CN111560445A - 维氏菌、伊丽莎白菌和摩氏菌qpcr试剂盒及方法 - Google Patents

维氏菌、伊丽莎白菌和摩氏菌qpcr试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种维氏菌、伊丽莎白菌和摩氏菌QPCR试剂盒及方法，针对维氏气单胞菌、伊丽莎白菌和摩氏摩根菌保守序列，分别设计PCR引物和荧光TaqMan探针，构成专门针对三种致病菌的引物组和探针组，组成三重荧光定量PCR检测试剂盒，用于维氏气单胞菌、伊丽莎白菌和摩氏摩根菌的检测，该检测方法具有操作简便、特异性强和重复性好等优点，反应结束即时便可根据扩增曲线判定结果，实现同时检测和鉴别维氏气单胞菌、伊丽莎白菌和摩氏摩根菌三种病原菌，该方法既可以节约时间的成本，又可以减少污染，具有极高的应用价值。

Description

维氏菌、伊丽莎白菌和摩氏菌QPCR试剂盒及方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，涉及水产动物的病原菌分子生物学检验方法及检验试剂盒，特别涉及一种维氏菌、伊丽莎白菌和摩氏菌QPCR试剂盒及方法。
背景技术
维氏气单胞菌(简称维氏菌)是孤菌科、气单胞菌属,普遍存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人类粪便中,对水产动物、畜禽和人类均有致病性，是一种典型人、兽、鱼共患病病原,可引起多种水产动物的败血症和人类腹泻。往往给淡水养殖业造成惨重的经济损失,已引起国内外水产界、兽医学界和医学界学者的高度重视。目前国内外学者对维氏气单胞菌的研究已有了很大进展。其中维氏气单胞菌可单独或与其它致病菌共同感染,引发人类的食物中毒、腹泻、败血症以及局部的伤口感染等病症,影响食品安全。
脑膜败血伊丽莎白菌广泛存在于自然环境中，由它引起的感染在临床上日益增多，尤其是它引起的新生儿脑膜炎常以暴发流行的形式出现，这种致命性细菌能在土壤、淡水及水库中找到，引起水产动物如青蛙的歪头病等。
摩氏摩根氏(简称摩氏菌)是兼性厌氧菌,氧化酶阴性。其菌落呈灰白色不透明的颜色,在琼脂平板上生长时,摩根菌是直线杆状,直径约06-07微米、长约10-17微米。它由周毛鞭毛的方式移动但某些菌株在30℃下没有形成鞭毛。摩氏摩根菌已被报告可以引起人尿路感染,医院内的手术伤口感染、腹膜炎中枢神经系统感染、眼内炎、肺炎、绒毛膜羊膜炎、新生儿败血症、化脓性肌炎、坏死性筋膜炎和关节炎等。且免疫功能低下者糖尿病者、老人或至少有一个严重的潜在疾病的患者能够引起菌血症的发展。有研究统计尿液中的分离率最高,表明摩根菌感染以尿路感染为主。同样，摩氏摩根菌也广泛分布于水产养殖环境中，危害水产养殖动物健康。当养殖环境变化，如水质恶化、气温骤然变化或水生动物因捕捞、转移等促发应激反应，造成的动物体抵抗力下降等，可诱发摩氏摩根菌感染。目前累计有龟、鳖、乌鳢、鲈鱼、胡子鲶、泥鳅等水生动物感染摩氏摩根菌的报道。摩氏摩根菌因其存在垂直传播致人类疾病的风险，在水产动物体内的暴发流行也需引起重视。
建立一种维氏气单胞菌、伊丽莎白菌和摩氏摩根菌三种人畜共患菌的三重QPCR快速检测方法，对于水产中致病菌的筛查意义重大。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种维氏菌、伊丽莎白菌和摩氏菌QPCR试剂盒及方法，克服当前检测维氏气单胞菌、伊丽莎白菌和摩氏摩根菌检测技术方面存在的缺陷和不足，分别提供三种致病菌的检测引物。所述引物可以快速准确的检测维氏气单胞菌、伊丽莎白菌和摩氏摩根菌，一个PCR反应可以同时检测三种病原，快速方便可用于多种致病菌的混合感染的病原鉴定，有利于开展流行病学调查，预防和控制疫情传播。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
本发明所述的维氏菌、伊丽莎白菌和摩氏菌QPCR试剂盒，包括以下引物对和探针：
