在组织部位施加最小的压力(并产生最小的损伤)。低压可小于100psig、小于90psig、小于80psig、小于70psig、小于60psig、小于50psig或小于25psig。在一些实施例中,低压为约0.1psig至约100psig、约0.5psig至约50psig、约0.5psig至约25psig、或约0.1psig至约10psig。在特定方面,溶剂的离散体积介于约0.1μL与100μL之间或介于约1μL与50μL之间。在进一步的方面,在施加步骤之后介于0.1秒与30秒之间收集施加的溶剂。在具体方面,在施加步骤之后,收集施加溶剂介于1秒到10秒之间(例如至少1秒、2秒、4秒、5秒、6秒、7秒、8秒或9秒)。在进一步的方面,实施例的方法不涉及向样本或组织施加超声能或振动能。在一些方面,组织部位是经手术评定的内部组织部位。
在另一方面,实施例的方法包括通过溶剂导管将固定或离散体积的溶剂(例如使用机械泵)施加到组织部位。在一些方面,溶剂的固定或离散体积通过溶剂导管移动到与组织部位直接接触的贮存器中(例如0.5-5.0秒)。在进一步方面,收集施加的溶剂包括施加负压以将样本拉入收集导管和/或施加气压以将样本推入收集导管。在一些方面,通过与收集导管分开的溶剂导管施加溶剂。在进一步的方面,其中施加气压以将样品推入收集导管中,通过与溶剂导管和收集导管分离的气体导管施加气体压力。在某些方面,其中施加气压以将样品本推入收集导管,施加气压小于100psig。例如,气压优选小于10psig,诸如0.1psig至5psig。在更进一步的方面,实施例的方法被定义为对被评估的组织不产生可检测的物理损伤。
在更进一步的方面,该方法可另外包括从多个组织部位收集多个液体样本。在一些情况下,用于收集样本的装置(例如探头)在每次样本收集之间洗涤。在其他方面,用于收集样本的装置包括可在每个样本收集之间改变的一次性收集尖端(探头)。在特定方面,收集尖端可以被弹出(例如能够从设备中弹出)。在某些方面,多个组织部位包括2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个体内组织部位。在另一方面,多个组织部位围绕已经被手术切除的组织区段(例如离体)。在特定方面,切除的组织是肿瘤。在一些方面,该方法可定义为术中方法。
进一步的实施例提供了一种识别取样组织部位的方法和一种将该部位的位置传达给设备(探头)操作员的方法。通过对取样组织部位的识别,操作者可以在从组织中收集的分子取样后一次访问在取样组织部位记录的分子信息。至少识别出三种类型的识别方法。在第一种方法中,将外源材料附着到识别取样分子信息的取样组织部位。在第二种方法中,该装置(探头)配备有跟踪传感器/发射器,其允许记录探头(装置)的位置并在对分子信息进行取样时与成像装置通信。在第三种方法中,对组织区域进行修饰,以便在获取组织分子后容易识别该部位。在第一种方法中,可附着于取样组织部位的材料包括例如缝合线、手术夹、附着于该组织的生物相容性聚合物、或附着于磁珠的RFID芯片,该磁珠允许容易读取和移除。在第二种方法类型中,探头可以包含RF手术跟踪系统的一部分的RF发射器、作为术中US成像系统的一部分的超声发射器或反射器。在第二种方法中,当操作者开始收集组织分子时,跟踪系统记录探头在相关成像系统(例如RF、US、CT、MRI)中可能与设备通信的位置。然后,操作者可以在稍后的时间通过参考能够向操作者指示取样部位位置的一个或多个记录图像来识别任何取样组织部位。在第三种方法中,组织被修饰。在第三种方法中,与探头通信的激光源可用于将图案消融或凝固到识别取样部位的组织中。这三种方法中的任何一种都可以结合起来。例如,方法1、2和3可以结合,其中在获取组织分子后将外源材料附着到组织部位,并且当RF传感器记录获取位置的位置并与成像设备通信时,激光对外源组织进行模式化。
在更进一步的方面,质谱法包括环境电离MS。如本文所公开的,与组织部位接触的探头可以通过导管与MS流体连通。在一些方面,探头和组织部位之间的导管距离MS的距离小于约10m、8m、6m或4m。在进一步的方面,导管的长度介于约0.5m、1.0m、1.5m、2.0m、2.5m、3.0m和4.0m之间。在若干方面,对样品进行质谱分析包括测定与组织部位对应的谱图。在另一方面,该方法还包括将谱图与参考谱图进行比较以识别包括患病组织的组织部位。在其他方面,该方法还包括切除被识别为包括患病组织的组织部位。在一些方面,使用根据上述实施例和方面的装置来执行该方法。
在进一步的实施例中,本发明提供一种评估组织样本的离体方法,包括从受试者的多个组织部位获得多个液体样本,将多个液体样本进行质谱分析以获得与组织部位对应的多个谱图,并将多个谱图与参考谱图进行比较,以识别包括患病组织的组织部位。在某些方面,液体样本包含在溶剂中。在进一步的方面,患病组织包含癌细胞。
在实施例的一些方面,通过实施例的方法和设备评估的患病组织部位包含(或怀疑包含)癌细胞。根据实施例可评估的癌细胞包括但不限于来自甲状腺、甲状旁腺、淋巴结、膀胱、血液、骨、骨髓、大脑、乳腺、结肠、食道、胃肠、牙龈、头部、肾脏、肝、肺、鼻咽、颈部、卵巢、胰腺、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌或子宫(或肿瘤周围的组织)的细胞或肿瘤组织。在一些方面,癌可能是恶性肿瘤;癌;未分化癌;巨细胞癌和梭形细胞癌;小细胞癌;乳头状癌;鳞状细胞癌;淋巴上皮癌;基底细胞癌;毛母质癌;移行细胞癌;乳头状移行细胞癌;腺癌;恶性胃泌素瘤;胆管癌;肝细胞癌;合并肝细胞癌和胆管癌;小梁腺癌;腺样囊性癌;腺瘤性息肉腺癌;家族性大肠息肉病腺癌;实体癌;恶性类癌;细支气管-肺泡腺癌;乳头状腺癌;嫌色细胞癌;嗜酸细胞癌;嗜氧腺癌;嗜碱细胞癌;透明细胞腺癌;颗粒细胞癌;滤泡腺癌;乳头状腺癌和滤泡腺癌;非包膜硬化性癌;肾上腺皮质癌;子宫内膜样癌;皮肤附件癌;顶浆腺癌;皮脂腺腺癌;角化腺癌;粘液表皮样癌;囊腺癌;乳头状囊腺癌;乳头状浆液性囊腺癌;黏液性囊腺癌;黏液腺癌;印戒细胞癌;浸润性导管癌;髓样癌;小叶癌;炎性癌;乳腺paget病;腺泡细胞癌;腺鳞癌;腺癌伴鳞状化生;恶性胸腺癌;恶性卵巢间质肿瘤;恶性卵泡膜细胞瘤;恶性颗粒细胞肿瘤;恶性男性母细胞瘤;支持细胞癌;恶性睾丸间质细胞瘤;恶性脂质细胞肿瘤;恶性副神经节瘤;恶性乳房外副神经节瘤;嗜铬细胞瘤;血管球血管瘤病;恶性黑色素瘤;无色素黑色素瘤;浅表扩散黑色素瘤;巨大色素痣中的恶性黑色素瘤;上皮样细胞黑色素瘤;恶性蓝色痣;肉瘤;纤维肉瘤;恶性纤维组织细胞瘤;粘液肉瘤;脂肪肉瘤;平滑肌肉瘤;横纹肌肉瘤;胚胎横纹肌肉瘤;肺泡横纹肌肉瘤;间质肉瘤;恶性混合肿瘤;苗勒管混合瘤;肾母细胞瘤;肝母细胞瘤;癌肉瘤;恶性间叶瘤;恶性勃勒纳瘤;恶性叶状肿瘤;滑膜肉瘤;恶性间皮瘤;无性细胞瘤;胚胎癌;恶性畸胎瘤;恶性卵巢甲状腺肿;绒毛膜癌;恶性中肾瘤;血管肉瘤;恶性血管内皮瘤;卡波西肉瘤;恶性血管外皮细胞瘤;淋巴管肉瘤;骨肉瘤;近皮质骨肉瘤;软骨肉瘤;恶性软骨母细胞瘤;间充质软骨肉瘤;骨巨细胞瘤;尤文氏肉瘤;恶性牙源性肿瘤;成釉细胞牙肉瘤;恶性成釉细胞瘤;成釉细胞纤维肉瘤;恶性松果体瘤;脊索瘤;恶性胶质瘤;室管膜瘤;星形细胞瘤;原生质星形细胞瘤;纤维星形细胞瘤;星形母细胞瘤;胶质母细胞瘤;少突神经胶质瘤;少突神经胶质母细胞瘤;原始神经外胚层;小脑肉瘤;神经节母细胞瘤;神经母细胞瘤;视网膜母细胞瘤;嗅源性肿瘤;恶性脑膜瘤;神经纤维肉瘤;恶性神经鞘瘤;恶性颗粒细胞瘤;恶性淋巴瘤;霍奇金病;霍奇金病;或类肉芽肿。在进一步的方面,癌症是甲状腺癌、脑癌(例如胶质瘤)、前列腺癌、乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、胰腺癌(例如胰腺导管腺癌)、急性髓系白血病(AML)、黑色素瘤、肾细胞癌或转移到淋巴结的癌。
在又一实施例中,提供了一种表征材料的方法,其包括(a)向所述材料施加固定或离散体积的溶剂;(b)收集施加的溶剂以获得液体样本;以及(c)对样本进行质谱分析以提供表征材料的质谱图。在一些方面,材料是商品,并且表征材料包括识别材料。例如,商品可以是食物,例如肉、鱼、食用菌、蔬菜或水果。因此,在一些方面,表征材料包括识别构成材料的肉或鱼的类型。在材料是肉的情况下,该方法可包括识别肉,例如,羊肉、鹿肉、驼鹿肉、鸡肉、火鸡肉、绵羊肉、狗肉、猫肉、马肉、猪肉、牛肉、水牛肉或山羊肉。在进一步的方面,该方法可用于将肉识别为来自草饲料或谷物饲料动物的肉。在材料为鱼的情况下,该方法可包括识别鱼,例如金枪鱼、鲑鱼、鳕鱼、鳟鱼、比目鱼或鲈鱼。在进一步的方面,该方法可用于将鱼识别为养殖鱼或野生捕获鱼。在更进一步的方面,鱼可以是水生有壳动物。在更进一步的方面,实施例的方法可用于识别食品(诸如鱼或肉)的原产地。在某些方面,使用如本文所述的装置来执行表征材料的方法。例如,装置可包括以下装置:包括溶剂的腔室;气体供应(例如加压气体供应);质谱仪;以及包括存贮器、第一导管、第二导管和第三导管的探头,其中:第一导管与腔室流体连通;第二个管道与气体供应流体连通;第三个管道与质谱仪流体连通。
