CN111560336B - 一种高浓度阿氏芽孢杆菌菌剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高浓度阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)菌剂的制备方法，该制备方法包括包括阿氏芽孢杆菌菌种活化培养、菌种发酵培养、电荷置换排斥法富集浓缩与喷雾干燥等步骤。本发明采用电荷替代排斥法对发酵原液进行高度富集浓缩，得到的浓缩发酵液的阿氏芽孢杆菌细胞高度完整，固体菌剂菌株存活率95％以上，有利于产品稳定，本发明方法能够高效、快速、高回收率、低成本地得到发酵浓缩液，最终得到高浓度阿氏芽孢杆菌的液体菌剂与固体菌粉。

Description

一种高浓度阿氏芽孢杆菌菌剂的制备方法
【技术领域】
本发明属于微生物发酵技术领域。更具体地，本发明涉及一种高浓度阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)菌剂的制备方法。
【背景技术】
阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)是印度科学家于2009年分离自20-41km平流层中的芽孢杆菌新种，并以印度天文学家阿耶波多的名字命名为阿耶波多氏芽孢杆菌，简称为阿氏芽孢杆菌。经过多年研究发现，阿氏芽孢杆菌广泛存在于环境中，其中在深海、高原地区、动物肠道以及植物根际土壤中均有发现，其具有极强的抗逆性，能够耐受低温、低氧及强紫外辐射。
目前阿氏芽孢杆菌被广泛应用于农业、食品业、工业以及医疗等方面，其对大分子化合物的降解、加强植物对逆境环境的耐受以及提高植物促生防病能力均具有显著效果。然而，目前阿氏芽孢杆菌的液体发酵水平较低，通常发酵活菌数是1.0×103～3.0×109cfu/mL，固体菌剂也随之较低，例如CN103952349B、发明名称“阿氏芽孢杆菌及生物菌剂和它们的应用”公开了液体发酵培养，其发酵液活菌数仅为8.0×107～1.5×109cfu/mL；CN108102958A、发明名称“一株重盐碱地植物根际促生阿氏芽孢杆菌及其应用”公开了液体发酵培养，其发酵液的活菌数仅为1.0×103～1.0×108cfu/mL；CN105985922B、发明名称“一株阿氏芽孢杆菌J5及其应用”公开了液体发酵培养，其发酵液的活菌数仅为1.0～9.0×108cfu/mL。
如上所述，近年来阿氏芽孢杆菌已经被广泛应用于农药降解、土壤重金属污染修复以及农业种植等方面，相关的液体菌剂也同时被开发并得到应用，但是由于阿氏芽孢杆菌具有类似巨大芽孢杆菌的细胞大小，液体发酵菌数较低，又因为传统浓缩方法存在芽孢得率、存活率不高、效率低等问题，使得很难解决兼顾得到高菌数和经济性的产品的问题，利用开发存在较大的困难。
为了解决现有技术存在的这些技术缺陷，本发明人研制出一种利用阿氏芽孢杆菌液体发酵及浓缩的新方法，该方法体现了高效、环保、经济等优势，得到一种高发酵活菌数的液体与固体菌剂。
【发明内容】
[要解决的技术问题]
本发明的目的是提供一种高浓度阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)菌剂的制备方法。
[技术方案]
本发明是通过下述技术方案实现的。
本发明涉及一种高浓度阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)菌剂的制备方法，该制备方法包括阿氏芽孢杆菌菌种活化培养步骤与发酵培养步骤，该制备方法还包括一个在发酵培养步骤后的电荷置换排斥法富集浓缩步骤，由该富集浓缩步骤得到一种液体阿氏芽孢杆菌菌剂，它的阿氏芽孢杆菌活菌数是1.12×1010～2.00×1010cfu/ml。
