CN111542612B - 用于治疗弗里德希氏共济失调的载体 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于治疗弗里德希氏共济失调的基因疗法。具体地，本发明提供用于生产腺相关病毒(AAV)载体的核酸、克隆载体和转移载体。所述核酸包含(i)编码共济蛋白的核酸序列，(ii)磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子，以及(iii)土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。本发明还提供包含所述AAV载体或核酸的药物组合物。此外，所述AAV载体、核酸或药物组合物可用作药物，具体地作为用于治疗弗里德希氏共济失调的药物。

Description

用于治疗弗里德希氏共济失调的载体

技术领域

本发明可被包括在用于治疗弗里德希氏共济失调(Friedreich's ataxia)的新疗法的领域中。具体地，本申请涉及用于基因疗法的新产品。所述产品能够治疗弗里德希氏共济失调。

背景技术

弗里德希氏共济失调(FRDA；OMIM#229300)是一种罕见的遗传性神经退行性疾病，其引起神经系统的进行性损伤，导致范围从步态障碍和语言问题到心脏疾病或心肌病的症状。这种疾病以在19世纪60年代第一个对其进行描述的医生尼古拉斯-弗里德希(NikolausFriedreich)命名。共济失调，涉及运动协调问题，如笨拙的动作和不稳定，由于脊髓和控制手臂和腿部的肌肉运动的神经中的神经组织变性而出现在弗里德希氏共济失调中。脊髓萎缩同时神经细胞失去其部分髓鞘。弗里德希氏共济失调虽然不常见，但却是最常见的遗传性共济失调，每3万-5万活产儿中就有1例，发病率为2-4/10万。两种性别受到相同影响。症状通常在年龄为5-15岁之间开始出现，但在极少数情况下，最早可在18个月或晚至年龄为50岁时出现。出现的第一个症状通常是行走困难，即步态共济失调。共济失调逐渐恶化，并慢慢扩散到手臂，然后到躯干。脚部畸形，如弓形足，脚趾无意识折叠，或锤状趾都可能作为早期症状出现。随着时间的推移，肌肉开始衰弱和被消耗，尤其是在足部、腿部和手部，并且出现畸形。其他症状包括肌腱反射丧失，尤其是在膝关和脚踝。通常，四肢感觉逐渐丧失，这可扩散到身体的其他部位。出现构音障碍，并且患者容易感到疲劳。被称为眼球震颤的眼球的快速、有节奏且不自主的运动是常见的。大多数弗里德希氏共济失调患者出现脊柱侧弯，如果严重的话，这会影响呼吸。

可能发生的其他症状有胸痛、呼吸短促和心悸。这些症状是常伴随弗里德希氏共济失调的多种形式的心脏疾病(如肥厚性心肌病，心肌纤维化，或心力衰竭)的结果。心率异常如心动过速和心阻也是常见的。约20％的弗里德希氏共济失调患者发展出碳水化合物不耐受并且30％显示糖尿病。一些受影响的人丧失听力或视力。疾病进展速度因人而异。通常，在最初症状发作后的10至20年间，人被困于轮椅中，并且在该疾病的后期，个体变得完全残疾。预期寿命可能会受影响。许多弗里德希氏共济失调患者在成年期死于相关的心脏疾病，其是最常见的死因。然而，一些有较不严重弗里德希氏共济失调症状的人有时可存活60或70年。

神经成像(如MRI)尽管渐渐揭示颈椎脊髓和小脑的可变性萎缩，但在该病的早期显示正常的外观。这通常显示上脚(superior peduncle)萎缩。电生理学研究显示在感觉动作电位不存在或减小的情况下大于40m/s的传导速度，以及H反射的缺失。在神经病理学水平，观察到脊髓、后根以及偶尔的小脑的显著萎缩以及心脏肥大。在外周感觉神经中鉴定出神经变性，以及大背根神经节感觉神经元的逐渐丧失，脊柱变性，克拉克氏脊柱和脊髓小脑纤维、锥体束中的神经元的跨突触变性，以及薄束核和楔形核的萎缩。继发性损伤可以包括影响大的谷氨酸能神经元的小脑中的齿状核的萎缩，以及贝茨细胞和皮层脊髓束的萎缩。

在1996年，弗里德希氏共济失调的病因被确定为位于9号染色体(9q21区)的FXN基因的分子缺陷。所述突变由位于FXN基因的第一个内含子中的ALU序列内的GAA三联体的异常纯合子扩张(expansion)组成。约98％的FRDA患者的2个染色体中各自具有的GAA重复的数目为201至1,700(更常见地，600至900)。然而，2％-5％的FRDA患者呈现GAA扩张和复合杂合中的FXN基因中的点突变(表1)。迄今，已经描述了超过17种不同的FXN基因突变能够触发FRDA。FRDA中的GAA扩张在减数分裂期间是非常不稳定的并且干扰FXN基因转录，引起异常低水平的共济蛋白mRNA。GAA扩张将使FXN基因的转录沉默并且因此通过形成三链DNA结构或DNA-RNA杂交体或两者而破坏共济蛋白表达。最近，有人提出GAA扩张会由于在GAA过度扩张附近形成异染色质样结构而阻断转录的自起始到延伸的过渡。还有人提出GAA扩张会导致位于FXN基因的5’上游区域中的CpG位点的表观遗传甲基化，从而导致其沉默。因此，作为FXN基因中的GAA突变的结果，在FRDA中出现共济蛋白的缺乏。

表1.引起弗里德希氏共济失调的FXN基因中确定的最常见的等位变体.

FXN基因编码小的保守的线粒体蛋白质，所述蛋白质在其前体形式中含有210个氨基酸(aa)，具有23,135Da的分子量，被称为共济蛋白(Q16595)。该前体蛋白质形式含有N-端的转运序列，所述转运序列将该前体蛋白质形式指引向线粒体基质，在线粒体基质中线粒体肽酶将其转化为成熟蛋白质共济蛋白的不同的更小的同种型(FXN42-210，FXN56-210，FXN81-210，FXN78-210)，其中130aa和14.2kDa的FXN81-210是最多的。在人中，在多种组织中在线粒体基质中检测到共济蛋白与其内膜结合，并且最高的水平在心脏组织、脊髓和分裂的成淋巴细胞中确定，并且明显地，小脑中水平最低。目前还没有在大脑皮质中检测到共济蛋白。因为确定了造成该疾病的基因并且产生了若干动物模型，推测共济蛋白有不同的功能，如线粒体铁体内平衡、铁存储、对氧化应激的应答、Fe-S簇的生物起源、线粒体顺乌头酸酶活性的调节和氧化磷酸化的调控。在FRDA中，由FXN基因中的GAA扩张的纯合子扩张产生的共济蛋白缺乏导致线粒体中的电子传送和顺乌头酸酶装配所需的铁-硫簇的生物合成不足，这导致线粒体功能失调和由于其体内平衡改变所致的线粒体铁累积。共济蛋白还调节蛋白质顺乌头酸酶1(ACO1)的DNA结合能力，所述酶除了参与线粒体基质中的柠檬酸循环外，还调控细胞铁的摄取和利用。

通过基因操纵已经建立了弗里德希氏共济失调的若干动物和细胞模型。在小鼠中生成尽可能模拟人类疾病的AF模型一直是一项艰巨的任务，并且目前有8个不同的鼠FRDA模型。不幸的是，虽然它们可用于研究FRDA中分子神经变性过程的孤立的方面并用于评估具体症状中的不同疗法，但它们中没有一种是在同一动物中呈现FA所有表型症状(如背根神经节(DRG)和小脑齿状核中的损伤)的组合。临床前治疗中最常用的是Prp-CreERT和YG8R小鼠。Prp-CreERT小鼠特异性地发展出小脑和进行性感觉性共济失调，即弗里德希氏共济失调的最显著的神经学功能。这些动物中的组织学研究显示脊髓和背根神经节的异常而不存在运动神经病(人疾病的标志)，以及小脑的浦肯野细胞中的分枝缺陷。与此相比，YG8R转基因小鼠在不存在内源鼠共济蛋白的情况下显示缓慢进展的FRDA病状。与人相比，这些小鼠未显示心脏缺陷。

在用于人病状的基因疗法中使用的病毒和非病毒载体中，来源于腺相关病毒(AAV)的载体已经显示重要的临床益处以及在戈谢病,法布里病，蓬佩病，异染性脑白质营养不良，尼曼氏病和黏多糖病I、II、IIIA、IIIB、IV和VII等的动物模型中的延迟表达。在溶酶体贮积病的动物模型中静脉内施用AAV载体导致在血液、肝脏、脾、肾和肌肉中酶活性增加至正常值的16倍，这使得其对于治疗此类病状非常有用。在过去10年里，AAV是为了治疗中枢和外周神经系统病状而进行的大多数临床试验中的载体选择(http：//www.abedia.com/wiley/index.html)。重要的是，至今用这些载体没有观察到不良作用并且结果是非常有希望的。因此，若干因素使得AAV成为用于中枢神经系统(CNS)的理想基因递送溶媒。包含共济蛋白序列的腺相关病毒载体已用于治疗小鼠中的FRDA(Gérard等,2014.Mol Ther Methods Clin Dev.1:14044；Chapdelaine等,2016.Gene Ther.23(7):606–614；Tremblay等,2015.Mol Ther.23(Suppl.1):pS153；WO 2016/150964)。但是，现有技术中公开的AAV载体要么使共济蛋白过表达要么使共济蛋白表达不足并且无法到达FRDA中受影响的所有靶细胞和神经元，这使得其不适用于FRDA并且特别是其神经学症候的有效治疗。因此，需要以治疗有效量表达共济蛋白的AAV载体。

