CN111529481A - 用于治疗视觉障碍的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及用于治疗视觉障碍的组合物和方法。本发明提供了甾醇及其用于治疗视觉障碍的用途。在一个实施方案中，包含药学上有效量的羊毛甾醇的组合物用于治疗和/或预防受试者的视觉障碍。在另一个实施方案中，包含药学上有效量的羊毛甾醇的组合物用于治疗受试者的白内障或失明/视觉损伤。在又一个实施方案中，包含羊毛甾醇的组合物用于溶解晶体蛋白的淀粉样纤维。

Description

用于治疗视觉障碍的组合物和方法

本申请是申请日为2015年8月24日，申请号为201580057679.0， 发明名称为“用于治疗视觉障碍的组合物和方法”的申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2014年8月22日提交的美国临时申请号 62/040,721和于2015年7月17日提交的美国临时申请号62/194,120 的优先权，这些申请的内容通过引用而全文并入本文。

技术领域

本公开内容总体上涉及甾醇及其用于治疗视觉障碍的用途，该视 觉障碍影响患有此类视觉障碍或处于发展成此类视觉障碍的风险下 的患者眼睛的晶状体的正常功能。

发明内容

本发明提供了一种治疗或预防视觉障碍的方法，该方法包括向有需 要的个体施用有效量的羊毛甾醇及其前药或药学上可接受的盐。

本发明还提供了一种眼用药物组合物，其包含药学上可接受的眼用 载体和具有以下式I的结构的羊毛甾醇：

及其前药或药学上可接受的盐。

在所述方法的各个方面，所述视觉障碍为影响眼睛晶状体的功能、 清晰度和/或结构的眼睛障碍。这样的眼睛疾病包括但不限于眼睛的白内 障、眼睛的老视以及眼睛晶状体的核硬化。此外，视觉障碍还指视网膜 变性，如雷夫叙姆病(Refsum disease)、Smith-Lemli-Opitz综合征(SLOS) 和施奈德结晶状角膜营养不良(SCCD)、无β脂蛋白血症和家族性低β 脂蛋白血症。

在一个实施方案中，本发明提供了一种通过向受试者施用治疗或预 防有效量的式I的甾醇来改善与视觉障碍相关的至少一种症状的方法。 在该方法的各个方面，该组合物局部、结膜下、眼球后、眼周、视网膜 下、脉络膜上或眼内施用。接受本发明甾醇的受试者可以包括但不限于 哺乳动物、禽类、两栖动物、爬行动物和其他脊椎动物。在一个实施方案中，该受试者为马、猪、狗、猫、啮齿动物和/或其他伴侣宠物。在另 一个实施方案中，该受试者为人。

在一个实施方案中，本发明涉及包含眼用药学上可接受的载体中的 本发明甾醇的眼用药物组合物。在一些实施方案中，该药物组合物包含 眼用药学上可接受的载体中的羊毛甾醇或其衍生物。在本发明的某些实 施方案中，该药学上可接受的载体为水、缓冲液或氯化钠溶液。在一些 实施方案中，该药学上可接受的载体是无菌的。在其他实施方案中，该 药学上可接受的载体为软膏。在其他实施方案中，该药学上可接受的载 体为凝胶。凝胶可以使用本领域公知的凝胶配制材料进行配制，该凝胶 配制材料包括但不限于高粘度羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚氧 化乙烯和卡波姆(carbomer)。在所述组合物的一些方面，该药学上可 接受的眼用载体为环糊精。在一个实施方案中，该环糊精为(2-羟丙基)-β- 环糊精。

本发明的某些实施方案还涉及包含可用于治疗和/或预防与视觉障 碍相关的症状的组分的试剂盒。这样的试剂盒包含含有在药学上可接受 的载体中的本发明甾醇的容器，以及关于施用本发明甾醇使得与视觉障 碍相关的至少一种症状得到改善或预防的说明。这样的视觉障碍包括但 不限于白内障、老视和眼睛晶状体的核硬化。此外，视觉障碍还指视网 膜变性，如雷夫叙姆病、Smith-Lemli-Opitz综合征(SLOS)和施奈德结 晶状角膜营养不良(SCCD)、无β脂蛋白血症和家族性低β脂蛋白血 症。包含在本文涉及的一些试剂盒中的容器是用于施用滴眼剂的滴管。 在其他实施方案中，该容器是用于分配软膏或凝胶的管。在其他实施方 案中，该容器是用于药物递送的任何合适的容器，包括但不限于注射器或适于药物的眼部递送或局部施用的其他容器。

在其他方面，本发明提供了一种用于抑制或预防蛋白质聚集的方法。 在该方法的各个方面，所述蛋白质为淀粉状蛋白形成蛋白或引起功能缺 失疾病的蛋白质。在一些方面，该淀粉状蛋白形成蛋白选自Hsp27、αA- 晶体蛋白、αB-晶体蛋白、βB2-晶体蛋白、βB1-晶体蛋白、γD-晶体蛋白、 Hsp22、Hsp20、tau、α-突触核蛋白、IAPP、β-淀粉状蛋白、PrP、亨廷顿蛋白(Huntingtin)、降钙素、心房钠尿肽、载脂蛋白AI、血清淀粉 状蛋白A、Medin、催乳素、运甲状腺素蛋白、溶菌酶、β2微球蛋白、 凝溶胶蛋白(Gelsolin)、角膜上皮素(Keratoepithelin)、半胱氨酸蛋 白酶抑制剂(Cystatin)、免疫球蛋白轻链AL和S-IBM。在其他方面， 引起功能缺失疾病的蛋白质选自突变的β-葡糖苷酶、囊性纤维化跨膜受 体、己糖胺酶A、己糖胺酶B、β-半乳糖苷酶和α-葡糖苷酶。

根据以下详细描述，本公开内容的其他特征和优点将变得显而易见。 然而，应当理解，虽然详细描述和具体实例说明了本公开内容的具体实 施方案，但其仅通过示例的方式给出，因为根据该详细描述，在本公开 内容的精神和范围内的各种变化和修改对本领域技术人员而言将变得显 而易见。整个文件旨在作为整体的公开内容而相关联，并且应当理解， 考虑了本文描述的特征的所有组合，即使特征的组合没有在该文件的相 同句子或段落或章节中一起找到。除了前述内容以外，作为附加的方面， 本发明还包括以任何方式范围比以上具体提及的变化方案更窄的本发明 的所有实施方案。例如，如果本发明的方面被描述为“包含”特征，则也 涉及到“由该特征组成”或“基本由该特征组成”的实施方案。

在一个实施方案中，本发明公开了组合物在制备用于治疗和/或预防 受试者的视觉障碍的药物中的用途，所述组合物包含药学上可接受的眼 用载体和药学上有效量的羊毛甾醇。所述受试者患有视觉障碍或处于发 展成视觉障碍的风险下，该视觉障碍影响眼内晶状体的正常结构。所述 受试者可以选自两栖动物、爬行动物、禽类和哺乳动物；其中所述哺乳 动物可以选自啮齿动物、猫、狗、猪、马和人。在另一个实施方案中， 所述视觉障碍选自白内障、先天性白内障、皮质混浊(cortical opacities)、 后囊下白内障、老视核硬化、视网膜退行性病症、雷夫叙姆病、 Smith-Lemli-Opitz综合征、施奈德结晶状角膜营养不良、玻璃疣、年龄 相关性黄斑变性和糖尿病视网膜病变，并且羊毛甾醇抑制晶体蛋白聚集。

在又一个实施方案中，本发明公开了组合物在制备用于治疗受试者 的白内障或失明/视觉损伤的药物中的用途，所述组合物包含药学上可接 受的眼用载体和药学上有效量的羊毛甾醇，其中所述羊毛甾醇溶解所述 受试者眼内的晶状体晶体蛋白聚集体；其中所述晶状体晶体蛋白为α– 晶体蛋白、β–晶体蛋白或γ–晶体蛋白中的任一种。上述组合物可配制成 眼用溶液、眼用软膏、眼用洗剂、眼内输注溶液、用于前房的洗剂、内 服药(internal medicine)、注射剂或用于提取的角膜的防腐剂。

