CN111560443B - 一组筛选优质猪卵母细胞的生物分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一组筛选优质猪卵母细胞的生物分子标记及其应用，属于基因和细胞工程技术领域。本发明所述生物分子标记包括miR‑10a‑5p、miR‑200b、miR‑141、miR‑92a、miR‑221‑3p、miR‑21‑5p、miR‑26a、let‑7d‑5p、miR‑125b和miR‑99a‑5p。本发明所述生物分子标记能够实现优质卵母细胞的筛选。

Description

一组筛选优质猪卵母细胞的生物分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及基因和细胞工程技术领域，具体涉及检测一组筛选优质猪卵母细胞的生物分子标记及其应用。

背景技术

卵母细胞体外成熟培养技术是哺乳动物体外受精技术的重要环节之一，是应用促性腺激素和类固醇激素在体外模拟卵泡环境，进而诱发卵母细胞成熟的一项生物技术。而卵母细胞体外成熟是指通过体外培养，使卵泡内的未成熟卵母细胞发育成为成熟的第二次减数分裂中期卵母细胞的一种辅助生殖技术。在进行卵母细胞体外成熟培养之前如何获得优质的猪卵母细胞是后续研究工作成功的关键因素之一。

随着现代生物学和生物医学研究的进展，证明了猪的生物学特性和遗传特性与人类具有相当高的同源性，并由此使得猪的转基因器官和核移植研究得到深入开展，为此目前有关模式动物研究和异种器官移植研究领域对猪卵母细胞的标准也在不断的提升。

发明内容

本发明的目的在于提供一组筛选优质猪卵母细胞的生物分子标记及其应用。本发明所述生物分子标记能够实现优质卵母细胞的筛选。

本发明提供了一组筛选优质猪卵母细胞的生物分子标记，所述生物分子标记包括miR-10a-5p、miR-200b、miR-141、miR-92a、miR-221-3p、miR-21-5p、miR-26a、let-7d-5p、miR-125b和miR-99a-5p。

本发明还提供了上述技术方案所述生物分子标记在筛选优质猪卵母细胞中的应用。

优选的是，所述优质猪卵母细胞为细胞核与胞质成熟的猪卵母细胞。

优选的是，所述筛选为筛选miR-10a-5p高表达、miR-200b、miR-141、miR-92a、miR-221-3p、miR-21-5p、miR-26a、let-7d-5p、miR-125b和miR-99a-5p同时低表达的猪卵母细胞。

本发明提供了检测一组筛选优质猪卵母细胞的生物分子标记。本发明通过选择性收集不同大小猪卵泡的卵泡液，利用测序和后续的生物学分子，研究不同大小的猪卵泡中miRNA表达谱的不同，筛选出代表优质卵母细胞的miRNA生物分子标记，建立统一的猪优质卵母细胞的判断标准。本发明所述生物分子标记能够实现优质卵母细胞的筛选。本发明技术方案，可以实现标准统一、技术可靠选择优质猪卵母细胞的方法，可以为后续利用该方法选择出的卵母细胞进行体外受精胚胎或转基因胚胎生产提高效率奠定基础。

附图说明

图1为本发明提供的不同样品表达量分布情况；

图2为本发明提供的样品测序数据的泊松分布图；

图3为本发明提供的样本的序列质控统计结果；

图4为本发明提供的不同大小卵泡组A和组B之间的外泌体中miRNA表达差异分析；

图5为本发明提供的不同大小卵泡组A和组C之间的外泌体中miRNA表达差异分析；

图6为本发明提供的不同大小卵泡组A和组D之间的外泌体中miRNA表达差异分析；

图7为本发明提供的不同实验组比较筛选的10个miRNA进行目标基因进行功能分析涉及的代谢途径功能分析。

具体实施方式

本发明提供了一组筛选优质猪卵母细胞的生物分子标记，所述生物分子标记包括miR-10a-5p(TACCCTGTAGATCCGAATTTGT，SEQ ID NO.1)、miR-200b(TAATACTGCCTGGTAATGATGAC，SEQ ID NO.2)、miR-141(TAACACTGTCTGGTAAAGATG，SEQ IDNO.3)、miR-92a(TATTGCACTTGTCCCGGCCTGT，SEQ ID NO.4)、miR-221-3p(AGCTACATTGTCTGCTGGGTTT，SEQ ID NO.5)、miR-21-5p(TAGCTTATCAGACTGATGTTGA，SEQ IDNO.6)、miR-26a(TTCAAGTAATCCAGGATAGGCT，SEQ ID NO.7)、let-7d-5p(