目前没有用于治疗FRDA的有效疗法并且因此需要用于治疗FRDA的新的治疗剂。本发明的目的是提供用于治疗FRDA的合适疗法。

附图

图1.针对共济蛋白(FXN)蛋白表达的SYN(突触蛋白)和FXN(共济蛋白；1,255bp)人 启动子的评估。为了检测与在高表达的组成型启动子CMV下的表达相比在内源启动子的片段(phFXN)和突触蛋白神经元启动子(phSYN)的调控下的人共济蛋白(FXN)蛋白表达水平，用空载体(第1道)、或编码人突触蛋白的构建体(phSYN)(第3道)、或共济蛋白(phFXN)启动子的1,255bp片段(第4道)转染人成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞。使用表达人FXN编码序列(hFXN CDS)的phSYN或phFXN(1,255bp)的构建体1.2和1.3不导致重组共济蛋白(rFXN)的表达。HA，血凝素标签。

图2.针对共济蛋白(FXN)蛋白表达的与WPRE序列一起的SYN(突触蛋白)、NSE(神经 元特异性烯醇酶)和FXN(共济蛋白；1,255bp)人启动子的评估。评估来自FXN的5′端的320bp片段和WPRE序列对来自之前图1中所示的phSYN启动子(第3道，4 vs 8)和phNSE(第6道)的FXN表达的作用。将不同的构建体转染到HEK细胞中并在转染后48小时分析细胞裂解物。在由CMV启动子表达FXN的构建体中观察到WPRE序列在稳定RNA方面的有效性(第2道)。然而，以上所示调控元件的添加和组合没有导致来自phSYN、hpFXN或phNSE的FXN表达。HA，血凝素标签；iFXN，中间体形式FXN；mFXN，成熟形式FXN；WPRE，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件。

图3.针对共济蛋白(FXN)蛋白表达的与CMV增强子和WPRE序列一起的SYN(突触蛋 白)、NSE(神经元特异性烯醇酶)和FXN(共济蛋白；1,255bp)人启动子的评估。用包含CMV增强子以及SYN、NSE或FXN(1,255bp)启动子的构建体转染HEK和小鼠成神经细胞瘤细胞N2a。以上所示调控元件的组合没有导致来自phSYN、phFXN或phNSE启动子的FXN表达。HA，血凝素标签；iFXN，中间体形式FXN；mFXN，成熟形式FXN；WPRE，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件。

图4.添加有KOZAK(5’)和WPRE(3’)序列的人启动子SYN(突触蛋白)、NSE(神经元特 异性烯醇酶)和FXN(共济蛋白；1,255bp)人启动子对共济蛋白(FXN)蛋白表达的作用的评 估。将不同的构建体转染到HEK细胞中并在转染后48小时分析裂解物。在由CMV启动子表达FXN的构建体中观察到WPRE序列在稳定RNA方面的有效性(第1道vs第2道)。通过在启动子和FXN编码序列之间加入kozak序列和105nt序列的进一步的FXN表达增强见于第2道vs第3道。然而，以上所示调控元件的添加和组合没有导致来自phSYN、phFXN或phNSE的FXN表达。HA，血凝素标签；iFXN，中间体形式FXN；mFXN，成熟形式；pFXN，前体形式；WPRE，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件。

图5.针对共济蛋白(FXN)蛋白表达的除了KOZAK(5’)和WPRE(3’)序列外人启动子 PGK1(磷酸甘油酸激酶1)、NSE(神经元特异性烯醇酶)、SYN(突触蛋白)或FXN(共济蛋白；1, 255bp)和FXN的编码区(CDS)之间的限定的接头的组合的评估。将所示的不同构建体转染到N2a(A，B和E)或HEK(C和D)细胞中并在转染后48小时分析裂解物。一致地检测到来自phPGK的FXN表达，但是当在启动子和编码区之间使用105bp接头时没有检测到来自phNSE或phFXN(1,255bp)启动子的FXN表达(A,C和D：第4道；B：第5道和E：第8道)。HA，血凝素标签；iFXN，中间体形式FXN；mFXN，成熟形式；pFXN，前体形式；WPRE，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件。

图6.对YG8R Tg/-和WT小鼠进行rAAV9载体(4.6x 10¹²vg/Kg)鞘内注射后在PGK1 (磷酸甘油酸激酶1)人启动子下的荧光素酶(LUC)的表达。在鞘内注射所述载体后3.5个月在以150mg/Kg小鼠体重腹膜内注射150μl的D-荧光素后检测荧光素酶的表达(A)。将器官切开并立即添加荧光素酶底物，之后捕获图像(在左图和右图(B)后显示相对标度)。

图7.在鞘内施用rAAV9-PGK1-FXN的7月龄小鼠中的共济蛋白mRNA的体内表达。在来自7月龄YG8R半合子转基因(Tg/-)或纯合子(Tg/Tg)小鼠的肝、心脏、腰背根神经节(DRG-L)、腰脊髓(SC-L)、胸脊髓(SC-T)、颈脊髓(SC-C)、小脑(Cb)和大脑(额区C1)组织中通过qRT-PCR量化共济蛋白mRNA水平。对YG8R半合子转基因小鼠(Tg/-)施用rAAV-Null(以黑色显示)或rAAV9-PGK1-FXN(以浅灰色显示)，并且没有对FRDA纯合子转基因小鼠(Tg/Tg)(以深灰色显示)进行注射。与载有在一个染色体中具有～82和～190GAA三核苷酸序列重复的人FXN基因的两个串联拷贝的YG8R半合子小鼠(Tg/-)不同，纯合子YG8R小鼠在每条染色体中都含有两个串联拷贝。人FXN的所述纯合子或半合子YG8R小鼠都不表达内源Fxn，因为其具有小鼠Fxn敲除遗传背景。纯合子YG8R小鼠充当人FXN mRNA的较高表达对照，因为其含有更多拷贝的人转基因并且显示正常功能。在2.5月龄对小鼠进行鞘内注射并且将人FXN特异性引物用于量化不同组织中的FXN mRNA。用在rAAV9-Null处理的YG8R半合子小鼠(Tg/-)中检测到的总FXN mRNA水平对分析的每种组织的总FXN mRNA水平进行归一化。鞘内注射rAAV9-PGK1-FXN载体五个月后，在所有组织中，与AAV-Null处理的Tg/-小鼠中的水平相比，以测试剂量注射rAAV9-PGK1-FXN的半合子YG8R小鼠(Tg/-)中的FXN mRNA水平更高(约1.3和3.2倍)，但是不高于纯合子YG8R小鼠(Tg/Tg)中的水平。A)雌性和雄性小鼠n＝6(3只雌性和3只雄性)中人FXN mRNA的相对水平。用对照AAV-null注射的弗里德希氏共济失调小鼠模型YG8R小鼠与rAAV9-PGK1-FXN注射YG8R小鼠之间的倍数差异在肝、背根神经节和脊髓中具有统计学显著性(p＝0.019，p＝0.004，以及p＝0.024；星号*标注)，在所示的所有其他组织中都有增加的趋势。在使用所述剂量的情况下，与雌性小鼠相比，在雄性小鼠中观察到更大的可变性。B)雌性YG8R小鼠中的hFXN mRNA的相对水平。在研究的所有组织中都检测到在共济蛋白水平方面的统计学显著的倍数差异(如星号*标注的)并列在下表中。rAAV9-PGK1-FXN注射小鼠中的倍数增加从不高于Tg/Tg YG8R小鼠中检测到的水平。统计学显著性，p<0.05*，p<0.005**。

图8.在鞘内注射后来自rAAV9-hPGK1-FXN载体的重组共济蛋白的体内表达。来自用空载体或共济蛋白表达载体(其被用作阳性对照)转染的培养的细胞N2a的裂解物(图8A和8B：第1道和第2道)。利用抗-FXN抗体检测N2a细胞和WT小鼠中的内源FXN蛋白(A和B)。在肝和小鼠脑(A和B)中检测来自YG8R小鼠中的转基因的人FXN蛋白以及注射小鼠中的人重组FXN蛋白。用抗-FXN抗体孵育印迹一小时开始显示人FXN蛋白，而过夜(o/n)孵育显示WT小鼠中的小鼠FXN，以及半合子(Tg/-)和纯合子小鼠(Tg/Tg)中的人FXN。由注射的rAAV9-FXN表达的重组人FXN蛋白的表达水平类似于WT小鼠中内源小鼠FXN蛋白的水平。HA，血凝素标签；iFXN，中间体形式FXN；mFXN，成熟形式FXN；WPRE，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件。

图9.在用rAAV9-FXN载体注射后YG8R小鼠中随时间的搂抱反射的恢复。在用rAAV9-FXN或rAAV9-null载体注射的半合子(Tg/-)小鼠和WT中，后肢的搂抱评分为0至3(见方法)，表示少到多的缺陷。雌性加雄性的结果(每组n＝10，5只雄性和5只雌性)。在半合子YG8R小鼠中，早至4月龄，观察到搂抱反射的改变。在鞘内注射rAAV9-FXN载体后，搂抱反射表现为正常化，表明该神经学病理表型随时间的恢复。星号(*)表示用rAAV9-null注射的WT和Tg/-小鼠的值之间的显著差异，而井号(#)表示注射有rAAV9-null的Tg/-小鼠和注射有rAAV9-FXN的Tg/-小鼠的所得值之间的显著差异。*，#：P<0.05

图10.rAAV9-hPGK1-FXN注射小鼠中重组共济蛋白的体内表达恢复在距尾神经的 刺激(D1-D4)不同距离处的电生理性质。星号(*)表示用rAAV9-null注射的WT和Tg/-YG8RFRDA小鼠的值之间的显著差异，而井号(#)表示rAAV9-null和rAAV9-FXN YG8R处理小鼠之间的显著差异。对2.5月龄小鼠进行rAAV9-FXN载体鞘内注射阻止或减缓了FRDA的FRDA小鼠模型(YG8R)中的神经传导缺陷。WT，绿色(n＝10)；用rAAV9-null载体处理的Tg/-YG8R FRDA小鼠，灰色(n＝10)；用rAAV9-FXN载体处理的Tg/-YG8R FRDA小鼠，蓝色(n＝10)。分别在距尾巴尖1cm，2cm，3cm和4cm处获得测量值，表示为位点D1、D2、D3和D4的值*，#：P<0.05。

图11.rAAV9-FXN处理的FRDA小鼠模型YG8R小鼠中背根神经节的保护。与用rAAV9-null病毒处理的相同小鼠相比，在用rAAV9-FXN处理的FRDA小鼠模型中，腰椎背根神经节的口径以及线粒体形态表现为被保护的。

