CN114457080A - 一种ARHGAP11B基因缺失的iPSC细胞系的构建方法及应用 - Google Patents

一种ARHGAP11B基因缺失的iPSC细胞系的构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及细胞基因工程领域，具体公开了一种ARHGAP11B基因缺失的iPSC细胞系的构建方法及应用。本发明用于靶向敲除人ARHGAP11B基因的特异性sgRNA在人ARHGAP11B基因的靶向位点位于人ARHGAP11B基因的6号外显子上。本发明提供的特异性sgRNA能够高效靶向人ARHGAP11B基因，并且基于CRISPR/Cas9系统构建敲除iPSC细胞系中ARHGAP11B基因的方法，该方法操作简便，敲除效果更加彻底。

Description

一种ARHGAP11B基因缺失的iPSC细胞系的构建方法及应用
技术领域
本发明涉及细胞基因工程领域，尤其是涉及一种ARHGAP11B基因缺失的iPSC细胞系的构建方法及应用。
背景技术
哺乳动物出现了高度发达的大脑皮层(cerebral cortex)，新发展起来的大脑皮层在调节机能上起着重要作用，虽然皮层下各级脑部及脊髓也有发展，但在机能上已从属于大脑皮层。大脑皮质是调节躯体运动或者说控制躯体运动的最高级中枢，人类的大脑皮层更产生了新的飞跃，有了抽象思维的能力，成为意识活动的物质基础。大脑皮层在记忆、注意力、思考、语言、意识、知觉等方面发挥着至关重要的作用。所以可以说大脑皮层相当于人体的“司令部”。因此，对影响大脑皮层发育因素的研究也成为了生命科学研究的热点。
人类新皮层扩张的某些特定方面被认为涉及人类特异性基因组变化。最近的转录组研究确定，某些先前鉴定的人类特异性基因在神经祖细胞中优先表达，并且已将这些基因牵涉到人类新皮层的扩张中。在这些基因中，与神经元相比在人类bRG中表达最特异性的基因是ARHGAP11B。从黑猩猩谱系中分离出人类谱系后，ARHGAP11B发生了进化，这是ARHGAP11A(编码Rho GTPase活化蛋白的基因)部分基因重复的产物。强迫表达的ARHGAP11B在胚胎小鼠的新皮层导致BP(基底祖细胞)增殖和大小的增加。
诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)技术是干细胞研究领域的一项重大突破，它回避了历来已久的伦理争议，解决了干细胞移植医学上的免疫排斥问题，使干细胞向临床应用又迈进了一大步。随着iPS技术的不断发展以及技术水平的不断更新，它在生命科学基础研究和医学领域的优势已日趋明显。诱导多能干细胞和基因组编辑技术结合所建立的细胞模型，为疾病研究提供了一个独特的实验平台。利用该平台体系，研究人员可以研究特定基因突变甚至染色体结构变异对人类多种细胞类型和组织器官功能的影响及其详细的分子机制，并可建立携带不同遗传突变的“个性化”疾病模型用于大规模药物筛选。
通过CRISPR/Cas9技术建立ARHGAP11B基因缺失的iPSC细胞系，观察ARHGAP11B基因缺失对iPSC的影响，有望建立转基因ARHGAP11B的体外模型，以便深入探究ARHGAP11B基因的特异性功能及作用。
目前尚未见构建敲除诱导多能干细胞ARHGAP11B基因的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种ARHGAP11B基因缺失的iPSC细胞系的构建方法及应用。其中，本发明提供的特异性sgRNA能够高效靶向人ARHGAP11B基因，并且基于CRISPR/Cas9系统构建敲除iPSC细胞系中ARHGAP11B基因的方法，该方法操作简便，敲除效果更加彻底。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一方面，本发明提供了用于靶向敲除人ARHGAP11B基因的特异性sgRNA，所述sgRNA在人ARHGAP11B基因的靶向位点位于人ARHGAP11B基因的6号外显子上；所述sgRNA对应的核苷酸序列为以下情况的至少一种：
a)sgRNA1：
gcgtgtaccagactttatcc；
b)sgRNA2：
ggaaaagataccagccatgt；
c)sgRNA3：
gactttatcctggaaaagat。
第二方面，本发明提供了一种CRISPR/Cas9载体，所述CRISPR/Cas9载体包括上述用于靶向敲除人ARHGAP11B基因的特异性sgRNA。更具体的说，CRISPR/Cas9载体包括sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3中的至少一种。
更优选地，CRISPR/Cas9载体的浓度为1255ng/μl。
作为本发明所述CRISPR/Cas9载体的优选实施方式，所述CRISPR/Cas9载体由质粒px458-exon6和质粒pCEP4-middle酶切后，带入上述用于靶向敲除人ARHGAP11B基因的特异性sgRNA、抗性基因Puro和GFP荧光蛋白基因。
