CN111537745B - 热休克蛋白90kDa αB1在检测可吸入性颗粒物导致蛋白变性程度中的应用 - Google Patents

热休克蛋白90kDa αB1在检测可吸入性颗粒物导致蛋白变性程度中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了热休克蛋白90kDa αB1在检测可吸入性颗粒物导致蛋白变性程度中的应用。本发明将热休克蛋白90kDa αB1与表面蛋白冠中含有变性蛋白的可吸入性颗粒物共同孵育，通过蛋白冠分离和蛋白质免疫印迹技术检测热休克蛋白90kDa αB1相对于颗粒表面所吸附蛋白含量的比值，可相对定量地评价可吸入性颗粒物表面蛋白变性的程度，从而判断可吸入性颗粒物通过变性蛋白可能导致的细胞毒性反应。与通过圆二色谱技术在含有可吸入性颗粒物和蛋白的混合体系中检测变性蛋白不同，本发明能直接检测仅存在于可吸入性颗粒物表面的变性蛋白。可避免传统的可吸入性颗粒物诱导蛋白变性检测方法中存在的可吸入性颗粒物干扰问题，且灵敏度较高。

Description

热休克蛋白90kDa αB1在检测可吸入性颗粒物导致蛋白变性 程度中的应用
技术领域
本发明涉及热休克蛋白90kDa αB1在检测可吸入性颗粒物导致蛋白变性程度中的应用。
背景技术
随着社会工业化发展，工程化的纳米颗粒得到越来越广泛的应用；同时，空气中存在的可吸入颗粒物也越来越复杂。因此，多种纳米材料和可吸入颗粒物引发的环境与健康问题已成为大众关注的热点。流行病学的研究显示，长期暴露于可吸入性颗粒物可能会促进肺癌、肺炎、慢性肺阻塞和心脑血管相关疾病的发生和发展。可吸入性颗粒物包括空气中的空气动力学粒径小于等于2.5微米的颗粒物(particulate matter 2.5,PM2.5)、香烟烟雾颗粒以及四氧化三铁纳米颗粒。
可吸入颗粒物的来源主要包括燃煤、工厂有害气体排放、汽车尾气排放以及建筑扬尘等几个方面。近些年来，政府相关部门已出台一系列的大气污染防治措施，包括从源头控制工业气体的排放、加快经济发展模式转变、建立和健全环境保护相关的法律法规、加速大气污染与疾病发生相关的科研公关和加强雾霾防治宣传等。但需要注意的是，现有措施还不能发挥关键作用，从环境治理和发展模式上入手在短期内无法有效改善可吸入性颗粒物引起肺部相关疾病和心脑血管疾病高发的现象。因此，加快在体内外对纳米生物毒性的研究更有助于我们发现可吸入性颗粒物导致疾病产生的主要途径和具体机制。
纳米颗粒进入体内后能够吸附以蛋白质为主的生物大分子，形成蛋白冠，并通过蛋白冠发挥生物学效应或毒性。纳米颗粒与蛋白作用的研究显示，颗粒吸附蛋白质后可诱导其发生错误折叠，这很有可能诱导蛋白变性相关细胞反应或病理过程发生。对纳米颗粒表面的变性蛋白进行精确定量有助于评价颗粒在体内的生物毒性。在已应用的变性蛋白检测方法中，圆二色谱、傅里叶红外光谱和拉曼光谱等方法可以从不同角度得出一定的蛋白变性信息，但它们都不能很好地从蛋白质体系中区分颗粒表面存在的变性蛋白，同时颗粒很有可能会干扰这些检测；因此，一种可以定量检测仅存在于颗粒表面的变性蛋白且不受颗粒干扰的检测方法是迫切需要的。
发明内容
本发明的目的是提供了热休克蛋白90kDa αB1在检测可吸入性颗粒物导致蛋白变性程度中的应用。
本发明的技术方案如下：
热休克蛋白90kDa αB1在检测可吸入性颗粒物导致蛋白变性程度中的应用。
优选的，所述可吸入性颗粒物为空气中的空气动力学粒径小于等于2.5微米的颗粒物、香烟烟雾颗粒或四氧化三铁纳米颗粒。所有颗粒物的粒径均应满足小于等于2.5微米。
优选的，所述蛋白为血清白蛋白、溶菌酶蛋白、肌红蛋白、铁蛋白或血红蛋白。
