CN111549162A

CN111549162A - 鉴别杜仲性别的引物、片段及方法

Info

Publication number: CN111549162A
Application number: CN202010302727.0A
Authority: CN
Inventors: 张宪智; 邓鑫; 李永泉; 郭微; 陈平
Original assignee: Zhongkai University of Agriculture and Engineering
Current assignee: Zhongkai University of Agriculture and Engineering
Priority date: 2020-04-16
Filing date: 2020-04-16
Publication date: 2020-08-18
Anticipated expiration: 2040-04-16
Also published as: CN111549162B

Abstract

本发明公开鉴别杜仲性别的引物、片段及方法，所述片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述引物对的核苷酸序列从5’‑3’如SEQ ID NO.2～3所示。本发明提供了一种新的用于杜仲苗期识别其性别的片段MSL4，其长度为479bp；所述MSL4在杜仲两个独立群体中均被发现，表明杜仲的性别可能是由基因决定的，且这个雄性特异性位点似乎暗示其在性染色体上的位置，这表明杜仲可能有一个XX/XY性别决定系统。本发明还提供了用于快速识别杜仲苗期性别的相关PCR引物对及鉴别方法，所述方法简单、快速，对杜仲性别的识别具有重要的应用前景，对缩短杜仲的育种周期、加快其杜仲胶商业生产有重要价值。

Description

鉴别杜仲性别的引物、片段及方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种鉴别杜仲性别的引物、片段及方法。

背景技术

杜仲是杜仲科的唯一物种，是中国南部和中部特有的一种雌雄异株的重要经济树种。它是一种著名的第三纪孑遗植物，两千多年来在我国作为药用植物被广泛栽培。近年来，杜仲胶(反式-1，4-聚异戊二烯)的高产引起了越来越多的关注，这种树种也被称为硬橡胶树。由于其在亚热带和温带地区的广泛适应性，杜仲有可能取代通常所知的橡胶树(大戟科)，该树只在热带地区生长。但是，杜仲的生育周期长(最长可达8-10年)，雌雄异株，无法在早期鉴定其性别，这极大地限制了杜仲的育种效率、产量以及其他研究。

我们都知道雌雄异株代表性别在个体上的分离，包括我们人类在内的绝大多数哺乳动物均具有雄性和雌性之分。大约6％的开花植物，即175个科的987个属中有15,600个种是雌雄异株。一般来说，雌雄异株植物有三种通过性染色体确定性别的系统：XY、ZW和XO。XY型系统中的雄性是异配子(XY)，雌性是同配子(XX),例如猕猴桃、芦笋、番木瓜和白花蝇子草。ZW型系统以雌性异配子(ZW)和雄性同配子(ZZ)为特征，如毛果杨。其他一些物种，如酸模，进化出XO性别决定系统，其中个体的性别由X所占比率决定。到目前为止，通过可靠的细胞遗传学或分子证据只找出39种植物为异型染色体。雌雄异株杜仲是二倍体，基本组成为2n＝34条染色体，基因组大小约为1.2Gb。尽管如此，我们仍然无法确定杜仲性别决定机制和异型性染色体，利用核型鉴定杜仲苗期的性别既困难又不可靠。此外，随着基因组学的出现，一些植物中的性别决定基因逐渐被发现。一个雄性特异的MADS-box APETALA3-like基因被证实可能参与了杜仲的性别决定。然而，杜仲的性别决定机制仍不清楚。

雌雄异株植物的形态和生理差异已被报道。杜仲胶的产量在雌雄株的叶子之间表现出显著的性二态性。在叶、树皮、根、果实和种子中，果实的杜仲胶含量最高[7]。在杜仲园中，雄性杜仲树的最佳占比为6-8％。因此，必须开发一种简单、准确的方法来鉴定杜仲的性别，以便在早期就能实现最佳雌雄配比，获得最高的经济价值。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种性别特异性DNA标记，以鉴定杜仲苗期的性别的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：用于鉴定杜仲性别的片段，所述片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明通过ddRAD-seq得到了一个新的用于鉴别杜仲性别的特异性片段，所述片段仅在雄性个体中出现，且在不同群体中高度保守；所述片段命名为MSL4，可用于鉴定杜仲性别。

本发明还要求保护所述片段在鉴别杜仲性别的应用。

进一步地，本发明还要求保护用于鉴别杜仲性别的引物对，所述引物对为根据如SEQ ID NO.1所述片段的核苷酸序列设计得到。

引物对为根据如SEQ ID NO.1所述片段核苷酸序列设计得到，对应产物大小不大于所述SEQ ID NO.1片段，并可通过本领域常规手段(包括PCR、电泳、产物序列比对等)即可快速验证相关的引物特异性；选择特异性高的引物对用于鉴别杜仲性别。