AGAGGTAGTAGGTTGCATAGTT，SEQ ID NO.8)、miR-125b(TCCCTGAGACCCTAACTTGTGA，SEQ ID NO.9)和miR-99a-5p(AACCCGTAGATCCGATCTTGTG，SEQ ID NO.10)。

本发明还提供了上述技术方案所述生物分子标记在筛选优质猪卵母细胞中的应用。在本发明中，所述优质猪卵母细胞为细胞核与胞质成熟的猪卵母细胞。本发明猪优质卵母细胞优选是指细胞核和胞质同步成熟，在大卵泡中接近排卵的时候卵泡中的卵母细胞达到核质成熟的同步性，具有最强的体外受精或重构胚胎发育能力。本发明优选筛选miR-10a-5p高表达、miR-200b、miR-141、miR-92a、miR-221-3p、miR-21-5p、miR-26a、let-7d-5p、miR-125b和miR-99a-5p同时低表达的猪卵母细胞作为优质卵母细胞。本发明具体实施例结果显示，在大卵泡组(D组)中，miR-10a-5p的表达显著高于对照组，其余9个基因的表达都显著低于对照组(A组)；由此可见miR-10a-5p的高表达、miR-200b、miR-141、miR-92a、miR-221-3p、miR-21-5p、miR-26a、let-7d-5p、miR-125b和miR-99a-5p同时的低表达可以作为猪优质卵母细胞选择的分子谱。

下面结合具体实施例对本发明所述的一组筛选优质猪卵母细胞的生物分子标记及其应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

1猪卵巢的采集及运输

猪卵巢采集于娄底某屠宰场，挑选刚刚屠宰的、卵泡颜色清亮、形态正常(无过大、病变卵泡)的卵巢剪下，放入加有双抗的35～38℃的灭菌生理盐水中，在2个小时内送回实验室。

2猪卵泡液的收集和外泌体纯化

分别用23号针头和5ml注射器从小卵泡(A组和B组：卵泡直径<3mm和3～5mm)或20号针头和10ml注射器从大卵泡(C组和D组：卵泡直径在5～8mm和>8mm)抽取猪卵泡液。卵泡直径的测量与之前报道的一样。

首先用(添加青霉素和链霉素)等温盐水冲洗卵巢2～3次至无血水。用外科手术剪剔除卵巢表面的结缔组织及附着的输卵管、卵巢组织。再抽取卵泡液放入15ml离心管中，然后离心处理，收集上清液备用，然后将上清液在1300×g离心15min以去除细胞，血液和其他材料在-80℃保存以作进一步实验。

外泌体的分离方法如下：在4℃下，以3500rpm的速度离心15ml卵泡液，去掉其液体中的细胞等碎片。然后将上清液首先转移到15ml超离心管中，在16500×g下4℃超离心30min，然后通过0.2mm注射器过滤器过滤，获得含有外泌体的液体。最后，用120000×g的超速离心法在4℃下造粒70min，并在-80℃下保存以供进一步分析。外体颗粒悬浮于PBS中进行电镜分析。首先将再悬浮的EXs样品5～10μl加入铜网中沉淀3min，滤纸从边缘吸收挥发液。其次，PBS漂洗后对磷钨酸进行负染，并在室温下干燥2min后在机器上成像(电子显微镜工作电压80～120kv)。鉴定其分离的纯度等。

3.实验设计

本发明利用RNA高通量测序技术鉴定和分析来自不同大小卵泡的猪卵泡液外体的转录组。研究不同大小的卵泡，其中小卵泡(A组和B组：<3mm和3～5mm)和大卵泡(C组和D组：5～8mm和>8mm)，分离其包含的外泌体，提取其总RNA进行测序分析，获得相关优质卵母细胞的代表性标记性分子标记，为后续选择优质卵泡细胞的技术体系奠定基础。