检测维氏气单胞菌的引物对和探针Aer-ve-Pro，所述检测维氏气单胞菌的引物对包括SEQ ID NO：1所示的上游引物Aer-ve-F和SEQ ID NO：2所示的下游引物Aer-ve-R，所述探针Aer-ve-Pro的序列为SEQ ID NO：7所示；具体如下：
上游引物Aer-ve-F：5’CCCAGTCGAGGGGGATAACTAC 3’；
下游引物Aer-ve-R：5’ACTAGCTAATCCCACCTGGGTTC 3’；
探针Aer-ve-Pro:FAM ACCGCATACGCCCTACGGG BQ1。
检测伊丽莎白菌引物对和探针Eliz-Pro，所述检测伊丽莎白菌引物对包括SEQ IDNO：3所示的上游引物Eliz-F和SEQ ID NO：4所示的下游引物Eliz-R，所述探针Eliz-Pro的序列为SEQ ID NO：8所示；具体如下：
上游引物Eliz-F：5’TTCCGGTTGAGGTAGCGATG 3’；
下游引物Eliz-R：5’TCTGGTCAGTGCTCTACGGA 3’；
探针Eliz-Pro:HEX AGGGGGAACTCACCTGGCAGG BQ1。
检测摩氏摩根菌引物对和探针Mor-Pro，所述检测摩氏摩根菌引物对包括SEQ IDNO：5所示的上游引物Mor-F和SEQ ID NO：6所示的下游引物Mor-R，所述探针Mor-Pro的序列为SEQ ID NO：9所示；具体如下：
上游引物Mor-F：5’GGGAATTGCATCTGATACTGGTCA 3’；
下游引物Mor-R：5’TAGCTCCGGAAGCCACGCCT 3’；
探针Mor-Pro:CY5 GCGGCCCCCTGGACAAAGAC BQ1。
本发明分别根据维氏气单胞菌、伊丽莎白菌和摩氏摩根菌特异性序列，分别进行比对找到特性序列设计PCR引物对、探针和PCR反应程序，从而实现对三种致病菌快速鉴定。所述PCR引物对和探针可用来特异性检测鉴定待测样品中是否含有维氏气单胞菌、伊丽莎白菌和摩氏摩根菌；因此，所述引物对及探针在同时检测或鉴定维氏气单胞菌、伊丽莎白菌和摩氏摩根菌中的应用，以及在维氏气单胞菌、伊丽莎白菌和摩氏摩根菌检测试剂盒中的应用，均应在本发明的保护范围之内。
作为优选的，所述上游引物Aer-ve-F、下游引物Aer-ve-R、探针Aer-ve-Pro、上游引物Eliz-F、下游引物Eliz-R、探针Eliz-Pro、上游引物Mor-F、下游引物Mor-R和探针Mor-Pro的终浓度为2mM到10mM。
作为优选的，所述探针Aer-ve-Pro、探针Eliz-Pro和探针Mor-Pro的5'标记的荧光基团为FAM、VIC、HEX、CY5中的一种，且各个探针的5'标记的荧光基团互不相同；所述探针Aer-ve-Pro、探针Eliz-Pro和探针Mor-Pro的3'标记的淬灭基团为BQ1、BQ2中的一种。
作为优选的，该试剂盒中还包括有酶液和反应缓冲液，所述酶液由DNA聚合酶组成，酶液和反应缓冲液直接采用市售的2X Premix Ex Taq Mix。
本发明还提供了一种维氏气单胞菌、伊丽莎白菌和摩氏摩根菌QPCR试剂盒的检测方法，按照以下步骤进行：
(1)提取待测样本核酸，选用商品化的核酸提取试剂盒；
(2)配置扩增反应体系，体系为：17μL PCR扩增反应液，3μL待检核酸模，体系的总体积为20μL；
(3)荧光定量PCR扩增：将PCR管中配制好的扩增反应体系置于荧光定量PCR仪中进行扩增反应，并进行信号采集；
(4)结果判定：分别在相应通道查看扩增曲线在36个循环以内曲线良好的反应直接判定为阳性，36个循环以后的可直接判定为阴性，同时阳性对照的扩增明显，阴性对照没有扩增。
作为优选的，所述PCR扩增反应液包含10μL的2X Premix Ex Taq Mix，各0.5μL权利要求1中所述的引物和探针，2.5μL的无菌水。
作为优选的，所述扩增反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s后，60℃退火延伸30s并采集荧光信号40个循环。