优选的，其步骤包括：
(1)将可吸入性颗粒物与蛋白混合后孵育，然后过滤，洗涤，得到可吸入性颗粒物-蛋白复合物；
(2)可吸入性颗粒物-蛋白复合物配置成混悬液，加入热休克蛋白90kDaαB1后孵育一段时间，然后过滤，洗涤，得到可吸入性颗粒物-混合蛋白复合物；
(3)分离可吸入性颗粒物-混合蛋白复合物中的蛋白冠，检测蛋白冠中热休克蛋白90kDa αB1含量与蛋白的含量，以蛋白的含量为内参计算热休克蛋白90kDa αB1的相对含量，相对含量即表征可吸入性颗粒物导致蛋白的变性程度，此处作为内参的蛋白仅指步骤(1)中可吸入性颗粒物-蛋白复合物中的蛋白，不包括热休克蛋白90kDa αB1。
优选的，步骤(3)中采用蛋白质免疫印迹分析法来检测蛋白冠中蛋白成分。
热休克蛋白90kDa αB1是一种在细胞中广泛分布、含量很高且容易被外界刺激进一步激活表达的分子伴侣，具有ATP结合区域、蛋白疏水区结合区域、辅助分子伴侣结合区域，其中蛋白疏水区结合区域可以与变性蛋白暴露出的疏水位点相结合。细胞内很多参与信号通路调控的信号分子能够与热休克蛋白90kDaαB1结合从而受到保护。当受到热激或者其他理化因素的刺激时，细胞内的变性蛋白得不到及时降解而导致其积累，在这一过程中，热休克蛋白90kDa αB1的表达被显著激活，同时其能够在ATP的介导下与变性蛋白暴露的疏水区结合，促进变性蛋白的处理，因此，热休克蛋白90kDa αB1能够快速地且高亲和性地识别和结合变性蛋白。可吸入性颗粒物与蛋白分子之间的相互作用会引起蛋白结构的错误折叠，即蛋白变性，本发明将热休克蛋白90kDa αB1与表面蛋白冠中含有变性蛋白的可吸入性颗粒物共同孵育，通过蛋白冠分离和蛋白质免疫印迹技术检测热休克蛋白90kDa αB1相对于颗粒表面所吸附蛋白含量的比值，可相对定量地评价可吸入性颗粒物表面蛋白变性的程度，从而判断可吸入性颗粒物通过变性蛋白可能导致的细胞毒性。
本发明能相对定量地检测仅存在于可吸入性颗粒物表面的蛋白的变性程度。在检测可吸入性颗粒物—蛋白混合体系中变性蛋白的传统方法(例如圆二色谱技术)中，检测结果一般会受到可吸入性颗粒物自身理化因素干扰。与在含有可吸入性颗粒物和蛋白的混合体系中检测变性蛋白不同，本发明能直接检测仅存在于可吸入性颗粒物表面的变性蛋白，避免传统的可吸入性颗粒物诱导蛋白变性检测方法中存在的可吸入性颗粒物干扰问题，且灵敏度较高。
附图说明
图1、实施例1中在不同孵育时间下四氧化三铁纳米颗粒诱导血清白蛋白变性的情况。
图2、实施例1中四氧化三铁纳米颗粒与血清白蛋白孵育不同时间后吸附热休克蛋白90kDa αB1的相对含量。
图3、实施例1中纳米颗粒-蛋白冠中的热休克蛋白90kDa αB1的相对吸附量与蛋白质的变性程度的相关性分析。
图4、通过检测纳米颗粒蛋白冠中热休克蛋白90kDa αB1的相对吸附量可以评价颗粒诱导蛋白变性的程度。
具体实施方式
实施例1
传统的圆二色谱技术可以检测含有可吸入性颗粒物与蛋白的混合体系中的变性蛋白。因此，首先使用圆二色谱技术检测在不同孵育时间下四氧化三铁纳米颗粒诱导血清白蛋白二级结构改变的情况：
根据蛋白质二级结构和蛋白折叠特性的变化，圆二色谱技术可用于检测纳米颗粒诱导的蛋白质错误折叠。蛋白质的α-螺旋结构在208nm和222nm处出现负峰，圆二色谱峰的位置发生位移代表蛋白质原有α-螺旋和β-折叠数量的改变。