作为本发明的优选实施方式，所述引物对的核苷酸序列从5’-3’如SEQ ID NO.2～3所示。

本发明还公开了用于鉴别杜仲性别的方法，包括如下步骤：使用设计的引物对对待测样本基因组DNA进行PCR扩增，并检测扩增产物；若PCR产物电泳结果与预测一致，则待测样本为雄株，否则为雌株。

作为本发明的优选实施方式，所述PCR扩增的反应体系为：12.5μL PCR反应液，25M引物2.0μL，50ng基因组DNA，ddH2O补足25μL。

作为本发明的优选实施方式，使用如SEQ ID NO.2～3所示的引物对进行PCR扩增，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min，变性、退火、延伸共进行30个循环；72℃终延伸5min。

PCR的扩增反应程序按照本领域常规手段，根据设计的引物，对退火温度、延伸时间等进行调整。

所述PCR扩增，所述检测扩增产物的方法为电泳。

使用如SEQ ID NO.2～3所示的引物对进行PCR扩增，产物大小为479bp。

本发明还要求保护所述引物对在鉴别杜仲性别的应用。

本发明还提供了一种用于检测鉴别杜仲性别的试剂盒，所述试剂盒包括所述引物对。

本发明提供了一种新的用于杜仲苗期识别其性别的片段MSL4，其长度为479bp；所述MSL4在杜仲两个独立群体中均被发现，表明杜仲的性别可能是由基因决定的；这个479bp的雄性特异性位点似乎暗示其在性染色体上的位置，这表明杜仲可能有一个XX/XY性别决定系统。进一步地，本发明还提供了用于快速识别杜仲苗期性别的相关PCR引物对及鉴别方法，所述方法简单、快速，对杜仲性别的识别具有重要的应用前景，对缩短杜仲的育种周期、加快其杜仲胶商业生产有重要价值。

附图说明

图1为杜仲雄株(♂)和雌株(♀)花部特征。

图2为使用MSL1、MSL2、MSL3和MSL5对应引物对进行PCR扩增的产物电泳结果。

图3为使用MSL4对应引物对进行PCR扩增的产物电泳结果。

图4为使用MSL4对应引物对进行PCR扩增的产物sanger测序结果。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1杜仲性别特异性标记的鉴别

选择在陕西杨凌西北农林科技大学校园内培养的杜仲种群(34°16'56”N，108°04'27″E)用于ddRAD标记的开发。在2017年4月的花期，通过花性状识别了这些个体的性别，并共对20株雌树和20株雄树进行了取样(图1)。将收集新鲜、健康的叶片立即浸入液氮中，然后在-80℃保存，直到DNA分离。

用CTAB法从叶片样品中分离出基因组DNA，并在1.0％琼脂糖凝胶和超微量分光光度计(IMPLEN，CA，USA)上检测DNA的质量。我们根据新修改的ddRAD(MiddRAD)建库流程，为20个雄性个体和20名雌性个体建立了ddRAD文库。

建库流程具体如下：通过AvaII和MspI酶消化各样品的基因组DNA，并分别接上接头。将DNA样品混合起来，筛选出长度为500-600bp的片段进行PCR扩增。然后通过凝胶电泳和Qubit2.0荧光计(Life Technologies，CA，USA)对富集的DNA进行纯化和收集。

最后，在中国北京诺禾致源科技股份有限公司的IlluminaHiSeq2500平台上对文库进行双端测序，读长为150bp。对测得的数据进行处理、分析后最终确定了五个基因组位点作为潜在的雄性特异性ddRAD标记，它们均在19/20个雄性中存在，而在20个雌性中不存在，命名为MSL1、MSL2、MSL3、MSL4和MSL5。

其中，片段MSL4的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2杜仲性别特异性标记验证

随后于2018年4月在河南新乡河南师范大学(34°41'33”N，113°40'16”E)采集的雌雄各12株杜仲树(与原采样点距离约为650公里)，将其作为一个单独的群体来验证性别特异性标记。

按同样的方法从叶片提取基因组DNA，设计相应的引物对，进行PCR扩增，各片段对应的引物如表1所示(其中，MSL4的引物对的核苷酸自5’-3’方向如SEQ ID NO.2～3所示)。

表1各片段引物核苷酸序列

PCR扩增的反应体系如下：

PCR反应液 12.5μL；

引物(25M)各 1.0μL(共2.0μL)；

基因组DNA 50ng；

ddH2O补足 25μL。

PCR扩增的反应程序如下：

94℃预变性3min；

72℃终延伸5min。

PCR扩增后得到的产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，每个PCR实验重复两次，确定可靠性和稳定性。