本发明的优点在于：根据维氏气单胞菌、伊丽莎白菌和摩氏摩根菌基因组的特异性序列，分别进行比对找到特性序列设计PCR引物、探针，可以同时检测维氏气单胞菌、伊丽莎白菌和摩氏摩根菌，该技术可以在一个PCR扩增反应中同时检测三种病原，减少操作流程，检测快速方便。
附图说明
图1是实施例2中维氏气单胞菌和伊丽莎白菌核酸提取后电泳图；
图2是实施例2中摩氏摩根菌核酸提取后电泳图；
图3是实施例2中维氏气单胞菌荧光定量PCR检测曲线图；
图4是实施例2中伊丽莎白菌荧光定量PCR检测曲线图；
图5是实施例2中摩氏摩根菌荧光定量PCR检测曲线图；
图6是实施例2中维氏气单胞菌和伊丽莎白菌PCR产物电泳图；
图7是实施例2中摩氏摩根菌PCR产物电泳图；
图8是实施例2中维氏气单胞菌、伊丽莎白菌和摩氏摩根菌三重荧光定量PCR检测曲线图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
实施例1：
一种维氏气单胞菌、伊丽莎白菌和摩氏摩根菌QPCR试剂盒，包括DNA聚合酶、反应缓冲液，DNA聚合酶和反应缓冲液直接采用市售的2X Premix Ex Taq Mix，可以具有阴性对照，阴性对照为用0.01mol/L、pH7.2的PBS缓冲盐水，还包括以下引物对和探针：
检测维氏气单胞菌的引物对和探针Aer-ve-Pro，所述检测维氏气单胞菌的引物对包括SEQ ID NO：1所示的上游引物Aer-ve-F和SEQ ID NO：2所示的下游引物Aer-ve-R，所述探针Aer-ve-Pro的序列为SEQ ID NO：7所示；具体如下：
上游引物Aer-ve-F：5’CCCAGTCGAGGGGGATAACTAC 3’；
下游引物Aer-ve-R：5’ACTAGCTAATCCCACCTGGGTTC 3’；
探针Aer-ve-Pro:FAM ACCGCATACGCCCTACGGG BQ1。
检测伊丽莎白菌引物对和探针Eliz-Pro，所述检测伊丽莎白菌引物对包括SEQ IDNO：3所示的上游引物Eliz-F和SEQ ID NO：4所示的下游引物Eliz-R，所述探针Eliz-Pro的序列为SEQ ID NO：8所示；具体如下：
上游引物Eliz-F：5’TTCCGGTTGAGGTAGCGATG 3’；
下游引物Eliz-R：5’TCTGGTCAGTGCTCTACGGA 3’；
探针Eliz-Pro:HEX AGGGGGAACTCACCTGGCAGG BQ1。
检测摩氏摩根菌引物对和探针Mor-Pro，所述检测摩氏摩根菌引物对包括SEQ IDNO：5所示的上游引物Mor-F和SEQ ID NO：6所示的下游引物Mor-R，所述探针Mor-Pro的序列为SEQ ID NO：9所示；具体如下：
上游引物Mor-F：5’GGGAATTGCATCTGATACTGGTCA 3’；
下游引物Mor-R：5’TAGCTCCGGAAGCCACGCCT 3’；
探针Mor-Pro:CY5 GCGGCCCCCTGGACAAAGAC BQ1。
探针Aer-ve-Pro在5'端修饰的荧光基团是FAM，3'端修饰的猝灭基团是BQ1；探针Eliz-Pro在5'端修饰的荧光基团是HEX，3'端修饰的猝灭基团是BQ1；探针Mor-Pro在5'端修饰的荧光基团是CY5，3'端修饰的猝灭基团是BQ1；荧光基团可以是FAM、HEX、VIC、CY5中的一种，但是本发明要求的权利不仅限于这4种固定荧光标记，也可以是其他荧光标记如TEXAS、RED等。探针在5'端修饰的荧光基团不同，3'端修饰的猝灭基团可以是相同，也可以是不同。
一种维氏气单胞菌、伊丽莎白菌和摩氏摩根菌QPCR试剂盒的检测方法，按照以下步骤进行：
(1)提取待测样本核酸，选用商品化的核酸提取试剂盒，实验中使用的是青岛英赛特生物科技有限公司细菌核酸提取试剂盒；
(2)配置扩增反应体系，体系为：17μL PCR扩增反应液(具体包括10μL的2X PremixEx Taq Mix，各0.5μL权利要求1中所述的引物和探针，2.5μL的无菌水)，3μL待检核酸模，体系的总体积为20μL；还可参照下表：
组成成分 用量
2X Premix Ex Taq Mix 10uL