在实验前制备新鲜的蛋白质溶液，在Tris-HCl储存液(150mM NaCl和20mM Tris-HCl，pH7.4)中溶解血清白蛋白(20μM)。将四氧化三铁纳米颗粒以100μg/ml的浓度与过滤后的血清白蛋白在0.5ml体积下室温孵育不同时间(0min、10min、30min、60min、120min和240min)。随后，将所有样品稀释40倍，进行圆二色谱检测。实验中圆二色谱检测所使用的蛋白质浓度根据208nm和222nm处的圆二色谱数值确定。
圆二色谱检测与分析：在190-260nm波长内以1nm的分辨率收集圆二色谱信号，并以50nm/min的速度收集三次扫描的平均值。在室温下进行所有光谱分析，并将含有或不含有NPs的缓冲溶液的光谱作为基线被减去。以测得的毫度值(millidegrees,mdeg)为基础在Origin软件中制图。使用以下公式将数据转换为平均蛋白残基摩尔椭圆度[θ]和Δε。1：椭圆度[θ]，单位是deg·cm2/dmol；
公式为：
1)[θ]＝(mdeg×肽平均残留量)/(样品池路径长度×蛋白浓度)；
2)Δε＝[θ]/3298；
肽平均残留量(MRW)是蛋白分子量除以主链氨基酸的数量，白蛋白的MRW值为113.90，样品池路径长度为10mm，白蛋白浓度值为0.03mg/ml。在190-260nm波长范围内，根据白蛋白摩尔质量70KDa，通过K2D3工具(http://cbdm-01.zdv.uni-mainz.de/～andrade/k2d3//)计算每组样品的α-螺旋和β-折叠结构的百分比。
结果表明：随着四氧化三铁纳米颗粒与白蛋白孵育时间的增加，血清白蛋白圆二色谱的峰值逐渐向上位移，说明血清白蛋白二级结构α-螺旋的含量逐渐降低，β-折叠的含量逐渐升高，说明血清白蛋白变性的程度随孵育时间增加而增加。
纳米颗粒蛋白冠吸附热休克蛋白90kDa αB1(Hsp90ab1)的检测，包括步骤：
1)四氧化三铁纳米颗粒与血清白蛋白孵育不同的时间：
在室温下，将浓度为100μg/ml四氧化三铁纳米颗粒与浓度为100μg/ml的血清白蛋白溶液在2ml离心管中以1ml体积在摇床上振荡孵育(100rpm/min)2h，分别设置不同孵育时间组(0min、10min、30min、60min、120min和240min)，然后在使用1xPBS洗涤四氧化三铁纳米颗粒三次，每次洗涤以12000rpm/min离心5min，最后得到四氧化三铁纳米颗粒—白蛋白复合物。每组沉淀中加入1ml的1x PBS并用移液器吹打混匀。
2)四氧化三铁纳米颗粒—白蛋白复合物与热休克蛋白90kDa αB1孵育：
在每组中重悬的1ml混悬液中分别加入10ug的热休克蛋白90kDa αB1，然后在2ml离心管中振荡孵育(100rpm/min)1h，以12000rpm/min离心5min，使用1xPBS洗涤四氧化三铁纳米颗粒三次，去上清，留下纳米颗粒-蛋白质复合物沉淀。
3)四氧化三铁纳米颗粒表面的血清白蛋白-热休克蛋白90kDa αB1蛋白冠的分离：
在每组的沉淀中加入200ul的RIPA裂解液，反复吹打，在冰上裂解30min，以12000rpm/min离心5min，取裂解液上清，并加入四分之一体积的SDS上样缓冲液，100℃加热5min，随后在-20℃保存备用。
4)蛋白冠中血清白蛋白和热休克蛋白90kDa αB1的蛋白质免疫印迹分析和灰度值计算：
结合图2所示，经过四氧化三铁纳米颗粒与血清白蛋白质孵育和洗涤，以及随后与热休克蛋白90kDa αB1的孵育、洗涤，对所有蛋白冠成分进行裂解，最后进行蛋白质免疫印迹分析和灰度值计算；