第三方面，本发明提供了一种宿主细胞，包括上述的CRISPR/Cas9载体。
第四方面，本发明提供了一种基于CRISPR/Cas9系统敲除iPSC细胞系中ARHGAP11B基因的构建方法，包括以下步骤：
S1、将上述的CRISPR/Cas9载体转染iPSC，培养，通过嘌呤霉素筛选成功转染的阳性iPSC；
S2、对成功转染的阳性iPSC进行多能性鉴定。
通过测序结果及iPSC细胞系多能性鉴定，可以证明缺失ARHGAP11B基因的iPSC细胞系构建成功。
作为本发明所述基于CRISPR/Cas9系统敲除iPSC细胞系中ARHGAP11B基因的构建方法的优选实施方式，所述步骤S1中转染为采用BEX CUY2 EDITⅡ转染系统的电转。
作为本发明所述基于CRISPR/Cas9系统敲除iPSC细胞系中ARHGAP11B基因的构建方法的优选实施方式，步骤S1转染结束后，将iPSC加入到含Y-27632(5mM 2000×)的mTeSRTM1培养基中进行培养。在转染后使用Y-27632的mTeSRTM1培养基培养iPSC细胞，提高了iPSC细胞的存活能力和克隆形成能力。
作为本发明所述基于CRISPR/Cas9系统敲除iPSC细胞系中ARHGAP11B基因的构建方法的优选实施方式，所述构建方法还包括对阳性iPSC进行PCR鉴定的步骤，PCR鉴定中的引物如SEQ ID NO:5～6所示。
第五方面，本发明提供了上述构建方法获得的iPSC细胞系，本发明还提供所述iPSC细胞系在建立ARHGAP11B基因敲除的体外细胞模型中的应用，以便深入探究ARHGAP11B基因的特异性功能及作用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)本发明利用CRISPR/Cas9系统从iPSC细胞系中敲除人ARHGAP11B基因，操作简便，效果完整而彻底。通过改造和优化CRISPR/Cas9基因组编辑技术，将抗性基因PuromycinN-acetyl-transferase和GFP荧光蛋白共同表达在载体上，通过嘌呤霉素对基因编辑后iPSC细胞进行筛选，可以大大提高CRISPR/Cas9基因组编辑技术在iPSC细胞中的基因编辑效率，并且可以通过GFP荧光蛋白直接判断ARHGAP11B基因敲除的情况。相比化学或者病毒介导的转染方式，本发明采用电穿孔方式进行转染大大提高了转染效率；优化后的CRISPR/Cas9基因组编辑技术操作简便、时间缩短、效率提高，为未来干细胞基因组编辑提供了有力工具；
2)本发明中基于CRISPR/Cas9系统敲除ARHGAP11B基因的方法，与沉默、敲低、干扰等方法相比，敲除效果更加彻底；
3)本发明从测序结果及iPSC细胞系多能性鉴定，可以证明缺失ARHGAP11B基因的iPSC细胞系构建成功。
附图说明
图1为本发明ARHGAP11B基因上三条sgRNA的序列图；
图2为本发明pCEP4-Cas9-EGFP-11B-exon6-3gRNA表达载体示意图；
图3为本发明pCEP4-Cas9-EGFP-11B-exon6-3gRNA表达载体的测序结果图；
图4为iPSC细胞系支原体检测图；
图5为经嘌呤霉素筛选后，表达GFP荧光蛋白的阳性细胞的显微观察图；
图6为ARHGAP11B基因缺失的iPSC细胞系的电泳鉴定图(M为2000Marker，WT为阳性对照)；
图7为ARHGAP11B基因缺失的iPSC细胞系的基因型测序结果图；
图8为外源基因整合检测图；
图9为脱靶分析图；
图10为细胞免疫荧光结果图；
图11为阳性克隆iPSC63细胞的核型分析图；
图12为阳性克隆iPSC63细胞的qPCR定量分析图；
图13为阳性克隆iPSC63细胞的三胚层分化图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、一种基于CRISPR/Cas9系统敲除iPSC细胞系中ARHGAP11B基因的构建方法
1、sgRNA设计
“sgRNA”，即Single guide RNA，单导向RNA，可在CRISPR/Cas9基因编辑(包括基因敲除)时识别特异性的基因组片段。根据sgRNA靶序列设计原则，在人ARHGAP11B基因外显子6(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)设计靶序列，构建3条sgRNA，分别为sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3，核苷酸序列分别如SEQ ID No.2～4所示(见表1)，其3条sgRNA的序列图如图1所示。
表1
sgRNA编号 核苷酸序列
sgRNA1 gcgtgtaccagactttatcc
sgRNA2 ggaaaagataccagccatgt
sgRNA3 gactttatcctggaaaagat
2、CRISPR/Cas9载体的构建