在又一个实施方案中，本发明公开了一种用于溶解晶体蛋白的淀粉 样纤维的方法，该方法包括使淀粉样纤维与羊毛甾醇以足够的量和持续 时间接触以便溶解晶体蛋白的淀粉样纤维的步骤，其中该方法可以在原 位、体外或体内进行。该方法可以对选自两栖动物、爬行动物、禽类和 哺乳动物的受试者进行；其中所述哺乳动物可以选自啮齿动物、猫、狗、 猪、马和人。

在另一个实施方案中，本发明公开了一种用于治疗和/或预防影响受 试者眼睛的正常结构的视觉障碍的试剂盒，该试剂盒包含药学上有效量 的羊毛甾醇、药学上可接受的载体的制剂，以及关于施用所述制剂使得 所述施用治疗和/或预防所述视觉障碍的说明。在又一个实施方案中，本 发明公开了用于治疗和/或预防受试者的视觉障碍的眼用药物组合物，所 述组合物包含药学上可接受的眼用载体和药学上有效量的羊毛甾醇；其 中所述组合物可配制成眼用溶液、眼用软膏、眼用洗剂、眼内输注溶液、 用于前房的洗剂、内服药、注射剂或用于提取的角膜的防腐剂。

在另一个实施方案中，本发明公开了一种用于鉴定和/或治疗处于发 展成与眼内晶状体晶体蛋白聚集体的形成相关的白内障或失明/视觉损 伤的风险下的受试者的方法，该方法包括：a)测定受试者的羊毛甾醇合 酶活性的量；b)确定羊毛甾醇合酶活性的量是否小于没有白内障或失明 /视觉损伤的对照群体的羊毛甾醇合酶活性的量，其中羊毛甾醇合酶活性 的量小于对照群体的羊毛甾醇合酶活性的量指示发展成与晶状体晶体蛋 白聚集体的形成相关的白内障或失明/视觉损伤的较高风险；以及c)用 羊毛甾醇以有效的量和持续时间治疗受试者以便阻止或逆转受试者眼内 晶状体晶体蛋白聚集体的形成，从而鉴定和治疗处于发展成与受试者眼 内晶状体晶体蛋白聚集体的形成相关的白内障或失明/视觉损伤的风险 下的受试者。

在另一个实施方案中，本发明公开了一种鉴定和/或治疗处于发展成 与受试者眼内晶状体晶体蛋白聚集体的形成相关的白内障或失明/视觉 损伤的风险下的受试者的方法，该方法包括：a)确定羊毛甾醇合酶基因 的两个等位基因是否受降低羊毛甾醇合酶表达或活性的突变的影响，其 中羊毛甾醇合酶的两个等位基因中突变的存在增加了发展成与受试者眼 内晶状体晶体蛋白聚集体的形成相关的白内障或失明/视觉损伤的风险； 以及b)用羊毛甾醇以有效的量和持续时间治疗受试者以便阻止或逆转 受试者眼内晶状体晶体蛋白聚集体的形成，从而鉴定和治疗处于发展成 与受试者眼内晶状体晶体蛋白聚集体的形成相关的白内障或失明/视觉 损伤的风险下的受试者。在一个实施方案中，羊毛甾醇合酶基因中的突 变在密码子581处，将色氨酸(W)改为精氨酸(R)，或在密码子588 处，将甘氨酸(G)改为丝氨酸(S)。

本申请涉及以下方面：

1).组合物在制备用于治疗和/或预防受试者的视觉障碍的药物 中的用途，所述组合物包含药学上可接受的眼用载体和药学上有效量 的羊毛甾醇。

2).根据1)所述的用途，其中所述受试者患有视觉障碍或处于 发展成视觉障碍的风险下，该视觉障碍影响眼内晶状体的正常结构。

3).根据1)所述的用途，其中所述视觉障碍选自白内障、先天 性白内障、皮质混浊、后囊下白内障、老视核硬化、视网膜退行性病 症、雷夫叙姆病、Smith-Lemli-Opitz综合征、施奈德结晶状角膜营养 不良、玻璃疣、年龄相关性黄斑变性和糖尿病视网膜病变。

4).根据1)所述的用途，其中所述羊毛甾醇抑制晶体蛋白聚集。

5).组合物在制备用于治疗受试者的白内障或失明/视觉损伤的 药物中的用途，所述组合物包含药学上可接受的眼用载体和药学上有 效量的羊毛甾醇，其中所述羊毛甾醇溶解所述受试者的眼内的晶状体 晶体蛋白聚集体。

6).根据4)所述的用途，其中所述晶状体晶体蛋白为α–晶体 蛋白、β–晶体蛋白或γ–晶体蛋白中的任一种。

7).根据1)-6)中任一项所述的用途，其中所述组合物被配制 成眼用溶液、眼用软膏、眼用洗剂、眼内输注溶液、用于前房的洗剂、 内服药、注射剂或用于提取的角膜的防腐剂。

8).根据1)-6)中任一项所述的用途，其中所述受试者选自两 栖动物、爬行动物、禽类和哺乳动物。

9).根据8)所述的用途，其中所述哺乳动物选自啮齿动物、猫、 狗、猪、马和人。

10).一种用于溶解晶体蛋白的淀粉样纤维的方法，该方法包括 使淀粉样纤维与羊毛甾醇以足够的量和持续时间接触以便溶解晶体 蛋白的淀粉样纤维的步骤。

11).根据10)所述的方法，其中所述方法在原位、体外或体内 进行。

12).根据10)所述的方法，其中所述方法对受试者进行。

13).根据12)所述的方法，其中所述受试者是人。

14).一种用于治疗和/或预防影响受试者眼睛的正常结构的视觉 障碍的试剂盒，该试剂盒包含药学上有效量的羊毛甾醇、药学上可接 受的载体的制剂，以及关于施用所述制剂使得所述施用治疗和/或预防 所述视觉障碍的说明。

15).一种用于治疗和/或预防受试者的视觉障碍的眼用药物组合 物，所述组合物包含药学上可接受的眼用载体和药学上有效量的羊毛 甾醇。

16).根据15)所述的眼用药物组合物，其中所述组合物被配制 成眼用溶液、眼用软膏、眼用洗剂、眼内输注溶液、用于前房的洗剂、 内服药、注射剂或用于提取的角膜的防腐剂。

附图说明

图1示出了LSS中引起先天性白内障的突变的鉴定。图1A，受影 响的家族和白内障表型的系谱。正方形和圆形分别表示男性和女性。1， 野生型等位基因；W581R和G588S为两种突变。图1B，上图，未受影 响的个体和具有纯合W581R突变的受影响的儿童(II-1)的DNA测序 数据；下图，未受影响的个体和具有纯合G588S突变的受影响的儿童 (IV-1)的DNA测序数据。带下划线的序列表示核酸变化。图1C，左 图，在患有全白内障的第一系谱中的患者1(IV-1)的右眼的彩色照片； 右图，在患有白内障的相同系谱中的患者2(IV-3)的右眼的彩色照片。