蛋白质免疫印迹：对含有血清白蛋白和热休克蛋白90kDa αB1的蛋白溶液进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后使用PVDF膜进行蛋白分子的转移，然后在4℃过夜孵育血清白蛋白和热休克蛋白90kDa αB1的一级抗体，使用PBST洗涤PVDF膜三次，室温孵育二级抗体1h，使用PBST洗涤含有蛋白特异性抗体的PVDF膜，加入发光底物后使用化学发光成像仪进行曝光成像，获得这两种蛋白的蛋白质免疫印迹条带，并使用Image J软件进行灰度分析和相对定量，以血清白蛋白为内参，将热休克蛋白90kDa αB1的灰度值除以血清白蛋白的灰度值，得到在四氧化三铁纳米颗粒表面吸附的热休克蛋白90kDa αB1的相对含量。
结果表明：随着四氧化三铁纳米颗粒与血清白蛋白孵育时间的增加，蛋白冠成分中热休克蛋白90kDa αB1相对于血清白蛋白的吸附量逐渐升高。
不同孵育时间下，四氧化三铁纳米颗粒诱导血清白蛋白变性与热休克蛋白90kDaαB1的相对吸附量的相关性分析：
结合图3所示，在GraphPad软件中，根据“线性回归”和“相关性分析”进行相关性分析。分别对圆二色谱结果中α-螺旋和β-折叠含量的变化和蛋白质免疫印迹结果中热休克蛋白90kDa αB1的相对吸附量的变化进行相关性分析，将至少三组数据用于相关性分析，并可获得“皮尔逊r”值和“P”值。
结果表明：圆二色谱结果中α-螺旋和β-折叠百分比的变化与蛋白质免疫印迹结果中热休克蛋白90kDa αB1的相对吸附量变化具有显著相关性。说明以四氧化三铁纳米颗粒表面蛋白冠中的变性检测目标—白蛋白作为内参，利用蛋白质免疫印迹技术分析得到热休克蛋白90kDa αB1的相对吸附量，通过比较热休克蛋白90kDa αB1的相对吸附量，可以精确地评价纳米颗粒表面白蛋白的变性程度。
实施例2
使用圆二色谱技术检测在不同孵育时间下四氧化三铁纳米颗粒诱导溶菌酶蛋白二级结构改变的情况：
在实验前制备新鲜的溶菌酶蛋白溶液，在Tris-HCl储存液(150mM NaCl和20mMTris-HCl，pH7.4)中溶解溶菌酶蛋白(80μM)。将四氧化三铁纳米颗粒以100μg/ml的浓度与过滤后的溶菌酶蛋白在0.5ml体积下室温孵育不同时间(0min、10min、30min、60min、120min和240min)。随后，将所有样品稀释40倍，进行圆二色谱检测。实验中圆二色谱检测所使用的蛋白质浓度根据208nm和222nm处的圆二色谱数值确定。
检测方法和分析方法同上，以测得的毫度值(millidegrees)为基础在Origin软件中制图。溶菌酶蛋白的MRW值为111.74，溶菌酶蛋白浓度值为0.03mg/ml，在190-260nm波长范围内，根据溶菌酶蛋白摩尔质量17KDa，通过K2D3工具(http://cbdm-01.zdv.uni-mainz.de/～andrade/k2d3//)计算每组样品的α-螺旋和β-折叠结构的百分比。
结果表明：随着四氧化三铁纳米颗粒与溶菌酶蛋白孵育时间的增加，溶菌酶蛋白圆二色谱的峰值越来越高，溶菌酶蛋白二级结构α-螺旋的含量逐渐降低，β-折叠的含量逐渐升高，说明溶菌酶蛋白变性的程度随孵育时间增加而增加。
纳米颗粒蛋白冠吸附热休克蛋白90kDa αB1的检测，包括步骤：
1)四氧化三铁纳米颗粒与溶菌酶蛋白孵育不同的时间：
在室温下，将浓度为100μg/ml四氧化三铁纳米颗粒与浓度为400μg/ml的溶菌酶蛋白溶液在2ml离心管中以1ml体积在摇床上振荡孵育(100rpm/min)2h，分别设置不同孵育时间组(0min、10min、30min、60min、120min和240min)，然后在使用1xPBS洗涤四氧化三铁纳米颗粒三次，每次洗涤以12000rpm/min离心5min，最后得到四氧化三铁纳米颗粒—溶菌酶蛋白复合物。每组沉淀中加入1ml的1x PBS并用移液器吹打混匀。