采集猪卵泡液，首先进行RNA分离和提纯用提取的总RNA构建小RNA文库。其小RNA克隆、测序和分析，使用

文库试剂盒按照说明书进行操作。RNA样品被纯化，在94℃下破碎15min，并用随机引物启动。将样品转化为双链cDNA，纯化，并将适配器连接到3’和5’末端。用索引正向引物和通用反向引物对cDNA进行14个周期的PCR扩增。PCR扩增后，利用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies Sweden AB)对RNA文库进行纯化和质量控制。进行测序分析，其样品采集信息如下：

表1不同大小卵泡的猪卵泡液采集记录表

采集次数	卵泡液体积	对照组(A组)	小卵泡(B组)	大卵泡(C组)	大卵泡(D组)
						1	10ml	A-3	B-3	C-3	D-1
2	10ml	A-5	B-5	C-5	D-5
						3	10ml	A-6	B-6	C-4	D-6

4.样品相关性图(Sample Correlation)

生物学重复主要有两个用途：一个是证明所涉及的生物学实验操作是可以重复的且变异不大，另一个是为了确保后续的差异基因分析得到更可靠的结果。样品间基因表达水平相关性是检验实验可靠性和样本选择是否合理的重要指标。相关系数约接近1，表明样品之间表达模式的相似度越高。

图1为不同样品表达量分布情况，描述的是测序序列比对到基因组后，归一化的的表达量的分布强度与丰度，由图1可知，不同样品测序后获得数据分析表明其表达的丰度也存在差别。图2为样品测序数据的泊松分布图，由图2可知，同组不同批次卵泡液之间存在相对较好的重复性。

5.数据过滤及质量控制(Quality Control)

采用Trimmomatic软件对raw reads进行过滤，Fast-QC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)软件对过滤前后测序数据的质量进行整体评估。表2为测序数据与参考序列以及数据库比对分析结果。样本的序列质控统计结果如图3可知，单个样本序列质量值分布符合质量标准。

6.miRNA与参考序列以及数据库比对分析

使用国际公认的BWA算法，在miRNA分析部分，将过滤后的CleanRead比对到对应物种的miRNA数据库上，获得miRNA的表达情况，其测序数据比对参考序列的结果如下(见表2)。

表2测序数据与参考序列以及数据库比对分析

7.差异基因筛选(Different Gene Analysis)

了解实验组和对照组互相之间的差异基因情况，并将其与表型结合起来有利于研究表型相关的基因表达情况。本发明采用不同的差异筛选算法以及标准化方式进行差异筛选，能够保证数据分析的有效性。为了全面的直观的展示样品之间的关系及差异情况，本发明将表达基因做聚类分析。用挑选的差异基因的表达情况来计算样品直接的相关性。图4为不同大小卵泡组A和组B之间的外泌体中miRNA表达差异分析，坐标轴Y轴代表基因名；坐标轴X轴代表样本名；每一个格子定义代表每一个基因的在不同样本中的RPKM值。红色代表基因表达相对于该基因在Median标准化后，相对于Median的表达较高，绿色代表基因相对于Median的表达较低。而颜色越深越接近黑色代表，越接近Median。以下的图(图5和图6)示类似的含义。图5为不同大小卵泡组A和组C之间的外泌体中miRNA表达差异分析，表明组C不同批次的样品的基因表达聚类在一起，显著不同于对照组A的基因表达族类；图6为不同大小卵泡组A和组D之间的外泌体中miRNA表达差异分析，表明组不同批次的样品的基因表达聚类在一起，显著不同于对照组A的基因表达族类。