分别将3条sgRNA经退火形成二聚体，用T4多聚核苷酸激酶将寡核苷酸退火产物双链sgRNA连接到经BbS I酶切后的px458载体外显子中，获得px458-exon6-3gRNA，然后将px458-exon6-3sgRNA和pCEP4-middle用PciⅠ和NotⅠ双酶切，分别跑胶回收6898bp和6910bp片段，切胶回收后用solutionⅠ16℃连接2小时，转化后挑取单克隆进行酶切鉴定和测序鉴定，从而获得pCEP4-Cas9-EGFP-11B-exon6-3gRNA表达载体(示意图见图2)，将构建得到的pCEP4-Cas9-EGFP-11B-exon6-3gRNA表达载体进行酶切鉴定，选择酶切正确的质粒送北京擎科生物科技有限公司进行测序鉴定，测序结果表明质粒序列都是正确的(测序结果见图3)。选择测序正确的质粒用FseⅠ内切酶进行单酶切，酶切产物纯化回收后备用，用引物T2A-puro-F/R以px459为模板进行PCR，跑胶纯化回收后与上述酶切纯化回收后的产物用重组酶进行重组，转化后挑取单克隆进行测序鉴定，构建得到的pCEP4-Cas9-puro-EGFP-11b-exon6-3gRNA表达载体总长14510bp，随机选择两个质粒送北京擎科生物科技有限公司进行测序鉴定，测序结果表明两个克隆都是正确的。选取正确的质粒用无内毒素小提中量试剂盒提取质粒，-20度冷冻备用。
3、ARHGAP11B基因缺失的iPSC细胞系的构建
(1)提前复苏培养iPSC细胞准备转染，细胞转染步骤如下：
1)收集细胞密度在80％的iPSC细胞。
2)吸弃培养基(6孔板)，用PBS洗两遍，加入1mLACCUTASETM，37℃孵育约4分钟。
3)加入1mLDPBS终止消化，吹打混匀后转移至15mL离心管中，每孔再加入1mL的DPBS收集剩余细胞，也转移至15mL离心管中。
4)200g，25℃离心5分钟。
5)吸弃上清，注意不要碰到细胞沉淀。
6)加入1mLOPTI-MEM重悬细胞，200g，25℃离心5分钟，弃掉上清。
7)加入1mLOPTI-MEM，充分重悬细胞。
8)使用转染系统(BEX CUY2 EDITⅡ)进行电转，先吸取10uL的悬浮细胞，放入电击杯中，测试电阻为262欧姆，然后吸取10μl的悬浮细胞，4μl pCEP4-Cas9-puro-EGFP-11b-exon6-3gRNA质粒(1255ng/μl)，9uLOPTI-MEM混匀后加入电击杯中，不能有气泡。
9)设置电转条件如下表2所示：
表2
Figure BDA0003520135210000061
10)点击开始按钮，完成后将电击杯取下来，吸出细胞打入(悬空，吸管切勿接触液面)预先铺上Matrigel matrix的6孔板中，每孔添加有2ml含Y-27632的mTeSR TM 1(BasalMedium)培养基。
11)将培养板置于37℃和5％CO2的培养箱中。
12)由于刚电转的细胞活力较弱，所以培养一周后再使用嘌呤霉素进行筛选，筛选过程中可在荧光显微镜下观察细胞所带GFP荧光蛋白情况来判断阳性细胞比例(图4)，以备挑选单克隆。
(2)单克隆挑选：
1)一周后加入1μg/mL的嘌呤霉素筛选阳性细胞，筛选后的细胞长到70-80％的汇合度，加入ACCUTASETM。37℃孵育约4分钟。
2)加入1mLDPBS终止消化，吹打混匀后转移至15mL离心管中，再加入1mL的DPBS收集剩余细胞，也转移至15mL离心管中。
3)200g，25℃离心5分钟，吸弃上清，注意不要碰到细胞沉淀。
4)用1mL含Y-27632的mTeSR TM 1培养基重悬细胞，以每孔500个传代于10cm皿(需提前包被Matrigel)中。
5)细胞传代第一天，采用含Y-27632的mTeSR TM 1培养基进行培养，以增加单个细胞存活能力和克隆形成率，后面每天采用不含Y-27632的mTeSR TM 1培养基进行换液，细胞培养一周后可进行单克隆挑选。
6)挑选克隆前，首先用Matrigel包被的48孔板，每孔添加0.5ml mTeSR TM 1培养基。
7)在超净台中，于显微镜下，使用20μl移液枪进行克隆刮取，克隆一半用于基因型鉴定，另外一半用于培养。
(3)iPSC细胞系支原体检测：
1)在细胞传代或换液三天以上，并且汇合度达到80％时取50μl培养液上清置于微量离心管中备用。
2)将MycoBlue Buffer从-20℃冰箱取出，待解冻后，颠倒混匀。根据待测样品数量在微量离心管中配制如下反应体系：
表3
组分 单次反应体积(μl)
MycoBlue Buffer 24
MycoBlue Enzyme 1
3)加样：样品：向25μl反应体系中加入1μl待测培养液上清；
阳性对照：向25μl反应体系中加入1μl Positive Control；
阴性对照：25μl反应体系中不加入任何样品。
4)反应：将反应管放入PCR仪中，温度设置成60℃，孵育60min，反应结束后，在一个光线良好的环境中观察反应液颜色(以白纸为背景)。如果反应液仍为紫色，则判定为支原体阴性；如果反应液变成天蓝色，则判定为支原体阳性。
检测结果表明样本iPSC63为阴性，说明没有支原体感染，结果见图5。