2)四氧化三铁纳米颗粒—溶菌酶蛋白复合物与热休克蛋白90kDa αB1孵育：
在每组中重悬的1ml混悬液中分别加入10ug的热休克蛋白90kDa αB1，然后在2ml离心管中振荡孵育(100rpm/min)1h，以12000rpm/min离心5min，使用1xPBS洗涤四氧化三铁纳米颗粒三次，去上清，留下纳米颗粒-蛋白质复合物沉淀。
3)四氧化三铁纳米颗粒表面的溶菌酶蛋白-热休克蛋白90kDa αB1蛋白冠的分离：
在每组的沉淀中加入200ul的RIPA裂解液，反复吹打，在冰上裂解30min，以12000rpm/min离心5min，取裂解液上清，并加入四分之一体积的SDS上样缓冲液，100℃加热5min，随后在-20℃保存备用。
4)蛋白冠中溶菌酶蛋白和热休克蛋白90kDa αB1的蛋白质免疫印迹分析和灰度值计算：
经过四氧化三铁纳米颗粒与溶菌酶蛋白的孵育和洗涤，以及随后与热休克蛋白90kDa αB1的孵育、洗涤，对所有蛋白冠成分进行裂解，最后进行蛋白质免疫印迹分析和灰度值计算，方法同上。
结果表明：随着四氧化三铁纳米颗粒与溶菌酶蛋白孵育时间的增加，蛋白冠成分中热休克蛋白90kDa αB1相对于溶菌酶蛋白的吸附量逐渐升高。
不同孵育时间下，四氧化三铁纳米颗粒诱导溶菌酶蛋白变性与热休克蛋白90kDaαB1的相对吸附量的相关性分析，方法同上。
结果表明：溶菌酶蛋白的圆二色谱结果中α-螺旋和β-折叠百分比的变化与蛋白质免疫印迹结果中热休克蛋白90kDa αB1的相对吸附量变化具有显著相关性。说明以四氧化三铁纳米颗粒表面蛋白冠中的变性检测目标—溶菌酶蛋白作为内参，利用蛋白质免疫印迹技术分析得到热休克蛋白90kDa αB1的相对吸附量，通过比较热休克蛋白90kDa αB1的相对吸附量，可以精确地评价纳米颗粒表面溶菌酶蛋白的变性程度。
实施例3
使用圆二色谱技术检测在不同孵育时间下四氧化三铁纳米颗粒诱导肌红蛋白二级结构改变的情况：
在实验前制备新鲜的肌红蛋白溶液，在Tris-HCl储存液(150mM NaCl和20mMTris-HCl，pH7.4)中溶解肌红蛋白(80μM)。将四氧化三铁纳米颗粒以100μg/ml的浓度与过滤后的肌红蛋白在0.5ml体积下室温孵育不同时间(0min、10min、30min、60min、120min和240min)。随后，将所有样品稀释40倍，进行圆二色谱检测。实验中圆二色谱检测所使用的蛋白质浓度根据208nm和222nm处的圆二色谱数值确定。
检测方法和分析方法同上，以测得的毫度值(millidegrees)为基础在Origin软件中制图。肌红蛋白的MRW值为111.58，肌红蛋白浓度值为0.03mg/ml，在190-260nm波长范围内，根据肌红蛋白摩尔质量17KDa，通过K2D3工具(http://cbdm-01.zdv.uni-mainz.de/～andrade/k2d3//)计算每组样品的α-螺旋和β-折叠结构的百分比。
结果表明：随着四氧化三铁纳米颗粒与肌红蛋白孵育时间的增加，肌红蛋白圆二色谱的峰值越来越高，肌红蛋白二级结构α-螺旋的含量逐渐降低，β-折叠的含量逐渐升高，说明肌红蛋白变性的程度随孵育时间增加而增加。
纳米颗粒蛋白冠吸附热休克蛋白90kDa αB1的检测，包括步骤：
1)四氧化三铁纳米颗粒与肌红蛋白孵育不同的时间：
在室温下，将浓度为100μg/ml四氧化三铁纳米颗粒与浓度为400μg/ml的肌红蛋白溶液在2ml离心管中以1ml体积在摇床上振荡孵育(100rpm/min)2h，分别设置不同孵育时间组(0min、10min、30min、60min、120min和240min)，然后在使用1xPBS洗涤四氧化三铁纳米颗粒三次，每次洗涤以12000rpm/min离心5min，最后得到四氧化三铁纳米颗粒—肌红蛋白复合物。每组沉淀中加入1ml的1x PBS并用移液器吹打混匀。