根据本发明的一种优选实施方式，所述的阿氏芽孢杆菌菌是阿氏芽孢杆菌MB22，其保藏编号CGMCC NO.17203或阿氏芽孢杆菌MB35-5，其保藏编号CGMCCNO.17204。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述的电荷置换排斥法富集浓缩步骤如下：
往由发酵培养步骤得到的发酵液中添加以该发酵液重量计1.0～3.0‰阳离子聚丙烯酰胺，混合均匀，静置3～4小时，然后除去上清液，得到第一次发酵液浓缩液；接着
按照阴离子聚丙烯酰胺与阳离子聚丙烯酰胺重量比为1.5～2.5：1，往第一次发酵液浓缩液中添加阴离子聚丙烯酰胺，混合均匀，静置1～2小时，得到第二次发酵液浓缩液，过滤，得到的滤液是液体阿氏芽孢杆菌菌剂。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述阳离子聚丙烯酰胺的分子量是800万～1200万与水解度20％～30％。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述阴离子聚丙烯酰胺的分子量是800万～1200万与水解度20％～30％。
根据本发明的另一种优选实施方式，由发酵培养步骤得到发酵液的阿氏芽孢杆菌活菌数是2.8×109cfu/mL以上。
根据本发明的另一种优选实施方式，第一次发酵液浓缩液的阿氏芽孢杆菌活菌数是发酵液阿氏芽孢杆菌活菌数的3.8倍以上。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述电荷置换排斥法富集浓缩步骤的阿氏芽孢杆菌活菌数总浓缩倍数是4.0～5.0倍。
根据本发明的另一种优选实施方式，在该电荷置换排斥法富集浓缩步骤后增加一个喷雾干燥步骤，由该喷雾干燥步骤得到一种固体阿氏芽孢杆菌菌剂，它的阿氏芽孢杆菌活菌数是1.08×1011～1.93×1011cfu/g。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述的喷雾干燥步骤如下：往由富集浓缩步骤得到的阿氏芽孢杆菌浓缩液中添加以阿氏芽孢杆菌浓缩液重量计3.8～4.2％麦芽糊精和3.8～4.2％可溶性淀粉保护剂，搅拌均匀，让其混合物溶液在进风温度150～160℃与出风温度70～75℃的条件下通过现有喷雾干燥设备喷雾干燥，冷却，得到所述的固体阿氏芽孢杆菌菌剂。
下面将更详细地描述本发明。
本发明是通过下述技术方案实现的。
本发明涉及一种高浓度阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)菌剂的制备方法，该制备方法包括阿氏芽孢杆菌菌种活化培养步骤与发酵培养步骤，该制备方法还包括一个在发酵培养步骤后的电荷置换排斥法富集浓缩步骤，由该富集浓缩步骤得到一种液体阿氏芽孢杆菌菌剂，它的阿氏芽孢杆菌活菌数是1.12×1010～2.00×1010cfu/ml。
本发明使用的阿氏芽孢杆菌株是目前国内各个微生物保藏机构保藏的阿氏芽孢杆菌株，例如阿氏芽孢杆菌MB22，其保藏编号CGMCC NO.17203，阿氏芽孢杆菌MB35-5，其保藏编号CGMCC NO.17204，这些菌株已在CN109706102A中公开。
本发明高浓度阿氏芽孢杆菌菌剂的制备方法包括按照下述顺序的阿氏芽孢杆菌菌种活化培养、菌种发酵培养、电荷置换排斥法富集浓缩与喷雾干燥等步骤。本发明采用的菌种活化培养步骤与发酵培养步骤是在微生物培养技术领域里通常采用的步骤。由电荷置换排斥法富集浓缩步骤得到液体阿氏芽孢杆菌菌剂，由喷雾干燥步骤得到固体阿氏芽孢杆菌菌剂。