(4)细胞基因组提取：将上述剩余细胞处理为细胞悬液，以200g离心5分钟，弃尽上清，加入8μl NP40裂解液振荡混匀后放入PCR仪中，PCR反应条件：56℃1h，95℃10min。
(5)打靶位点PCR鉴定：在ARHGAP11B基因上，设计引物exon6-F和exon6-R序列如下。
exon6-F：5’-atattactgacctcaccccc-3’(SEQ ID NO:5)
exon6-R：5’-ggtgcttaaagcacagctgg-3’(SEQ ID NO:6)
使用Ex Taq(2X)酶，配制20μl PCR体系，如下表：
表4
试剂 使用量
Ex Taq(2x) 10μl
exon6-F 0.8μl
exon6-R 0.8μl
DNA模板 0.2μl
灭菌水 8.2μl
PCR反应条件：
表5
温度 时间
98℃ 1min
98℃ 15s
58℃ 30s
72℃(回到步骤2，循环30次) 90s
72℃ 2min
将其中扩增片段大小符合预期的PCR产物送去测序。PCR结果如图6。
(6)打靶位点基因型鉴定：将PCR产物送Sanger测序，测序结果与野生型(引物如上：exon6-F和exon6-R)PCR序列比对，确定iPSC63细胞为缺失6bp和插入1bp的突变体，结果见图7。
(7)鉴定后，将阳性克隆iPSC63号进行扩大培养。
(8)外源基因整合检测：针对外源表达载体pCEP4-Cas9-puro-EGFP-11b-exon6-3gRNA，设计引物EBNA1-F和EBNA1-R序列如下。
EBNA1-F：5’-tgtctgacagcgaccatgaa-3’(SEQ ID NO:7)
EBNA1-R：5’-aaatacaccaacagcacgca-3’(SEQ ID NO:8)
使用Ex Taq(2X)酶，配制10μl PCR体系，如下表：
表6
试剂 使用量
Ex Taq(2x) 5μl
EBNA1-F 0.4μl
EBNA1-R 0.4μl
iPSC63号基因组DNA/水/质粒 0.1μl
灭菌水 4.1μl
PCR反应条件：
表7
温度 时间
98℃ 1min
98℃ 15s
58℃ 30s
72℃(回到步骤2，循环30次) 90s
72℃ 2min
水和pCEP4-Cas9-puro-EGFP-11b-exon6-3gRNA质粒分别作为阴性和阳性对照，反应产物进行凝胶电泳鉴定，可看到阳性对照有明显条带，而样本iPSC63和阴性对照一样没有条带，说明外源基因没有整合进基因组。结果如图8。
(9)脱靶分析：利用Cas-OFFinder分析得到Top10的off-target(脱靶)位点，位点信息如下。
表8
脱靶位点编号 序列
OT1 AGAGAAGAGACCAGCCATGTGGG
OT2 TGAAAAGACACCTGCCATGTGGG
OT3 GAAAAAGATACCTTCCATGTGGG
OT4 GGCAAGGAAACCAGCCATGTGGG
OT5 ACATGGAGGGTATCTCTTCCAGG
OT6 ACATGGCAGGTGGCTTTTCCAGG
OT7 GGAAAAGATTGCAGTCATGTAGG
OT8 ACATGGCTGGTGTCTTTATAAGG
OT9 ACATGACTGGTATCTTTATTAGG
OT10 AAAAGAGATCCCAGCCATGTGGG
针对这10个潜在的脱靶位点设计10对引物序列如下。
Primer1-F：5’-GGAGGATGCTACAAACAAAG-3’(SEQ ID NO:9)
Primer1-R：5’-CCCAAAAACATATGTTCACA-3’(SEQ ID NO:10)
Primer2-F：5’-AACAAAGCTAAATTCAAGGC-3’(SEQ ID NO:11)
Primer2-R：5’-ACAAAGGATCACAGCATTAT-3’(SEQ ID NO:12)
Primer3-F：5’-GATTACAGTGTGCCTTTCAT-3’(SEQ ID NO:13)
Primer3-R：5’-ACACAGTTCAGACAAAAGCC-3’(SEQ ID NO:14)
Primer4-F：5’-GTCAAGTCATGACAAATACG-3’(SEQ ID NO:15)
Primer4-R：5’-GGTTATCAAACATGCCAAAC-3’(SEQ ID NO:16)
Primer5-F：5’-AGATTTCAATAAGCAGGCTC-3’(SEQ ID NO:17)
Primer5-R：5’-AAACAAAGACACCTGGAAGA-3’(SEQ ID NO:18)
Primer6-F：5’-TGCTCTTATTCTTCTCCTTC-3’(SEQ ID NO:19)
Primer6-R：5’-TTGCACCTCACTAAACCTGA-3’(SEQ ID NO:20)
Primer7-F：5’-ATGTTAGTATCTGTCTCCCT-3’(SEQ ID NO:21)