发明内容

本发明提供包含核酸的腺相关病毒(AAV)载体，其中所述核酸包含：(i)编码共济蛋白的核酸序列；(ii)磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子；和(iii)土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。本发明还提供核酸，其包含：(i)编码共济蛋白的核酸序列；(ii)PGK启动子；和(iii)WPRE；包含所述核酸的克隆载体以及包含所述核酸的转移载体。此外，本发明涵盖所述核酸、克隆载体或转移载体用于制备本发明的AAV载体的用途。本发明还提供药物组合物以及所述AAV载体、核酸或药物组合物作为药物(特别是作为用于治疗FRDA的药物)的用途。

具体实施方式

定义

术语“治疗”和“疗法”，如本申请中使用的，是指意在治愈和/或减轻疾病和/或症状且目标在于补救健康问题而使用的一组卫生、药理学、手术和/或物理手段。术语“治疗”和“疗法”包括预防性和治愈性方法，因为两者都指向保持和/或重建个体或动物的健康。不论症状、疾病和残疾的源头为何，施用合适的药物以减轻和/或治愈健康问题应当被解释为本申请语境内的治疗或疗法的形式。

术语“治疗有效量”是指具有治疗效果并且能够治疗FRDA的物质的量。

术语“个体”，“患者”或“对象”在本申请中可互换地使用并且绝不意在进行限制。所述“个体”，“患者”或“对象”可以为任何年龄，性别和身体状况。

如本文中使用的，“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的稀释剂”表示与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、涂覆剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂。此种介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域中已知的。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度对于受体是无毒的，并且，在不限制本发明范围的情况下，包括：另外的缓冲剂；防腐剂；助溶剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；螯合剂，如EDTA；金属络合物(例如，Zn蛋白络合物)；可生物降解的聚合物，如聚酯；成盐抗衡离子，如钠、多元糖醇；氨基酸，如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸和苏氨酸；有机糖或糖醇，如乳糖醇、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、myoinisitose、肌醇(myoinisitol)、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环醇(例如，肌醇(inositol))、聚乙二醇；含硫还原剂，如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸钠、硫代甘油、[α]-一硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量蛋白质，如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其他免疫球蛋白；和亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮。

术语“共济蛋白”是指由FXN基因编码并且通常位于线粒体中的蛋白质。该蛋白质的详细信息可见于UniProtKB数据库，其登录号为Q16595。

术语“启动子”是指RNA聚合酶可以与其结合从而启动转录的DNA序列。所述序列还可以包含调控转录的多种蛋白质(如转录因子)的结合位点。启动子序列可以由DNA序列中位置紧邻的不同启动子片段(不同的或相同的片段)组成并且可以由接头或间隔区隔开。此种启动子被称作嵌合启动子。在优选的实施方案中，术语“启动子”是指磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。

术语“转录后调控元件”是指在被转录时产生增强或抑制蛋白质表达的三维结构的DNA序列。

术语“可操作连接”是指以允许一个核酸序列影响另一个的方式连接的两个或更多个核酸序列。例如，PGK启动子和WPRE与编码共济蛋白的核酸序列可操作连接以致共济蛋白的表达水平受PGK启动子和WPRE调控。

术语“功能变体”是指核酸或氨基酸序列在一个或多个位置上与亲本核酸或氨基酸序列有区别的核酸或氨基酸，其中区别可以是核酸或氨基酸残基的添加、缺失和/或置换，并且其仍然是有功能的并且因此适合用于治疗FRDA。技术人员可以通过利用BLAST搜索寻找同源物或通过研究群体中蛋白质或基因的可变性确定功能变体。

术语“腺相关病毒”是指感染人和其他一些灵长类物种的小病毒。“载体”是可用于将外源遗传物质人工携带进细胞中的任何媒介物。因此，“AAV载体”是指将核酸携带到细胞中的重组AAV。

AAV载体

在第一方面，本发明提供包含核酸的腺相关病毒(AAV)载体，其中所述核酸包含：(i)编码共济蛋白的核酸序列；(ii)磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子；和(iii)土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；其中(ii)和(iii)与(i)可操作连接并调控(i)的表达。

SEQ ID NO:1是指以下序列：

GAATTCCGGGGTTGGGGTTGCGCCTTTTCCAAGGCAGCCCTGGGTCTGCGCAGGGACGCGGCTGCTCTGGGCGTGGTTCCGGGAAACGCAGCGGCGCCGACCCTGGGTCTCGCACATTCTTCACGTCCGTTCGCAGCGTCACCCGGATCTTCGCCGCTACCCTTGTGGGCCCCCCGGCGACGCTTCCTGCTCCGCCCCTAAGTCGGGAAGGTTCCTTGCGGTTCGCGGCGTGCCGGACGTGACAAACGGAAGCCGCACGTCTCACTAGTACCCTCGCAGACGGACAGCGCCAGGGAGCAATGGCAGCGCGCCGACCGCGATGGGCTGTGGCCAATAGCGGCTGCTCAGCAGGGCGCGCCGAGAGCAGCGGCCGGGAAGGGGCGGTGCGGGAGGCGGGGTGTGGGGCGGTAGTGTGGGCCCTGTTCCTGCCCGCGCGGTGTTCCGCATTCTGCAAGCCTCCGGAGCGCACGTCGGCAGTCGGCTCCCTCGTTGACCGAATCACCGACCTCTCTCCCCAG

在优选的实施方案中，PGK启动子包含SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少75％同一性的序列。优选地，PGK启动子包含SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少75％、80％、85％、89％、90％、91％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。更优选地，PGK启动子是SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少75％、80％、85％、89％、90％、91％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。

两条序列间的序列同一性可以通过常规方法确定。例如，通过使用现有技术中已知的标准比对算法如BLAST(Altschul等,1990.J Mol Biol.215(3):403-10)。在优选的实施方案中，两条序列间的序列同一性使用BLAST来确定。

SEQ ID NO:2是指以下序列：

TCGACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG

在优选的实施方案中，WPRE包含SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少75％同一性的序列。优选地，WPRE包含SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少75％、80％、85％、89％、90％、91％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。更优选地，WPRE是SEQ IDNO:2或与SEQ ID NO:2具有至少75％、80％、85％、89％、90％、91％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。

SEQ ID NO:3是指以下序列：

ATGTGGACTCTCGGGCGCCGCGCAGTAGCCGGCCTCCTGGCGTCACCCAGCCCGGCCCAGGCCCAGACCCTCACCCGGGTCCCGCGGCCGGCAGAGTTGGCCCCACTCTGCGGCCGCCGTGGCCTGCGCACCGACATCGATGCGACCTGCACGCCCCGCCGCGCAAGTTCGAACCAGAGAGGTCTCAACCAGATTTGGAATGTCAAAAAGCAGAGTGTCTATTTGATGAATTTGAGGAAATCTGGAACTTTGGGCCACCCAGGCTCTCTAGATGAGACCACCTATGAAAGACTAGCAGAGGAAACGCTGGACTCTTTAGCAGAGTTTTTTGAAGACCTTGCAGACAAGCCATACACGTTTGAGGACTATGATGTCTCCTTTGGGAGTGGTGTCTTAACTGTCAAACTGGGTGGAGATCTAGGAACCTATGTGATCAACAAGCAGACGCCAAACAAGCAAATCTGGCTATCTTCTCCATCCAGTGGACCTAAGCGTTATGACTGGACTGGGAAAAACTGGGTGTACTCCCACGACGGCGTGTCCCTCCATGAGCTGCTGGCCGCAGAGCTCACTAAAGCCTTAAAAACCAAACTGGACTTGTCTTCCTTGGCCTATTCCGGAAAAGATGCTT

在优选的实施方案中，编码共济蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:3或与SEQ IDNO:3具有至少75％同一性并且是共济蛋白的功能变体的序列。优选地，编码共济蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少75％、80％、85％、89％、90％、91％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。更优选地，编码共济蛋白的核酸序列是SEQ IDNO:3或与SEQ ID NO:3具有至少75％、80％、85％、89％、90％、91％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。

在优选的实施方案中，所述核酸还包含：在所述启动子和所述编码共济蛋白的核酸序列之间的接头，其中所述接头由SEQ ID NO:6或与SEQ ID NO:6具有至少75％同一性的序列组成或包含SEQ ID NO:6或与SEQ ID NO:6具有至少75％同一性的序列。优选地，所述接头由SEQ ID NO:6或与SEQ ID NO:6具有至少75％、80％、85％、89％、90％、91％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列组成或包含SEQ ID NO:6或与SEQ ID NO:6具有至少75％、80％、85％、89％、90％、91％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。

SEQ ID NO:6是指以下序列：

TGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGCCGCCACC

在优选的实施方案中，所述核酸还包含kozak序列并且所述kozak序列也与编码共济蛋白的核酸序列可操作连接并且调控编码共济蛋白的核酸序列的表达。kozak序列是这样的序列，其出现在真核mRNA中并且具有共有序列gccRccAUGG，其中R是嘌呤，小写字母表示在碱基可变的位置处最常见的碱基而大写字母是高度保守的。