具体地，所述菌种活化培养步骤如下：挑起一环从冷冻保藏甘油管中划线培养的阿氏芽孢杆菌接种于固体培养基上，在温度30～35℃下培养24～48h，得到原始斜面种子，再使用划线法将原始斜面种子接种到250mL茄瓶固体斜面培养基上，在同样的条件培养24～48h，获得发酵培养斜面种子。
所述固体培养基的组成如下：10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠、5g/L牛肉膏，定容后调节pH至7.0，加入20g/L琼脂。
所述固体斜面培养基的组成如下：10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠、5g/L牛肉膏，定容后调节pH至7.0，加入20g/L琼脂。
所述发酵培养步骤如下：初始pH为6.95～7.0的发酵培养基在发酵罐中培养基装料系数0.5～0.7、温度121℃的条件下高温蒸汽灭菌30～35分钟，将10～15个茄瓶的发酵斜面种子接种于3吨灭菌冷却发酵培养基中，通过调节搅拌器转速以控制发酵液溶氧饱和度DO值为10％～30％，在培养温度35～38℃与通气量1.0:0.8(v/v·min)的条件下培养25～35h，停止发酵，分离得到发酵液。
采用平板计数法检测，这个发酵液的阿氏芽孢杆菌活菌数是2.8×109cfu/mL以上。
所述发酵培养基组成如下：20～25g/L葡萄糖、7～9g/L蔗糖、3～4g/L麦芽糊精、20～30g/L氨基酸水解液、3～4g/L蛋白胨、1～1.5g/L酵母粉、2～2.3g/L碳酸钙、1g/L氯化钠、0.5g/L硫酸锰、2g/L磷酸二氢钾、0.5g/L硫酸铵和0.5g/L氯化铁，使用稀无机酸或稀无机碱水溶液将其发酵培养基的初始pH调节至6.9～7.0。
在本发明阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)菌剂制备的过程中，采用电荷置换排斥法对阿氏芽孢杆菌发酵液进行富集浓缩。
在本发明中，电荷置换排斥法应该理解如下：往阿氏芽孢杆菌发酵液中加入带正电荷的阳离子聚丙烯酰胺时，由于阿氏芽孢杆菌菌体带负电荷而随阳离子聚丙烯酰胺快速沉淀，沉降一段时间后将上清液与沉淀物分离，沉淀物为吸附阿氏芽孢杆菌菌体的阳离子聚丙烯酰胺；再往该沉淀物中添加带负电荷的阴离子聚丙烯酰胺，它将吸附在阳离子聚丙烯酰胺上的阿氏芽孢杆菌置换出去，过量的阴离子聚丙烯酰胺使沉淀物呈负电荷，从而使阳离子聚丙烯酰胺与负电荷阿氏芽孢杆菌分离，于是阿氏芽孢杆菌得到富集，这种方法高效、快速、细胞损伤小、喷雾干燥的活菌率高。
根据本发明，所述的电荷置换排斥法富集浓缩步骤如下：
往由发酵培养步骤得到的发酵液中添加以该发酵液重量计1.0～3.0‰阳离子聚丙烯酰胺，混合均匀，静置3～4小时，然后除去上清液，得到第一次发酵液浓缩液。经检测确定，第一次发酵液浓缩液的阿氏芽孢杆菌活菌数是发酵液阿氏芽孢杆菌活菌数的3.8倍以上。
本发明使用的阳离子聚丙烯酰胺的分子量是800万～1200万，水解度是20％～30％。如果阳离子聚丙烯酰胺的参数超过所述的范围都是不可取的，如果超出所述范围，浓缩效果不佳，去掉的上清液中活菌增加，所需的沉淀中活菌数降低，最终活菌得率降低。
在本发明中，所述阳离子聚丙烯酰胺的使用量低于1.0‰，则会浓缩时间过长，效果不佳；所述阳离子聚丙烯酰胺的使用量高于3.0‰，则会浓缩液过于黏稠，喷雾干燥困难，且不经济；因此，所述阳离子聚丙烯酰胺的使用量为1.0～3.0‰是合理的；
在这个步骤中，混合均匀的混合物静置3～4小时后分层，当沉淀物与上清液的体积比达到1:2.8～3.2时就除去上清液，得到呈粘稠状的第一次发酵液浓缩液。在这里，选择体积比为1:2.8～3.2的主要原因是在保证浓缩倍数的前提下，沉淀液的粘度适中，且具有经济性。