图2显示LSS突变消除了环化酶的酶功能。图2A，LSS中的W581R 和G588在以下若干物种中保守：智人(Homo sapiens)、黑猩猩(Pan troglodytes)、家牛(Bos taurus)、小家鼠(Mus musculus)、褐家鼠 (Rattus norvegicus)、原鸡(Gallus gallus)和斑马鱼(Daniorerio)。 图2B，LSS结构的计算机建模以及LSS W581R和G588S突变的影响。 计算机建模分析鉴定了源自C584并终止于E578的环，其中在该环的末 端处W581的关键侧链稳定了甾醇。该环由S–S桥和E578–R639盐桥固 定。G588的酰胺氮N与来自前面的螺旋转角的C584相互作用，并且 G588的Ca氢与临界E578非常接近，E578随后与同一支持螺旋的R639 形成牢固的盐桥。突变G588S导致丝氨酸的侧链碰撞到所述环的E578 残基，并且与该结构不相容。箭头指示突变侧链的位置。图2C，野生型 蛋白(WT LSS)和LSS突变体的工程化表达对甾醇含量的影响。野生 型LSS显著地增加了羊毛甾醇的产量，而W581R和G588S突变体均未 表现出任何环化酶活性。每组n＝3；***P<0.001。

图3显示羊毛甾醇减少了多种晶体蛋白突变蛋白质的细胞内聚集。 图3A，人晶状体祖细胞中晶体蛋白聚集体的共聚焦图像。aA-晶体蛋白 的致白内障Y118D突变体形成p62阳性细胞内包涵体或聚集体 (aggresomes)。绿色，eGFP–晶体蛋白；红色，p62；蓝色，细胞核。 用peGFP-N1转染的细胞用作对照。图3B，LSS对晶体聚集体的抑制作 用的共聚焦图像。图3C，野生型LSS(WT LSS)和羊毛甾醇而非突变 LSS或胆固醇对晶体蛋白突变体聚集的抑制。图3D，通过野生型LSS 而非LSS突变体的共表达引起的可溶性aA-晶体蛋白(Y118D)突变蛋 白质的增加(与pcDNA3.1–N-Flag共表达的Y118D用作对照)。通过 对细胞裂解物的上清液或不可溶部分的蛋白质印迹分析，使用晶体蛋白 的密度测定法进行定量分析。每组n＝3；代表性的蛋白质印迹分析示于 图9c中；*P<0.05，**P<0.01。图3E，预先形成的晶体聚集体被羊毛甾 醇再溶解的共聚焦图像。图3F，羊毛甾醇以浓度依赖性方式显著减少了 多种致白内障的突变晶体蛋白引起的细胞内聚集(n＝3，P<1×10^-4)。胆 固醇并不减少细胞内聚集(n＝3，P>0.1)。图3G，羊毛甾醇增加了人晶 状体祖细胞中多种晶体蛋白突变体的可溶部分。n＝3；P<0.001。图3H， 通过连续活细胞成像，DMSO、胆固醇或羊毛甾醇对人晶状体祖细胞中 αA-晶体蛋白Y118D聚集体的影响。图3I，随时间推移，羊毛甾醇对细 胞内晶体蛋白聚集体溶解的影响(n＝22，来自3个生物重复品)。平均 值±SD值显示为黑色符号。数据通过单指数衰减过程进行最佳拟合(红 线)。

图4显示羊毛甾醇使晶体蛋白的预先形成的淀粉样纤维再溶解。图 4A，用脂质体媒介物、脂质体中的胆固醇或羊毛甾醇处理的aA-晶体蛋 白突变蛋白质的聚集体的负染色TEM照片。右列羊毛甾醇组的图像在 其右侧显示了该图像的5倍放大。图4B，根据ThT荧光，羊毛甾醇对 晶体蛋白聚集体的再溶解的影响(n＝3)。图4B(i)，b/γ-晶体蛋白突 变体；图4B(ii)，a-晶体蛋白突变体。每条的数据均来自三个独立的 样品。

图5显示羊毛甾醇降低了白内障严重性并增加了清晰度。图5A，经 羊毛甾醇治疗的患有白内障的兔子的晶状体的照片，其显示晶状体清晰 度增加。图5A(i)，左图，治疗前；图5A(ii)，右图，治疗后。图 5B，羊毛甾醇的治疗效果的定量的箱线图(n＝13)。图5C，经羊毛甾 醇治疗的患有白内障的狗的晶状体的照片，其显示晶状体清晰度增加。 图5C(i)，左图，治疗前；图5C(ii)，右图，治疗后。D，羊毛甾醇 的治疗效果的定量的箱线图(n＝7)。示出了范围、中值(水平线)和 平均值(圆圈)。十字形表示测量的最大和最小白内障等级。须触线表 示标准差，而方框包含40％置信区间。

图6A显示纯合性映射器(homozygosity mapper)将全基因组纯合 性绘制为条形图。为了强调感兴趣的区域，任何高于该项目中所达到的 最大分数的80％的分数均标注为红色。图6B显示纯合性分数相对于含 有LSS基因的21号染色体上的物理位置作图。红色条表示具有最高分 数的区域。该染色体的右侧含有LSS基因所在的长连续纯合区。

图7示出了用Flag–LSS和eGFP共转染的细胞的代表性共聚焦图像。 用野生型或突变的LSS基因和eGFP基因共转染人晶状体祖细胞4h，并 在新鲜培养基中培养16h。随后使用抗-Flag抗体对LSS的细胞分布进 行可视化(紫色)。eGFP的分布(绿色)用作对照。将细胞核染色并 通过Hoechst 33342进行可视化(蓝色)。

图8示出了用LSS和多种致白内障的晶体蛋白突变体共转染的细胞 的代表性共聚焦图像。图8A，αA-晶体蛋白的R116C突变体。图8B，αB- 晶体蛋白的R120G突变体。图8C，βB2-晶体蛋白的V187E突变体。图 8D，γC-晶体蛋白的G129C突变体。图8E，γD-晶体蛋白的W43R突变 体。用野生型或突变的Flag–LSS基因和突变GFP–晶体蛋白基因共转染 人晶状体祖细胞4h，并在新鲜培养基中培养16h。所有的晶体蛋白突变 体都形成p62-阳性聚集体，如通过突变晶体蛋白和p62的共定位所示出 的。用GFP-晶体蛋白和pcDNA3.1-N-Flag共转染的细胞用作对照。通过 GFP的荧光(绿色)对多种晶体蛋白的细胞内聚集体的形成进行可视化。用抗-Flag抗体检测野生型或突变的LSS(红色)，p62用抗-p62抗体进 行染色，而细胞核通过Hoechst 33342染色(蓝色)进行染色和可视化。 具有聚集体的细胞的定量分析总结于图3c中。

图9显示在HLEB-3细胞(图9A)或HeLa细胞(图9B)中野生 型LSS和羊毛甾醇对晶体蛋白突变体聚集的抑制。在分析聚集体之前将 用LSS和晶体蛋白突变体构建体共转染的细胞培养24h。通过向细胞培 养基中添加40μM甾醇(羊毛甾醇或胆固醇)进行拯救实验(rescue experiment)2h，随后用新鲜培养基代替甾醇培养基，并将细胞培养另 外12h。从十个随机选择的视野计算具有晶体蛋白聚集体的细胞的百分 比。计算野生型LSS组、突变体组或突变体加羊毛甾醇组的值。与对照 组相比，野生型LSS组和羊毛甾醇组的聚集体显著较低(P<1×10^-4)， 而突变LSS组或胆固醇组的聚集体显示与对照组没有差异(P>0.1)。图9C，人晶状体祖细胞用野生型或突变LSS加αA-晶体蛋白(Y118D) 进行共转染。与pcDNA3.1-N-Flag共表达的αA-晶体蛋白(Y118D)用 作对照。在转染4h并在新鲜培养基中温育另外24h之后，将细胞裂解 并离心以分离上清液和不可溶部分。分别用针对Flag和GFP的抗体检 测LSS和晶体蛋白融合蛋白。红色箭头表示在含有WT-LSS的细胞的可 溶部分中相对于不可溶部分中较高的晶体含量。数据根据三个独立的实 验进行定量并总结于图3D中。