SEQ ID NO:4是指以下序列：

GAATTCCGGGGTTGGGGTTGCGCCTTTTCCAAGGCAGCCCTGGGTCTGCGCAGGGACGCGGCTGCTCTGGGCGTGGTTCCGGGAAACGCAGCGGCGCCGACCCTGGGTCTCGCACATTCTTCACGTCCGTTCGCAGCGTCACCCGGATCTTCGCCGCTACCCTTGTGGGCCCCCCGGCGACGCTTCCTGCTCCGCCCCTAAGTCGGGAAGGTTCCTTGCGGTTCGCGGCGTGCCGGACGTGACAAACGGAAGCCGCACGTCTCACTAGTACCCTCGCAGACGGACAGCGCCAGGGAGCAATGGCAGCGCGCCGACCGCGATGGGCTGTGGCCAATAGCGGCTGCTCAGCAGGGCGCGCCGAGAGCAGCGGCCGGGAAGGGGCGGTGCGGGAGGCGGGGTGTGGGGCGGTAGTGTGGGCCCTGTTCCTGCCCGCGCGGTGTTCCGCATTCTGCAAGCCTCCGGAGCGCACGTCGGCAGTCGGCTCCCTCGTTGACCGAATCACCGACCTCTCTCCCCAGTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGCCGCCACCATGTGGACTCTCGGGCGCCGCGCAGTAGCCGGCCTCCTGGCGTCACCCAGCCCGGCCCAGGCCCAGACCCTCACCCGGGTCCCGCGGCCGGCAGAGTTGGCCCCACTCTGCGGCCGCCGTGGCCTGCGCACCGACATCGATGCGACCTGCACGCCCCGCCGCGCAAGTTCGAACCAGAGAGGTCTCAACCAGATTTGGAATGTCAAAAAGCAGAGTGTCTATTTGATGAATTTGAGGAAATCTGGAACTTTGGGCCACCCAGGCTCTCTAGATGAGACCACCTATGAAAGACTAGCAGAGGAAACGCTGGACTCTTTAGCAGAGTTTTTTGAAGACCTTGCAGACAAGCCATACACGTTTGAGGACTATGATGTCTCCTTTGGGAGTGGTGTCTTAACTGTCAAACTGGGTGGAGATCTAGGAACCTATGTGATCAACAAGCAGACGCCAAACAAGCAAATCTGGCTATCTTCTCCATCCAGTGGACCTAAGCGTTATGACTGGACTGGGAAAAACTGGGTGTACTCCCACGACGGCGTGTCCCTCCATGAGCTGCTGGCCGCAGAGCTCACTAAAGCCTTAAAAACCAAACTGGACTTGTCTTCCTTGGCCTATTCCGGAAAAGATGCTTTGCCCACCTAGGGATCGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCTGCAGATATCCAGCACACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCGACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG

在优选的实施方案中，包含(i)、(ii)和(iii)的核酸的序列是SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4具有至少75％同一性的序列。优选地，所述包含(i)、(ii)和(iii)的核酸是SEQID NO:4或与SEQ ID NO:4具有至少75％、80％、85％、89％、90％、91％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。

在优选的实施方案中，所述核酸还包含PolyA信号。优选地，所述PolyA信号的长度为至少50bp、100bp、150bp或228bp。更优选地，所述PolyA信号的长度为至少228bp。最优选地，所述PolyA信号的长度为228bp。

在优选的实施方案中，所述核酸还包含一个或多个反向末端重复(ITR)序列。优选地，所述核酸包含两个ITR序列。更优选地，所述ITR序列位于所述核酸的其余组件的两端。

SEQ ID NO:5是指以下序列：

CTGGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGAATTCCGGGGTTGGGGTTGCGCCTTTTCCAAGGCAGCCCTGGGTCTGCGCAGGGACGCGGCTGCTCTGGGCGTGGTTCCGGGAAACGCAGCGGCGCCGACCCTGGGTCTCGCACATTCTTCACGTCCGTTCGCAGCGTCACCCGGATCTTCGCCGCTACCCTTGTGGGCCCCCCGGCGACGCTTCCTGCTCCGCCCCTAAGTCGGGAAGGTTCCTTGCGGTTCGCGGCGTGCCGGACGTGACAAACGGAAGCCGCACGTCTCACTAGTACCCTCGCAGACGGACAGCGCCAGGGAGCAATGGCAGCGCGCCGACCGCGATGGGCTGTGGCCAATAGCGGCTGCTCAGCAGGGCGCGCCGAGAGCAGCGGCCGGGAAGGGGCGGTGCGGGAGGCGGGGTGTGGGGCGGTAGTGTGGGCCCTGTTCCTGCCCGCGCGGTGTTCCGCATTCTGCAAGCCTCCGGAGCGCACGTCGGCAGTCGGCTCCCTCGTTGACCGAATCACCGACCTCTCTCCCCAGTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGCCGCCACCATGTGGACTCTCGGGCGCCGCGCAGTAGCCGGCCTCCTGGCGTCACCCAGCCCGGCCCAGGCCCAGACCCTCACCCGGGTCCCGCGGCCGGCAGAGTTGGCCCCACTCTGCGGCCGCCGTGGCCTGCGCACCGACATCGATGCGACCTGCACGCCCCGCCGCGCAAGTTCGAACCAGAGAGGTCTCAACCAGATTTGGAATGTCAAAAAGCAGAGTGTCTATTTGATGAATTTGAGGAAATCTGGAACTTTGGGCCACCCAGGCTCTCTAGATGAGACCACCTATGAAAGACTAGCAGAGGAAACGCTGGACTCTTTAGCAGAGTTTTTTGAAGACCTTGCAGACAAGCCATACACGTTTGAGGACTATGATGTCTCCTTTGGGAGTGGTGTCTTAACTGTCAAACTGGGTGGAGATCTAGGAACCTATGTGATCAACAAGCAGACGCCAAACAAGCAAATCTGGCTATCTTCTCCATCCAGTGGACCTAAGCGTTATGACTGGACTGGGAAAAACTGGGTGTACTCCCACGACGGCGTGTCCCTCCATGAGCTGCTGGCCGCAGAGCTCACTAAAGCCTTAAAAACCAAACTGGACTTGTCTTCCTTGGCCTATTCCGGAAAAGATGCTTTGCCCACCTAGGGATCGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCTGCAGATATCCAGCACACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCGACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTGGAATTCGAGCTCGGTACGATCAGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTGGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT

在优选的实施方案中，所述核酸是SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:5具有至少75％同一性的序列。优选地，所述核酸是SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:5具有至少75％、80％、85％、89％、90％、91％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。

在优选的实施方案中，所述载体允许在患有弗里德希氏共济失调的患者中表达治疗有效量的共济蛋白。因此，所述载体将所述核酸递送到患者的细胞，然后所述核酸在此处以治疗有效量表达共济蛋白。

在优选的实施方案中，所述AAV载体是AAV血清型9载体，即AAV-9载体。

核酸

在第二方面，本发明提供核酸，其包含：(i)编码共济蛋白的核酸序列；(ii)PGK启动子；和(iii)WPRE；其中(ii)和(iii)与(i)可操作连接并调控(i)的表达。

在优选的实施方案中，PGK启动子包含SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少75％同一性的序列。优选地，PGK启动子包含SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少75％、80％、85％、89％、90％、91％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。更优选地，PGK启动子是SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少75％、80％、85％、89％、90％、91％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。

在优选的实施方案中，WPRE包含SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少75％同一性的序列。优选地，WPRE包含SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少75％、80％、85％、89％、90％、91％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。更优选地，WPRE是SEQ IDNO:2或与SEQ ID NO:2具有至少75％、80％、85％、89％、90％、91％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。

在优选的实施方案中，编码共济蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:3或与SEQ IDNO:3具有至少75％同一性并且是共济蛋白的功能变体的序列。优选地，编码共济蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少75％、80％、85％、89％、90％、91％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。更优选地，编码共济蛋白的核酸序列是SEQ IDNO:3或与SEQ ID NO:3具有至少75％、80％、85％、89％、90％、91％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。

在优选的实施方案中，所述核酸还包含：在所述启动子和所述编码共济蛋白的核酸序列之间的接头，其中所述接头由SEQ ID NO:6或与SEQ ID NO:6具有至少75％同一性的序列组成或包含SEQ ID NO:6或与SEQ ID NO:6具有至少75％同一性的序列。优选地，所述接头由SEQ ID NO:6或与SEQ ID NO:6具有至少75％、80％、85％、89％、90％、91％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列组成或包含SEQ ID NO:6或与SEQ ID NO:6具有至少75％、80％、85％、89％、90％、91％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。

在优选的实施方案中，所述核酸还包含kozak序列并且所述kozak序列也与编码共济蛋白的核酸序列可操作连接并且调控其表达。

在优选的实施方案中，包含(i)、(ii)和(iii)的核酸的序列是SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4具有至少75％同一性的序列。优选地，所述包含(i)、(ii)和(iii)的核酸是SEQID NO:4或与SEQ ID NO:4具有至少75％、80％、85％、89％、90％、91％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。

在优选的实施方案中，所述核酸还包含PolyA信号。优选地，PolyA信号的长度为至少50bp、100bp、150bp或228bp。更优选地，PolyA信号的长度为至少228bp。最优选地，PolyA信号的长度为228bp。

在优选的实施方案中，所述核酸还包含一个或多个反向末端重复(ITR)序列。优选地，所述核酸包含两个ITR序列。更优选地，所述ITR序列位于所述核酸的其他组件的两端。

在优选的实施方案中，所述核酸是SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:5具有至少75％同一性的序列。优选地，所述核酸是SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:5具有至少75％、80％、85％、89％、90％、91％、92％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。

克隆载体

在第三方面，本发明提供克隆载体，所述克隆载体包含根据前述实施方案中任一项所述的核酸和用于促进所述克隆载体在细菌细胞中复制的另外的核酸元件。

术语“克隆载体”是指任何适用于克隆的载体，其通常涉及限制性位点、用于细菌增殖的复制起点和选择性标记的存在。

本发明的克隆载体包含本发明的核酸并且可以优选地用于制备本发明的转移载体或AAV载体。

转移载体

在第四方面，本发明提供转移载体，所述转移载体包含根据前述实施方案中任一项所述的核酸和用于促进所述转移载体整合或转座到AAV载体(优选AAV-9载体)中的另外的核酸元件。

术语“转移载体”是指适用于在AAV载体中整合或转座的载体。因此转移载体通常允许将遗传信息插入AAV载体中。

本发明的转移载体包含本发明的核酸并且可以优选地用于制备本发明的AAV载体。

核酸、克隆载体和转移载体的用途

在第五方面，本发明提供本发明的核酸，本发明的克隆载体或本发明的转移载体用于制备根据前述实施方案中任一项所述的AAV载体的用途。

药物组合物

在第六方面，本发明提供药物组合物，其包含本发明的AAV载体或本发明的核酸和药学上可接受的载体或稀释剂。

如本文中所述的药物组合物也可以含有其他物质。这些物质包括但不限于，冷冻保护剂、冻干保护剂、表面活性剂、填充剂、抗氧化剂和稳定剂。在一些实施方案中，所述药物组合物可以是冻干的。