本发明使用的阳离子聚丙烯酰胺是目前市场上销售的产品，例如由巩义市宝来水处理材料厂以商品名阳离子聚丙烯酰胺或阳离子絮凝剂销售的产品。当然，凡是具有上述性能并且对阿氏芽孢杆菌富集及其菌剂性能没有任何负面影响的其它正电荷有机聚合物都可以用于本发明，它们也都在本发明保护范围之内。
接着，按照阴离子聚丙烯酰胺与阳离子聚丙烯酰胺重量比为1.5～2.5：1，往第一次发酵液浓缩液中添加阴离子聚丙烯酰胺，混合均匀，静置1～2小时，得到第二次发酵液浓缩液，过滤，得到的滤液是液体阿氏芽孢杆菌菌剂。
本发明使用的阴离子聚丙烯酰胺的分子量是800万～1200万与水解度20％～30％。如果阴离子聚丙烯酰胺的参数超过所述的范围都是不可取的，如果超出所述范围，所得到的最终所需发酵浓缩上清液中活菌降低，去掉的沉淀物中的活菌数较多，最终活菌得率降低。
在本发明中，阴离子聚丙烯酰胺与阳离子聚丙烯酰胺重量比为1.5～2.5：1。如果阴离子聚丙烯酰胺与阳离子聚丙烯酰胺重量比小于1.5：1，则会最终的浓缩液中的活菌数相对较低，活菌回收率低；如果阴离子聚丙烯酰胺与阳离子聚丙烯酰胺重量比大于2.5：1，则会浓缩液过于黏稠，喷雾干燥困难，且不经济；因此，阴离子聚丙烯酰胺与阳离子聚丙烯酰胺重量比为1.5～2.5：1是合适的，优选地是1.8～2.2：1。
本发明使用的阴离子聚丙烯酰胺是目前市场上销售的产品，例如由巩义市宝来水处理材料厂以商品名阴离子聚丙烯酰胺或阴离子絮凝剂销售的产品。当然，凡是具有上述性能并且对阿氏芽孢杆菌富集及其菌剂性能没有任何负面影响的其它负电荷有机聚合物都可以用于本发明，它们也都在本发明保护范围之内。
根据本发明，第二次发酵液浓缩液经过滤得到的滤液是本发明的液体阿氏芽孢杆菌菌剂。它的阿氏芽孢杆菌活菌数是1.12×1010～2.00×1010cfu/ml。本发明电荷置换排斥法富集浓缩步骤的阿氏芽孢杆菌活菌数总浓缩倍数是4.0～5.0倍。
根据本发明，在该电荷置换排斥法富集浓缩步骤后增加一个喷雾干燥步骤，由该喷雾干燥步骤得到一种固体阿氏芽孢杆菌菌剂。
根据本发明，所述的喷雾干燥步骤如下：往由富集浓缩步骤得到的阿氏芽孢杆菌浓缩液中添加以阿氏芽孢杆菌浓缩液重量计3.8～4.2％麦芽糊精和3.8～4.2％可溶性淀粉保护剂，搅拌均匀，让其混合物溶液在进风温度150～160℃与出风温度70～75℃的条件下通过现有喷雾干燥设备喷雾干燥，冷却，得到所述的固体阿氏芽孢杆菌菌剂，它的阿氏芽孢杆菌活菌数是1.08×1011～1.93×1011cfu/g。
往阿氏芽孢杆菌浓缩液中添加麦芽糊的主要作用在于在喷雾干燥过程中对芽孢进行保护，从而提高活菌回收率。
在本发明中，麦芽糊的添加量小于3.8％，芽孢在干燥过程中损失量大；麦芽糊的添加量高于4.2％，喷雾干燥得到的菌粉吸潮严重；因此，麦芽糊的添加量为3.8～4.2％是恰当的；
本发明使用的麦芽糊是目前市场上销售的产品，例如由丽华淀粉厂公司以商品名麦芽糊精销售的产品。当然，凡是具有上述作用并且对阿氏芽孢杆菌菌剂品质与应用没有任何负面影响的其它麦芽糊都可以用于本发明，也都在本发明保护范围之内。
往阿氏芽孢杆菌浓缩液中添加可溶性淀粉的主要作用在于对喷雾干燥过程中的芽孢具有保护作用。
在本发明中，可溶性淀粉的添加量小于3.8％，芽孢在干燥过程中损失量大；可溶性淀粉的添加量高于4.2％，喷雾干燥得到的菌粉吸潮严重；因此，可溶性淀粉的添加量为3.8～4.2％是合适的；
本发明使用的可溶性淀粉是目前市场上销售的产品，例如由丽华淀粉厂公司以商品名可溶性淀粉销售的产品。当然，凡是具有上述作用并且对阿氏芽孢杆菌菌剂品质与应用没有任何负面影响的其它淀粉都可以用于本发明，也都在本发明保护范围之内。
采用平板计数法检测，本发明固体阿氏芽孢杆菌菌剂中阿氏芽孢杆菌的存活率高于95％。
在相同人工及设备折损的前提下，仅计算材料成本，本发明高浓度阿氏芽孢杆菌菌剂浓缩步骤成本计算如下：