图10显示当在HLEB-3或HeLa细胞中测定时，羊毛甾醇以浓度依 赖性方式显著减少了由多种致白内障的突变晶体蛋白引起的细胞内聚集。 图10A，用多种致白内障的晶体蛋白突变体转染的HLEB-3细胞的代表 性共聚焦图像。图10B，用多种致白内障的晶体蛋白突变体转染的HeLa 细胞的代表性共聚焦图像。将细胞用多种晶体蛋白构建体转染4h，并在新鲜的培养基中培养另外24h。然后将细胞用在1％(HLEB-3细胞)或 2％DMSO(HeLa细胞)中的10μM、20μM和40μM羊毛甾醇处理2h， 并培养另外12h。用1％(HLEB-3细胞)或2％DMSO(HeLa细胞)处 理的细胞用作对照。多种晶体蛋白的细胞内聚集体的形成通过GFP的荧 光(绿色)进行可视化，并用Hoechst 33342将细胞核染色(蓝色)。 箭头指示典型的细胞内聚集体。图10C，当在HLEB-3细胞中测定时， 羊毛甾醇的聚集-溶解作用的浓度依赖性。图10D，当在HeLa细胞中测 定时，羊毛甾醇的聚集-溶解作用的浓度依赖性。

图11显示与对照组或突变LSS组相比，羊毛甾醇而非胆固醇处理 增加了可溶部分中的致白内障的突变晶体蛋白。图11A，将人晶状体祖 细胞用突变晶体蛋白基因转染4h，随后在新鲜培养基中温育另外24h。 收获并裂解细胞。上清液和不可溶部分通过离心进行分离，并通过蛋白 质印迹分析进行分析。分别用针对Flag和GFP标记物的抗体鉴定LSS 和晶体蛋白融合蛋白。用红框突出显示羊毛甾醇处理的组。用1％DMSO 处理的细胞用作对照。β-肌动蛋白用作全细胞裂解物(TCL)的内部蛋 白质负荷对照。S，上清液；P，不可溶部分。图11B，通过活细胞成像 中的单粒子跟踪评估的DMSO(n＝4)和胆固醇(n＝7)对人晶状体祖细胞中αA-晶体蛋白(Y118D)聚集体的大小变化的影响。图11C，通过 浊度评估羊毛甾醇对晶体蛋白聚集体的溶解的影响。通过在1M盐酸胍 的存在下将5mg m1^-1蛋白质溶液在60℃下温育2h(α-晶体蛋白)或在 37℃下温育48h(β-和γ-晶体蛋白)来形成晶体蛋白聚集体。将预先形 成的聚集体以0.2mg m1^-1的最终蛋白质浓度重悬于PBS中，并用在500 μM DPPC脂质体中的500μM甾醇进行处理，并在37℃下温育24h。将 仅用500μM DPPC脂质体处理的聚集体用作对照。图11D，通过ThT 荧光评估的羊毛甾醇对αA-晶体蛋白突变体再溶解淀粉样纤维的浓度依 赖性影响。将仅用500μM DPPC脂质体处理的聚集体用作对照。

图12示出了白内障晶状体的分级系统。图12A，将晶状体放在网格 上，并拍照。将透明度评分为0，清晰的晶状体且不存在浑浊(网格线 清晰可见，a')；1，模糊的晶状体和轻度的浑浊(网格线最低限度的混 浊，但网格线仍然可见，b')；2，混浊的晶状体且存在涉及几乎整个晶 状体的弥漫性浑浊(网格线中度混浊，但主要的网格线可见，c')；或3， 不透明的晶状体且存在涉及整个晶状体的广泛、密集的浑浊(网格线完 全混浊，且网格线根本无法看到，d')。图12B，在分离出的白内障兔 子晶状体中，羊毛甾醇降低了白内障的严重程度并增加了清晰度。将兔 子晶状体(n＝13)切开并与羊毛甾醇一起温育6天，随后评估晶状体的 清晰度和透明度。示出了显示处理前后的每个白内障兔子晶状体的成对 照片，下方为分数。图12C，羊毛甾醇降低了狗的白内障严重程度并增 加了晶状体的清晰度。将患有白内障的狗眼睛(n＝7)用羊毛甾醇处理6 周，并评估晶状体的清晰度和透明度。示出了处理前后每个研究眼睛的 成对照片，下方为分数。还呈现了单独用媒介物处理的三个对照眼睛。

具体实施方式

现将详细参考本发明的具体实施方案，包括本发明人预期用于实施 本发明的最佳方式。这些具体实施方案的实例在附图中示出。虽然结合 这些具体实施方案描述了本发明，但应当理解，其并非旨在将本发明限 于所述实施方案。相反，意在涵盖可被包含在如所附权利要求所限定的 本发明精神和范围内的替代方案、修改和等同项。在以下描述中，阐述 了具体细节以提供对本发明的彻底理解。可以在没有一些或全部这些具 体细节的情况下实施本发明。另外，公知的特征可能未进行详细描述， 以避免不必要地使本发明变模糊。

本发明涉及用于治疗或预防患有视觉障碍或处于发展成视觉障碍的 风险下的受试者中影响眼睛正常结构的这类视觉障碍的方法和组合物， 其包括向这样的受试者施用包含药学上可接受的载体和药学上有效量的 具有式I的甾醇的组合物。例如，本发明的示例性化合物包括向患者施 用眼科药学上有效量的羊毛甾醇(3β-羟基-8,24-羊毛甾二烯；8,24-羊毛 甾二烯-3β-醇)。

在其他实施方案中，本公开内容描述了甾醇和使用甾醇的方法。例 如，将式I的甾醇配制在包含药学上可接受的眼用载体的眼用药物组合 物中以抑制晶体蛋白聚集。在某些其他实施方案中，本公开内容描述了 使用式1的甾醇来抑制晶体蛋白聚集的方法。在其他实施方案中，本发 明的化合物能够逆转晶体蛋白的聚集并抑制晶体蛋白的进一步聚集。

治疗或预防视觉障碍的方法

本发明提供了使用本发明预防和/或治疗患有视觉障碍或处于发展 成视觉障碍的风险下的受试者中影响眼内晶状体正常结构的这类视觉障 碍的眼用药物组合物和方法。如本文所述，影响眼内晶状体正常结构的 视觉障碍(本文中称为短语“视觉障碍”)是指影响晶状体结构从而引起 视觉功能障碍如眼睛晶状体的清晰度或硬度变化的状况。这样的状况包 括白内障、老视和核硬化。另外，视觉障碍还指视网膜变性，如雷夫叙 姆病、Smith-Lemli-Opitz综合征(SLOS)和施奈德结晶状角膜营养不良 (SCCD)、无β脂蛋白血症和家族性低β脂蛋白血症。在某些实施方 案中，本发明提供了用来减轻或逆转晶体蛋白聚集的组合物及其使用方 法。在替代实施方案中，提供了用于抑制、预防和/或治疗蛋白质内或蛋 白质间相互作用的破坏的组合物和方法，该相互作用形成对于晶状体透 明度和折射率而言必需的宏观结构。

如本发明中所提及的术语“白内障”意指表现出引起晶状体表面上和 /或内部的混浊或不透明的症状或者诱发晶状体肿胀的症状的疾病或状 况，并且该术语包括先天性白内障和后天性白内障(参见PDR Staff, “PDR of Ophthalmic Medicines 2013”,PDRNetwork,2012)。在一些实施 方案中，所述白内障为年龄相关性白内障、糖尿病白内障、与外科手术 相关的白内障、由暴露于辐射引起的白内障、由遗传疾病引起的白内障、 由感染引起的白内障或由药物引起的白内障。在一些实施方案中，个体 患有早发性遗传形式的白内障。这类白内障的具体实例为先天性白内障， 如先天性假性白内障(congenitalpseudo-cataract)、先天性膜性白内障、 先天性花冠状白内障、先天性板层白内障、先天性点状白内障和先天性 丝状白内障；以及后天性白内障，如老年性白内障、继发性白内障、褐变白内障(browning cataract)、并发性白内障、糖尿病白内障、外伤性 白内障和可由电击、辐射、超声波、药物、全身性疾病和营养失调诱发 的其他白内障。后天性白内障进一步包括为了治疗白内障插入晶状体而 具有在包含该晶状体的后部中引起混浊的症状的术后白内障。