如本文中使用的术语“冷冻保护剂”包括针对冷冻引起的胁迫为AAV载体提供稳定性的试剂，其是通过优先从AAV载体的表面排除。冷冻保护剂也可以在初级和二次干燥和长期产品存储期间提供保护。冷冻保护剂的非限制性实例包括糖类，如蔗糖、葡萄糖、海藻糖、甘露醇、甘露糖和乳糖；聚合物，如右旋糖、羟乙基淀粉和聚乙二醇；表面活性剂，如聚山梨醇酯(例如，PS-20或PS-80)；和氨基酸，如甘氨酸、精氨酸、亮氨酸和丝氨酸。通常使用的是在生物系统中显示低毒性的冷冻保护剂。

在一个实施方案中，将冻干保护剂添加到本文所述的药物组合物。如本文中使用的术语“冻干保护剂”包括这样的试剂：在冻干或脱水过程(初级和二次冻干循环)期间，通过提供非晶玻璃状基质以及通过借助氢键与AAV载体的表面结合，替代在干燥过程中被除去的水分子而为AAV载体提供稳定性。这有助于使冻干循环期间的产品降解最小化，并且提高产品长期稳定性。冻干保护剂的非限制性实例包括糖类，如蔗糖或海藻糖；氨基酸，如谷氨酸单钠，非晶甘氨酸或组氨酸；甲胺，如甜菜碱；易溶的盐(lyotropic salt)，如硫酸镁；多元醇，如三元或更多元糖醇，例如，丙三醇、赤藓糖醇、甘油、阿糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇；丙二醇；聚乙二醇；普朗尼克(pluronics)；及其组合。添加到药物组合物中的冻干保护剂的量通常为当药物组合物被冻干时不导致不可接受量的品种降解的量。

在一些实施方案中，将填充剂包含在药物组合物中。如本文中使用的术语“填充剂”包括提供冻干产品的结构而不直接与药物产品相互作用的试剂。除了提供药学上优雅的块状物以外，填充剂还可以给予关于改变坍缩(collapse)温度，提供冻融保护和增强品种的长期存储稳定性的有用的品质。填充剂的非限制性实例包括甘露醇、甘氨酸、乳糖和蔗糖。填充剂可以是晶体的(如甘氨酸、甘露醇或氯化钠)或非晶的(如葡聚糖、羟乙基淀粉)并且通常以0.5％至10％的量用于制剂中。

其他药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，如Remington药物科学(Remington'sPharmaceutical Sciences，第16版,Osol,A.编辑(1980))中描述的那些也可以被包含在本文中所述的药物组合物中，前提是其对药物组合物的所需的特性没有不利影响。如本文中使用的，“药学上可接受的载体”是指与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、涂覆剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂。此种介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域中已知的。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度对于受体是无毒的，并且包括：另外的缓冲剂；防腐剂；助溶剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；螯合剂，如EDTA；金属络合物(例如，Zn蛋白络合物)；可生物降解的聚合物，如聚酯；成盐抗衡离子，如钠、多元糖醇；氨基酸，如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸和苏氨酸；有机糖或糖醇，如乳糖醇、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、myoinisitose、肌醇(myoinisitol)，半乳糖、半乳糖醇、甘油、环醇(例如，肌醇(inositol))、聚乙二醇；含硫还原剂，如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸钠、硫代甘油、[α]-一硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量蛋白质，如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶、或其他免疫球蛋白；和亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮。

药物组合物可被制备成用于口服、舌下、颊含、静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、结膜、直肠、经皮、鞘内、局部和/或吸入介导的施用。在优选的实施方案中，药物组合物可以是适用于静脉内、肌肉内、结膜、经皮、腹膜内和/或皮下施用的溶液。在另一个实施方案中，药物组合物可以是适用于舌下、颊含和/或吸入介导的施用途径的溶液。在备选的实施方案中，药物组合物可以是适用于鞘内施用的凝胶或溶液。在备选的实施方案中，药物组合物可以是适用于吸入介导的施用的气溶胶。在优选的实施方案中，药物组合物可被制备成用于鞘内施用。

药物组合物还可以包含现有技术中已知的常见赋形剂和载体。对于固体药物组合物，可以使用常规无毒性固体载体，其包括例如药品级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。对于注射溶液，药物组合物还可以包含冷冻保护剂、冻干保护剂、表面活性剂、填充剂、抗氧化剂、稳定剂和药学上可接受的载体。对于气溶胶施用，通常将药物组合物以细粉形式与表面活性剂和推进剂一起供应。当然，所述表面活性剂必须是无毒的并且通常可溶于所述推进剂。此种试剂的代表是含6至22个碳原子的脂肪酸的酯或部分酯，如己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、olesteric酸(olesteric acid)和油酸与脂肪族多元醇或其环酸酐的酯。可以采用混合酯，如混合的或天然的甘油酯。还可以根据需要包含载体，例如卵磷脂，用于鼻内递送。对于栓剂，可以包含常规粘合剂和载体，例如，聚亚烷基二醇或甘油三酯。

医药用途

在第七方面，本发明提供本发明的AAV载体、本发明的核酸或本发明的药物组合物，其用作药物。在第八方面，本发明提供本发明的AAV载体、本发明的核酸或本发明的药物组合物，其用于治疗弗里德希氏共济失调。

在优选的实施方案中，本发明的AAV载体、本发明的核酸或本发明的药物组合物通过鞘内、肌肉内、大脑内或脑室内施用，优选为通过鞘内或肌肉内施用。

在优选的实施方案中，本发明的AAV载体、本发明的核酸或本发明的药物组合物以至少1x 10⁹载体基因组/Kg体重，优选地1x 10¹⁰、1x 10¹¹或1x 10¹²载体基因组/Kg体重的剂量施用。更优选地，以至少或约4.6x 10¹²载体基因组/Kg体重施用。

实施例

实施例1：质粒构建

将人共济蛋白(hFXN)的同种型1的编码序列与血凝素标签(HA)融合并利用HD克隆试剂盒(Clontech)克隆到pcDNA3.1表达载体中。该融合系统被用于所有克隆步骤。生成若干构建体，所述构建体将CMV或突触蛋白(phSYN)，神经元特异性烯醇酶(phNSE)，1,255bp的FXN启动子(phFXN1255)或人磷酸甘油酸激酶同种型1(phPGK1)的人(h)启动子(p)与FXN基因的编码区融合。除了在3'端的土拨鼠肝炎病毒响应元件(WPRE)序列，将另外的调控元件如CMV增强子和Kozak序列添加在5'端。所有这些表达载体生成的构建体列在表2中。

还通过将FXN的编码序列替换为萤火虫荧光素酶编码序列(LUC)(扩增自pGL3-LUC载体(Promega)，同样使用HD克隆试剂盒(Clontech))来生成包含相同的调控元件组合的质粒以驱动荧光素酶表达。这些质粒列在表3中。

实施例2：重组腺相关病毒载体构建和制备.

将来自pcDNA3.1-phPGK-kFXN-HA-WPRE和pcDNA3.1-phPGK-kLUC-HA-WPRE质粒的表达盒克隆到重组AAV9载体的SnaBI-MfeI位点(rAAV9-phPGK1-FXN-HA-WPRE载体和rAAV9-phPGK-LUC-WPRE载体)。此外，生成缺少FXN编码序列的对照无效(null)载体(AAV2/9-null)。由在动物生物技术和基因治疗中心(Center of Animal Biotechnology and GeneTherapy，Universitat Autònoma de Barcelona)的载体制备单位(Vector ProductionUnit)生产全部三种构建体和病毒颗粒。获得的最终滴度为1.4×10¹³vg/ml(AAV9-phPGK-FXN-HA-WPRE)，9.8×10¹²vg/ml(AAV9-phPGK-LUC-WPRE)，和6×10¹²vg/ml(AAV2/9-null)。

实施例3：优化共济蛋白表达

1.细胞培养、体外表达及荧光素酶报告物测定

在10cm培养皿中，以70％的汇集率，在含10％胎牛血清(Sigma)，2mM谷氨酰胺，50μg/ml青霉素/链霉素(Life technologies)的Dulbecco’s Modified Eagle’s培养基(DMEM)中培养小鼠成神经细胞瘤细胞(N2a)、人成神经细胞瘤细胞(SH-SY5Y)和人胚肾(HEK 293)细胞。对于N2a和SH-SY5Y细胞使用lipofectamine 2000(Life technologies)进行转染，对于HEK 293使用磷酸钙进行转染，除了0.25μg EGFP以外仅使用4μg质粒DNA。在转染后，将培养基替换为新鲜DMEM培养基(对于HEK细胞)和Neurobasal，B27补充剂，10μM视黄酸，2mM谷氨酰胺，50μg/ml青霉素/链霉素(对于N2a和SH-SY5Y细胞)。改变细胞培养基后48小时，收获用表2中所列表达质粒转染的细胞并将其存储在-80℃直至进一步使用。对于荧光素酶报告物测定，如上所述地转染表3中所列质粒并将细胞重新置于384孔板中并且根据生产商的说明(Promega)使用双重荧光素酶报告物测定试剂盒来确定荧光素酶活性。

2.SDS-PAGE和免疫印迹法

通过在RIPA裂解缓冲液：10mM Tris-HCl pH 7.4，140mM NaCl，0.1％脱氧胆酸钠，1％Triton X-100，1％SDS，2mM乙二胺四乙酸(EDTA)，25mM氟化钠(NaF)，2.5mM NaVO3和蛋白质抑制剂混合物(Roche)中进行匀浆处理而从培养的细胞提取蛋白质。使用DC-BioRad蛋白质测定(BioRad)确定蛋白质浓度。将总蛋白提取物与含1mM DTT的4X蛋白质样品上样缓冲液(Li-Cor Biosciences)混合并且通过在15％丙烯酰胺凝胶上以恒定的20mA电泳来进行分离，之后转移至PVDF膜。使用的一抗为抗-FXN PAC 2518(来自Grazia Isaya博士，MayoClinic，Rochester MN的馈赠)、抗-FXN(1G2，Merck Millipore)、抗-HA标签(克隆16B12，MMS-101P，Covance)和抗-β肌动蛋白(AC15，Sigma)。红外染料缀合的二抗为抗-小鼠IRDye-800CW和抗-兔IRDye 700CW(Li-Cor Biosciences)，并且使用Odyssey分析仪软件v2.1(Li-Cor Biosciences)检测免疫反应性。

