CN111533587A - 一种高效的蓝藻有机质资源综合利用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于环保技术领域，涉及一种高效的蓝藻有机质资源综合利用方法，包括如下步骤：S1.蓝藻采用复合降解菌进行发酵；S2.将发酵后的蓝藻与辅料混匀，蓝藻：辅料的干物质比为2:4~6，调节含水率为62%~75%；S3.将黑水虻幼虫按照万分之一比例，添加到上述蓝藻和辅料的混合物料中，处理期间温度维持25~28℃，底物含水率维持在62%~75%；S4.对虫体与底料进行分离。S5.底料室温下堆沤，得到腐熟后的生物有机肥。既能实现蓝藻的高效处理，又能够降解蓝藻藻毒素，而且可以带来经济效益，且幼虫死亡率为4.1%以下，黑水虻平均体重至少201 mg/虫。
Description
技术领域
本发明属于环保技术领域，涉及一种高效的蓝藻有机质资源综合利用方法。
背景技术
在一些营养丰富的水体中，有些蓝藻常于夏季大量繁殖，并在水面形成一层蓝绿色蓝藻水华而有腥臭味的浮沫，称为"水华"，大规模的蓝藻爆发，被称为"绿潮"。绿潮引起水质恶化，严重时耗尽水中氧气而造成鱼类的死亡。更为严重的是，蓝藻中有些种类(如微囊藻)还会产生微囊藻毒素(microcystins，简称MCs)，大约50%的绿潮中含有大量MCs。
微囊藻毒素（简称MCs），是一类具有生物活性的环状七肽化合物，分子量约1000Da左右，目前已发现90多种异构体，在这些已鉴定的异构体中，发现分布最广的、产量和毒性最大的三类为微囊藻毒素-LR（MC-LR）、微囊藻毒素-RR（MC-RR）和微囊藻毒素-YR（MC-YR），其中MC-LR的毒性最强，也是水体中存在最普遍、含量最多、分布最广泛的MCs，占MCs 总量的90％。MCs除了直接对鱼类、人畜产生毒害之外，也是肝癌的重要诱因。
蓝藻内含大量N、P 等营养元素和藻蓝蛋白等可利用物质，但由于其含有微囊藻毒素，并受当前技术水平和经济成本等因素的制约，我国湖面打捞的蓝藻大多经藻水分离形成藻饼，外运后简单填埋，并未进行大规模资源化利用。将蓝藻填埋或长期堆积在岸边，不仅无法有效利用丰富的蓝藻有机质，而且会产生藻毒素、多环芳烃等毒性物质，并伴随着具有臭味的硫化氢、氨气等有害气体释放。
专利申请公布号为CN111011311A的中国发明专利申请于2020年4月17日公开了亮斑扁角水虻在转化蓝藻藻泥同时降解藻毒素中的应用，并具体公开将亮斑扁角水虻添加至含有蓝藻藻泥和辅料（麸皮或玉米皮和菌渣）的基质中，蓝藻藻泥：麸皮=1:5-10；或蓝藻藻泥：玉米皮：菌渣=1:7-20:1-3。上述专利公开的方案还存在一定的缺陷：1.基质中蓝藻藻泥的添加量偏少，而麸皮或玉米皮、菌渣又需要购买，因此无法产生经济价值，还需要额外投入钱财；2.对藻毒素的降解效果有限，亮斑扁角水虻死亡率高，所带来的经济效益降低。
发明内容
为了解决蓝藻在处理过程中存在的上述缺陷，本发明提供一种高效的蓝藻有机质资源综合利用的方法，既能实现蓝藻的高效处理，又能够降解蓝藻藻毒素，而且可以带来经济效益。本发明采用如下的技术方案：
一种高效的蓝藻有机质资源综合利用方法，包括如下步骤：
S1. 蓝藻采用复合降解菌进行发酵；
S2. 将发酵后的蓝藻与辅料混匀，蓝藻：辅料的干物质比为2:4~6，调节含水率为62%~75%；
S3. 将黑水虻幼虫按照万分之一比例，添加到上述蓝藻和辅料的混合物料中，处理期间温度维持25~28℃，底物含水率维持在62%~75%；
S4.对虫体与底料进行分离。
S5.底料室温下堆沤，得到腐熟后的生物有机肥。
作为优选，复合降解菌通过如下方法获得：
S11. 取河流或湖泊中水样，抽提水样DNA；
S12. 以上述抽提的水样DNA为模板，以引物1（5’ TGCGCTATGGGKCAGATCC3’）和引物2（5’ GGTCAAACTTCTTGAGSAGCTG， 3’）为引物，进行PCR反应，测序，确认有无藻毒素降解关键基因mlrA；引物中K代表T或G、S代表G或C；