2)四氧化三铁纳米颗粒—肌红蛋白复合物与热休克蛋白90kDa αB1孵育：
在每组中重悬的1ml混悬液中分别加入10ug的热休克蛋白90kDa αB1，然后在2ml离心管中振荡孵育(100rpm/min)1h，以12000rpm/min离心5min，使用1xPBS洗涤四氧化三铁纳米颗粒三次，去上清，留下纳米颗粒-蛋白质复合物沉淀。
3)四氧化三铁纳米颗粒表面的肌红蛋白和热休克蛋白90kDa αB1蛋白冠的分离：
在每组的沉淀中加入200ul的RIPA裂解液，反复吹打，在冰上裂解30min，以12000rpm/min离心5min，取裂解液上清，并加入四分之一体积的SDS上样缓冲液，100℃加热5min，随后在-20℃保存备用。
4)蛋白冠中肌红蛋白和热休克蛋白90kDa αB1的蛋白质免疫印迹分析和灰度值计算：
经过四氧化三铁纳米颗粒与肌红蛋白的孵育和洗涤，以及随后与热休克蛋白90kDa αB1的孵育、洗涤，对所有蛋白冠成分进行裂解，最后进行蛋白质免疫印迹分析和灰度值计算，方法同上。
结果表明：随着四氧化三铁纳米颗粒与肌红蛋白孵育时间的增加，蛋白冠成分中热休克蛋白90kDa αB1相对于肌红蛋白的吸附量逐渐升高。
不同孵育时间下，四氧化三铁纳米颗粒诱导肌红蛋白变性与热休克蛋白90kDa αB1的相对吸附量的相关性分析，方法同上。
结果表明：肌红蛋白的圆二色谱结果中α-螺旋和β-折叠百分比变化与蛋白质免疫印迹结果中热休克蛋白90kDa αB1的相对吸附量变化具有显著相关性。说明以四氧化三铁纳米颗粒表面蛋白冠中的变性检测目标—肌红蛋白作为内参，利用蛋白质免疫印迹技术分析得到热休克蛋白90kDa αB1的相对吸附量，通过比较热休克蛋白90kDa αB1的相对吸附量，可以精确地评价纳米颗粒表面肌红蛋白的变性程度。

Claims (5)

1.热休克蛋白90kDaαB1在检测可吸入性颗粒物导致蛋白变性程度中的应用，所述可吸入性颗粒物为空气中的空气动力学粒径小于等于2.5微米的颗粒物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述可吸入性颗粒物为四氧化三铁纳米颗粒。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述蛋白为血清白蛋白、溶菌酶蛋白、肌红蛋白、铁蛋白或血红蛋白。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其步骤包括：
(1)将可吸入性颗粒物与蛋白混合后孵育，然后离心，洗涤，得到可吸入性颗粒物-蛋白复合物；
(2)可吸入性颗粒物-蛋白复合物配置成混悬液，加入热休克蛋白90kDaαB1后孵育一段时间，然后离心，洗涤，得到新的可吸入性颗粒物-混合蛋白复合物；
(3)分离新的可吸入性颗粒物-混合蛋白复合物中的蛋白冠，检测蛋白冠中热休克蛋白90kDaαB1与蛋白的含量，以蛋白的含量为内参计算热休克蛋白90kDaαB1的相对含量，相对含量即表征可吸入性颗粒物导致蛋白的变性程度。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：步骤(3)中采用蛋白质免疫印迹分析法检测蛋白冠中蛋白成分。
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