在另一个实施例中,提供了一种表征材料的方法,其包括(a)将固定或离散体积的溶剂施加到材料上;(b)收集施加的溶剂以获得液体样本;和(c)将样本进行质谱分析以提供表征材料的质谱分析曲线材料。在一些方面,表征材料包括检测和/或量化材料中化合物的量。例如,化合物可以是小分子,诸如药品、药物(例如止痛药)、农药(例如杀虫剂)、除草剂、抗生素或毒素。例如,在一些方面,药物可以是阿得拉、可卡因、可待因、吗啡、大麻、安非他明、甲基安非他明、MDMA、海洛因、氯胺酮、麦角酸二乙酰胺或羟考酮。在进一步的方面,化合物可以是杀虫剂或除草剂,诸如麦草畏、草甘膦、嘧菌酯或莠去津。在某些方面,使用如本文所述的装置来执行表征材料的方法。例如,装置可包括以下装置:包括溶剂的腔室;气体供应(例如加压气体供应);质谱仪;以及包括存贮器、第一导管、第二导管和第三导管的探头,其中:第一导管与腔室流体连通;第二个管道与气体供应流体连通;第三个管道与质谱仪流体连通。
如本文中所使用的,“样本”或“液体样本”可指根据实施例通过将组织或生物样品与溶剂接触而获得的来自组织或其他生物样品的提取物(例如包含蛋白质和代谢物的提取物)。在一些方面,样本可以是非生物样品的提取物,诸如物体表面(例如法医样本)。
如本文中所使用的,就特定组分而言,“基本上不含”在本文中被用于表示未将任何特定组分故意配制成组合物和/或仅作为污染物或微量存在。由组合物的任何意外污染而产生的特定组分的总量远低于0.01%。最优选的是使用标准分析方法无法检测特定组分的组合物。
如本说明书所使用的,“a”或“an”可指一个或多个。如在本说明书或权利要求书中所使用的,当与“包含”一词一起使用时,“a”或“an”可指一个或多个。如在本说明书和权利要求书中所使用的,“另一个”或“进一步”可表示至少一秒或更多。
如在本说明书或权利要求书中所使用的,术语“导管”和“管”可互换使用,并指可用于引导气体或液体流动的结构。
如在本说明书或权利要求书中所使用的,术语“关于”用于指示包括装置的固有误差变化、用于确定值的方法或研究对象之间存在的变化的值。
通过下面详细的描述,本发明的其他目的、特点和优点将会变得显而易见。然而应当理解,这些详细说明和特定的实施例在指示本发明的某些实施例时,只是用于示范,因为根据此详细说明,在本发明的精神和范围内的各种变化和改进对于本领域技术人员将显而易见。
附图简要说明
以下附图构成本说明书的一部分并被包括,以进一步说明本发明的某些方面。通过参考一个或多个附图,并结合此处给出的具体实施方式的描述,可以更好地理解本发明。
图1:质谱探头在微创手术中的代表性原理图。
图2:用于微创手术的质谱探头的多腔管。
图3:用于放置和插入用于微创手术的质谱探头的套管和套管针。
图4:质谱探头在微创手术中的代表性原理图。本实施例包括用于阻挡探头的挡板。
图5:用Q Exactive Orbitrap质谱仪对来自微创质谱探头的小鼠脑组织切片的质谱。使用的1.5米的PTFE管的内径为2mm,外径为4mm。
图6:用Q Exactive Orbitrap质谱仪对来自微创质谱探头的小鼠脑组织切片的质谱。使用的3.5米的PTFE管的内径为2mm,外径为4mm。
图7:用Q Exactive Orbitrap质谱仪对来自微创质谱探头的小鼠脑组织切片的质谱。使用的4.5米的PTFE管的内径为2mm,外径为4mm。
图8:用Q Exactive Orbitrap质谱仪对来自微创质谱探头的小鼠脑组织切片的质谱。
图9:质谱探头在微创手术中的代表性原理图。左下角显示的是多通道探头尖端。
图10:模拟子宫上的腹腔镜光学摄像机显示的模拟腹腔镜手术。右图为夹持微创质谱探头的镊子。
图11:与水背景相比,使用4.5米长的管从16μm小鼠脑切片中产生的质谱。
图12:使用Q Exactive Orbitrap质谱仪和直径为1.5-4.0mm的导管用微创质谱探头产生的质谱。
图13:与微创质谱探头一起使用的球囊挡板的力学描述。
图14:用Q Exactive Orbitrap质谱仪对微创质谱探头进行人肺组织切片的质谱。
图15:微创质谱探头洗涤室示意图。
图16A-16D:腹腔镜MasSpec笔系统在(a)手动腹腔镜MIS程序和(b)机器人辅助MIS中使用的示意图。(c)笔尖设计有一个抓握翼,允许使用镊子或其他抓握器操作和应用MasSpec笔,(d)笔尖接触组织进行分析,当使用脚踏板触发系统(t=0秒)时,注射泵将控制体积的水输送至贮存器。离散的水滴与组织相互作用以提取分子。3秒后,真空和气体导管同时打开,通过管道系统将液滴从MasSpec笔输送到质谱仪进行分子分析。
图17A-17C:手持式与腹腔镜MasSpec笔的设计与性能比较。(a)手持MasSpec笔包含一个PDMS尖端和三个PTFE导管,这些导管向针头提供进水(1)和气体(2),以及一个用于向质谱仪提供水滴的出水导管(3)。笔尖在贮存器内保持水滴,水滴接触组织进行分析,(b)腹腔镜MasSpec笔PDMS尖端移植了两个微型PTFE管,一个用于进水(1),另一个用于进气(2)。然后,笔尖的近端连接到一个更大的PTFE导管,该导管起到出水导管(3)的作用。使用这种设计,笔尖远端的中空空间起到水滴贮存器(c)的作用,用小鼠脑组织切片的手持式和腹腔镜MasSpec笔获得代表性质谱,两者均在2.7mm贮存器直径和1.5米管长度下操作。
图18A-18C:使用小鼠脑组织切片评估腹腔镜MasSpec笔(2.7mm贮存器直径)和质谱仪之间的不同管长度。使用(a)1.5m(3.8秒,n=10)、(b)3.0m(5.8秒,n=10)和(c)4.5m(7.5秒,n=10)在不同的转移时间获得相似的分子谱图。
图19A-19B:开发了一个用于自动质谱数据采集、统计分析和结果连通的自动化系统,(a)使用脚踏板通过与Arduino微控制器连通来触发分析工作流,然后通过触发注射泵来激活水滴沉积。在GUI中,用户在使用前选择要评估的组织类型,以便软件选择适当的统计分类器,提供与相关癌症概率相关的预测性诊断,(b)腹腔镜MasSpec笔平台通过8mm套管使用人体模型进行测试。使用腹腔镜镊子操作MasSpec笔,同时使用摄像机传输腹部器官的图像和/或视频,并在手术过程中指导操作者。
图20A-20C:(a-c)在1.5mm、2.7mm和4.0mm的贮存器直径和4.5米的管长度下,用腹腔镜MasSpec笔从小鼠脑组织切片获得的代表性质谱。
图21:用腹腔镜MasSpec笔(2.7mm贮存器直径和4.5米管长度)获得正常和癌性卵巢组织的代表性质谱。
图22:以CAN:DMF 1:1为溶剂,用MasSpec笔从牛肉、羊肉、鸡肉和猪肉样本中获得的代表性质谱。结果表明,用MasSpec笔获得的光谱能以较高水平的准确度评价肉的来源。
图23:用MasSpec笔从草饲牛肉和粮饲牛肉样本中获得的代表性质谱(使用CAN:DMF 1:1作为溶剂)。结果表明,用MasSpec笔获得的光谱能够很好地确定肉来源于草饲动物还是谷饲动物。
图24:以水为溶剂,用MasSpec笔从牛肉、羊肉、鸡肉和猪肉样本中获得的代表性质谱。结果表明,用MasSpec笔获得的光谱,即使以水作为唯一的溶剂,也能以较高水平的准确度评估肉的来源。
图25:用MasSpec笔从鱼样品(包括大西洋鲑鱼、红鲑、鳟鱼、鳕鱼腰或大比目鱼)中获得的代表性质谱(使用ACN:DMF(1:1)作为溶剂)。结果表明,用MasSpec笔获得的光谱能以高水平的准确度评价鱼的来源。
图26:用MasSpec笔从包括非法药物、可卡因和安非他明在内的样本中获得的代表性质谱。结果表明,用MasSpec笔获得的光谱对药物具有高的敏感度,并能定量测定样本中药物的含量。
图27:用MasSpec笔从包括羟考酮含量的样本中获得的代表性质谱。结果表明,用MasSpec笔获得的光谱能够检测和定量样本中羟考酮的量。
图28:用MasSpec笔从包括杀虫剂嘧菌酯在内的样本中获得的代表性质谱(和比较色谱)。结果表明,MasSpec笔分析法能够检测和定量样本中杀虫剂的量。
图29:用MasSpec笔从包括杀虫剂莠去津在内的样本中获得的代表性质谱(和比较色谱)。结果表明,MasSpec笔分析法能够检测和定量样本中杀虫剂的量。
图30:用MasSpec笔从葡萄中获得的代表性质谱。结果表明,MasSpec笔分析能够产生一个能用于样本表征的光谱。
具体实施方式
I.本实施例
在某些方面,即时施加为样本(诸如组织样本)的微创分子评估提供了方法和设备。特别地,在组织的手术(或活检)期间,这些方法可用于评估多个组织部位。这一特征可以“实时”的方式准确识别患病组织(例如,保留癌细胞的组织部位),使外科医生能够更准确地定位患病组织相对于周围正常组织的位置。在特定方面,这里公开的方法可涉及将固定或离散体积的溶剂输送至组织部位,然后从该部位收集液体样本并对液体样本进行质谱分析。重要的是,溶剂不是以高压喷雾施加,而是在低压下作为离散液滴施加。这些方法允许从不同的组织部位准确收集样本,同时避免对被评估的组织造成损害。从收集的样本中得到的质谱图可以区分患病部位和正常组织部位。该方法可以在多个感兴趣的位置重复,以非常精确地绘制分子变化图(例如在组织里)。重要的是,即使不使用电离源,样本的谱图也可以被区分。因此,虽然实施例的方法可以与电离源一起使用,但不需要使用这种源。这些方法可以在短时间内评估多个组织部位,从而能够非常准确地评估患病组织与正常组织的界限。
在一些方面,本文详述的方法可用于从各种来源收集和分析样品。例如,这些方法可用于评估外科、法医、农业、制药和/或石油/石油样本。
在一些方面,在实施例的装置中使用的材料(PDMS和PTFE)和溶剂(例如仅水溶剂)是生物相容的,使得它们可用于实时分析的手术中。此外,由于设备可以非常紧凑,它可以手持,并用于微创外科手术或非外科手术。