3.结果

如图1-5和表2-3中可见，提供包含hPGK1启动子、接头序列(长度和内容)和WPRE的构建体允许在细胞中表达共济蛋白。人PGK1启动子是在生理相关组织中表达的代谢调控的启动子，因此成为用于共济蛋白的良好的候选启动子。然而，使用的能够表达共济蛋白编码序列的调控元件或接头序列/长度是不清楚的。通过尝试元件和序列的不同组合，我们的结果显示来自人共济蛋白编码序列的蛋白质表达需要在hPGK1启动子和FXN编码序列之间包括操作功能接头，因为含有约105nt的长度的构建体允许FXN表达，而长度约35nt的接头甚至添加WPRE RNA稳定序列也不行。有趣的是，仅在使用hPGK1启动子时观察到此种接头要求，在测试的其他启动子(即hSYN)的情况下则没有观察到。此外，来自此载体的共济蛋白的水平远低于自CMV或CAG启动子驱动的载体的水平，甚至是在不存在WPRE序列由此与内源水平更相当的情况下。之前方法的限制之一在于为了能够获得共济蛋白表达，使用高驱动启动子如CAG或CMV启动子，导致非常高水平的蛋白质表达，这可能引起细胞应激并超过一些保护作用。此处提供的载体能够驱动共济蛋白以生理功能范围内的量在相关神经系统和外周组织中表达。

表2：结果概述.转染不同构建体后FXN的相对水平

表3：共济蛋白报告物测定和PGK1启动子构建体

荧光素酶表达质粒	细胞类型	表达
			pcDNA3.1-pCMV-135nt-LUC-WPRE	N2a/HEK293	++++
pcDNA3.1-phPGK-135nt-LUC-WPRE	N2a/HEK293	++
			pcDNA3.1-E-phPGK-135nt-LUC-WPRE	N2a	++
pcDNA3.1-phFXN1255-135nt-LUC-WPRE	HEK293	-
			pcDNA3.1-phFXN1255-35nt-LUC-WPRE	N2a/HEK293	-
pcDNA3.1-phFNX220-35nt-LUC-WPRE	N2a/HEK293	+
			pcDNA3.1-phFXN1255OCT-35nt-LUC-WPRE	N2a/HEK293	-

实施例4：体内数据

1.动物

本研究中使用的由Pook及同事开发的弗里德希氏共济失调小鼠模型YG8R(Pook等.2001.Neurogenetics.3(4):185-93；Virmouni等，2014.PLoS ONE.9(9):e107416)获得自Jackson Laboratories Repository(库存号012253)。该人FXN转基因小鼠模型的内源小鼠共济蛋白基因被敲除(Fxn-/-)并且含有来自创建者YG8(带有两个串联拷贝的人FXN基因，具有约82个和190个GAA三核苷酸序列重复)的人FXN YAC转基因。将小鼠置于NexGen小鼠IVC笼(Allentown，NJ)中SPF样条件下：12小时明暗周期和受控的负压、温度和湿度，并且可自由获取水和经辐照的啮齿类食物Teklad global 18％蛋白质(Envigo)。YG8R小鼠种群在Institute for Health Science Research Germans Trias i Pujol(IGTP)产生。在所有实验中使用雌性和雄性半合子YG8R(Tg/-)和WT C57Bl/6小鼠。

突变体人FXN基因的小鼠半合子(YG8R)的基因型是如前所报道的(29,36)。简言之，通过16小鼠尾部DNA纯化试剂盒(Promega)从YG8R小鼠尾部提取基因组DNA。使用定量实时PCR(qPCR)在/>480 Instrument(Roche)中使用SYBR PremixEx Taq II(Tli RNase H Plus)(Takara)和以下人共济蛋白转基因的引物来确定每只小鼠的转基因拷贝数：hFXN_Tg_FW：5’-GAAC-TTCAAATTAGTTCCCCTTTCTTC-3’(SEQ ID NO:7)，hFXN_Tg_RV：5’-CACAGCCAT-TCTTTGGGTTTC-3’(SEQ ID NO:8)；和内参载脂蛋白B-100同种型X1：IC_FW：5’-CACGTGGGCTCCAGCATT-3’(SEQ ID NO:9)，IC_RV：TCACCAGTCATTTCTGCCTTTG(SEQ ID NO:10)。利用以下热循环条件进行测定：95℃持续5分钟，和40个循环的95℃持续20秒和60℃持续30秒，72℃持续30秒并且最后72℃持续2min的1个循环。对各目的基因一式三份地进行样品测定并且通过Ct(ΔΔCt)方法确定转基因水平。相对于来自具有已知拷贝数的对照样品的Ct数据评估转基因拷贝数。通过GAA PCR扩增PCR使用LA taq(Invitrogen)和以下引物确定GAA重复长度：GAA-F：5’-GGGATTGGTT-GCCAGTGCTT-AAAAGTTAG-3’(SEQ IDNO:11)和GAA-R：5’-GATCTAAGGACCATCATGG-CCACACTTGCC-3’(SEQ ID NO:12)。在1.5％琼脂糖凝胶中通过以100V电泳3小时来对PCR产物进行分解并且分析条带大小。然后通过从PCR产物大小减去451bp(两侧的非重复DNA)并且将剩余的碱基对重复尺寸除以3确定GAA重复的数目。

所有的动物程序根据EU和地方规定进行并且由合适的地方伦理委员会批准。

2.AAV施用

通过腹膜内注射克他命(10mg/kg体重；Imalgene 500；Lyon，France)和甲苯噻嗪(1mg/kg体重；Rompun；Bayer)将YG8R半合子和WT 10周龄小鼠麻醉。AAV9-phPGK-FXN-HA-WPRE，AAV9-phPGK-LUC-WPRE或AAV2/9-null的鞘内施用在腰部进行。在侧部脊柱暴露后，通过椎旁肌肉解剖，通过33-规针和Hamilton注射器在腰椎L3和L4之间将病毒载体缓慢注射到CSF中。通过动物尾部活动确认对鞘内空间的适当接入。之后缝合肌肉和皮肤。给每只小鼠施用的不同病毒载体的量为4.6x 10e-12vg/Kg小鼠体重。

3.使用荧光素酶成像的载体生物分布

为了对AAV9-phPGK-LUC-WPRE载体生物分布进行体内评估，小鼠在10周龄(2.5月龄)时鞘内施用所述载体并且在3.5个月后其以150mg/kg小鼠体重接受D-荧光素底物溶液的单次腹膜内注射。在底物施用后15分钟通过吸入麻醉剂(异氟烷4％用于诱发，2％用于维持)将小鼠麻醉。将麻醉的小鼠保持在Perkin Elmer Ivis Lumina II(Caliper LifeSciences，Germany)的暗室中以记录光子发射。利用Living成像软件(XenogenCorporation，CA，EUA)在1min积分时间，12.5cm视野下分析图像。对于离体评估，在底物施用后15分钟提取小鼠的组织和器官。将组织和器官置于干净的器皿中并且如上所述地利用Living成像软件(Xenogen Corporation，CA，EUA)捕捉图像。结果可见于图6。

4.qRT-PCR

使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)从30mg新鲜冷冻的小鼠组织中提取RNA。利用Agilent 2200 TapeStation(Agilent)获得RNA RIN和量化。使用PrimeScriptTM RTreagent Kit(Takara)利用以下热条件将RNA逆转录成cDNA(25ng/ul)：37℃持续15分钟，85℃持续5秒。以多孔板形式使用LightCycler480仪器(Roche Diagnostics)利用来自小鼠组织的cDNA进行qRT-PCR以测试共济蛋白表达水平。反应混合物含总体积10μl，由以下组成：0.1mM各引物，10ng的cDNA和5μl的TaqMan Universal Master Mix II，无UNG(Thermofisher Scientific)。用于人共济蛋白检测的引物-探针由Bio-rad预先设计(dHsaCPE5031641，Bio-rad)，用于小鼠样品的β-2微球蛋白(B2m)持家基因的引物由IDT预先设计(Mm.PT.39a.22214835；IDT)。利用以下热循环条件进行测定：50℃持续2分钟，95℃持续10分钟，以及40个循环的95℃持续15秒和60℃持续1分钟。对各目的基因一式三份地进行样品测定并且通过Ct(ΔΔCt)方法确定水平。结果可见于图7。

5.SDS-PAGE和免疫印迹法

通过在RIPA裂解缓冲液：10mM Tris-HCl pH 7.4，140mM NaCl，0.1％脱氧胆酸钠，1％Triton X-100，1％SDS，2mM乙二胺四乙酸(EDTA)，25mM氟化钠(NaF)，2.5mM NaVO3和蛋白质抑制剂混合物(Roche)中进行匀浆处理从小鼠组织提取蛋白质。使用DC-BioRad蛋白质测定(BioRad)确定蛋白质浓度。将总蛋白提取物与含1mM DTT的4X蛋白质样品上样缓冲液(Li-Cor Biosciences)混合并且通过在15％丙烯酰胺凝胶上以恒定的20mA电泳来进行分离，之后转移至PVDF膜。使用的一抗为抗-FXN PAC 2518(来自Grazia Isaya博士，MayoClinic，Rochester MN的馈赠)、抗-FXN(1G2，Merck Millipore)、抗-HA标签(克隆16B12，MMS-101P，Covance)和抗-β肌动蛋白(AC15，Sigma)。红外染料缀合的二抗为抗-小鼠IRDye-800CW和抗-兔IRDye 700CW(Li-Cor Biosciences)，并且使用Odyssey分析仪软件v2.1(Li-Cor Biosciences)检测免疫反应性。结果可见于图8。