上游引物Aer-ve-F(10mM) 0.5uL
下游引物Aer-ve-R(10mM) 0.5uL
上游引物Eliz-F(10mM) 0.5uL
下游引物Eliz-R(10mM) 0.5uL
上游引物Mor-F(10mM) 0.5uL
下游引物Mor-R(10mM) 0.5uL
探针Aer-ve-Pro(10mM) 0.5uL
探针Eliz-Pro(10mM) 0.5uL
探针Mor-Pro(10mM) 0.5uL
样品DNA模板 3uL
加无菌水至 20uL
(3)荧光定量PCR扩增：将PCR管中配制好的扩增反应体系置于荧光定量PCR仪中进行扩增反应，所述扩增反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s后，60℃退火延伸30s并采集荧光信号40个循环。
(4)结果判定：荧光定量PCR反应结束后，获得相应通道的扩增曲线图，观察特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号是否形成扩增曲线，荧光曲线有三种信号，有FAM信号形成的S型扩增曲线并且该通道ct值小于36则说明该待检样本存在维氏气单胞菌，有HEX信号形成的S型扩增曲线并且该通道ct值小于36则说明该待检样本存在伊丽莎白菌，有CY5信号形成的S型扩增曲线并且该通道ct值小于36则说明该待检样本存在摩氏摩根菌，通过一个荧光定量PCR反应就可以判断该样本的是或否存在维氏气单胞菌、伊丽莎白菌和摩氏摩根菌。
实施例2：
对4株维氏气单胞菌，3株伊丽莎白菌和3株摩氏摩根菌荧光定量PCR检测，其具体流程如下：
1)样本核酸提取：待提样本10例，包含4例维氏气单胞菌、3例伊丽莎白菌和3株摩氏摩根菌，分别用商业化的细菌核酸提取试剂盒进行提取。图1为前7例样本核酸提取电泳图,A1到A4为维氏气单胞菌核酸电泳图，B1到B3为摩氏摩根菌核酸电泳图；图2为3例摩氏摩根菌核酸提取电泳图,C1到C3电泳都出现条带，由图可知10例样本核酸均提取成功。
2)分别取3μL上一步提取的好的核酸和17μL的检测试剂盒中的PCR反应液，加入到PCR反应管中并用移液器吹打混匀后，置于荧光定量PCR仪上进行反应。将阳性的维氏气单胞菌、伊丽莎白菌和摩氏摩根菌基因组进行混合后作为检测模板，取3uL混合模板和17μL的检测试剂盒中的PCR反应液，加入到PCR反应管中并用移液器吹打混匀，置于荧光定量PCR仪上进行反应。
3)PCR扩增反应程序如下：
95℃预变性30s；95℃变性5s后，60℃退火延伸30s并采集荧光信号40个循环。；
4)结果分析：通过荧光扩增曲线图Ct值的大小来判断结果的阴阳性的，确定样品中是否含有维氏气单胞菌、伊丽莎白菌和摩氏摩根菌。当扩增曲线图Ct值≤36,并呈现明显指数增长时,结果表现为阳性；当扩增曲线图Ct值>36或无Ct值,结果表现为阴性；为了在判断检测结果阴阳性时具有参照，检测样本时需要给维氏气单胞菌、伊丽莎白菌和摩氏摩根菌三重荧光PCR检测试剂盒设置阴性对照。
本实施例中，用于检测维氏气单胞菌、伊丽莎白菌和摩氏摩根菌的荧光定量PCR仪包括但不限于：ABI系列、Bio-Rad系列、、Rocheightcycler、杭州博日系列等。
在FAM通道查看维氏气单胞菌的检测结果如图3所示，4例维氏气单胞菌的检测结果均为阳性，其A0为阴性对照，3例伊丽莎白菌检测结果同样为阳性如图4所示，其中B0为阴性对照。3例摩氏摩根菌检测结果同样为阳性如图5所示，其中C0为阴性对照。图6和图7为维氏气单胞菌、伊丽莎白菌和摩氏摩根菌PCR产物电泳图，电泳显示扩增出目的条带，检测结果与预期一致，说明该试剂盒可以单独检测维氏气单胞菌、伊丽莎白菌和摩氏摩根菌。
把检测维氏气单胞菌、伊丽莎白菌和摩氏摩根菌的基因组DNA混合后作为模板，同时检测三种致病菌如图8所示，检测结果均为阳性，说明试剂盒可以同时检测维氏气单胞菌、伊丽莎白菌和摩氏摩根菌，具有三重检测能力，检测结果符合预期。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.维氏菌、伊丽莎白菌和摩氏菌QPCR试剂盒，其特征在于包括以下引物对和探针：