S13. 取确认含mlrA基因序列的水样，接种于LB培养基中，振荡培养，接着取上述培养液接种于含1 mg/L微囊藻毒素LR的无机盐培养基中，振荡培养，之后每隔2天以10%接种量接种至新的无机盐培养基中，逐渐提高无机盐培养基中微囊藻毒素的浓度，逐步富集微囊藻毒素降解菌，并通过mlrA基因PCR确认；
S14.待富集结束后，离心收集菌体，并用生理盐水清洗收集后，于LB培养基中扩大培养，获得复合降解菌。
作为优选，所述辅料为麸皮、米糠、木屑、餐厨垃圾中的一种或几种混合。
作为优选，所述复合降解菌按照0.1%蓝藻体积加入。
作为优选，步骤S3中采用经过驯化的黑水虻幼虫，驯化方法：在喂食蓝藻过程中，选择个体大的幼虫，进入后期预蛹、蛹、成虫及产卵生活史；获得的虫卵经70%含水率的麸皮孵化后，继续喂食蓝藻，并继续挑选个体大的幼虫，进行新一轮筛选，如此反复，共计进行至少5轮驯化和筛选。
作为优选，所述个体大的幼虫是指虫体长度达到2cm以上的幼虫。
作为优选，黑水虻的驯化方法中，孵化温度25~28℃，孵化时间3-4天。
作为优选，步骤S3中的黑水虻幼虫选用3日龄的幼虫。
作为优选，当第一个虫蛹出现时，进行步骤S4操作。
作为优选，步骤S4中分离出来的虫体经烘干机烘干至含水率10％左右，得到昆虫蛋白饲料。
通过实施上述技术方案，本发明具有如下的有益效果：
1.既能实现蓝藻的高效处理，又能够降解蓝藻藻毒素，而且可以带来经济效益。
2.经黑水虻转化后，虫体和生物有机肥中均检测不到藻毒素。
3.幼虫死亡率为4.1%以下，黑水虻平均体重至少201 mg/虫。
具体实施方式
以下结合具体的实施例和实验数据对本发明做进一步的说明。应理解，本发明的实施例只用于说明本发明而非限制本发明，在不脱离本发明技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出的各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。
本发明实施例中所述技术方案，如未特别说明，均为常规技术方案，所用试剂或配方若未特别说明，均购自生化商店。
实施例1
一种高效的蓝藻有机质资源综合利用方法，包括如下步骤：
S1. 蓝藻采用复合降解菌进行发酵；
本试验从浙江湖州渔人码头附近的太湖表层水中取样，用Water DNA Kit水体DNA提取试剂盒（Omega）抽提水样DNA。将目前 NCBI数据库中已有的微囊藻毒素降解关键基因mlrA序列，使用MEGA软件进行比对分析，配合Primer Premier5.0在同源性高的序列间设计两条简并引物，通过PCR扩增，检测水样中有无微囊藻毒素降解菌。以上述抽提的水样DNA为模板，以引物1（5’ TGCGCTATGGGKCAGATCC，其中K代表T或G 3’）和引物2（5’GGTCAAACTTCTTGAGSAGCTG，其中S代表G或C 3’）为引物，进行PCR反应。PCR反应体系为:步骤1所得的模板2µL，Taq DNA聚合酶(5Μ/μL)1μL，10×PCR buffer 5µL，引物1(10μmol/µL)1µL，引物2(10μmol/µL)1µL，dNTP(100mmol/L)1μL，H2O 39µL，总体积50µL。PCR反应程序如下：94℃预热5min；然后94℃ 50s, 55℃ 30s，72℃ 1min，30个循环；最后72℃延伸10min。取上述PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，若有mlrA基因，则在132 bp有条带。通过 SanPrep 柱式DNA 胶回收试剂盒（生工生物工程（上海）有限公司）将此条带回收后，送生工生物工程（上海）有限公司测序确认。