8.10个miRNA分子可以作为选择优质猪卵母细胞的分子标记

卵巢卵泡为卵母细胞的发育提供了独特的微环境，如卵泡体细胞与卵母细胞的相互作用，研究卵泡液成分对阐明卵母细胞成熟机制至关重要。外泌体是卵泡液中卵泡体细胞与卵母细胞相互作用信号转导的重要载体。通过综合两组之间的比对分析(图4～7)，发现以下的10个miRNA分子(miR-10a-5p，miR-200b，miR-141，miR-92a，miR-221-3p，miR-21-5p，miR-26a，let-7d-5p，miR-125b和miR-99a-5p)在组建存在较大的差别，能作为候选的优质卵母细胞选择的分子标记。

当上述10个分子标记全都存在时，而且miR-10a-5p相对于对照组高表达，但是其余的miR-200b，miR-141，miR-92a，miR-221-3p，miR-21-5p，miR-26a，let-7d-5p，miR-125b和miR-99a-5p都低表达，代表的发育成熟的卵泡临近要进行排卵，卵泡中的卵母细胞核质已经同步成熟，具有受精能力，能够进行后续胚胎的进一步发育，可以作为选择猪优质卵母细胞的分子标记。

表3候选的miRNA分子标记在不同大小卵泡中的测序数据的TPM值

在B组卵泡中miR-99a-5p和miR-125b的表达与对照组和大卵泡组没有显著差异，但是miR-10a-5p、miR-200b，miR-141，miR-92a，miR-221-3p，miR-21-5p，miR-26a和let-7d-5p的表达都显著高于对照组和大卵泡组，说明这8个基因在猪卵泡发育过程中，在直径达到3mm的时候，表达显著增加。同时，这10个基因在C组和D组中的表达没有显著差异，说明猪的卵泡在直径大于5mm，已经基本接近成熟发育。大卵泡组中miR-10a-5p的表达相对于对照组高表达，但是其余的miR-200b，miR-141，miR-92a，miR-221-3p，miR-21-5p，miR-26a，let-7d-5p，miR-125b和miR-99a-5p都显著低表达于对照组。

图7不同实验组比较筛选的10个MiRNA进行目标基因进行功能分析涉及的代谢途径功能分析。结果表明，在GO-Enrichment散点图中显示(图7)，与神经递质分泌的基因数量种类发生了很大变化，由此可以说明与生殖有关的内分泌激素的调控随着卵泡的生长发生了很大的改变。结果还表明，图7中卵泡刺激素(FSH)分泌调节的丰富因子值几乎为1，说明本发明的10个miRNAs的许多靶向基因的功能主要集中在FSH模拟猪卵泡生长的卵母细胞发育上。本发明还发现，这些miRNAs能够作为猪优质卵母细胞选择的分子标记，尤其是miR-10a-5p的表达相对于对照组高表达，另外的miR-200b，miR-141，miR-92a，miR-221-3p，miR-21-5p，miR-26a，let-7d-5p，miR-125b和miR-99a-5p都显著低表达于对照组，这种分子标记的表达模式代表优质的猪卵母细胞。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 湖南人文科技学院

<120> 一组筛选优质猪卵母细胞的生物分子标记及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

taccctgtag atccgaattt gt 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taatactgcc tggtaatgat gac 23

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taacactgtc tggtaaagat g 21

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tattgcactt gtcccggcct gt 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agctacattg tctgctgggt tt 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tagcttatca gactgatgtt ga 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttcaagtaat ccaggatagg ct 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agaggtagta ggttgcatag tt 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tccctgagac cctaacttgt ga 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aacccgtaga tccgatcttg tg 22

Claims (4)

1.一组筛选优质猪卵母细胞的生物分子标记，其特征在于，所述生物分子标记包括miR-10a-5p、miR-200b、miR-141、miR-92a、miR-221-3p、miR-21-5p、miR-26a、let-7d-5p、miR-125b和miR-99a-5p。

2.权利要求1所述生物分子标记在筛选优质猪卵母细胞中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述优质猪卵母细胞为细胞核与胞质成熟的猪卵母细胞。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述筛选为筛选miR-10a-5p高表达、miR-200b、miR-141、miR-92a、miR-221-3p、miR-21-5p、miR-26a、let-7d-5p、miR-125b和miR-99a-5p同时低表达的猪卵母细胞。

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