检测维氏气单胞菌的引物对和探针Aer-ve-Pro，所述检测维氏气单胞菌的引物对包括SEQ ID NO：1所示的上游引物Aer-ve-F和SEQ ID NO：2所示的下游引物Aer-ve-R，所述探针Aer-ve-Pro的序列为SEQ ID NO：7所示；
检测伊丽莎白菌引物对和探针Eliz-Pro，所述检测伊丽莎白菌引物对包括SEQ ID NO：3所示的上游引物Eliz-F和SEQ ID NO：4所示的下游引物Eliz-R，所述探针Eliz-Pro的序列为SEQ ID NO：8所示；
检测摩氏摩根菌引物对和探针Mor-Pro，所述检测摩氏摩根菌引物对包括SEQ ID NO：5所示的上游引物Mor-F和SEQ ID NO：6所示的下游引物Mor-R，所述探针Mor-Pro的序列为SEQ ID NO：9所示。
2.根据权利要求1所述的维氏菌、伊丽莎白菌和摩氏菌QPCR试剂盒，其特征在于：所述上游引物Aer-ve-F、下游引物Aer-ve-R、探针Aer-ve-Pro、上游引物Eliz-F、下游引物Eliz-R、探针Eliz-Pro、上游引物Mor-F、下游引物Mor-R和探针Mor-Pro的终浓度为2mM到10mM。
3.根据权利要求1或2所述的维氏菌、伊丽莎白菌和摩氏菌QPCR试剂盒，其特征在于：所述探针Aer-ve-Pro、探针Eliz-Pro和探针Mor-Pro的5'标记的荧光基团为FAM、VIC、HEX、CY5中的一种，且各个探针的5'标记的荧光基团互不相同；所述探针Aer-ve-Pro、探针Eliz-Pro和探针Mor-Pro的3'标记的淬灭基团为BQ1、BQ2中的一种。
4.根据权利要求1所述的维氏菌、伊丽莎白菌和摩氏菌QPCR试剂盒，其特征在于：该试剂盒中还包括有酶液和反应缓冲液，所述酶液由DNA聚合酶组成，酶液和反应缓冲液直接采用市售的2X Premix Ex Taq Mix。
5.一种权利要求要求1所述的维氏菌、伊丽莎白菌和摩氏菌QPCR试剂盒的检测方法，其特征在于按照以下步骤进行：
(1)提取待测样本核酸，选用商品化的核酸提取试剂盒；
(2)配置扩增反应体系，体系为：17μL PCR扩增反应液，3μL待检核酸模，体系的总体积为20μL；
(3)荧光定量PCR扩增：将PCR管中配制好的扩增反应体系置于荧光定量PCR仪中进行扩增反应，并进行信号采集；
(4)结果判定：分别在相应通道查看扩增曲线在36个循环以内曲线良好的反应直接判定为阳性，36个循环以后的可直接判定为阴性，同时阳性对照的扩增明显，阴性对照没有扩增。
6.根据权利要求5所述的维氏菌、伊丽莎白菌和摩氏菌QPCR试剂盒的检测方法，其特征在于：所述PCR扩增反应液包含10μL的2X Premix Ex Taq Mix，各0.5μL权利要求1中所述的引物和探针，2.5μL的无菌水。
7.根据权利要求5所述的维氏菌、伊丽莎白菌和摩氏菌QPCR试剂盒的检测方法，其特征在于所述扩增反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s后，60℃退火延伸30s并采集荧光信号40个循环。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103642903A (zh) * 2013-11-13 2014-03-19 浙江省水产技术推广总站 摩氏摩根菌快速检测试剂盒及应用
CN105420373A (zh) * 2015-12-22 2016-03-23 于辉 同时检测三种气单胞菌的多重pcr引物组及探针和检测方法
CN107083443A (zh) * 2017-06-15 2017-08-22 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 一组用于脑膜炎败血伊丽莎白菌pcr检测的引物组合

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