取确认含微囊藻毒素降解菌的水样2 mL，接种于100 mL LB培养基中，30℃，120rpm振荡培养1天。接着取1 mL上述培养液接种于含1 mg/L微囊藻毒素LR的100 mL无机盐培养基中，30℃，120 rpm振荡培养2天，之后每隔2天以10%接种量接种至新的无机盐培养基中，逐渐提高无机盐培养基中微囊藻毒素的浓度（1-25 mg/L），逐步富集微囊藻毒素降解菌，并通过mlrA基因PCR确认。待富集结束后，离心收集菌体，并用生理盐水清洗收集后，于LB培养基中扩大培养。
LB培养基：10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L氯化钠，pH7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
无机盐培养基：4g Na2HPO4、1.5g KH2PO4、1g NH4Cl、0.2g MgSO4•7H2O、0.02gCaCl2、0.03g FeSO4•7H2O、1.0g NaNO3、1mL 微量元素/L培养基（每100mL溶液包括：0.25mgCoCl2•6H2O、0.37mg (NH4)6Mo7O24•4H2O、4.0mg CuSO4•5H2O、5.7mg H3BO3、4.3mg MnSO4•5H2O、4.3mg ZnSO4•7H2O），去离子水定容到1000mL，121℃高压蒸汽灭菌20min。
S2.按照0.1%蓝藻体积，加入上述混菌菌液，常温放置3天后，对藻毒素的去除率为99.1%。将混菌发酵后的蓝藻与麸皮混匀，蓝藻：麸皮的干物质比为2:5，调节含水率为70%。
选取黑水虻虫卵孵化，置于孵化室进行孵化，孵化过程中所用饲料为麸皮，含水率为70%，孵化温度28℃，孵化时间3天。之后继续在该物料中培养黑水虻幼虫3天。
S3.将黑水虻幼虫（3日龄）按照万分之一比例，添加到上述蓝藻和麸皮的混合物料中，喂食14天，处理期间温度维持28℃，底物含水率维持在70％。
S4.当第一个虫蛹出现时，用网筛对虫体与底料进行分离。
S5.鲜虫经烘干机烘干至含水率10％左右，得到昆虫蛋白饲料。底料室温下堆沤15天，得到腐熟后的生物有机肥。
经黑水虻转化后，虫体和生物有机肥中均检测不到藻毒素。物料减少率为62.1%，幼虫死亡率为4.8%，黑水虻平均体重为175mg/虫。
实施例2：
与实施例1的不同在于，在S3中，采用经过驯化的黑水虻幼虫，在喂食蓝藻过程中，选择个体大的幼虫（驯化培养20天，虫体长度达到2cm以上的幼虫），进入后期预蛹、蛹、成虫及产卵生活史。获得的虫卵经70%含水率的麸皮孵化后（孵化温度28℃，孵化时间3天），继续喂食蓝藻，并继续挑选个体大的幼虫，进行新一轮筛选。如此反复，共计进行5轮驯化和筛选。
将上述经驯化后的黑水虻，按照实施例1中S3的方法进行喂食，其物料减少率为70.3%，幼虫死亡率为4.1%，黑水虻平均体重为201 mg/虫，效果较未驯化前显著。
实施例3：
与实施例1的不同在于，将S2中的麸皮替换为米糠，蓝藻：米糠的干物质比为2:6，直接将蓝藻与麸皮混合，按照S3中的方法进行喂食，经黑水虻转化后，物料减少率为53.3%，幼虫死亡率为5.8%，黑水虻平均体重为163mg/虫。
实施例4：
与实施例1的不同在于，将S2中的麸皮替换为木屑，蓝藻：木屑的干物质比为2:4，直接将蓝藻与麸皮混合，按照S3中的方法进行喂食，经黑水虻转化后，物料减少率为52.6%，幼虫死亡率为6.3%，黑水虻平均体重为159mg/虫。
实施例5：
与实施例1的不同在于，将S2中的麸皮替换为餐厨垃圾和木屑，蓝藻：餐厨垃圾：木屑的干物质比为2:2:4，直接将蓝藻与麸皮混合，按照S3中的方法进行喂食，经黑水虻转化后，物料减少率为64.7%，幼虫死亡率为4.9%，黑水虻平均体重为173mg/虫。
对比例1
采用专利申请公开号CN111011311A 、专利名称“-亮斑扁角水虻在转化蓝藻藻泥同时降解藻毒素中的应用”中的实施方式。