核硬化是指通常在年老的动物中类似地导致晶状体不透明的状况。 它是由新纤维形成压缩核中较老的晶状体纤维而引起的晶状体核密度的 年龄相关变化。

老视是指一种视觉状况，其中眼睛的晶状体失去其柔韧性，这使其 难以聚焦于近处的物体。

在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗或预防视觉障碍的方法， 该方法包括向有需要的个体施用有效量的包含具有结构式I的化合物的 组合物。在一些实施方案中，该化合物为具有结构式I的甾醇。

根据本发明“需要”治疗的个体为患有影响眼内晶状体正常功能的视 觉障碍的个体。例如，该个体可患有年龄相关性白内障或白内障或处于 发展成年龄相关性白内障或白内障的风险下。处于发展成白内障的风险 下的个体包括但不限于，具有发展成白内障的家族史的个体、具有与白 内障相关的突变的个体、暴露于辐射的个体、糖尿病个体等。例如，在 一方面，该个体被诊断为一只眼患有白内障，且施用所述化合物以预防 或减缓对侧眼中白内障的形成。类似地，根据本发明“需要”治疗的个体 为可能患有老视或处于发展老视的风险下的个体。类似地，根据本发明 “需要”治疗的个体为患有核硬化或处于发展成核硬化的风险下的个体。 优选地，该个体为人，然而，本领域技术人员还可以鉴定患有眼病或处于眼病风险下的动物(需要治疗的动物)。可鉴定需要治疗的哺乳动物， 如猫、狗、猪、马、牛和啮齿动物。此外，可鉴定需要治疗的动物，如 禽类、爬行动物、两栖动物和鱼。

“治疗”视觉障碍并不需要视觉障碍的100％消除或逆转。在一些实施 方案中，与不存在本发明组合物或方法时(例如，在未暴露于本发明组 合物或本发明方法的化合物的生物学匹配的对照受试者或标本中)观察 到的水平相比，根据本发明方法“治疗”视觉障碍将晶状体的功能障碍例 如晶状体的不透明或柔韧性缺乏减轻、抑制、预防和/或逆转了例如至少 约5％、至少约10％或至少约20％。在一些实施方案中，与不存在本发 明方法的化合物时的晶状体功能障碍相比，功能障碍(如在晶状体上或 晶状体中的白内障形成、不透明或晶体聚集)被治疗了至少约30％、至 少约40％、至少约50％或至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少 约90％或更多(约100％)。晶状体功能障碍如不透明或混浊或白内障 通常使用多种光学测试中的任一种进行检测，该光学测试包括但不限于 视敏度测试、检眼镜检查、裂隙灯检查、角膜曲率测量、眼压测量、对 比测试、眩光敏感度、波阵面映射。

类似地，“预防”并不需要视觉障碍的100％抑制或遏制。例如，混浊 或不透明的任何减少或白内障进展的减速都构成受试者的有益生物效应。 同样例如，眼睛晶状体中的晶体聚集的任何减少都构成有益的生物效应。 在这方面，与不存在本发明方法时(例如，在未暴露于本发明方法的化 合物的生物学匹配的对照受试者或标本中)观察到的水平相比，本发明 使视觉障碍减少了例如至少约5％、至少约10％或至少约20％。在一些 实施方案中，视觉障碍减少了至少约30％、至少约40％、至少约50％或 至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多(约100％)。

抑制、预防或逆转功能障碍并不需要100％抑制、预防、消灭或逆 转。例如，对聚集的任何抑制都构成受试者中的有益生物效应。在这方 面，与不存在本发明方法时(例如，在未暴露于本发明方法的化合物的 生物学匹配的对照受试者或标本中)观察到的水平相比，本发明将受试 者的影响眼睛晶状体正常功能的视觉障碍抑制了例如至少约5％、至少 约10％或至少约20％。在一些实施方案中，视觉障碍被抑制、预防和/ 或逆转了至少约30％、至少约40％、至少约50％或至少约60％。在一些 实施方案中，与不存在本发明方法的化合物时的淀粉状蛋白形成相比， 本发明方法将淀粉状蛋白形成抑制了至少约70％、至少约80％、至少约 90％或更多(约100％)。

包含式1化合物的眼用药物组合物的“有效量”为抑制、预防或逆转 个体晶状体的功能障碍的量。本发明的眼用药物组合物以治疗视觉障碍 的有效量施用于有需要的受试者。如本文所用的，“治疗有效量”意指减 轻视觉障碍的体征、症状或病因或任何其他所需生物系统改变中的至少 一种的剂量。在预防性应用中，术语“预防有效量”意指施用于易患特定 疾病或处于特定疾病风险下的患者的剂量，其可以是与治疗有效量相同 或不同的剂量。用于特定个体的组合物的有效量可取决于个体、个体状 况的严重程度、施加的制剂的类型、给药频率和治疗持续时间。根据本 发明，本发明的眼用药物制剂例如羊毛甾醇即使在液体滴剂中以相对较 低的浓度，例如至少10^-9M、至少0.5x10^-8M至1x10^-8M、至少0.5x10^-7M至1x10^-7M、至少0.5x10^-6M至1x10^-6M、至少0.5x10^-5M至1x10^-5M、 至少0.5x10^-4M至1x10^-4M或至少0.5x10^-3M至1x10^-3M，或在这些值 之间的范围(例如，10^-9M至10^-3M)内的任何浓度施用，也可以通过 每日仅一次、两次、三次或多次施加来逆转这样的视觉障碍，并且如此 快速地进行。

给药途径

如本领域技术人员将理解的，将化合物施用于受试者的最适当的方 法取决于很多因素。在多个实施方案中，根据本发明的化合物局部施用 于眼，例如，局部、结膜下、眼球后、眼周、视网膜下、脉络膜上或眼 内施用。

对于直接施用于眼睛特别有用的药物组合物包括配制成滴眼剂的水 溶液和/或悬浮液和配制成眼用凝胶(包括凝胶形成溶液)或软膏的增稠 溶液和/或悬浮液，其为眼用溶液、眼用软膏、眼用洗剂、眼内输注溶液、 用于前房的洗剂、内服药、注射剂或用于提取的角膜的防腐剂。用于眼 用药物递送的其他剂型包括眼用插入物(ocularinsert)、玻璃体内注射 剂和植入物。可注射溶液可使用细针直接注入角膜、晶状体和玻璃体或 其临近组织中。该组合物还可以作为眼内灌注液施用。

其他预期的给药途径包括但不限于以下途径中的一种或多种：口服 (例如，作为片剂、胶囊或作为可摄取溶液)、经粘膜(例如，作为用 于吸入的鼻腔喷雾剂或气雾剂)、经鼻、肠胃外(例如，通过可注射形 式)、胃肠、脊柱内、腹膜内、肌肉内、静脉内、子宫内、皮内、颅内、 气管内、阴道内、脑室内、大脑内、皮下、经皮、直肠、经颊、硬膜外 和舌下。

在一些实施方案中，用于将本发明的组合物递送至眼睛的方式是经 由接触透镜。可提供用所需化合物预处理的透镜。或者，该透镜在具有 用于制备镀膜透镜的组分的试剂盒中提供，该组分以用于重建的冻干粉 或以浓缩的或即用型溶液的形式提供。所述组合物可以以单用途或多用 途的试剂盒的形式提供。

在一些实施方案中，用于将本发明的组合物递送至眼睛的方式是经 由眼用棒(rod)(Gwon等人,Ophthalmology.1986年9月；93(9 Suppl):82-5)。在一些实施方案中，用于将本发明的组合物递送至眼睛 的方式是经由眼内透镜-水凝胶组件(Garty等人,InvestOphthalmol Vis Sci,2011年8月3日；52(9):6109-16)。