6.紧扣

后肢紧扣已被证明是数种小鼠神经变性模型中疾病进展的标志。通过尾巴将各只小鼠提离周围的任何物品。观察后肢位置持续10秒并按如下进行打分：如果后肢持续向外展开，远离腹部，赋值0分。如果一条后肢向腹部缩回达超过悬吊时间的50％，其得到1分。如果两条后肢都向腹部部分缩回达超过悬吊时间的50％，其得到2分。如果其后肢完全缩回并且触及腹部达超过悬吊时间的50％，其得到3分。从4月龄起，每2个月一次评估小鼠的搂抱反射。结果可见于图9。

7.电生理学

测量小鼠尾部的尾神经的幅度(μV)和神经传导速度(m/s)。在动物处于吸入麻醉的情况下(异氟烷2％)，将刺激电极针皮下置于4个不同的刺激位点(距尾尖1cm，2cm，3cm，4cm)同时将登记针点固定在距尾尖6cm处。利用EMG/PE N-EP利用来自Medelec Synergy设备(Viasys，EUA)的2个通道记录值。在电生理测试期间，保持动物的皮肤温度高于32℃。从4月龄起，每2个月一次评估小鼠。结果可见于图10。

8.结果

我们提出提供的AAV治疗可有效作为FRDA的治疗方法，因为其可以按生理相关水平表达于生理相关组织中，显示与内源蛋白质类似的加工并且能够显著改善小鼠FRDA模型(YG8R)中受影响的神经元的电生理性质和神经学症状。图6显示，当鞘内注射时，在与AAV9-hPGK1-FXN载体中相同的调控元件控制下(除了FXN以外)，AAV9载体中的荧光素酶基因的表达遍及脊髓、脑以及外周组织。此外，在相同载体和调控元件下的荧光素酶表达在注射后约至少7个月里保持一致(数据未显示)。因为减少的共济蛋白水平是FRDA中大部分(如果不是全部)症状的基础并且用于表达≥25％水平的共济蛋白的突变的个体载体没有FRDA症状，所以FXN表达的少量增加应当能够预防或显著减轻FRDA患者的症状。然而，非常高水平的FXN表达或任何其他蛋白质可能引起细胞的并且最终减弱保护作用或甚至加重症状。因此，目的是开发产生与内源FXN蛋白的水平尽可能类似水平的FXN表达载体。因此我们开发了载体(AAV9-hPGK1-FXN)载体，其允许在代谢调控促进下以生理相关水平表达FXN并且将其鞘内递送到10周龄YG8R半合子小鼠(Tg/-)中。在鞘内注射AAV9-PGK1-FXN载体后3.5个月，与未注射的小鼠相比，在YG8R半合子小鼠(Tg/-)中，在肝和脊髓的胸部都检测到更高水平的FXN mRNA(分别为0.5和2倍；图7)。这些等于或低于纯合子YG8R小鼠，与半合子YG8R小鼠相比，纯合子YG8R小鼠分别显示0.5和3倍脊髓。这表明在L3-L4鞘内区中注射的该FXN编码载体被摄入并且通过逆向运输或当其通过脊髓液扩散时在胸脊髓神经元中表达。我们还注意到鞘内施用的AAV9载体还能够跨过血脑屏障并且到达外周组织如肝、心脏等(图6)并且能够表达来自注射的载体的hFXN mRNA(图7)。

还分析了来自开发的重组载体的FXN蛋白表达水平。虽然使用的抗体显示更高的对人FXN蛋白的亲和性(如由在将印迹与初级抗-FXN抗体孵育1小时vs.孵育过夜后获得的蛋白质图样所见)，图8显示由rAAV9-PGK1-FXN载体表达的FXN蛋白的水平表现为与WT小鼠中的小鼠FXN水平相似(图8A，第3道vs.第4道，图8B，第二幅图，第3道vs.第4道以及第5道vs.第6道和第7道)。惊人地，我们能够在小鼠脑的运动皮质区(C1)检测到重组FXN蛋白(图8B，第7道)。这指示通过鞘内注射将我们的载体递送到脊髓的腰区导致载体遍布CNS的运动相关区域。此外，重组蛋白质表现为以与野生型FXN蛋白相似的方式进行加工，其中中间体和成熟形式是最主要的加工形式。

我们进一步分析了用rAAV9-PGK1-FXN相比用rAAV9-null载体处理的YG8R半合子小鼠(Tg/-)的紧扣神经反射和尾神经的电生理性质的表型。已证明若干神经变性病症涉及搂抱反射。该反射表现为涉及感觉并且还涉及调控前后肢运动的脊柱运动通路。特别地，已证明涉及小脑-皮质-网状(cerebello-cortico-reticular pathways)通路。因此，为了确定在YG8R小鼠中rAAV9-hPGK1-FXN载体处理对这些通路的作用，我们量化了在鞘内注射所述载体后不同时间的搂抱反射(参见方法)。图9显示用AAV9-null或AAV9-FXN载体处理的YG8R小鼠在早至四月龄时(鞘内注射后1.5个月)就显示出紧扣缺陷。然而，将AAV-FXN处理的小鼠的随时间的搂抱反射归一化与WT小鼠的那些更相似，在10月龄时(注射后6.5个月)更是如此。这表明这些是FRDA小鼠模型中的感觉和小脑-皮质-网状系统的早期异常，该早期异常通过利用AAV-FXN载体的处理被显著改善或逆转。

为了更具体地确定处理对感觉神经元的作用，我们确定了与用AAV9-null对照载体处理的那些小鼠相比用AAV-FXN载体处理的YG8R小鼠的尾神经的电生理性质(幅度和速度)。图10显示，在四月龄(处理后1.5个月)，在null载体处理的WT或null和AAV-FXN处理的YG8R半合子小鼠之间，在从尾尖起的所有距离处(1-4cm)没有注意到显著差异。然而，从6月龄起，AAV9-null处理的YG8R(Tg/-)小鼠显示幅度显著减小，而AAV9-FXN处理的小鼠与WT小鼠更相似，甚至是在晚至13月龄时(处理后9.5个月)也是如此。没有观察到速度的变化(数据未显示)。这些数据表明利用AAV-hPGK1-FXN载体进行处理能够保护YG8R小鼠中尾神经的功能(可能通过阻止来自受影响的神经元的轴突的损失)。

序列表

<110> 日耳曼人特里亚斯艾普霍尔健康科学研究院基金会

<120> 用于治疗弗里德希氏共济失调的载体

<130> 903 551

<160> 12

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 518

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PGK启动子

<400> 1

gaattccggg gttggggttg cgccttttcc aaggcagccc tgggtctgcg cagggacgcg 60

gctgctctgg gcgtggttcc gggaaacgca gcggcgccga ccctgggtct cgcacattct 120

tcacgtccgt tcgcagcgtc acccggatct tcgccgctac ccttgtgggc cccccggcga 180

cgcttcctgc tccgccccta agtcgggaag gttccttgcg gttcgcggcg tgccggacgt 240

gacaaacgga agccgcacgt ctcactagta ccctcgcaga cggacagcgc cagggagcaa 300

tggcagcgcg ccgaccgcga tgggctgtgg ccaatagcgg ctgctcagca gggcgcgccg 360

agagcagcgg ccgggaaggg gcggtgcggg aggcggggtg tggggcggta gtgtgggccc 420

tgttcctgcc cgcgcggtgt tccgcattct gcaagcctcc ggagcgcacg tcggcagtcg 480

gctccctcgt tgaccgaatc accgacctct ctccccag 518

<210> 2

<211> 597

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> WPRE

<400> 2

tcgacaatca acctctggat tacaaaattt gtgaaagatt gactggtatt cttaactatg 60

ttgctccttt tacgctatgt ggatacgctg ctttaatgcc tttgtatcat gctattgctt 120

cccgtatggc tttcattttc tcctccttgt ataaatcctg gttgctgtct ctttatgagg 180

agttgtggcc cgttgtcagg caacgtggcg tggtgtgcac tgtgtttgct gacgcaaccc 240

ccactggttg gggcattgcc accacctgtc agctcctttc cgggactttc gctttccccc 300

tccctattgc cacggcggaa ctcatcgccg cctgccttgc ccgctgctgg acaggggctc 360

ggctgttggg cactgacaat tccgtggtgt tgtcggggaa gctgacgtcc tttccatggc 420

tgctcgcctg tgttgccacc tggattctgc gcgggacgtc cttctgctac gtcccttcgg 480

ccctcaatcc agcggacctt ccttcccgcg gcctgctgcc ggctctgcgg cctcttccgc 540

gtcttcgcct tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg ggccgcctcc ccgcctg 597