两次检测结果相同，如图2、3所示。其中：图2中，A、B、C、D分别为使用MSL1、MSL2、MSL3、MSL5基因对应的引物进行扩增的产物电泳结果；图3为使用MSL4基因对应的引物进行扩增的产物电泳结果(两次重复)；图2、图3中间为DNA指示带，左边为雄性样本的PCR产物检测结果，右边为雌性样本的PCR产物检测结果。

由图2可得，在MSL1、MSL2、MSL3和MSL5上，PCR条带在性别上没有明显区别；相比之下，图3结果显示，来自MSL4位点的PCR产物仅在雄性中出现，显示出一个单一的亮带，其大小约为500bp，而在雌性个体中均不存在。

进一步地，通过对MSL4扩增产物进行Sanger测序，结果如图4，A为各样本测序比对结果；B为产物对应的核苷酸序列，即SEQ ID NO.1序列。

由图4可得，在12个雄性个体中，MSL4的核苷酸序列高度保守，长度为479bp，与预期相同；没有检测到变异，并且与ddRAD-seq数据吻合，表明来源于相同的基因组位置。

进一步地，将测序的核苷酸序列与在NCBI核苷酸数据库(https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/)中收录的植物、动物、微生物的DNA及RNA序列进行比对，比对结果未发现MSL4片段的同源序列。

进一步地，与已公开的杜仲基因组数据库(https://bigd.big.ac.cn/gwh/ Assembly/13/show)进行比对，发现一段同源序列，位于组装的scaffold571上，起止位置为25,047-25,525，两者的相似性达到98％。且结果显示，MSL4片段位于一个未知功能的基因中，属于非编码序列，在外显子17(24,544-24,670)和外显子18(25,716-25,793)之间。

另外，2018年公布的杜仲基因组为一个雄性个体的基因组(Wuyun,T.-n.；Wang,L.；Liu,H.；Wang,X.；Zhang,L.；Bennetzen,J.L.；Li,T.；Yang,L.；Liu,P.；Du,L.The hardyrubber tree genome provides insights into the evolution of polyisoprenebiosynthesis.Molecular Plant 2018,11,429-442)，在该基因组中找到MSL4片段的同源序列，进一步证实了MSL4片段作为雄性特异性DNA标记的广适性。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 仲恺农业工程学院

<120> 鉴别杜仲性别的引物、片段及方法

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 479

<212> DNA

<213> Eucommia ulmoides

<400> 1

gtggtgagaa attcccgatc aagcagccat tgctagcgct aggatgcttg aatcttcatt 60

caagcagtca gatttttata gttgctgatt gcaatggaaa ggtggacgta agtggcaaat 120

ggaactaaaa gagtctgaag taataaaaaa tcaatcacat caactctaaa ccccaacttc 180

cagatatatt atattatcgt agcagattcc aagttacaga ttattcgttc tctcaatcta 240

caagcgtgat tgccccacaa ggggagttaa agacccaggg tacatcccaa agcaacagaa 300

ggaagcattg caaacaatca aattcaacaa tggtaagtag gacgcacgtg ggtttaaaaa 360

aacctcagaa tccccaaatt taaccagcca aatccacctc ttcaaccatg aaaaaacatg 420

aagaaaagat cgagaagctc agaaagcatt gagatgaatc atgaagtttg agccccaca 479

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acagagccaa ccaacaggaa 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgtggggctc aaacttcatg 20

Claims

1.用于鉴定杜仲性别的片段，其特征在于，所述片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述片段在鉴别杜仲性别的应用。

3.用于鉴别杜仲性别的引物对，其特征在于，所述引物对为根据如SEQ ID NO.1所述片段的核苷酸序列设计得到。

4.如权利要求3所述的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列从5’-3’如SEQID NO.2～3所示。

5.用于鉴别杜仲性别的方法，其特征在于，包括如下步骤：使用如权利要求3或4所述的引物对，对待测样本基因组DNA进行PCR扩增，并检测扩增产物；若PCR产物电泳结果与预测一致，则待测样本为雄株，否则为雌株。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：12.5μL PCR反应液，25M引物2.0μL，50ng基因组DNA，ddH2O补足25μL。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，使用如权利要求4所述的引物对进行PCR扩增，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min，变性、退火、延伸共进行30个循环；72℃终延伸5分钟。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述检测扩增产物的方法为电泳。

9.如权利要求3或4所述引物对在鉴别杜仲性别的应用。

10.一种用于检测鉴别杜仲性别的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求3或4所述引物对。