剂量

包含所述化合物的组合物以治疗有效量提供，该治疗有效量在医学 上可接受的毒性水平下达到所需的生物效果。该组合物的剂量可根据给 药途径和疾病的严重程度而变化。该剂量还可根据待治疗的每个患者的 体重、年龄、性别和/或症状程度而调整。精确的剂量和给药途径将最终 由经治医生或兽医来决定。可以理解，可能需要根据患者的年龄和体重 以及待治疗的状况的严重程度对剂量作出常规改变。给药频率取决于制 剂和上述参数。例如，可能期望每天施加滴眼剂至少一次，包括每天2、 3、4或5次。

普通技术人员可容易地确定最佳剂量、给药方法和重复率。最佳剂 量可根据特定药物组合物的相对功效和给药方法而变化。可接受的剂量 通常可根据在体外和体内动物模型中发现有效的EC50(对于测试组中 的50％有效的浓度)来估算。通常，剂量为每kg体重0.01μg-100g，并 且可每天、每周、每月或每年给予一次或多次，或甚至每2至20年给予 一次。本领域普通技术人员可容易地根据所测量的药物在体液或组织中 的停留时间和浓度来估算给药的重复率。在成功治疗之后，可能期望使 患者经受维持治疗以预防疾病状态的复发，其中本文所述的治疗组合物 以在每kg体重0.01μg至100g范围内的维持剂量每日施用一次或多次 到每20年施用一次。用于经由全身途径施用于人(约70kg体重)的化 合物的示例性剂量为每单位剂量0.1mg至5g，例如1mg至2.5g化合 物。

式I化合物的优选浓度在约1μg/ml至500μg/ml的范围内，例如， 约1μg/ml、约2μg/ml、约3μg/ml、约4μg/ml、约5μg/ml、约10μg/ml、 约20μg/ml、约30μg/ml、约40μg/ml、约50μg/ml、约60μg/ml、约 70μg/ml、约80μg/ml、约90μg/ml、约100μg/ml、约120μg/ml、约 140μg/ml、约160μg/ml、约180μg/ml、约200μg/ml、约250μg/ml、 约300μg/ml、约350μg/ml、约400μg/ml、约450μg/ml或约500μg/ml。 抑制剂可与其他药物活性剂联合提供。

本文所述的药物组合物可以以单剂量或多剂量的形式施用；以单独 的治疗剂施用或与其他治疗剂联合施用；以及与常规疗法相组合(可依 次或同时施用)。在本发明的一个实施方案中，本发明眼用制剂在人和/ 或动物治疗中的每日剂量为约每只眼1滴、约每只眼2滴、约每只眼3 滴、约每只眼4滴、约每只眼5滴、约每只眼6滴、约每只眼7滴、约 每只眼8滴、约每只眼9滴、约每只眼10滴、约每只眼11滴、约每只 眼12滴或多于约每只眼12滴。在本发明的另一个实施方案中，本发明 眼用制剂在人和/或动物治疗中的每日施用计划为约每天1次、约每天2 次、约每天3次、约每天4次、约每天5次、约每天6次、约每天7次、 约每天8次、约每天9次、约每天10次、约每天11次、约每天12次或 多于约每天12次。例如，可通过外径为3mm的标准药典药用滴管将剂 量标准化，该滴管在保持垂直时在25℃下递送20滴总重量为0.9至1.1 克的水。

当根据上述用药计划施用时，在人和/或动物中的治疗方案可无限期 延续或直到未观察到进一步改善。或者，该治疗方案可持续1天、2天、 3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23 天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、 33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天、40天、41天、42 天、43天、44天、45天、46天、47天、48天、49天、50天、60天、 70天、80天、90天、100天、150天、200天、250天、300天、400天、 500天、750天、1000天或多于1000天。

在治疗或预防白内障中有效的化合物

在多个实施方案中，本发明方法或组合物的化合物为具有式I化合 物的羊毛甾醇：

或其前药或药学上可接受的 盐。

例如，本发明方法或组合物的化合物为羊毛甾醇；其前药或药学上 可接受的盐。在一个实施方案中，该化合物为羊毛甾醇。在另一个实施 方案中，上述化合物的任何前药或药学上可接受的盐均被认为在本发明 的范围内。

药物组合物

在本发明的一些实施方案中，一种或多种治疗性化合物的药物组合 物可通过将这些治疗性化合物中的一种或多种配制在药学上可接受的载 体中来制备。如本文所用的，“药学上或治疗上可接受的载体”是指不干 扰活性成分的生物活性的有效性并且对宿主或患者无毒的载体介质。药 物制剂中使用的载体类型将取决于施用该治疗性化合物的方法。制备用 于多种给药途径的药物组合物的许多方法是本领域公知的。

如本文所用的，“药学上可接受的眼用载体”是指用于将结构式1的 化合物直接或间接递送至眼睛、眼睛上或眼睛附近的药学上可接受的赋 形剂、载体、粘合剂和/或稀释剂。因此，本发明进一步包括包含结构式 I的化合物及药学上可接受的眼用载体的组合物。

任选地，所述组合物包含结构式I的化合物的游离酸、游离碱、盐 (例如，酸或碱加成盐)、水合物或前药。如本文所用的短语“药学上可 接受的盐”或“药学上可接受的酸”分别是指式I化合物的药学上可接受的 有机或无机盐或酸。反荷离子可为稳定母体化合物上的电荷的任何有机 或无机部分。此外，药学上可接受的盐(或酸)可在其结构中具有多于一个带电原子。多个带电原子为药学上可接受的盐(或酸)的一部分的 实例可具有多个反荷离子。因此，药学上可接受的盐(酸)可具有一个 或多个带电原子和/或一个或多个反荷离子。

示例性的盐包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯 化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异 烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、单宁 酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆 酸盐(gentisinate)、延胡索酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、蔗糖酸盐、 甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲 苯磺酸盐和双羟萘酸盐(即，1,1'-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))。药 学上可接受的盐可涉及包括另一种分子如乙酸根离子、琥珀酸根离子或 其他反荷离子。

所述前药为包含与载体部分共价结合的结构式I的化合物的物质。 该载体部分可在体外或体内从结构式1的化合物释放，以产生结构式I 的化合物。前药形式是本领域公知的，如在Sloan,K.B.,Prodrugs,M. Dekker,New York,1992以及Testa,B和Mayer,J.M.,Hydrolysis in drug and prodrug metabolism:chemistry,biochemistry,andenzymology, Wiley-VCH,Zurich,2003中所例示的。

在本发明的一些实施方案中，通过将本发明组合物溶解在适当的溶 剂中来制备药物组合物。适当的溶剂包括但不限于水、盐溶液(例如， NaCl)、缓冲溶液、软膏、凝胶或其他溶剂。在某些实施方案中，该溶 剂为无菌的。

在制备滴眼剂中使用的用于悬浮液的水溶液和稀释剂可包括蒸馏水、 生理盐水等。这些药物组合物可通过以下方式配制：根据常规方法将化 合物任选地与适当的药物添加剂如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、 稀释剂、缓冲剂、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂和溶解助 剂一起混合、稀释或溶解，并根据剂型以常规方式配制。用于悬浮液的 非水溶液和稀释剂可包括食用(例如植物)油、液体石蜡、矿物油、丙 二醇、对辛基十二烷醇、聚山梨醇酯、聚乙二醇、单硬脂酸铝以及类似 的溶剂。

多种添加剂可根据需要被包含在滴眼剂、眼用凝胶和/或眼用软膏中。 这些添加剂可包括适于接触眼或在眼周围使用而没有过度毒性、不相容 性、不稳定性、刺激性、变态反应等的附加成分、添加剂或载体。可在 适当情况下向制剂中加入添加剂如溶剂、基质、助溶剂、悬浮剂、增稠 剂、乳化剂、稳定剂、缓冲剂、等渗性调节剂、pH调节剂、螯合剂、舒 缓剂、防腐剂、矫味剂、调味剂、着色剂、赋形剂、粘合剂、润滑剂、 表面活性剂、吸收促进剂、分散剂、防腐剂、增溶剂等。