浓缩步骤成本＝材料成本+动力成本
同时，采用等电点浓缩法，将上述发酵液的pH调节至4.0，出现沉淀，使用由华鼎离心机有限公司公司以商品名碟式离心机销售的离心机在离心转速6000转/min，离心30min条件下进行离心分离浓缩，在与本发明相同的条件下喷雾干燥，测定固体粉剂活菌数，并按照上述计算方法计算这种浓缩成本。其结果可以参见实施例部分。
[有益效果]
本发明的有益效果是：本发明采用电荷替代排斥法对发酵原液进行高度富集浓缩，得到的浓缩发酵液的阿氏芽孢杆菌细胞高度完整，喷雾干燥的固体阿氏芽孢杆菌菌剂的存活率95％以上，有利于产品稳定，本发明方法能够高效、快速、高回收率、低成本地得到发酵浓缩液，最终得到高浓度阿氏芽孢杆菌的液体菌剂与固体菌粉。
【具体实施方式】
通过下述实施例将能够更好地理解本发明。
实施例1：本发明高浓度阿氏芽孢杆菌菌剂的制备
该实施例的实施步骤如下：
I、菌种活化培养：
挑起一环从冷冻保藏甘油管中划线培养的阿氏芽孢杆菌接种于本申请说明书描述的固体培养基上，在温度30℃下培养32h，得到原始斜面种子，再使用划线法将原始斜面种子接种到250mL茄瓶中本申请说明书描述的固体斜面培养基上，在同样的条件培养32h，获得斜面发酵培养种子。
II、菌种发酵培养：
初始pH为6.9的发酵培养基在发酵罐中培养基装料系数0.6、温度121℃的条件下高温蒸汽灭菌32分钟，将12个茄瓶的发酵斜面种子接种于3吨灭菌冷却发酵培养基中，通过调节搅拌器转速以控制发酵液溶氧饱和度DO值为16％，在培养温度37℃与通气量1.0：0.8(v/v·min)的条件下培养32h，停止发酵，分离得到一种发酵液。根据本申请说明书描述的方法检测，这个发酵液的阿氏芽孢杆菌活菌数是2.8×109cfu/mL。
III、电荷置换排斥法富集浓缩：
往由步骤II得到的发酵液中添加以该发酵液重量计1.6‰由巩义市宝来水处理材料厂以商品名阳离子絮凝剂销售的阳离子聚丙烯酰胺，该阳离子聚丙烯酰胺的分子量是1000万与水解度25％，混合均匀，静置3.3小时，然后除去上清液，得到第一次发酵液浓缩液。根据本申请说明书描述的方法检测确定，第一次发酵液浓缩液的阿氏芽孢杆菌活菌数是上述发酵液阿氏芽孢杆菌活菌数的3.8倍；
接着，按照阴离子聚丙烯酰胺与阳离子聚丙烯酰胺重量比为2.5：1，往第一次发酵液浓缩液中添加由巩义市宝来水处理材料厂以商品名阴离子絮凝剂销售的阴离子聚丙烯酰胺，混合均匀，静置1.0小时，得到第二次发酵液浓缩液，过滤，得到的滤液是本发明的液体阿氏芽孢杆菌菌剂。根据本申请说明书描述的方法检测确定，该电荷置换排斥法富集浓缩步骤的阿氏芽孢杆菌活菌数总浓缩倍数是4.0倍。
IV、喷雾干燥：
往由富集浓缩步骤得到的阿氏芽孢杆菌浓缩液中添加以阿氏芽孢杆菌浓缩液重量计3.8％由丽华淀粉厂以商品名麦芽糊精销售的麦芽糊精和4.0％由丽华淀粉厂以商品名可溶性淀粉销售的可溶性淀粉保护剂，搅拌均匀，让其混合物溶液在进风温度150℃与出风温度70℃的条件下通过由鹏冻干燥公司以商品名喷雾干燥塔销售的喷雾干燥设备进行喷雾干燥，冷却，得到所述的固体阿氏芽孢杆菌菌剂，根据本申请说明书描述的方法检测，它的阿氏芽孢杆菌活菌数是1.35×1011cfu/g。采用平板计数法检测，本发明固体阿氏芽孢杆菌菌剂中阿氏芽孢杆菌的存活率为95.6％。
该实施例的实施结果列于下表1中。作为对比，使用该实施例的发酵液进行等电点浓缩，其实施结果也列于下表1中。
表1：该实施例富集浓缩实施结果
Figure BDA0002535870500000091
实施例2：本发明高浓度阿氏芽孢杆菌菌剂的制备
该实施例的实施步骤如下：
I、菌种活化培养：