在一些方面,本发明提供用于将固定或离散体积的溶剂输送到组织以用于微创手术的延长长度和增加紧凑性的装置。在一些方面,这些方法可以封装在各种形状因子中,诸如导管,其内径在0.5mm到10.0mm之间(例如内径在1.0mm到5.0mm之间;1.0mm到10.0mm之间;2.0到8.0mm之间;或5.0到10.0mm之间)。在一些方面,输送固定或离散体积的溶剂然后收集液体样本的部位可能在体内,诸如外科手术部位。在一些方面,可以将两个较小的导管插入第三个较大的导管中以形成多腔导管。例如,多腔导管可以具有2个、3个、4个、5个、6个或更多的腔空间,每个腔空间的内径为,例如0.05mm至5.0mm;0.1mm至5.0mm;0.25mm至3.0mm;或0.5mm至10.0mm。多腔导管可以附着到质谱仪上,用于在手术期间分析体内的样本组织,同时避免对周围组织造成不必要的损伤。
在一些方面,装置可在微创外科或内窥镜手术中通过套管或导管使用,或可在非外科手术中通过针引导件或活检引导件使用。在一些方面,本发明可以集成到机器人外科系统中,使得能够快速地对人体腔的多个区域进行采样和分析。在一些方面,该设备可用于使用分子特征数据库和机器学习算法分析组织,从而允许对每个采样区域进行实时诊断。本发明可用于多种肿瘤和其他外科治疗(诸如子宫内膜异位症),需要对组织进行实时表征和诊断。
在一些方面,本公开提供了一种探头附件,用于在微创或非侵入性操作过程中对探头进行精细操作。例如,探头的附件可以是翼。在一些方面,这种翼可以由与探头相同的材料组成。在一些情况下,翼是由PDMS制成的。在一些方面,翼可以通过注射成型过程形成,或者可以3D打印。在一些方面,本发明可进一步包括一种用于在腹腔镜手术期间操纵探头的装置,用于在探针头部抓住探头。抓取装置可用于保持、旋转或移动探头,或可抓住附在探头上的翼以移动或旋转探头。
在一些方面,本发明使用带有凹陷端口的多腔导管在腹腔镜手术过程中沉积水和氮气来维护贮存器。例如,可以使用本领域众所周知的多腔挤压来形成多腔导管。这些导管可用于任何套管。最常用的套管直径为5mm和10mm,通常用于腹腔镜手术。
在一些方面,本公开提供了在内窥镜检查期间操作探头的工具、设备和方法。例如,多腔管可与外部真空源一起使用,以便在分析时将探头连接到组织表面。
在一些方面,本发明提供了一种遮住微创手术装置的孔口的挡板系统。在一些方面,该挡板系统可以是集成在设备中或单独添加到设备中的导管球囊。当导管插入患者体内时,挡板或球囊可关闭探头尖端,防止不需要的生物材料进入设备,包括管腔和管道。分析开始后,挡板或球囊可禁止内源性生物流体进入质谱仪,从而防止结果受到污染。最后,关闭挡板或球囊可以防止过量的氮气和水进入人体。包括用于微创手术的加长探头和探头尖端的阻塞技术,可以减轻手术期间可能影响信号采集的内部器官运动和器官系统的不可预测且经常混乱的性质。球囊技术也可用于装置的其他区域,代替或除夹管阀门之外,用于控制溶剂和气体通过管的运动。
在一些方面,本发明可与机器人操作一起使用。在一些方面,本发明的技术可以通过附件端口或通过机械臂集成在现代外科手术室中。这些设备可以集成到机器人系统中,例如Intuitive Surgical的达芬奇机器人外科系统。本发明的装置可以在机器人系统中有自己的专用臂,或者通过将“翼”结合到探头上由机器人抓取器来处理。越来越小和越来越大的直径也可用于连接任何现有的导管、套管以及针/活检引导件。
在一些方面,跟踪探头可以与该设备集成,以便显示和记录组织样本的分析位置,以便更好地帮助外科医生在术中或其他情况下定位采样点。例如,在术中超声期间,设备上的超声发射器可用于在采样时显示探头。该探头可与基于射频技术的跟踪装置(诸如Biosense Webster Carto系统)集成。在那种情况下,探头可以在各种成像方式中的任何一种上显示设备/采样位置,诸如术中超声(US)/计算机断层扫描(CT)/磁共振成像(MRI)/光学相干断层扫描(OCT)。另外,荧光成像和分子染料可用于跟踪分析区域并绘制图表以提供二维或三维空间成像。更简单地说,探头尖端可以涂上一层外科染料,然后印在组织上,以跟踪分析的区域。另一种跟踪方法是将RF发射器集成到探头中,以便跟踪空间位置。
在一些方面,本发明的探头可通过在活体内实时提供全面和确定的诊断分子信息,在微创外科干预期间用于协助外科医生和医学专业人员,不必对病人的原活组织造成损害或改变。手持式MasSpec笔已经证明了在非腹腔镜/内窥镜手术过程中能够做到这一点(通过引用将美国专利申请号15/692167全部并入本文中)。与手持MasSpec笔类似,本发明适用于组织(新鲜、冷冻、切片、活检)或其他可能由病理学家检查的临床标本的离体分析,并可用于任何给定样本的化学分析,在受限和空间受限的领域(动物、植物、爆炸物、药物等)需要直接分析。还可以分析各种组织类型,包括但不限于乳腺、肾脏、淋巴结、甲状腺、卵巢、胰腺和脑组织。
在一些方面,本发明的探头可与用于治疗疾病的手术器械一起使用。各种手术器械可用于切除或消融细胞或组织,包括但不限于激光消融工具、用于烧灼或电烙的工具,或用于手工解剖组织的工具,诸如手术刀。
因此,在手术过程中,可以对人体腔的许多区域进行快速采样和分析(例如,使用分子特征数据库和机器学习算法)。因此,可以实时地为每个采样区域提供诊断结果。下面详细说明在这些方法中使用的示例性装置。
Ⅱ.实施例的装置的示例性特征
A.挡板系统
在一些方面,本实施例的装置进一步包括挡板系统,该挡板系统可以阻塞孔口,并在贮存器和组织之间创建分离。例如,挡板系统可以在液滴停留3秒后以及液滴被传送到质谱仪之前激活。其中一个原因是确保没有生物材料到达质谱仪并对仪器造成损坏。挡板可以是虹彩光圈、机械闭合、栅极或磁带。挡板的另一个设计是球囊机制,它将设备的外部与组织密封起来。球囊可以位于导管的远端,例如垂直于笔或探头。当球囊被激活时,球囊会向组织的方向膨胀并填满贮存器。这至少完成了3件事:首先,用充气的球囊轻轻地将笔尖从组织上提起,确保组织没有损伤。这是为了确保探头在分析组织被确定为“正常”的情况下保持无损和生物相容性。其次,它密封贮存器内的溶剂液滴,防止采样窗口后的脂质泄漏或吸收。第三,它在导管的末端形成密封,这将使液滴更有效地转移到质谱仪上。
B.导管系统
在一些情况下,当探头被并入腹腔镜/内窥镜装置时,贮存器包括使用多腔导管,例如,具有用于沉积水和氮气的凹陷端口。在提取期间,贮存器也保留了水。多腔导管可以例如使用多腔挤压来形成,这在本领域中是众所周知的。已经证明,这些导管可用于腹腔镜手术中的任何套管,最常见的直径为5mm和10mm。这项技术与机器人操作兼容,诸如Intuitive Surgical的达芬奇机器人外科系统。腹腔镜/内窥镜探头可通过辅助端口或机械臂方便地集成到当前外科手术室中。越来越小和越来越大的直径也可用于连接任何现有的导管、套管以及针/活检引导件。
C.阀门系统
在进一步的方面,实施例的探头系统可以包括另外的阀门。例如,微型电磁阀可以安装在每个导管上,例如在取样探头的远端。这些将由arduino、微控制器或信号单独控制。在一些情况下,阀门操作是自动化的。在其他情况下,它可以手动控制。在一些方面,阀门位于密封导管的溶剂导管内壁。因此,通过使用这些阀门,采样操作中只能使用两个甚至一个导管。例如,输送溶剂的管道和将液滴转移到质谱仪的回流管道。可以植入更多的微型螺线管来实现更多的控制。例如,三个或四个微型螺线管可以插入实施例的探头中。
D.进一步的外科系统特征
在一些方面,医疗器械需要通过难以维持手动控制的身体区域。一种解决方案是使用内窥镜导管,但与手持设备相比,这些导管往往不太精确。进一步的控制可以通过使用机器人工具来实现,这些工具的功能几乎相同,有时甚至比配备传统手术刀的医生更好。本实施例的腹腔镜/内窥镜探头的另一个特征是可由镊子、机器人工具或腹腔镜抓取器抓取的“翼”。这将允许探测器在不牺牲分辨率或敏感度的情况下,以多种方式使用。在一些方面,翼本身是从平行于所述导管的导管外部逐渐倾斜的突出物。它的纹理为抓取机构提供额外的牵引力。
在进一步的方面,跟踪探头可以与该设备集成,以显示和记录组织样本的分析位置,以便更好地帮助外科医生在术中或其他情况下定位采样点。对于术中超声,可利用设备上的超声发射器在取样时显示探头。或者,探头可以与基于射频技术的跟踪装置集成,例如,Biosense Webster Carto系统。通过这种方法,探头可以在任何成像方式上显示设备/采样位置,如术中超声(US)/计算机断层扫描(CT)/磁共振成像(MRI)/光学相干断层扫描(OCT)。
在一些进一步的方面,可以标记由实施例的探头评估的组织部位。例如,被癌细胞和正常细胞吸收的染料,它会标记探头的放置位置。在一些方面,可使用导管中另外的导管或多腔导管递送化学染料。追踪染料的另一种传递方式是将其溶解在我们用来分析组织的溶剂中。例如,在溶剂中使用染料的一个优点是它将直接与组织样本的采集位置相关,而不是与周围区域相关。当然,在这方面,化学染料会出现在质谱中,并且必须与样本中的生物分子区分开来。在一些方面,使染料可见可能是有用的(例如,在白色手术室灯光下)。在其他方面,该染料可以是荧光染料。在另一方面,笔尖可以涂上外科染料,然后印在组织上以跟踪分析的区域。同样,如上所述,可以使用跟踪方法来虚拟地映射所分析的组织部位。例如,可以将RF发射器集成到探头中,以便跟踪空间位置。因此,在一些方面,染料(或探头跟踪)可用于跟踪组织的分析区域。在一些方面,分析的组织可以绘制图表以提供二维和三维空间成像。