Primer7-R：5’-AGGAACCACAAAACCATGCT-3’(SEQ ID NO:22)
Primer8-F：5’-GATGACTGTCTTCTTGCTGT-3’(SEQ ID NO:23)
Primer8-R：5’-GCCATGATTATCAACGTAGA-3’(SEQ ID NO:24)
Primer9-F：5’-CCTCAGAAAGTGACCTATTT-3’(SEQ ID NO:25)
Primer9-R：5’-ATGCCTCTTCACATGGCTTT-3’(SEQ ID NO:26)
Primer10-F：5’-AATTACCGAGTCTTGGGTAT-3’(SEQ ID NO:27)
Primer10-R：5’-AGTCAAGTTCTGGTGAAGAT-3’(SEQ ID NO:28)
使用Ex Taq(2X)酶，配制20μl PCR体系，如下表：
表9
试剂 使用量
Ex Taq(2x) 10μl
Primer-F 0.8μl
Primer-R 0.8μl
iPSC63号基因组DNA 0.2μl
灭菌水 8.2μl
PCR反应条件：
表10
温度 时间
98℃ 1min
98℃ 15s
58℃ 30s
72℃(回到步骤2，循环30次) 90s
72℃ 2min
将其中扩增片段大小符合预期的PCR产物送去Sanger测序，测序结果表明10个位点都是野生型，并没有发生突变，说明没有发生脱靶。结果如图9。
实施例2、ARHGAP11B基因缺失的iPSC细胞系的多能性鉴定分析
(1)细胞免疫荧光
将细胞(iPSC63号、野生型WT iPSC)分别传代至四孔板中的三个孔，待细胞密度达到70％-80％后，开始进行免疫荧光实验。
1)将四孔板中的培养基吸出，用PBS浸洗3次，每次10min；
2)用4％的多聚甲醛固定细胞20min，PBS浸洗3次，每次10min；
3)加入0.5％Trition X-100(PBS配制)室温通透20min，PBS浸洗3次，每次10min；
4)吸干PBS，滴加正常山羊血清，室温封闭30min；
5)吸干封闭液，每个孔直接加入200μl稀释好的一抗(分别加入Oct4，Sox2，Nanog)，4℃孵育过夜；
6)将一抗吸出，用PBS浸洗3次，每次10min；
7)吸干PBS，加入对应的稀释好的荧光二抗，用锡箔纸室温孵育30min；
8)将二抗吸出，用PBS浸洗3次，每次10min(从加入二抗后，后面所有的步骤都要避光进行)；
9)每个孔都加入稀释好的DAPI避光孵育5min，对细胞进行染核，用PBS浸洗4次，每次10min；
10)每个孔换上新的PBS到荧光显微镜下观察拍照。
细胞的免疫荧光结果显示，OCT4、SOX2和NANOG三个多能性的Marker都正常表达(参考图10)，说明iPSC63细胞是具有多能性的。
(2)阳性克隆核型分析
将两个细胞量在80％以上的6孔板的细胞消化下来置于15mL离心管中，离心后吸去上清液，加入1mL培养基重悬细胞，然后将培养基加满，送到佛山迪安医学检验实验室有限公司做核型分析，结果显示iPSC63细胞为正常核型(46.XX)(参考图11)。
(3)qPCR定量分析
1)将一个细胞量在80％左右的6孔板的细胞(iPSC63号、野生型WT iPSC)消化下来，离心后去掉上清，加入1mL裂解液混匀；
2)将处理后的细胞在室温放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；
3)向细胞中加0.2mL氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置5min；
4)4℃12000rpm离心10min；RNA主要在上层无色的水相中，把水相转移到新管中；
5)吸附柱前处理：在吸附柱中加入500μl洗柱液，室温放置2min，4℃12000rpm离心2min，弃废液；
6)将第4步收集的上清中加入200μl无水乙醇混匀，加入吸附柱静置2min，4℃12000rpm离心2min，弃废液；
7)向吸附柱中加入600μl漂洗液，4℃12000rpm离心2min，弃废液；
8)重复步骤7)；
9)12000rpm离心2min，弃掉收集管，将吸附柱置于室温放置5min将吸附柱中残余的漂洗液去除；
10)将吸附柱置于新管中，向膜中央滴加50μl RNase free ddH2O，室温放置5min，12000rpm离心2min即得到RNA；
11)在无RNase的已灭菌微型离心管中加入1μl引物和1μg Total RNA(第10步所得RNA)，并加ddH2O至13μl；
12)在70℃加热5min以破坏RNA二级结构；
13)迅速置于冰上以阻止二级结构重新形成，然后短暂离心至管底；
14)按下表至上述引物和模板的混合样品中：
表11
试剂 使用量
5xRT Reaction Buffer 5μl
Oligo 1μl
dNTP混合物 1μl
M-MLV Reverse Transcriptase 1μl
加入ddH<sub>2</sub>O至总体积 25μl