挑起一环从冷冻保藏甘油管中划线培养的阿氏芽孢杆菌接种于本申请说明书描述的固体培养基上，在温度32℃下培养24h，得到原始斜面种子，再使用划线法将原始斜面种子接种到250mL茄瓶中的本申请说明书描述的固体斜面培养基上，在同样的条件培养28h，获得斜面发酵培养种子。
II、菌种发酵培养：
初始pH为7.0的发酵培养基在发酵罐中培养基装料系数0.5、温度121℃的条件下高温蒸汽灭菌30分钟，将10个茄瓶的发酵斜面种子接种于3吨灭菌冷却发酵培养基中，通过调节搅拌器转速以控制发酵液溶氧饱和度DO值为10％，在培养温度35℃与通气量1.0：0.8(v/v·min)的条件下培养25h，停止发酵，分离得到一种发酵液。根据本申请说明书描述的方法检测，这个发酵液的阿氏芽孢杆菌活菌数是3.0×109cfu/mL。
III、电荷置换排斥法富集浓缩：
往由步骤II得到的发酵液中添加以该发酵液重量计1.0‰由巩义市宝来水处理材料厂以商品名阳离子絮凝剂销售的阳离子聚丙烯酰胺，该阳离子聚丙烯酰胺的分子量是1200万与水解度30％，混合均匀，静置4.0小时，然后除去上清液，得到第一次发酵液浓缩液。根据本申请说明书描述的方法检测确定，第一次发酵液浓缩液的阿氏芽孢杆菌活菌数是上述发酵液阿氏芽孢杆菌活菌数的4.0倍；
接着，按照阴离子聚丙烯酰胺与阳离子聚丙烯酰胺重量比为2.2：1，往第一次发酵液浓缩液中添加由巩义市宝来水处理材料厂以商品名阴离子絮凝剂销售的阴离子聚丙烯酰胺，混合均匀，静置2.0小时，得到第二次发酵液浓缩液，过滤，得到的滤液是本发明的液体阿氏芽孢杆菌菌剂。根据本申请说明书描述的方法检测确定，该电荷置换排斥法富集浓缩步骤的阿氏芽孢杆菌活菌数总浓缩倍数是5.0倍。
IV、喷雾干燥：
往由富集浓缩步骤得到的阿氏芽孢杆菌浓缩液中添加以阿氏芽孢杆菌浓缩液重量计4.2％由丽华淀粉厂以商品名麦芽糊精销售的麦芽糊精和3.8％由丽华淀粉厂公司以商品名可溶性淀粉销售的可溶性淀粉保护剂，搅拌均匀，让其混合物溶液在进风温度160℃与出风温度72℃的条件下通过由鹏冻干燥公司以商品名喷雾干燥塔销售的喷雾干燥设备进行喷雾干燥，冷却，得到所述的固体阿氏芽孢杆菌菌剂，根据本申请说明书描述的方法检测，它的阿氏芽孢杆菌活菌数是1.08×1011cfu/g。采用平板计数法检测，本发明固体阿氏芽孢杆菌菌剂中阿氏芽孢杆菌的存活率为96.3％。
该实施例的实施结果列于下表2中。作为对比，使用该实施例的发酵液进行等电点浓缩，其实施结果也列于下表2中。
表2：该实施例富集浓缩实施结果
Figure BDA0002535870500000111
实施例3：本发明高浓度阿氏芽孢杆菌菌剂的制备
该实施例的实施步骤如下：
I、菌种活化培养：
挑起一环从冷冻保藏甘油管中划线培养的阿氏芽孢杆菌接种于本申请说明书描述的固体培养基上，在温度35℃下培养40h，得到原始斜面种子，再使用划线法将原始斜面种子接种到250mL茄瓶本申请说明书描述的固体斜面培养基上，在同样的条件培养30h，获得斜面发酵培养种子。
II、菌种发酵培养：
初始pH为6.9的发酵培养基在发酵罐中培养基装料系数0.7、温度121℃的条件下高温蒸汽灭菌35分钟，将15个茄瓶中的发酵斜面种子接种于3吨灭菌冷却发酵培养基中，通过调节搅拌器转速以控制发酵液溶氧饱和度DO值为30％，在培养温度38℃与通气量1.0：0.8(v/v·min)的条件下培养28h，停止发酵，分离得到一种发酵液。根据本申请说明书描述的方法检测，这个发酵液的阿氏芽孢杆菌活菌数是2.9×109cfu/mL。
III、电荷置换排斥法富集浓缩：
往由步骤II得到的发酵液中添加以该发酵液重量计3.0‰由巩义市宝来水处理材料厂以商品名阳离子絮凝剂销售的阳离子聚丙烯酰胺，该阳离子聚丙烯酰胺的分子量是800万与水解度20％，混合均匀，静置3.7小时，然后除去上清液，得到第一次发酵液浓缩液。根据本申请说明书描述的方法检测确定，第一次发酵液浓缩液的阿氏芽孢杆菌活菌数是上述发酵液阿氏芽孢杆菌活菌数的4.2倍；