在进一步的方面,探测系统可以包括过滤器。例如,过滤器可以防止生物组织进入导管。例如,过滤网系统可并入设备内,以防止较小的组织体、蛋白质聚集体或凝固的细胞团进入。这种网可以放在开口处,与组织接触,或者放在探头较高的位置,这样就不会发生组织接触。在一些方面,这种过滤网包括小于约1.0mm、0.5mm、0.25mm或0.1mm的平均孔径。由于固体物质会损坏质谱仪,这样的过滤系统可以延长仪器寿命,而不会对检测到的信号产生负面影响。
在更进一步的方面,实施例的内窥镜/腹腔镜探头与微控制器、用户接口和/或将使用适当软件操作的相关硬件集成。
在一些进一步的情况下,将包括一个灯,例如LED,以向用户提供视觉反馈,例如,指示探头已准备好取样、正在取样或需要更换/修理。例如,还可以使用声音反馈来让用户知道设备所处的处理步骤(例如,由于物理提示在腹腔镜下可能不可用)。用户界面系统也可以与设备集成,例如在脚踏板和探头外壳上的按钮上。
Ⅲ.测定方法
在一些方面,本公开提供了通过识别质谱谱图的特定模式来确定患病组织(例如肿瘤组织)的存在或检测生物样本的分子特征的方法。用于分析的生物样品可以来自动物、植物或任何与生物分子或有机体接触的材料(活的或非活的)。生物样品可以是体内(如例如手术中)或离体的样本。
通过实施例的方法获得的谱图可以对应于例如来自分析的生物样品或组织部位的蛋白质、代谢物或脂质。这些模式可以通过使用质谱仪测量特定离子的存在来测定。可与该装置联接的电离方法的一些非限制性实例包括化学电离、激光电离、常压化学电离、电子电离、快原子轰击、电喷雾电离、热电离。另外的电离方法包括电感耦合等离子体源、光电离、辉光放电、场解吸、热喷涂、硅的解吸/电离、实时直接分析、二次离子质谱、火花电离和热电离。
特别地,本方法可应用于或联接到环境电离源或用于获得质谱数据的方法,诸如提取环境电离源。提取环境电离源的方法是在这种情况下液体提取过程动态遵循电离的方法。提取环境电离源的一些非限制性实例包括气流辅助解吸电喷雾电离(AFADESI)、实时直接分析(DART)、解吸电喷雾电离(DESI)、电荷交换解吸电离(DICE)、电极辅助解吸电喷雾电离(EADESI)、电喷雾激光解吸电离(ELDI)、静电喷雾电离(ESTASI)、喷射解吸电喷雾电离(JeDI)、激光辅助解吸电喷雾电离(LADESI)、激光解吸电喷雾电离(LDESI)、基质辅助激光解吸电喷雾电离(MALDESI)、纳米喷雾解吸电喷雾电离(nano-DESI)或传输模式解吸电喷雾电离(TM-DESI)。
与许多质谱方法一样,可以通过修改收集或溶剂条件(诸如溶剂成分、pH值、气体流速、施加电压和影响样本溶液电离的其他方面)来优化电离效率。特别地,本方法考虑使用与人类问题相容的溶剂或溶液。一些可用作离子化溶剂的溶剂的非限制性实例包括水、乙醇、甲醇、乙腈、二甲基甲酰胺、酸或其混合物。在一些实施例中,该方法考虑乙腈和二甲基甲酰胺的混合物。可以改变乙腈和二甲基甲酰胺的量,以增强从样品中提取分析物的能力,并增加样品的电离度和挥发性。在一些实施例中,该组合物包含约5:1(v/v)二甲基甲酰胺:乙腈到约1:5(v/v)二甲基甲酰胺:乙腈,诸如1:1(v/v)二甲基甲酰胺:乙腈。然而,在优选实施例中,根据实施例使用的溶剂是药学上可接受的溶剂,诸如无菌水或缓冲水溶液。
Ⅳ.实例
包括以下实例以说明本发明的优选实施例。本领域技术人员应该理解,以下实施例中公开的技术代表本发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术,因此可以被视为构成本发明实践的优选模式。然而,根据本公开,本领域技术人员应当理解,在不脱离本发明的精神和范围的情况下,可以对所公开的特定实施例进行许多改变并且仍可获得相同或相似的结果。
实例1-用于质谱分析设计的微创探头
开发的系统包括三个主要部分:1)注射器泵,其程序设计为使用受控流率输送离散溶剂体积;2)集成到双向夹管阀门的管道系统,用于受控溶剂和气体输送;3)用于生物组织直接取样的探头尖端。管系统和探头尖端也集成到微创外科设备中,诸如用于腹腔镜或内窥镜手术的套管或导管。为了最大限度地减少组织损伤、最大限度地提取组织分析物以及最大限度地向质谱仪传递溶剂,对系统的若干迭代进行了探索和优化。图1示出了用于分析生物组织的微创器械的一个实例的示意图。注射泵通过微PTFE管将溶剂和气体送入微创探头。探头与样本保持接触,在与组织的相互作用过程中保留溶剂。尖端采用3D打印技术制造,由生物相容性聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成。探头有三个主要端口:一个用于输入管道系统,一个用于气体输送的中心端口,第三个用于输出管道系统。所有的端口都在一个小的贮存器里设置了禁令,在那里液滴被保留并暴露在组织样本中一段受控的时间,这样可以有效地提取分子。贮存器的大小决定了装置的空间分辨率。将10μL的溶剂体积暴露于组织样本中。图2示出了三个导管。所用的三个导管均由聚四氟乙烯(PTFE)制成,该材料也具有生物相容性。来自注射泵的管用于将溶剂从注射泵输送到探头尖端,而另一个微型PTFE管用于将惰性气体(N2或CO2)输送到探头尖端。该气体有三个主要用途:1)分析前组织干燥;2)通过接触组织样品防止由于质谱仪真空而导致的溶剂间隙;3)通过较宽的PTFE管帮助溶剂从组织运输到质谱仪。较大的PTFE管直接连接到质谱仪的入口,从而利用质谱仪真空系统的正压力将液滴从贮存器驱动到质谱仪入口进行电离。图9显示了微创探头的示意图,其包括探头尖端的示意图,包括树形导管和底部的贮存器(标记为4)。图3显示了两种可能的设备来放置微创探头。图中所示的套管有进入顶部的气体和溶剂管,以及通向质谱仪的管。探头从套管底部露出。也可以使用套管针将探头引入体腔。图10描绘了模拟腹腔镜子宫手术,并显示微创探头可以由镊子控制。如图4所示,可以使用阻挡微创探头孔的挡板系统。4.挡板的一个选择是使用一个导管气囊,当导管插入患者体内时,它可以关闭探头尖端,其示意图如图13所示,防止不需要的生物材料进入设备,包括管腔和管道。分析开始后,挡板可禁止内源性生物流体进入质谱仪,从而防止结果受到污染。关闭挡板可以防止过量的氮气和水进入人体。在微创手术所需的加长探头中使用挡板,可能有助于减轻手术期间可能会影响信号采集内脏运动和器官系统的不可预测和经常混乱的性质。微创质谱探头还可能包括与上述样本真空分离的真空管。第二个真空管的目的是在分析过程中轻轻地将探头的尖端固定在组织上。
设备操作所涉及的时间事件是自动化的,并由与Arduino系统和两个双向夹管阀门通信的软件精确控制。当低于300μL/min时,向泵发送脉冲以注入溶剂两秒并停止,从而在微创探头贮存器中产生10μL液滴时,所有夹管阀门关闭,直到该过程开始。气体和质谱管在夹管阀门处关闭,使贮存器中的溶剂与组织相互作用三秒以提取分子。控制气体和质谱管的夹管阀门同时打开,允许液滴转移到质谱仪进行电离和分子分析。向泵发送脉冲,将溶剂再注入12秒然后停止,以将所有提取的分子完全驱动到质谱仪中。气体和质谱管再打开20秒,让质谱管中的所有溶剂进入质谱仪。总分析时间为37秒。
可以在各种方法的分析之间洗涤探头。一般用无菌水擦拭探头尖端。另一有助于洗涤步骤的设计是一种可伸缩的设计,它可以洗涤探头的外部,而无需从患者身上移除装置(图15)。设计包括一个阀门室,阀门室位于开口处,以保持水和气体密封。当尖端位于洗涤室内时,一根包含探头尖端、水和气体导管的长管只会横切顶部的阀门,但当尖端伸入患者环境时,它会穿过两个阀门。在手术过程中,当探头尖端、管或两者都受到污染后,探头将撤回洗涤室。水管可以位于洗涤室内,并指向上方,提供强大的清洗溶剂喷射。真空管的两个位置将位于第一和第二阀门上方,以清除脏溶剂。放置在第一阀门上方的真空管是一个应急管,以防水冲破第一阀门屏障。整个系统将顺利地安装在套管内部,并且可展开探头将位于系统内部。在清洗过程中,位于探头内部的真空也将工作,将冲洗管子直到洗涤干净。
实例2-分子谱图和分析
本文描述的系统通过将传输管直接连接到质谱仪入口来运行,用于将含有溶剂的分析物传输到质谱仪以进行分子分析。该装置大大简化了操作细节,并排除了电离源的使用。探头与组织相互作用后,溶剂被输送到质谱仪并直接注入,无需另外的电离源。由于该系统是全自动的,因此每10μL的溶剂液滴分别被输送到入口,质谱仪的工作不会对其性能产生任何影响。以这种方式获得丰富的分子信息,类似于从其他溶剂提取环境电离技术(诸如解吸-电喷雾电离)观察到的信息。电离机理可能与入口电离相似。对于入口电离方法,电离发生在大气和真空之间的入口压降区。由于微创外科技术的本质,管的直径和长度至关重要。如图5-8所示,测试了不同长度的管,以将溶剂输送至质谱仪。
图5-8示出了在整个分析期间从小鼠脑切片获得的同时使用1.5米到4.5米的管长度的总离子色谱图。所有病例均观察到丰富的分子谱图。在4.5米长的管中,分子谱图很容易在水的背景信号上建立(图11)。图12示出了使用1.5mm至4.0mm导管获得的总离子色谱图。同样,在每个导管尺寸下观察到丰富的分子谱图。为了进一步证明微创探头在质谱分析中的应用,对人肺组织进行了分析(图14),并生成了一个稳健的分子谱图。