例如，可通过将化合物溶解在溶有表面活性剂的无菌水中并任选地 添加适当的药物添加剂如防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和粘度改 善剂来配制滴眼剂。

例如，添加缓冲剂以保持pH恒定，并且该缓冲剂可包括药学上可 接受的缓冲剂，如硼酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、酒石酸盐缓冲液、 磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液(包含三(羟甲基)氨基 甲烷和HCl)。例如，pH为7.4的Tris-HCl缓冲液包含3g/l的三(羟甲 基)-氨基甲烷和0.76g/l的HCl。在又一个方面，缓冲液为10×磷酸盐缓 冲盐水(“PBS”)或5×PBS溶液。以提供对于预期的生理条件足够的缓 冲能力的量包含缓冲剂。

其他缓冲液包括但不限于基于以下物质的缓冲液：在25℃下pK_a为 7.5且pH在约6.8-8.2范围内的HEPES(N-{2-羟乙基}哌嗪-N'-{2-乙磺 酸})；在25℃下pK_a为7.1且pH在约6.4-7.8范围内的BES(N,N-双{2- 羟乙基}2-氨基乙磺酸)；在25℃下pK_a为7.2且pH在约6.5-7.9范围内 的MOPS(3-{N-吗啉基}丙磺酸)；在25℃下pK_a为7.4且pH在约6.8-8.2 范围内的TES(N-三{羟甲基}-甲基-2-氨基乙磺酸)；在25℃下pK_a为 7.6且pH在约6.9-8.3范围内的MOBS(4-{N-吗啉基}丁磺酸)；在25℃ 下pK_a为7.52且pH在约7-8.2范围内的DIPSO(3-(N,N-双{2-羟乙基} 氨基)-2-羟基丙烷))；在25℃下pK_a为7.61且pH在约7-8.2范围内的TAPS({(2-羟基-3{三(羟甲基)甲基氨基}-1-丙磺酸))；在25℃下pK_a为 8.4且pH在约7.7-9.1范围内的TAPS({(2-羟基-1,1-双(羟甲基)乙基)氨 基}-1-丙磺酸))；在25℃下pK_a为8.9且pH在约8.2-9.6范围内的TABS (N-三(羟甲基)甲基-4-氨基丁磺酸)；在25℃下pK_a为9.0且pH在约 8.3-9.7范围内的AMPSO(N-(1,1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸)；在25℃下pK_a为9.5且pH在约8.6-10.0范围内的CHES(2-环己 基氨基)乙磺酸)；在25℃下pK_a为9.6且pH在约8.9-10.3范围内的CAPSO (3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸)；以及在25℃下pK_a为10.4且pH 在约9.7-11.1范围内的CAPS(3-(环己基氨基)-1-丙磺酸)。

除了缓冲液之外，还可以向滴眼剂中添加等渗剂以制备与泪液等渗 的制剂。等渗剂包括但不限于糖类，如右旋糖、葡萄糖、蔗糖和果糖； 糖醇，如甘露糖醇和山梨糖醇；多元醇，如甘油、聚乙二醇和丙二醇； 以及盐，如氯化钠、柠檬酸钠、苯扎氯铵、盐酸麻黄碱(phedrine chloride)、 氯化钾、盐酸普鲁卡因(procaine chloride)、氯霉素(chloramphenicol) 和琥珀酸钠。以使滴眼剂的渗透压等于泪液渗透压的量添加等渗剂。

可以添加防腐剂以维持滴眼剂和/或眼用软膏的完整性。防腐剂的实 例包括但不限于山梨酸、苯扎氯铵、苄十二烷基二甲基铵溴化物 (benzododecinium bromide)、对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苄醇、苯乙醇、 依地酸二钠、山梨酸、聚季铵盐-1或本领域技术人员已知的其他试剂。

在一些实施方案中，使用增稠剂来增加眼用制剂如滴眼剂、眼用凝 胶和/或眼用软膏的粘度。可以使用的增稠剂包括但不限于甘油、聚乙二 醇、羧甲基纤维素和羧基乙烯基聚合物。

除了上述物质以外，在一些实施方案中，还期望使用附加的试剂， 包括但不限于稳定剂，如亚硫酸钠、碳酸钠和丙二醇；抗氧化剂，如抗 坏血酸、抗坏血酸钠、丁羟甲苯(BHT)、丁羟茴醚(BHA)、生育酚、 硫代硫酸钠；和/或螯合剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-双-(2- 氨基乙基)-N,N,N,N-四乙酸(EGTA)和柠檬酸钠。

滴眼剂、眼用凝胶和/或眼用软膏可通过无菌操作来制备，或者可替 代地在制备的合适阶段进行灭菌。例如，无菌药物组合物可以通过无菌 地混合无菌成分来制备。或者，该无菌药物组合物可通过先将成分混合 随后将最终制剂灭菌来制备。灭菌方法可包括但不限于热灭菌、辐射和 过滤。

眼用软膏(眼膏)可通过将活性成分混合至用于制备眼膏的基质中， 随后采用本领域已知的任何方法配制成药物制剂来无菌制备。用于眼膏 的典型基质的示例为凡士林、jelene 50、plastibase以及聚乙二醇。此外， 可以添加表面活性剂以增加亲水性。

可使用多种用于活性剂的控制释放的有效方法。参见，例如，Wagh V.D.,InamdarB.,Samanta M.K.,Polymers used in ocular dosage form and drug deliverysystems.Asian J Pharm 2,2008,12-17以及其中引用的参 考文献，其内容通过引用并入本文。特别考虑使用聚合物(例如，纤维 素衍生物，如羟丙基甲基纤维素(HPMC)和羟丙基纤维素(HPC)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚丙烯酸酯、环糊精和天然树胶、聚原酸酯(POE) 以及粘膜粘附聚合物)；半固体，如凝胶、膜和其他插入物；树脂，如离 子交换树脂；离子电渗递送；以及胶粒，如微球和纳米颗粒。

本发明的化合物还可以与其他治疗剂联合提供。在一些实施方案中， 本发明的化合物可以与其他活性剂共同配制，该活性剂包括但不限于抗 感染剂、抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、抗原生动物剂、消炎药、抗过 敏剂(包括抗组胺药)、人工泪液血管收缩剂、血管扩张剂、局部麻醉剂、 镇痛剂、眼压降低剂、免疫调节剂、抗氧化剂、维生素和矿物质、酶抑 制剂或可替代的蛋白酶和肽酶、细胞因子抑制剂等。

在多个实施方案中，本发明的化合物还可以与眼部治疗剂联合提供， 该眼部治疗剂选自安贺拉(Acular)(酮咯酸氨丁三醇眼用溶液)0.5％、 Acuvail(酮咯酸氨丁三醇)、AK-Con-A(萘甲唑啉眼药)、Akten(盐酸 利多卡因)、Alamast、Alphagan(溴莫尼定)、Alrex、Astepro(盐酸氮