接着，按照阴离子聚丙烯酰胺与阳离子聚丙烯酰胺重量比为1.8：1，往第一次发酵液浓缩液中添加由巩义市宝来水处理材料厂以商品名阴离子絮凝剂销售的阴离子聚丙烯酰胺，混合均匀，静置1.4小时，得到第二次发酵液浓缩液，过滤，得到的滤液是本发明的液体阿氏芽孢杆菌菌剂。根据本申请说明书描述的方法检测确定，该电荷置换排斥法富集浓缩步骤的阿氏芽孢杆菌活菌数总浓缩倍数是4.6倍。
IV、喷雾干燥：
往由富集浓缩步骤得到的阿氏芽孢杆菌浓缩液中添加以阿氏芽孢杆菌浓缩液重量计4.0％由丽华淀粉厂以商品名麦芽糊精销售的麦芽糊精和4.2％由理化淀粉厂以商品名可溶性淀粉销售的可溶性淀粉保护剂，搅拌均匀，让其混合物溶液在进风温度152℃与出风温度73℃的条件下通过由鹏冻干燥公司以商品名喷雾干燥塔销售的喷雾干燥设备进行喷雾干燥，冷却，得到所述的固体阿氏芽孢杆菌菌剂，根据本申请说明书描述的方法检测，它的阿氏芽孢杆菌活菌数是1.93×1011cfu/g。采用平板计数法检测，本发明固体阿氏芽孢杆菌菌剂中阿氏芽孢杆菌的存活率为95.8％。
该实施例的实施结果列于下表3中。作为对比，使用该实施例的发酵液进行等电点浓缩，其实施结果也列于下表3中。
表3：该实施例富集浓缩实施结果
Figure BDA0002535870500000121
实施例4：本发明高浓度阿氏芽孢杆菌菌剂的制备
该实施例的实施步骤如下：
I、菌种活化培养：
挑起一环从冷冻保藏甘油管中划线培养的阿氏芽孢杆菌接种于本申请说明书描述的固体培养基上，在温度33℃下培养48h，得到原始斜面种子，再使用划线法将原始斜面种子接种到250mL茄瓶本申请说明书描述的固体斜面培养基上，在同样的条件培养25h，获得斜面发酵培养种子。
II、菌种发酵培养：
初始pH为7.0的发酵培养基在发酵罐中培养基装料系数0.6、温度121℃的条件下高温蒸汽灭菌34分钟，将14个茄瓶中的发酵斜面种子接种于3吨灭菌冷却发酵培养基中，通过调节搅拌器转速以控制发酵液溶氧饱和度DO值为24％，在培养温度36℃与通气量1.0：0.8(v/v·min)的条件下培养35h，停止发酵，分离得到一种发酵液。根据本申请说明书描述的方法检测，这个发酵液的阿氏芽孢杆菌活菌数是3.2×109cfu/mL。
III、电荷置换排斥法富集浓缩：
往由步骤II得到的发酵液中添加以该发酵液重量计2.4‰由巩义市宝来水处理材料厂以商品名阳离子絮凝剂销售的阳离子聚丙烯酰胺，该阳离子聚丙烯酰胺的分子量是1000万与水解度25％，混合均匀，静置3.0小时，然后除去上清液，得到第一次发酵液浓缩液。根据本申请说明书描述的方法检测确定，第一次发酵液浓缩液的阿氏芽孢杆菌活菌数是上述发酵液阿氏芽孢杆菌活菌数的3.9倍；
接着，按照阴离子聚丙烯酰胺与阳离子聚丙烯酰胺重量比为1.5：1，往第一次发酵液浓缩液中添加由巩义市宝来水处理材料厂以商品名阴离子絮凝剂销售的阴离子聚丙烯酰胺，混合均匀，静置1.8小时，得到第二次发酵液浓缩液，过滤，得到的滤液是本发明的液体阿氏芽孢杆菌菌剂。根据本申请说明书描述的方法检测确定，该电荷置换排斥法富集浓缩步骤的阿氏芽孢杆菌活菌数总浓缩倍数是4.2倍。
IV、喷雾干燥：
往由富集浓缩步骤得到的阿氏芽孢杆菌浓缩液中添加以阿氏芽孢杆菌浓缩液重量计3.9％由丽华淀粉厂以商品名麦芽糊精销售的麦芽糊精和4.1％由丽华淀粉厂以商品名可溶性淀粉销售的可溶性淀粉保护剂，搅拌均匀，让其混合物溶液在进风温度156℃与出风温度75℃的条件下通过由鹏冻干燥公司以商品名喷雾干燥塔销售的喷雾干燥设备进行喷雾干燥，冷却，得到所述的固体阿氏芽孢杆菌菌剂，根据本申请说明书描述的方法检测，它的阿氏芽孢杆菌活菌数是1.68×1011cfu/g。采用平板计数法检测，本发明固体阿氏芽孢杆菌菌剂中阿氏芽孢杆菌的存活率为97.3％。