随着物料中蓝藻比例的增加，幼虫死亡率显著增加，当蓝藻：麸皮的干物质比约为1:5时（96.3%含水率的藻泥500g，麸皮100g），幼虫死亡率38%，水虻的转化率降低，说明藻毒素会严重影响水虻的生长。经水虻转化后，转化后物料中藻毒素的含量为11.97 μg/g（333.33g物料，物料减少率为46.12%，剩余藻毒素总量2146.83 ug），鲜虫中藻毒素含量为0.67μg/g（333.33g物料，幼虫转化率为13.44%，虫体中藻毒素总量29.81 ug），虫干中藻毒素含量为2.22 μg/g（100 g物料干重，幼虫转化率为13.44%，虫体中藻毒素总量29.81 ug），其藻毒素的含量都远超于国家饮用水中规定的1μg/L或1μg/kg的限定值。
对比例2：
与实施例1的不同在于，无蓝藻的复合降解菌步骤S1，直接将蓝藻与麸皮混合，按照S3中的方法进行喂食，经黑水虻转化后，虫体和生物有机肥中藻毒素含量分别约占初始藻毒素总量的。物料减少率为39.3%，幼虫死亡率为32.1%，黑水虻平均体重为151mg/虫。
Claims (10)
1.一种高效的蓝藻有机质资源综合利用方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1. 蓝藻采用复合降解菌进行发酵；
S2. 将发酵后的蓝藻与辅料混匀，蓝藻：辅料的干物质比为2:4~6，调节含水率为62%~75%；
S3. 将黑水虻幼虫按照万分之一比例，添加到上述蓝藻和麸皮的混合物料中，处理期间温度维持25~28℃，底物含水率维持在62%~75%；
S4.对虫体与底料进行分离，
S5.底料室温下堆沤，得到腐熟后的生物有机肥。
2.根据权利要求1所述的一种高效的蓝藻有机质资源综合利用方法，其特征在于，复合降解菌通过如下方法获得：
S11. 取河流或湖泊中水样，抽提水样DNA；
S12. 以上述抽提的水样DNA为模板，以引物1（5’ TGCGCTATGGGKCAGATCC3’）和引物2（5’ GGTCAAACTTCTTGAGSAGCTG， 3’）为引物，进行PCR反应，测序，确认有无藻毒素降解关键mlrA基因序列；
S13. 取确认含mlrA基因序列的水样，接种于LB培养基中，振荡培养，接着取上述培养液接种于含1 mg/L微囊藻毒素LR的无机盐培养基中，振荡培养，之后每隔2天以10%接种量接种至新的无机盐培养基中，逐渐提高无机盐培养基中微囊藻毒素的浓度，逐步富集微囊藻毒素降解菌，并通过mlrA基因PCR确认；
S14.待富集结束后，离心收集菌体，并用生理盐水清洗收集后，于LB培养基中扩大培养，获得复合降解菌。
3.根据权利要求1或2所述的一种高效的蓝藻有机质资源综合利用方法，其特征在于，所述复合降解菌按照0.1~0.3%蓝藻体积加入。
4.根据权利要求1或2所述的一种高效的蓝藻有机质资源综合利用方法，其特征在于，所述辅料为麸皮、米糠、木屑、餐厨垃圾中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的一种高效的蓝藻有机质资源综合利用方法，其特征在于，步骤S3中采用经过驯化的黑水虻幼虫，驯化方法：在喂食蓝藻过程中，选择个体大的幼虫，进入后期预蛹、蛹、成虫及产卵生活史；获得的虫卵经70%含水率的麸皮孵化后，继续喂食蓝藻，并继续挑选个体大的幼虫，进行新一轮筛选，如此反复，共计进行至少5轮驯化和筛选。
6.根据权利要求4所述的一种高效的蓝藻有机质资源综合利用方法，其特征在于，所述个体大的幼虫是指虫体长度达到2cm以上的幼虫。
7.根据权利要求4所述的一种高效的蓝藻有机质资源综合利用方法，其特征在于，黑水虻的驯化方法中，孵化温度25~28℃，孵化时间3-4天。
8.根据权利要求1所述的一种高效的蓝藻有机质资源综合利用方法，其特征在于，步骤S3中的黑水虻幼虫选用3日龄的幼虫。
9.根据权利要求1所述的一种高效的蓝藻有机质资源综合利用方法，其特征在于，当第一个虫蛹出现时，进行步骤S4操作。
10.根据权利要求1所述的一种高效的蓝藻有机质资源综合利用方法，其特征在于，步骤S4中分离出来的虫体经烘干机烘干至含水率10％左右，得到昆虫蛋白饲料。
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