微创质谱探头产生的分子谱图也可用于组织分型。使用微创质谱探头对一系列组织样本进行评估,总的准确度为98.55%(表1)。
表1.组织分型结果。
真 | 甲状腺 | 淋巴 | 甲状旁腺 | 乳腺 | 肺 | 卵巢 | 胰腺 |
甲状腺 | 42 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
淋巴 | 0 | 26 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
甲状旁腺 | 0 | 1 | 62 | 0 | 0 | 0 | 0 |
乳腺 | 0 | 0 | 0 | 29 | 0 | 0 | 0 |
肺 | 0 | 0 | 0 | 0 | 47 | 0 | 0 |
卵巢 | 0 | 1 | 0 | 1 | 0 | 41 | 0 |
胰腺 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 24 |
该系统能够100%准确地识别淋巴、乳腺和肺组织,识别甲状腺和甲状旁腺的准确率在97%到99%之间,识别卵巢的准确率为95.35%,识别胰腺组织的准确率为83.33%。这些组织分型结果是根据表2所示质谱谱图的选定特征产生的。
表2.组织分型的选定特征。
与组织类型的区分类似,微创质谱探头可用于区分正常组织和癌组织。系统预测正常组织的准确率大于89%,预测癌组织的准确率大于91%,如表3所示。
表3.癌组织预测结果。
根据表4所示的选定特征预测这些组织。
表4.用于预测癌组织的选定特征。
为了评估系统性能,对同一组织切片和不同组织切片进行连续分析,以证明系统在样本内和不同样本间具有高度的重复性。
材料和方法。
质谱仪。使用Q Exactive组合型四极杆Orbitrap质谱仪(Thermo Scientific,SanJose,CA)。在m/z 500-1800范围内进行全扫描,其他质谱参数如下:分辨率140000,微扫描2,最大注入时间300ms,毛细管温度350℃,S透镜RF水平100。
生物组织。野生型小鼠脑购自Bioreclamation IVT。从人类组织合作网络和贝勒学院组织库获得62份冷冻人体组织样品,包括乳腺、甲状腺、淋巴结、卵巢和肾脏。样本储存在-80℃的冰箱中。在16μm处用CryoStarTMNX50低温恒温器切片组织切片。在使用前在室温下解冻冷冻组织样品。
统计分析。使用IBM SPSS Statistics 22.0(IBM Corporation,Armonk,NY,USA)进行主成分分析(PCA),揭示数据中的模式。直接使用原始数据进行分析。在700-900的m/z范围内的最高相对强度的10个峰值被用于PCA。典型地,在本结果中使用包含了总方差的85%以上的前三个组分。
实例3-用于手持式和腹腔镜使用的系统自动化
由于微创探头设计中使用的所有材料(PDMS和PTFE)和溶剂(仅水)都是生物相容的,因此该系统很有可能用于腹腔镜和内镜手术中进行实时分析。更重要的是,由于设备的尺寸很小,它可以通过辅助端口或其一个机械臂集成到机器人手术系统中,诸如达芬奇手术系统。在每次分析之间,无论是否进行洗涤/冲洗步骤,都可以在手术过程中快速采集人体体腔的几个区域,并使用分子特征数据库和机器学习算法进行分析。因此,可以实时地为每个采样区域提供诊断结果。该系统可广泛应用于各种肿瘤学和其他外科手术(诸如子宫内膜异位症),需要对组织进行实时表征和诊断。
因此,开发了一种腹腔镜MasSpec笔平台,可用于手动或机器人控制的MIS程序(图16A和16B)。腹腔镜MasSpec笔平台的开发强调了三个主要设计特点:1)遵守腹腔镜环境中使用所需的尺寸和材料规范;2)与手持MasSpec笔类似的性能规范,以确保与先前生成的统计模型兼容;3)集成到自动化软件和图形用户界面,以进行实时数据分析和统计分类。
腹腔镜MasSpec笔的设计符合MIS的功能要求。设计修改允许通过腹腔镜套管针的套管或通过机器人系统的开放端口(通常直径为5mm、8mm或12mm)引入MasSpec笔,同时保持与手持式MasSpec笔类似的操作。手持式MasSpec笔的直径为10mm,这是由3D打印的聚二甲基硅氧烷(PDMS)笔尖的直径决定的。手持式MasSpec笔的尖端设计有三个导管(进水、进气和出水),它们与开放的贮存器流体连通,该贮存器将水滴放置在与组织表面接触的位置(图17A)。在腹腔镜MasSpec笔中,将两个微型聚四氟乙烯(PTFE)管(OD 0.794mm,ID0.339mm)(一个用于进水,另一个用于进气)移植到3D打印的PDMS尖端上(图17B)。笔尖的近端连接到一个更大的PTFE导管(OD 1.59mm,ID 0.794mm)作为出水导管。在这种设计中,笔尖末端的中空空间起到了水滴贮存器的作用,可以根据预期用途定制不同的直径。
在本研究中,贮存器的设计直径为1.5mm、2.7mm和4.0mm,以显示一系列性能。虽然1.5mm以下的贮存器直径可以通过微模压制造,但由于制造能力的限制,没有对其进行测试。此外,目前推荐的实体癌切除术的无癌边缘通常大于1.5mm,诸如基底细胞癌为3mm,乳腺癌为2mm,胃癌为5cm。
为了操作MasSpec笔与体内感兴趣的器官接触,在笔尖上安装了一个抓握翼,为腹腔镜工具(诸如镊子或机械臂)提供一个固定点(图16C)。在任何腹腔镜手术中,器官的进入都是由套管针的位置决定的。腹腔镜MasSpec笔的一个优点是聚合物管系统的灵活性和重量轻。这些特征使得该设备可以通过套管针在x、y和z方向上轻松操作,因为套管的位置与感兴趣的器官有关。在笔尖的近端单侧将3mm长的翼并入3D打印模具中,以避免增加设备的直径。包括翼在内的腹腔镜MasSpec笔的总直径为用于1.5mm和2.7mm贮存器直径尖端的7.5mm,和用于4.0mm贮存器直径尖端的9.5mm;所有部件均适用于普通大小的套管针。
研究了腹腔镜MasSpec笔和质谱仪之间的不同管长度,以供在手术室环境中使用(图18)。考虑到将MasSpec笔插入腹腔镜套管针所需的另外的长度(5-12mm长)、手术室(OR)工作空间的限制以及器械放置在手术无菌区外的需要,对比手持式MasSpec笔使用的管长度(1.5m)更长的管长度进行了测试。与手持式MasSpec笔一样,将笔尖内的水滴与被探测脑组织切片之间的3秒接触时间用于分子提取(图16D)。
采样周期结束后,使用4秒的水冲洗,以促进水滴从笔尖通过PTFE管传输到质谱仪。PTFE管通过柔性硅管直接连接到扩展的、加热的质谱仪传输管(350℃),从而消除了外部电离源的使用。在负离子模式下进行分析。图18A-C示出了用2.7mm腹腔镜MasSpec笔在1.5m、3.0m和4.5m管长度下,从小鼠脑组织的连续切片中获得的质谱。在记录的质谱中观察到类似的模式,显示出各种负电荷离子的高相对丰度,这些负电荷离子被确定为典型地通过MasSpec笔和其他环境电离技术从小鼠脑组织切片中观察到的脂质种类。例如,在小鼠脑灰质的质谱中,观察到高相对丰度的m/z834.529(鉴定为[PS(40:6)-H]')、m/z 885.550(鉴定为[PI(38:4)-H]')和m/z 790.539(鉴定为[PE(40:6)-H]')。
在不同管长下获得的质谱的平均余弦相似性达到0.93(n=12),这表明所获得的分子信息是可重复的,与管长无关(表5)。此外,还测量了每个测试长度的传输时间,对于分别为1.5m、3.0m和4.5m的管长,产生3.8s±0.5s(n=10)、5.8s±0.7s(n=10)和7.5s±0.4s(n=10)(表6)。有趣的是,将管长度从1.5m增加到4.5m导致传输时间加倍,这表明液滴在管道系统中的传输速度是非线性的。在4.5米长的管中,对不同的腹腔镜MasSpec笔贮存器直径(1.5mm、2.7mm和4.0mm)进行了测试,获得了与由于对不同脑组织区域取样而导致的质谱图预期变化相当的性能(图20)。
为了比较腹腔镜MasSpec笔和手持系统的性能,使用先前描述的手持式MasSpec笔的相同尺寸(笔尖直径2.7mm,管长度1.5m)对小鼠大脑的连续组织切片进行分析。在整个m/z范围内(m/z 120-1800,余弦相似=0.88,n=8)和限制m/z范围内(m/z 600-1800,余弦相似=0.92,n=8),从分析的小鼠脑组织切片观察到相似的谱图(图17C)。这些结果表明,尽管在贮存器设计和管长度方面发生了变化,但腹腔镜MasSpec笔的结果与手持式MasSpec笔的结果相当。选择2.7mm贮存器直径和4.5m管长度,用腹腔镜MasSpec笔进行剩余实验。利用这些参数,获得了20秒/点的总测量时间,包括用于组织取样(3秒)、液滴传输(7秒)和液滴电离与分析(~10秒)的时间。
为了方便腹腔镜MasSpec笔的临床应用,开发了一个带有图形用户界面(GUI)的软件,用于实时质谱数据采集、统计分析和结果显示。如之前报道的手持式MasSpec笔,使用脚踏板触发分析工作流。在这里,系统被进一步改进,使得脚踏板也触发了实验室构建的软件(图19A)。使用这种方法,用户在组织分析之前在GUI中选择要评估的组织类型,以便软件正确地选择相应的统计模型进行数据分析。然后,在踏板的激活下,注射器泵被触发,从而在笔尖形成离散的水滴,在那里它与组织相互作用3秒。如前所述,组织接触后,富含提取生物分子种类的液滴通过PTFE管被输送到Orbitrap质谱仪进行电离和质量分析。质谱数据由软件程序连续记录和读取。对所选离子的三个强度最高的质谱进行平均和预处理以进行统计分析。然后,使用先前由Lasso方法建立的统计模型,使用从组织学验证的组织中获得的数据进行预测,并在GUI中报告组织成为癌症的概率。