15)轻柔混匀，50℃保温30min；
16)85℃加热5min后冰上冷却，即得cDNA；
17)按下表配制PCR反应液(反应液配制在冰上进行)：
表12
试剂 使用量
TB Green Premix Ex TaqⅡ(2x) 10μl
引物F(GAPDH-F、SOX2-F、NANOG-F、OCT4-F) 0.8μl
引物R(GAPDH-R、SOX2-R、NANOG-R、OCT4-R) 0.8μl
DNA模板(iPSC63号、野生型WT iPSC)100ng Xμl
灭菌水 加至20μl
18)进行Real Time PCR反应。
利用两步法PCR扩增，标准程序如下表：
表13
Figure BDA0003520135210000141
rtPCR结果表明，OCT4、SOX2和NANOG三个多能性的Marker和管家基因GAPDH一样，都有正常表达的mRNA(图12)。
(4)三胚层分化鉴定
1)准备两个细胞量在80％以上的10cm培养皿的细胞，DPBS清洗细胞两次，加入2mlACCUTASETM，37℃消化3min，细胞大部分脱落，加入4mL mTeSR TM 1培养基终止消化，再用DPBS收集剩余细胞，分别转移至2个15mL离心管，离心(200g，4min)，去上清。
2)DPBS清洗、重悬，再离心(200g，4min)。
3)用DMEM/F12培养基重悬细胞，计数，使细胞终浓度达为1×107cells/mL。
4)1.5ml EP管中加入300ul Matrigel后，再加入300ul细胞悬液，然后加入0.6ul的Y-27632，轻轻混合均匀(Matrigel胶比较黏，注意不要吹出大量气泡)，置于冰上。
5)月龄在1.5～2的免疫缺陷小鼠(约25g/只)，腹腔注射阿佛汀麻醉，待小鼠身体变软后，背部两侧予以剃毛处理。
6)细胞注射之前瞬离一下，然后用黄色枪头把细胞悬液混匀；再用1ml注射器去掉针头后吸取悬液，每只小鼠每侧背部皮下注射250μL细胞悬液，每管细胞注射一只小鼠的两个点，注射过程可观察到隆起。
7)注射完毕后，苦味酸标记细胞注射位置，方便后续取材。
8)每隔一个礼拜观察小鼠状态，2个礼拜后开始检测注射部位是否有肿瘤形成，确认有肿瘤形成的话，取出肿瘤从中间切开后加固定液固定。
9)肿瘤固定48小时后送至广州塞维尔生物科技有限公司进行石蜡包埋、切片和HE染色。
HE染色结果表明，肿瘤中有三个不同胚层组织的形成(参考图13)，说明iPSC63具有体内分化成三个不同胚层的能力。
通过以上测序结果以及iPSC细胞系多能性的验证，证明ARHGAP11B基因缺失的iPSC细胞系构建成功。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 五邑大学
<120> 一种ARHGAP11B基因缺失的iPSC细胞系的构建方法及应用
<130> 2022-02-24
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 554
<212> DNA
<213> ARHGAP11B基因外显子6的核苷酸序列
<400> 1
atccagtgag aataagatgg atagcagcaa tcttgcagta atatttgcac caaatcttct 60
tcagacaagt gaaggacatg aaaagatgtc ttctaacgca gaaaagaagg tacgattaca 120
ggctgcagta gtacagactc ttatcgatta tgcatcagat attggtaaga tgtagttgca 180
ttattaacag aatttgttta aatgaggaaa atctctgttt ctttcaaagg aactatgaag 240
gcaactgtta gaaagttggt atattactga cctcaccccc accctacagt accggcccct 300
cctgcaaaga aaaaaagaaa agaaattggt atattagtat ctaaacattt ttggggaaga 360
gtggaggaag gataataatt gtcttacttg tgaacatttt catttagggc gtgtaccaga 420
ctttatcctg gaaaagatac cagccatgtt gggtattgat ggtctctgtg ctactccatc 480
actggaaggc tttgaagaag gtgaatatga aactcctggt gaatataaga gaaagagaag 540
acaacgtgta ggag 554
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> sgRNA1的核苷酸序列
<400> 2
gcgtgtacca gactttatcc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> sgRNA2的核苷酸序列