该实施例的实施结果列于下表4中。作为对比，使用该实施例的发酵液进行等电点浓缩，其实施结果也列于下表4中。
表4：该实施例富集浓缩实施结果
Figure BDA0002535870500000141
/>
实施例1-4实施结果表明，本发明所述的一种高浓度阿氏芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)菌剂的制备方法在阿氏芽孢杆菌制备过程中充分体现了高效、快速、菌体回收率高、细胞存活率高等优点，得到的产品活菌数高，极具有可实施性。

Claims (7)

1.一种高浓度阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)菌剂的制备方法，该制备方法包括阿氏芽孢杆菌菌种活化培养步骤与发酵培养步骤，其特征在于该制备方法还包括一个在发酵培养步骤后的电荷置换排斥法富集浓缩步骤，由该富集浓缩步骤得到一种液体阿氏芽孢杆菌菌剂，它的阿氏芽孢杆菌活菌数是1.12×1010～2.00×1010cfu/ml；
所述的电荷置换排斥法富集浓缩步骤如下：
往由发酵培养步骤得到的发酵液中添加以该发酵液重量计1.0～3.0‰阳离子聚丙烯酰胺，混合均匀，静置3～4小时，然后除去上清液，得到第一次发酵液浓缩液；其中，阳离子聚丙烯酰胺的分子量是800万～1200万与水解度20%～30%；接着
按照阴离子聚丙烯酰胺与阳离子聚丙烯酰胺重量比为1.5～2.5：1，往第一次发酵液浓缩液中添加阴离子聚丙烯酰胺，混合均匀，静置1～2小时，得到第二次发酵液浓缩液，过滤，得到的滤液是液体阿氏芽孢杆菌菌剂；其中，阴离子聚丙烯酰胺的分子量是800万～1200万与水解度20%～30%。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的阿氏芽孢杆菌是阿氏芽孢杆菌MB22，其保藏编号CGMCC NO.17203或阿氏芽孢杆菌MB35-5，其保藏编号CGMCC NO.17204。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于由发酵培养步骤得到发酵液的阿氏芽孢杆菌活菌数是2.8×109cfu/mL以上。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于第一次发酵液浓缩液的阿氏芽孢杆菌活菌数是发酵液阿氏芽孢杆菌活菌数的3.8倍以上。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述电荷置换排斥法富集浓缩步骤的阿氏芽孢杆菌活菌数总浓缩倍数是4.0～5.0倍。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在该电荷置换排斥法富集浓缩步骤后增加一个喷雾干燥步骤，由该喷雾干燥步骤得到一种固体阿氏芽孢杆菌菌剂，它的阿氏芽孢杆菌活菌数是1.08×1011～1.93×1011 cfu/g。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述的喷雾干燥步骤如下：往由富集浓缩步骤得到的阿氏芽孢杆菌浓缩液中添加以阿氏芽孢杆菌浓缩液重量计3.8～4.2%麦芽糊精和3.8～4.2%可溶性淀粉保护剂，搅拌均匀，让其混合物溶液在进风温度150～160℃与出风温度70～75℃的条件下通过现有喷雾干燥设备喷雾干燥，冷却，得到所述的固体阿氏芽孢杆菌菌剂。
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