为了测试组织诊断集成系统的性能,按照上述工作流程分析了12个人卵巢组织样本,包括7个正常组织和5个高级别浆液性癌(HGSC)。之前为卵巢癌诊断建立的统计分类器被纳入软件中,并使用脚踏板激活触发分析。对于较大的组织样品,分析了同一组织样本中的几个区域,共得到24个分析。获得的质谱显示了与我们之前描述的正常和癌性卵巢组织相似的特征性脂质分布(图21)。使用软件和统计分类器,报告每个分析区域的癌症概率和相关预测诊断。
根据通过统计分类器生成的截止值,预测概率大于0.51的样本称为“癌症”,而预测概率小于0.51的样本称为“正常”。如表7所示,由于分析的五个癌症样本的所有区域都被归类为癌症,因此对癌症诊断的敏感性达到了100%。在分析的两个区域中,七个正常组织样本(On_164b)中的一个被误分类为癌症,而在样本ON_135a分析的四个区域中的一个被分类为癌症,产生80%的选择性。总的来说,预测性诊断与病理诊断的符合率为87.5%。
最后,使用腹腔镜模拟人体模型测试腹腔镜MasSpec笔。腹腔镜MasSpec笔通过8mm套管插入人体模型。在人体模型内,使用腹腔镜镊子操作MasSpec笔,同时使用摄像机传输腹部器官的图像和/或视频,并在手术过程中指导腹腔镜MasSpec笔的放置(图19B)。正常人和癌症人的卵巢样本被放置在模拟器官的顶部,通过人体模型内的腹腔镜切口进入,然后使用腹腔镜设备进行分析。用镊子抓取工程化翼,并正确引导笔到达组织表面进行分析。如前所述,使用脚踏板自动激活分析。对正常卵巢组织(癌概率=0.37)进行“正常”的预测性诊断,对卵巢癌组织(癌概率=0.68)进行“癌”的预测性诊断,与样本的组织病理学诊断一致。总的来说,腹腔镜MasSpec笔在模拟人体模型中显示出了强大的性能,表明其在MIS程序中的兼容性。
表5.腹腔镜MasSpec笔(2.7mm贮存器直径)获得的质谱与不同管长度之间的余弦相似性结果。
表6.液滴从笔尖到质谱仪通过不同段长度的传输时间。
液滴传输时间 | ||
平均值(n=10) | 相对标准偏差(RSD) | |
1.5米 | 3.8 | 12.4% |
3.0米 | 5.8 | 11.5% |
4.5米 | 7.5 | 5.2% |
表7.用腹腔镜MasSpec笔(2.7mm贮存器直径,管长度4.5m)分析人卵巢组织标本的病理诊断、软件预测诊断和癌症概率。
综上所述,腹腔镜MasSpec笔是为MIS提供近实时诊断信息的自动化设备。本文介所述的腹腔镜MasSpec笔的独特设计和特点,满足了手工和机器人MIS的许多要求。与手持版本相比,从小鼠脑组织切片中获得了相似的分子模式。不同的笔尖直径和管长度也被测试用于不同的临床需要。最后,开发了定制的实验室软件,为组织分析和诊断反馈提供了全自动化的工作流程。这项技术可能是MIS的补充工具,它可以加快临床工作流程,提高手术效果。
实例4-材料和方法
腹腔镜MasSpec笔设计。从直径分别为1.5mm、2.7mm和4.0mm的PDMS中创建了三种不同的腹腔镜/机器人MasSpec笔尖。抓取翼是单方面内置的,以尽量减少整体横截面。两个微型PTFE管(OD 0.794mm,ID0.339mm)被移植到PDMS尖端末端附近的内部。微型PTFE管端接在贮存器上方2毫米处,以避免组织相互作用。来自Dow Coming(Midland,MI)的PDMS混合解决方案被塑造成由Stratasys Upprint SE Plus 3D打印机(Eden Prairie,Minnesota,USA)制作的负片。PTFE管购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MI,USA),而硅胶管购自SaintGobain(Tygon#3550,Malvern,PA,USA)。这种设计允许在PDMS尖端末端形成水滴,水滴与组织相互作用,通过相扩散提取细胞脂质和小代谢物。整个系统通过Karl Storz(Tuttlingen,Germany)的10mm HiCap 30107H5套管针插入腹腔镜模拟人体模型中。在模拟人体模型中,使用无线内窥镜IP67蛇形摄像机拍摄图像。
组织样本。根据批准的机构审查委员会协议,从人类组织合作网络(CHTN)(Charlottesville,VA)获取人体组织。小鼠大脑取自BioIVT(Westbury,NY,USA)。分析前将组织样本解冻至室温。
质谱分析。实验是在Q ExactiveTM组合型四极杆OrbitrapTM质谱仪(ThermoFisher Scientific,San Jose,CA,USA)上进行的。采用HPLC级水进行分析。全扫描模式在m/z 120到1800范围内进行,分辨率为140000,毛细管温度设置为350℃,S透镜射频电平设置为100。
统计分析和软件工具。在以前的工作中,我们解释了使用Lasso生成统计模型的统计分析过程。将实验室建立的桌面软件设计用于实时预测和显示诊断结果。踏板通过Arduino微控制器激活后,质谱仪中的数据将使用MSFileReader(Thermo FisherScientific)和在GitHub上开源的MSFileReader-Python绑定包进行连续读取。对所选离子的三个最高强度连续质谱进行平均和预处理,以进行统计预测。然后,使用先前安装的Lasso模型,生成预测并通过GUI显示给用户。
实例5-使用MasSpec笔表征材料
MasSpec笔还用于从各种材料中获取样本,以进一步评估笔的使用是环境中表征材料的食品和法医样本。结果表明,在实施例的质谱分析中有广泛的进一步应用。例如,图22-25和30所示的研究已证实效应谱可以从包括肉、鱼和水果在内的各种食品中产生。这些光谱可用于准确地表征样本的源材料,诸如正在评估的肉或鱼类型。在这些研究中,肉和鱼(鲑鱼、鳟鱼、大西洋鳕鱼和鳕鱼)的样本是从当地超市(Central Market,Austin,TX)获得的。样本储存在冰箱(4℃)中,直到在室温下进行分析。使用联接到MasSpec笔的LTQOrbitrap XL质谱仪(Thermo Scientific)进行分析。对样本的分析区域进行标记,以防止重复分析。收集每个样品的分子谱图,用最小绝对收缩和选择操作者(Lasso)建立分类模型。利用Lasso对肉类型预测标记进行了识别,并建立了未知样品识别的分类模型。
用MasSpec笔分析肉样本以及每种鱼类的5个样本。进行初步实验,优化了MasSpec笔的最佳提取和传输参数。在负离子模式下,实现了对甘油磷酸肌醇、甘油磷酸丝氨酸、甘油磷酸乙醇胺等多种甘油磷脂的检测。除GP外,还观察到小代谢物、神经酰胺等鞘脂(SP)和花生四烯酸、油酸等游离脂肪酸(FA)。尽管质谱很复杂,但得到的谱图显示了每个肉样本离子丰度特性的趋势。然后施加统计分析方法识别每种肉型的预测标记,并建立和评估用于肉型预测的分类模型的性能。这些分析表明,在正确识别源肉样本方面具有很高的准确性。事实上,这些方法非常敏感,甚至可以区分草饲和谷饲肉类产品(图24)。因此,实施例的方法可用于认证消费品,诸如肉和鱼,否则将难以准确和快速地认证。
这些方法同样可用于检测和量化材料中的化合物含量。例如,在法医样本的情况下,可以使用MasSpec笔采集的样本准确地测定非法药物的数量(见图26和27)。同样,已显示方法在检测源材料中农药的存在方面是有效的(见图28-29)。因此,可以有效地施加实施例的方法来表征广泛的材料以及测定和量化材料中感兴趣化合物的存在。
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鉴于本公开,可以在不进行过度实验的情况下进行和执行本文所公开和要求保护的所有方法。尽管已经根据优选实施例描述了本发明的组合物和方法,但是对于本领域技术人员而言将显而易见的是,在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下,可以对本文所述的方法和对本文所述方法的步骤或对本文所述方法的步骤顺序应用改变。更具体地,将显而易见的是,在化学和生理上均相关的某些药剂可以代替本文所述的药剂,同时将获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有此类类似替代和修改都被认为落入由所附权利要求所限定的本发明的精神、范围和概念内。
Claims (173)
1.一种制备用于质谱分析的样本的装置,所述装置包括:
腔室,所述腔室包含溶剂;
气体供应;
质谱仪;
探头,所述探头包括贮存器、第一导管、第二导管和第三导管,其中:
所述第一导管与所述腔室流体连通;
所述第二导管与所述气体供应流体连通;并且
所述第三导管与所述质谱仪流体连通。
2.根据权利要求1所述的装置,其中所述探头是手术器械的套管,或包含在手术器械的套管中。
3.根据权利要求2所述的装置,其中所述手术器械是腹腔镜。
4.根据权利要求2所述的装置,其中所述手术器械是套针。
5.根据权利要求2所述的装置,其中所述手术器械是活检引导件。
6.根据权利要求2所述的装置,其中所述手术器械是多腔导管。
7.根据权利要求2所述的装置,其中所述手术器械是手动操作的。