<400> 3
ggaaaagata ccagccatgt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> sgRNA3的核苷酸序列
<400> 4
gactttatcc tggaaaagat 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> exon6-F
<400> 5
atattactga cctcaccccc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> exon6-R
<400> 6
ggtgcttaaa gcacagctgg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> EBNA1-F
<400> 7
tgtctgacag cgaccatgaa 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> EBNA1-R
<400> 8
aaatacacca acagcacgca 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Primer1-F
<400> 9
ggaggatgct acaaacaaag 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Primer1-R
<400> 10
cccaaaaaca tatgttcaca 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Primer2-F
<400> 11
aacaaagcta aattcaaggc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Primer2-R
<400> 12
acaaaggatc acagcattat 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Primer3-F
<400> 13
gattacagtg tgcctttcat 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Primer3-R
<400> 14
acacagttca gacaaaagcc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Primer4-F
<400> 15
gtcaagtcat gacaaatacg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Primer4-R
<400> 16
ggttatcaaa catgccaaac 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Primer5-F
<400> 17
agatttcaat aagcaggctc 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Primer5-R
<400> 18
aaacaaagac acctggaaga 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Primer6-F
<400> 19
tgctcttatt cttctccttc 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Primer6-R
<400> 20
ttgcacctca ctaaacctga 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Primer7-F
<400> 21
atgttagtat ctgtctccct 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Primer7-R
<400> 22
aggaaccaca aaaccatgct 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Primer8-F
<400> 23
gatgactgtc ttcttgctgt 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Primer8-R
<400> 24
gccatgatta tcaacgtaga 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Primer9-F
<400> 25
cctcagaaag tgacctattt 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Primer9-R