<210> 3

<211> 631

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 共济蛋白

<400> 3

atgtggactc tcgggcgccg cgcagtagcc ggcctcctgg cgtcacccag cccggcccag 60

gcccagaccc tcacccgggt cccgcggccg gcagagttgg ccccactctg cggccgccgt 120

ggcctgcgca ccgacatcga tgcgacctgc acgccccgcc gcgcaagttc gaaccagaga 180

ggtctcaacc agatttggaa tgtcaaaaag cagagtgtct atttgatgaa tttgaggaaa 240

tctggaactt tgggccaccc aggctctcta gatgagacca cctatgaaag actagcagag 300

gaaacgctgg actctttagc agagtttttt gaagaccttg cagacaagcc atacacgttt 360

gaggactatg atgtctcctt tgggagtggt gtcttaactg tcaaactggg tggagatcta 420

ggaacctatg tgatcaacaa gcagacgcca aacaagcaaa tctggctatc ttctccatcc 480

agtggaccta agcgttatga ctggactggg aaaaactggg tgtactccca cgacggcgtg 540

tccctccatg agctgctggc cgcagagctc actaaagcct taaaaaccaa actggacttg 600

tcttccttgg cctattccgg aaaagatgct t 631

<210> 4

<211> 1934

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PGK共济蛋白和WPRE盒

<400> 4

gaattccggg gttggggttg cgccttttcc aaggcagccc tgggtctgcg cagggacgcg 60

gctgctctgg gcgtggttcc gggaaacgca gcggcgccga ccctgggtct cgcacattct 120

tcacgtccgt tcgcagcgtc acccggatct tcgccgctac ccttgtgggc cccccggcga 180

cgcttcctgc tccgccccta agtcgggaag gttccttgcg gttcgcggcg tgccggacgt 240

gacaaacgga agccgcacgt ctcactagta ccctcgcaga cggacagcgc cagggagcaa 300

tggcagcgcg ccgaccgcga tgggctgtgg ccaatagcgg ctgctcagca gggcgcgccg 360

agagcagcgg ccgggaaggg gcggtgcggg aggcggggtg tggggcggta gtgtgggccc 420

tgttcctgcc cgcgcggtgt tccgcattct gcaagcctcc ggagcgcacg tcggcagtcg 480

gctccctcgt tgaccgaatc accgacctct ctccccagtg gctaactaga gaacccactg 540

cttactggct tatcgaaatt aatacgactc actataggga gacccaagct ggctagcgtt 600

taaacttaag cttggccgcc accatgtgga ctctcgggcg ccgcgcagta gccggcctcc 660

tggcgtcacc cagcccggcc caggcccaga ccctcacccg ggtcccgcgg ccggcagagt 720

tggccccact ctgcggccgc cgtggcctgc gcaccgacat cgatgcgacc tgcacgcccc 780

gccgcgcaag ttcgaaccag agaggtctca accagatttg gaatgtcaaa aagcagagtg 840

tctatttgat gaatttgagg aaatctggaa ctttgggcca cccaggctct ctagatgaga 900

ccacctatga aagactagca gaggaaacgc tggactcttt agcagagttt tttgaagacc 960

ttgcagacaa gccatacacg tttgaggact atgatgtctc ctttgggagt ggtgtcttaa 1020

ctgtcaaact gggtggagat ctaggaacct atgtgatcaa caagcagacg ccaaacaagc 1080

aaatctggct atcttctcca tccagtggac ctaagcgtta tgactggact gggaaaaact 1140

gggtgtactc ccacgacggc gtgtccctcc atgagctgct ggccgcagag ctcactaaag 1200

ccttaaaaac caaactggac ttgtcttcct tggcctattc cggaaaagat gctttgccca 1260

cctagggatc ggatccccgg gtaccgagct cgaattctgc agatatccag cacactttgc 1320

ctttctctcc acaggtgtcg acaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac 1380

tggtattctt aactatgttg ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt 1440

gtatcatgct attgcttccc gtatggcttt cattttctcc tccttgtata aatcctggtt 1500

gctgtctctt tatgaggagt tgtggcccgt tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt 1560

gtttgctgac gcaaccccca ctggttgggg cattgccacc acctgtcagc tcctttccgg 1620

gactttcgct ttccccctcc ctattgccac ggcggaactc atcgccgcct gccttgcccg 1680

ctgctggaca ggggctcggc tgttgggcac tgacaattcc gtggtgttgt cggggaagct 1740

gacgtccttt ccatggctgc tcgcctgtgt tgccacctgg attctgcgcg ggacgtcctt 1800

ctgctacgtc ccttcggccc tcaatccagc ggaccttcct tcccgcggcc tgctgccggc 1860

tctgcggcct cttccgcgtc ttcgccttcg ccctcagacg agtcggatct ccctttgggc 1920

cgcctccccg cctg 1934

<210> 5

<211> 2458

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ITR PGK 共济蛋白 WPRE PolyA ITR

<400> 5

ctggcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt 60

tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac 120

taggggttcc tgaattccgg ggttggggtt gcgccttttc caaggcagcc ctgggtctgc 180

gcagggacgc ggctgctctg ggcgtggttc cgggaaacgc agcggcgccg accctgggtc 240

tcgcacattc ttcacgtccg ttcgcagcgt cacccggatc ttcgccgcta cccttgtggg 300

ccccccggcg acgcttcctg ctccgcccct aagtcgggaa ggttccttgc ggttcgcggc 360

gtgccggacg tgacaaacgg aagccgcacg tctcactagt accctcgcag acggacagcg 420

ccagggagca atggcagcgc gccgaccgcg atgggctgtg gccaatagcg gctgctcagc 480

agggcgcgcc gagagcagcg gccgggaagg ggcggtgcgg gaggcggggt gtggggcggt 540

agtgtgggcc ctgttcctgc ccgcgcggtg ttccgcattc tgcaagcctc cggagcgcac 600

gtcggcagtc ggctccctcg ttgaccgaat caccgacctc tctccccagt ggctaactag 660

agaacccact gcttactggc ttatcgaaat taatacgact cactataggg agacccaagc 720

tggctagcgt ttaaacttaa gcttggccgc caccatgtgg actctcgggc gccgcgcagt 780

agccggcctc ctggcgtcac ccagcccggc ccaggcccag accctcaccc gggtcccgcg 840

gccggcagag ttggccccac tctgcggccg ccgtggcctg cgcaccgaca tcgatgcgac 900

ctgcacgccc cgccgcgcaa gttcgaacca gagaggtctc aaccagattt ggaatgtcaa 960

aaagcagagt gtctatttga tgaatttgag gaaatctgga actttgggcc acccaggctc 1020

tctagatgag accacctatg aaagactagc agaggaaacg ctggactctt tagcagagtt 1080

ttttgaagac cttgcagaca agccatacac gtttgaggac tatgatgtct cctttgggag 1140

tggtgtctta actgtcaaac tgggtggaga tctaggaacc tatgtgatca acaagcagac 1200

gccaaacaag caaatctggc tatcttctcc atccagtgga cctaagcgtt atgactggac 1260

tgggaaaaac tgggtgtact cccacgacgg cgtgtccctc catgagctgc tggccgcaga 1320

gctcactaaa gccttaaaaa ccaaactgga cttgtcttcc ttggcctatt ccggaaaaga 1380

tgctttgccc acctagggat cggatccccg ggtaccgagc tcgaattctg cagatatcca 1440

gcacactttg cctttctctc cacaggtgtc gacaatcaac ctctggatta caaaatttgt 1500

gaaagattga ctggtattct taactatgtt gctcctttta cgctatgtgg atacgctgct 1560

ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt tcattttctc ctccttgtat 1620

aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg ttgtcaggca acgtggcgtg 1680

gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg gcattgccac cacctgtcag 1740

ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc cctattgcca cggcggaact catcgccgcc 1800

tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca ctgacaattc cgtggtgttg 1860

tcggggaagc tgacgtcctt tccatggctg ctcgcctgtg ttgccacctg gattctgcgc 1920

gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag cggaccttcc ttcccgcggc 1980

ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc gccctcagac gagtcggatc 2040

tccctttggg ccgcctcccc gcctggaatt cgagctcggt acgatcagct gatcagcctc 2100

gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac 2160

cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg 2220

tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga 2280

ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc tctatggctg gcgcgctcgc 2340

tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg tcgcccggcc 2400

tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact ccatcactag gggttcct 2458

<210> 6

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 6

tggctaacta gagaacccac tgcttactgg cttatcgaaa ttaatacgac tcactatagg 60

gagacccaag ctggctagcg tttaaactta agcttggccg ccacc 105

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hFXN_Tg_FW

<400> 7

gaacttcaaa ttagttcccc tttcttc 27

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hFXN_Tg_RV

<400> 8

cacagccatt ctttgggttt c 21

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IC_FW

<400> 9

cacgtgggct ccagcatt 18

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IC_RV

<400> 10

tcaccagtca tttctgcctt tg 22

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAA-F

<400> 11

gggattggtt gccagtgctt aaaagttag 29

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAA-R

<400> 12

gatctaagga ccatcatggc cacacttgcc 30

Claims (12)

1.包含核酸的腺相关病毒(AAV)载体，其中所述核酸包含：

(i)编码共济蛋白的核酸序列；

(ii)由SEQ ID NO:1组成的磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子；和

(iii)土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；

其中(ii)和(iii)与(i)可操作连接并调控(i)的表达，其中在(i)和(ii)之间存在操作功能接头，其中所述接头由SEQ ID NO:6组成，并且其中所述AAV载体是AAV血清型9载体。

2.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述编码共济蛋白的核酸序列包含SEQ IDNO:3，或与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性并且是共济蛋白的功能变体的序列。

3.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述编码共济蛋白的核酸序列由SEQ ID NO:3，或与SEQ ID NO:3具有至少98％同一性并且是共济蛋白的功能变体的序列组成。

4.如权利要求1-3中任一项所述的载体，其特征在于，所述WPRE由SEQ ID NO:2或与SEQID NO:2具有至少90％同一性的序列组成。

5.如权利要求1-3中任一项所述的载体，其特征在于，所述WPRE由SEQ ID NO:2或与SEQID NO:2具有至少99％同一性的序列组成。

6.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述编码共济蛋白的核酸序列由SEQ ID NO:3组成，并且所述WPRE由SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的序列组成。

7.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述编码共济蛋白的核酸序列由SEQ ID NO:3组成，并且所述WPRE由SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少99％同一性的序列组成。

8.如权利要求1所述的载体，其特征在于，包含(i)、(ii)、(iii)和所述接头的所述核酸的序列由SEQ ID NO:4组成，并且其中所述AAV载体是AAV血清型9载体。

9.转移载体，所述转移载体包含核酸，所述核酸包含：

(i)编码共济蛋白的核酸序列；

(ii)由SEQ ID NO:1组成的PGK启动子；和

(iii)WPRE；

其中(ii)和(iii)与(i)可操作连接并调控(i)的表达，其中在(i)和(ii)之间存在操作功能接头，并且其中所述接头由SEQ ID NO:6组成，并且其中所述转移载体还包含另外的核酸元件用于促进所述转移载体整合或转座到AAV血清型9载体中。

10.药物组合物，其包含如权利要求1-8中任一项所述的AAV载体和药学上可接受的载体或稀释剂。

11.如权利要求1-8中任一项所述的AAV载体，其用作药物。

12.如权利要求1-8中任一项所述的AAV载体，其用于治疗弗里德希氏共济失调。