8.根据权利要求2所述的装置,其中所述手术器械是机械的。
9.根据权利要求1所述的装置,其中所述气体供应是加压气体供应。
10.根据权利要求1所述的装置,其中所述气体供应包括空气。
11.根据权利要求1所述的装置,其中所述气体供应包括CO2或N2。
12.根据权利要求1所述的装置,其中所述贮存器是在所述第一导管、所述第二导管或所述第三导管中形成的空间。
13.根据权利要求12所述的装置,其中所述贮存器是在所述第一导管中形成的空间。
14.根据权利要求1所述的装置,其中所述贮存器包含0.01ml至1.0ml的流体。
15.根据权利要求2所述的装置,其中所述手术器械包括可抓握的鳍片。
16.根据权利要求2所述的装置,其中所述手术器械包括可通过成像检测到的追踪探头。
17.根据权利要求16所述的装置,其中所述成像包括视觉、荧光、US、CT、MRI或OCT成像。
18.根据权利要求16所述的装置,其中所述腔室或所述第三导管包括筛网过滤器。
19.根据权利要求1所述的装置,其中所述探头包括探头远端,并且所述探头远端包括挡板,所述挡板可闭合以防止流体传递到所述探头外部。
20.根据权利要求19所述的装置,其中所述挡板是可膨胀以防止流体传递到所述探头外部的球囊。
21.根据权利要求19所述的装置,其中所述球囊可用气体或液体进行膨胀。
22.根据权利要求19所述的装置,其中所述挡板是可闭合以防止流体传递到所述探头外部的门。
23.根据权利要求19所述的装置,其中所述挡板配置为可多次打开和闭合。
24.根据权利要求19所述的装置,其中所述挡板是手动控制的。
25.根据权利要求19所述的装置,其中所述挡板是机械控制的。
26.根据权利要求1所述的装置,其中所述第一导管、所述第二导管或所述第三导管的长度大于1米。
27.根据权利要求1所述的装置,其中:
所述第一导管与所述第三导管流体连通;
并且所述第二导管与所述第三导管流体连通。
28.根据权利要求1所述的装置,其中所述第一导管设置在所述第三导管内。
29.根据权利要求1所述的装置,其中所述第二导管设置在所述第三导管内。
30.根据权利要求1所述的装置,其中所述第一导管和所述第二导管设置在所述第三导管内。
31.根据权利要求30所述的装置,其中:所述探头包括探头远端;
所述第一导管包括第一远端;
所述第二导管包括第二远端;
所述第三导管包括第三远端;并且
所述第一远端和所述第二远端位于所述第三导管内。
32.根据权利要求31所述的装置,其中所述第三远端位于所述探头内。
33.根据权利要求31所述的装置,其中:
所述第一远端位于距所述探头远端第一距离处;
所述第二远端位于距所述探头远端第二距离处;
所述第三远端位于距所述探头远端第三距离处;
所述第一距离大于所述第三距离;
并且所述第二距离大于所述第三距离。
34.根据权利要求31所述的装置,其中所述第一远端和所述第二远端在所述第三导管的样本收集区的近端终止。
35.根据权利要求34所述的装置,其中所述样本收集区位于所述第一远端和所述第二远端与所述第三远端之间。
36.根据权利要求35所述的装置,其中所述样本收集区经由所述第三导管与所述质谱仪流体连通。
37.根据权利要求31所述的装置,所述装置进一步包括控制系统,所述控制系统配置为控制:
溶剂流从所述腔室通过所述第一导管到达所述第一远端;
气体流从所述气体供应通过所述第二导管到达所述第二远端;
以及样本流通过所述第三导管到达所述质谱仪。
38.根据权利要求1所述的装置,所述装置进一步包括第四导管,其中:
所述第一导管、所述第二导管和所述第三导管各自与所述第四导管流体连通。
39.根据权利要求38所述的装置,所述装置进一步包括:
第一阀门,所述第一阀门配置为控制所述第一导管与所述第四导管之间的流动;以及
第二阀门,所述第二阀门配置为控制所述第二导管与所述第四导管之间的流动。
40.根据权利要求39所述的装置,所述装置进一步包括第三第一阀门,所述第三阀门配置为控制所述第三导管与所述第四导管之间的流动。
41.根据权利要求1所述的装置,其中所述气体供应向所述探头提供空气、氮气或二氧化碳。
42.根据权利要求1所述的装置,其中所述气体供应是加压气体供应。
43.根据权利要求42所述的装置,其中所述加压气体供应以介于0.1psig与5.0psig之间的压力向所述探头提供气体。
44.根据权利要求42所述的装置,其中所述加压气体供应以介于0.5psig与2.5psig之间的压力向所述探头提供气体。
45.根据权利要求42所述的装置,其中所述加压气体供应以小于100psig的压力向所述探头提供气体
46.根据权利要求1所述的装置,其中所述溶剂包括水。
47.根据权利要求1所述的装置,其中所述溶剂包括无菌水。
48.根据权利要求1所述的装置,其中所述溶剂包括乙醇。
49.根据权利要求1所述的装置,其中所述溶剂包括含水混合物,所述含水混合物包含1%至25%的乙醇。
50.根据权利要求1所述的装置,其中所述探头包括追踪设备或染料以追踪所述探头的位置。
51.根据权利要求22所述的装置,所述装置进一步包括控制系统,所述控制系统配置为控制:
溶剂流从所述腔室通过所述第一导管;
气体流从所述气体供应通过所述第二导管;
以及样本流通过所述第三导管到达所述质谱仪。
52.根据权利要求51所述的装置,其中所述控制系统配置为:
将所述溶剂流控制在介于200微升/分钟与5000微升/分钟之间的流率达介于1秒与3秒之间的时间段;
将所述气体流控制在介于0.1psig与15psig之间的流率达介于5秒与50秒之间的时间段;
控制所述样本流达介于5秒与50秒之间的时间段。
53.根据权利要求51所述的装置,其中所述控制系统包括启动溶剂流的程序。
54.根据权利要求1所述的装置,其中所述质谱仪与可提供样本分析的计算机进行电子通信。
55.根据权利要求54所述的装置,其中所述计算机提供所述样本分析的视觉或听觉读出。
56.根据权利要求1所述的装置,所述装置进一步包括废液容器,所述废液容器与所述第三导管流体连通。
57.根据权利要求56所述的装置,所述装置进一步包括阀门,所述阀门配置为使流体从所述第三导管分流到所述废液容器。
58.根据权利要求56所述的装置,所述装置进一步包括泵,所述泵配置为去除所述废液容器中的内容物。
59.根据权利要求1所述的装置,所述装置进一步包括泵,所述泵与所述第三导管流体连通。
60.根据权利要求59所述的装置,其中所述泵配置为提高所述第三导管内的所述内容物的速率。
61.根据权利要求1所述的装置,所述装置进一步包括加热元件,所述加热元件联接至所述第三导管。
62.根据权利要求61所述的装置,其中所述加热元件是加热丝。
63.根据权利要求1所述的装置,所述装置进一步包括电离设备,所述电离设备与所述第三导管流体连通。
64.根据权利要求63所述的装置,其中所述电离设备是电喷雾电离(ESI)设备。
65.根据权利要求63所述的装置,其中所述电离设备是大气压化学电离(APCI)设备。
66.根据权利要求63所述的装置,其中所述电离设备用于在质谱仪的入口近侧形成喷雾。
67.根据权利要求1所述的装置,其中所述第三导管不直接联接到所述质谱仪。
68.根据权利要求1所述的装置,所述装置进一步包括文丘里(venturi)设备,所述文丘里设备与所述第三导管流体连通。
69.根据权利要求1所述的装置,其中所述装置不包括用于施加超声能或振动能的设备。
70.一种评定来自受试者的组织样本的方法,所述方法包括:
(a)通过手术器械的套管将固定或离散体积的溶剂施加到所述受试者的组织部位;
(b)收集所述施加的溶剂以获得液体样本;以及
(c)对所述样本进行质谱分析。
71.根据权利要求70所述的方法,其中不将所述固定或离散体积的溶剂作为喷雾施加。
72.根据权利要求70所述的方法,其中将所述固定或离散体积的溶剂作为液滴施加。
73.根据权利要求70所述的方法,其中所述手术器械是腹腔镜。
74.根据权利要求70所述的方法,其中所述手术器械是套针。
75.根据权利要求70所述的方法,其中所述手术器械是活检引导件。
76.根据权利要求70所述的方法,其中所述手术器械是手动操作的。
77.根据权利要求70所述的方法,其中所述手术器械是机械的。
78.根据权利要求70所述的方法,所述方法进一步包括将染料施加到所述组织部位。
79.根据权利要求70所述的方法,所述方法进一步包括对所述组织部位进行成像。
80.根据权利要求79所述的方法,其中所述成像包括视觉、荧光、US、CT、MRI或OCT成像。
81.根据权利要求70所述的方法,其中所述套管包括在具有探头远端的探头中,并且所述探头远端包括挡板,所述挡板可闭合以防止流体从所述探头的所述套管中流出。
82.根据权利要求81所述的方法,其中所述挡板是可膨胀以防止流体传递到所述探头外部的球囊。
83.根据权利要求82所述的方法,其中所述球囊可用气体进行膨胀。
84.根据权利要求81所述的方法,其中所述挡板是可闭合以防止流体传递到所述探头外部的门。
85.根据权利要求70所述的方法,其中使用小于100psig的压力施加所述固定或离散体积的溶剂。
86.根据权利要求70所述的方法,其中使用小于10psig的压力施加所述固定或离散体积的溶剂。
87.根据权利要求70所述的方法,其中使用机械泵施加所述固定或离散体积的溶剂以使所述溶剂移动通过溶剂导管。
88.根据权利要求70所述的方法,其中收集所述施加的溶剂包括施加负压以将所述样本拉入收集导管和/或施加气压以将所述样本推入收集导管。