<400> 26
atgcctcttc acatggcttt 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Primer10-F
<400> 27
aattaccgag tcttgggtat 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Primer10-R
<400> 28
agtcaagttc tggtgaagat 20

Claims (10)

1.用于靶向敲除人ARHGAP11B基因的特异性sgRNA，其特征在于，所述sgRNA在人ARHGAP11B基因的靶向位点位于人ARHGAP11B基因的6号外显子上；所述sgRNA对应的核苷酸序列为以下情况的至少一种：
a)sgRNA1：
gcgtgtaccagactttatcc；
b)sgRNA2：
ggaaaagataccagccatgt；
c)sgRNA3：
gactttatcctggaaaagat。
2.一种CRISPR/Cas9载体，其特征在于，所述CRISPR/Cas9载体包括权利要求1所述的用于靶向敲除人ARHGAP11B基因的特异性sgRNA。
3.如权利要求2所述的CRISPR/Cas9载体，其特征在于，所述CRISPR/Cas9载体由质粒px458-exon6和质粒pCEP4-middle酶切后，带入权利要求1所述的用于靶向敲除人ARHGAP11B基因的特异性sgRNA、抗性基因Puro和GFP荧光蛋白基因。
4.一种宿主细胞，其特征在于，包括权利要求2或3所述的CRISPR/Cas9载体。
5.一种基于CRISPR/Cas9系统敲除iPSC细胞系中ARHGAP11B基因的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将权利要求2或3所述的CRISPR/Cas9载体转染iPSC，培养，通过嘌呤霉素筛选成功转染的阳性iPSC；
S2、对成功转染的阳性iPSC进行多能性鉴定。
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中转染为采用BEX CUY2EDITⅡ转染系统的电转。
7.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤S1转染结束后，将iPSC加入到含10％CloneRTM的mTeSRTM1培养基中进行培养。
8.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括对阳性iPSC进行PCR鉴定的步骤，PCR鉴定中的引物如SEQ ID NO:5～6所示。
9.如权利要求5～8任一项所述的构建方法获得的iPSC细胞系。
10.如权利要求9所述的iPSC细胞系在建立ARHGAP11B基因敲除的体外细胞模型中的应用。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108753772A (zh) * 2018-04-04 2018-11-06 南华大学 基于CRISPR/Cas技术敲除CAPNS1基因的人神经母细胞瘤细胞系的构建方法
US20190185819A1 (en) * 2016-08-01 2019-06-20 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Human induced pluripotent stem cells for high efficiency genetic engineering

Patent Citations (2)

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Title
DAVID SABATINI, ERIC LANDER: "Addgene: Sabatini Lab - Human CRISPR High Activity Pooled Library (3 sub-libraries)", pages 1, Retrieved from the Internet <URL:Addgene https://www.addgene.org/pooled-library/ sabatini-crispr-human-high-activity-3-sublibraries/> *
LEI XING ET AL.: "Expression of human-specific ARHGAP11B in mice leads to neocortex expansion and increased memory flexibility", THE EMBO JOURNAL, vol. 40, pages 1 - 17 *

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