89.根据权利要求70所述的方法,其中收集所述施加的溶剂包括施加负压以将所述样本拉入收集导管并且施加正压以将所述样本推入收集导管。
90.根据权利要求88所述的方法,其中通过与所述收集导管分开的溶剂导管施加所述溶剂。
91.根据权利要求90所述的方法,其中通过与所述溶剂导管和所述收集导管分开的气体导管施加所述气压。
92.根据权利要求88所述的方法,其中施加气压以将所述样本推入收集导管包括施加小于100psig的压力。
93.根据权利要求70所述的方法,其中所述方法不对所述组织产生可检测到的物理损伤。
94.根据权利要求70所述的方法,其中所述方法不涉及向所述组织施加超声能或振动能。
95.根据权利要求70所述的方法,其中所述溶剂是无菌的。
96.根据权利要求70所述的方法,其中所述溶剂是药学上可接受的制剂。
97.根据权利要求96所述的方法,其中所述溶剂是水溶液。
98.根据权利要求97所述的方法,其中所述溶剂是无菌水。
99.根据权利要求97所述的方法,其中所述溶剂基本上由水组成。
100.根据权利要求97所述的方法,其中所述溶剂包含约1%至20%的醇。
101.根据权利要求100所述的方法,其中所述醇包括乙醇。
102.根据权利要求70所述的方法,其中所述溶剂的离散体积介于约0.1μL与100μL之间。
103.根据权利要求102所述的方法,其中所述溶剂的离散体积介于约1μL与50μL之间。
104.根据权利要求70所述的方法,其中在所述施加步骤之后介于0.1秒与30秒之间收集所述施加的溶剂。
105.根据权利要求104所述的方法,其中在所述施加步骤之后介于1秒与10秒之间收集所述施加的溶剂。
106.根据权利要求70所述的方法,其中所述组织部位是经手术评定的内部组织部位。
107.根据权利要求70所述的方法,所述方法进一步包括从多个组织部位收集多个液体样本。
108.根据权利要求107所述的方法,其中所述液体样本是用探头收集的。
109.根据权利要求108所述的方法,其中在所述不同样本的收集之间洗涤所述探头。
110.根据权利要求108所述的方法,其中所述探头是一次性的,并且在所述不同样本的收集之间进行更换。
111.根据权利要求108所述的方法,其中所述探头包括收集尖端,并且所述方法进一步包括在收集所述液体样本之后从所述探头弹出所述收集尖端。
112.根据权利要求107所述的方法,其中所述多个组织部位包括2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个组织部位。
113.根据权利要求112所述的方法,其中所述多个组织部位围绕已经被手术切除的组织区段。
114.根据权利要求113所述的方法,其中所述被切除的组织是肿瘤。
115.根据权利要求70所述的方法,所述方法进一步定义为术中或术后方法。
116.根据权利要求70所述的方法,其中所述质谱法包括环境电离MS。
117.根据权利要求70所述的方法,其中对所述样本进行质谱分析包括测定与所述组织部位对应的谱图。
118.根据权利要求117所述的方法,所述方法进一步包括将所述谱图与参考谱图进行比较以识别包括患病组织的组织部位。
119.根据权利要求118所述的方法,所述方法进一步包括切除被识别为包括患病组织的组织部位。
120.根据权利要求119所述的方法,其中切除组织部位包括激光切除。
121.根据权利要求70所述的方法,其中评定所述组织部位包括确定不同部位处的组织类型。
122.根据权利要求121所述的方法,所述方法进一步包括切除已识别类型的组织。
123.根据权利要求122所述的方法,其中所述识别的组织类型是癌组织。
124.根据权利要求122所述的方法,其中所述识别的组织类型是非癌类型的器官组织。
125.根据权利要求70所述的方法,其中使用根据权利要求1-69中任一项所述的装置来执行所述方法。
126.一种表征材料的方法,所述方法包括:
(a)向所述材料施加固定或离散体积的溶剂;
(b)收集所述施加的溶剂以获得液体样本;以及
(c)对所述样本进行质谱分析以提供表征所述材料的质谱图。
127.根据权利要求126所述的方法,其中所述材料是商品,并且表征所述材料包括识别所述材料。
128.根据权利要求127所述的方法,其中所述商品是食物。
129.根据权利要求128所述的方法,其中所述食物是肉、鱼、食用菌、蔬菜或水果。
130.根据权利要求129所述的方法,其中所述食物是肉或鱼。
131.根据权利要求130所述的方法,其中表征所述材料包括识别构成所述材料的肉或鱼的类型。
132.根据权利要求130所述的方法,其中表征所述材料包括将所述肉识别为来自草饲或谷饲动物的肉。
133.根据权利要求130所述的方法,其中表征所述材料包括将所述鱼识别为来自养殖或野生捕获的鱼。
134.根据权利要求130所述的方法,其中所述肉是羊肉、鹿肉、驼鹿肉、鸡肉、火鸡肉、马肉、猪肉、牛肉、水牛肉或山羊肉。
135.根据权利要求130所述的方法,其中所述鱼是金枪鱼、鲑鱼、鳕鱼、鳟鱼、大比目鱼或海鲈鱼。
136.根据权利要求130所述的方法,其中所述鱼是水生有壳动物。
137.根据权利要求126所述的方法,其中所述材料包括药物。
138.根据权利要求137所述的方法,其中表征所述材料包括量化所述材料中化合物的量。
139.根据权利要求137所述的方法,其中所述化合物是药物。
140.根据权利要求137所述的方法,其中所述药物是止痛药。
141.根据权利要求137所述的方法,其中所述药物包括阿得拉、可卡因、可待因、吗啡、大麻、安非他明、甲基安非他明、MDMA、海洛因、氯胺酮、麦角酸二乙酰胺或羟考酮。
142.根据权利要求137所述的方法,其中所述化合物是杀虫剂或除草剂。
143.根据权利要求142所述的方法,其中所述杀虫剂包括嘧菌酯或莠去津。
144.根据权利要求126所述的方法,其中不将所述固定或离散体积的溶剂作为喷雾施加。
145.根据权利要求126所述的方法,其中将所述固定或离散体积的溶剂作为…施加
146.根据权利要求126所述的方法,其中所述方法是使用包括以下的装置来执行的:
腔室,所述腔室包含溶剂;
气体供应;
质谱仪;
探头,所述探头包括贮存器、第一导管、第二导管和第三导管,其中:
所述第一导管与所述腔室流体连通;
所述第二导管与所述气体供应流体连通;并且
所述第三导管与所述质谱仪流体连通。
147.根据权利要求146所述的方法,其中所述装置是手动操作的。
148.根据权利要求146所述的方法,其中所述装置是机械的。
149.根据权利要求126所述的方法,其中使用小于100psig的压力施加所述固定或离散体积的溶剂。
150.根据权利要求126所述的方法,其中使用小于10psig的压力施加所述固定或离散体积的溶剂。
151.根据权利要求146所述的方法,其中使用机械泵施加所述固定或离散体积的溶剂以使所述溶剂移动通过溶剂导管。
152.根据权利要求146所述的方法,其中收集所述施加的溶剂包括施加负压以将所述样本拉入收集导管和/或施加气压以将所述样本推入收集导管。
153.根据权利要求146所述的方法,其中收集所述施加的溶剂包括施加负压以将所述样本拉入收集导管并且施加正压以将所述样本推入收集导管。
154.根据权利要求152所述的方法,其中通过与所述收集导管分开的溶剂导管施加所述溶剂。
155.根据权利要求154所述的方法,其中通过与所述溶剂导管和所述收集导管分开的气体导管施加所述气压。
156.根据权利要求152所述的方法,其中施加气压以将所述样本推入收集导管包括施加小于100psig的压力。
157.根据权利要求126所述的方法,其中所述方法不对所述材料产生可检测到的物理损伤。
158.根据权利要求126所述的方法,其中所述方法不涉及向所述材料施加超声能或振动能。
159.根据权利要求126所述的方法,其中所述溶剂包含有机组分。
160.根据权利要求126所述的方法,其中所述溶剂是水溶液。
161.根据权利要求160所述的方法,其中所述溶剂是无菌水。
162.根据权利要求160所述的方法,其中所述溶剂基本上由水组成。
163.根据权利要求160所述的方法,其中所述溶剂包含约1%至20%的醇。
164.根据权利要求163所述的方法,其中所述醇包括乙醇。
165.根据权利要求126所述的方法,其中所述溶剂的离散体积介于约0.1μL与100μL之间。
166.根据权利要求165所述的方法,其中所述溶剂的离散体积介于约1μL与50μL之间。
167.根据权利要求126所述的方法,其中在所述施加步骤之后介于0.1秒与30秒之间收集所述施加的溶剂。
168.根据权利要求167所述的方法,其中在所述施加步骤之后介于1秒与10秒之间收集所述施加的溶剂。
169.根据权利要求107所述的方法,其中所述液体样本是用探头收集的。
170.根据权利要求169所述的方法,其中在所述不同样本的收集之间洗涤所述探头。
171.根据权利要求169所述的方法,其中所述探头是一次性的,并且在所述不同样本的收集之间进行更换。
172.根据权利要求126所述的方法,其中所述质谱法包括环境电离MS。
173.根据权利要求126所述的方法,其中使用根据权利要求1-69中任一项所述的装置来执行所述方法。
Applications Claiming Priority (5)
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