斯汀鼻喷雾剂)、AzaSite(阿奇霉素)、Bepreve(苯磺酸贝他斯汀眼用溶液)、Besivance(贝西沙星眼用悬浮液)、Betaxon、BSS无菌灌洗液、 Cosopt、Durezol(二氟泼尼酯)、Eylea(阿柏西普)、Lotemax、Lucentis (雷珠单抗)、Lumigan(比马前列素眼用溶液)、Macugen(哌加他尼)、 Ocuflox(氧氟沙星眼用溶液)0.3％、OcuHist、Ozurdex(地塞米松)、 Quixin(左氧氟沙星)、Rescula(乌诺前列酮异丙基眼用溶液)0.15％、 Restasis(环孢菌素眼用乳液)、Salagen片剂、Travatan(曲伏前列素眼 用溶液)、Valcyte(盐酸缬更昔洛韦)、三氟胸苷(Viroptic)、Vistide(西 多福韦)、Visudyne(注射用维替泊芬)、Vitrasert植入物、福米韦生注射 剂、ZADITOR、Zioptan(他氟前列素眼用溶液)、Zirgan(更昔洛韦眼 用凝胶)、Zymaxid(加替沙星眼用溶液)、阿托品、氟比洛芬、毒扁豆 碱(Physostimine)、派立明(Azopt)、庆大霉素、匹鲁卡品(Proparacaine)、 杆菌肽、羟丙甲纤维素眼液(Goniosol)、多粘菌素B、聚维酮碘(Betadine)、 短杆菌肽、泼尼松龙、倍他洛尔、Humorsol、丙美卡因、倍他洛尔眼液(Betoptic)、Hylartin、Propine、布林佐胺、高渗NaCl、Puralube、BSS、 吲哚菁绿(Indocycanine Green)、玫瑰红(Rose Bengal)、卡巴胆碱、伊 曲康唑、透明质酸钠、头孢唑啉、拉坦前列素、舒洛芬、潇莱威(Celluvisc)、 甘露糖醇、土霉素、氯霉素、醋甲唑胺、噻吗洛尔、Ciloxan、咪康唑、 妥布霉素、环丙沙星、Miostat、曲安西龙、Cosopt、Muro 128、三氟尿 苷、Demecarium、新霉素、托吡卡胺、地塞米松、甲醋唑胺(Neptazane)、 Trusopt、地匹福林、Ocuflox、阿糖腺苷、多佐胺、氧氟沙星、Vira-A、 肾上腺素、氧四环素、三氟胸苷、荧光素、苯肾上腺素和适利达(Xalatan)。

试剂盒

本发明的一些实施方案涉及用于预防和/或减轻与眼病相关的一种 或多种症状的试剂盒。该试剂盒可包含含有一种或多种本文所述的治疗 性化合物的一个或多个容器。该化合物可以作为制备的药物组合物存在 于容器中，或者可替代地，该化合物可以是未经配制的。在这样的实施 方案中，该试剂盒可以在容器中包含与药学上可接受的载体分离的未配 制的化合物。在使用之前，将该化合物用该药学上可接受的载体稀释或 与之混合。

本文提供的试剂盒的一些实施方案还包含描述用于以某种方式施用 所述药物组合物的方法的说明，与眼病相关的一种或多种症状包括但不 限于视网膜变性、老视、白内障和/或眼晶状体的核硬化。在一些实施方 案中，该说明还描述了用于将包含在试剂盒中的治疗性化合物与眼用药 学上可接受的载体混合的程序。

在本发明的一些实施方案中，包含本文所述治疗性化合物的容器是 用于眼部施用的容器。在某些实施方案中，该容器是用于施用滴眼剂的 滴管。在其他实施方案中，该容器是用于施用眼用凝胶或眼用软膏的管。

本发明的一些实施方案通过以下实施例进一步阐明，该实施例不应 被解释为限制性的。本领域技术人员将会理解，下面的实施例中公开的 技术代表本发明人发现在本文描述的本发明实施方案的实施中运作良好 的技术，并因此可被认为构成用于实施这些实施方案的优选方式。然而， 根据本公开内容，本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的精神和范 围的情况下，可以在本文公开的具体实施方案中作出许多改变，并且仍 可获得同样或相似的结果。

装置

本发明的一些实施方案涉及用于将本发明甾醇施用于受试者的装置。 在一些实施方案中，该装置包含含有配制在药学上可接受的载体中的本 发明甾醇的内部部分、腔体或储器。在这样的实施方案中，该药学上可 接受的载体包括但不限于溶液、凝胶和软膏。在某些实施方案中，该内 部部分、腔体或储器含有本文所述的一种或多种含有本发明甾醇的药物 制剂。

在一些实施方案中，本文考虑的装置还包含与该装置的内部部分、 腔体或储器耦合的涂抹器。该涂抹器可以为允许将含有本发明甾醇的药 物制剂从内部部分、腔体或储器递送至眼睛的圆柱形、圆锥形或任何其 他形状。在优选的实施方案中，该涂抹器为锥形圆筒，其中宽端与内部 部分、腔体或储器耦合，并且锥形端形成含有本发明甾醇的药物制剂到 眼睛的通路的出口。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所 属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。虽然与本文所述 的那些类似或等同的任何方法、装置和材料可用于本发明的实施或测试， 但现在描述的是优选的方法、装置和材料。

本文提及的所有出版物均通过引用而全文并入本文，以用于描述和 公开可能与当前描述的发明关联使用的出版物中描述的方法的目的。上 文和整个文本中讨论的出版物仅提供其在本申请的申请日之前的公开内 容。本文中的任何内容都不应被解释为承认发明人无权因在先发明而早 于此公开内容。

以下实施例旨在说明本发明，而非以任何方式、形状或形式明确地 或隐含地限制本发明。虽然它们是可以使用的典型代表，但也可以替代 地使用本领域技术人员已知的其他程序、方法或技术。

实施例1

人晶状体主要由组装成对于晶状体透明度和折射率而言必需的高度 有序、相互作用的宏观结构的晶体蛋白组成。对蛋白质内或蛋白质间相 互作用的任何破坏都将改变此精细结构，使疏水性表面暴露，并伴有后 续的蛋白质聚集和白内障形成。在世界范围内白内障是失明的最常见病 因，其影响数千万人，并且当前唯一的治疗是手术去除白内障晶状体。 晶状体蛋白质阻止聚集和保持晶状体透明度的确切机制在很大程度上都 是未知的。羊毛甾醇是在晶状体中富集的两性分子。它由羊毛甾醇合酶 (LSS)在胆固醇合成途径的关键环化反应中合成。这里我们鉴定了患 有广泛先天性白内障的两个家庭的两种不同的纯合LSS错义突变 (W581R和G588S)。这两种突变均影响高度保守的氨基酸残基并削弱LSS的关键催化功能。野生型而非突变的LSS的工程化表达阻止多种致 白内障的突变晶体蛋白的细胞内蛋白质聚集。羊毛甾醇而非胆固醇治疗 显著减少了在体外和细胞转染实验中预先形成的蛋白质聚集体。我们进 一步证明了羊毛甾醇治疗既可以在体外降低切开的兔子白内障晶状体的 白内障严重程度并增加透明度，又可以在体内降低狗的白内障严重程度。 我们的研究将羊毛甾醇鉴定为在阻止晶状体蛋白质聚集中的关键分子， 并提出了用于白内障预防和治疗的新策略。

白内障占全世界所有失明病例的半数以上，且唯一确定的治疗包括 手术去除不透明的晶状体。在发达国家，由于该疾病在老年人群中的高 患病率，使得白内障手术占医疗保健费用的很大一部分。此外，在发展 中国家中也有与白内障相关的高发病率，其中手术治疗的机会是有限的。

晶状体纤维中高浓度的晶体蛋白有助于晶状体的透明度和折射性能 ²。晶体蛋白超家族由a-、b-和c-晶体蛋白组成，它们是人体内最高度浓 缩的细胞内蛋白质中的一些。蛋白质聚集是白内障形成中的一个最重要 的因素³。导致蛋白质聚集的因素包括晶体蛋白中的突变，已知这些突 变导致先天性白内障或氧化应激，这转而促成年龄相关性白内障。然而， 晶状体蛋白质保持透明度或引起浑浊的确切机制尚未完全了解。

羊毛甾醇合酶(2,3-氧代角鲨烯-羊毛甾醇环化酶，LSS；EC 5.4.99.7) 由LSS基因编码。LSS蛋白催化(S)-2,3-氧代角鲨烯转化为羊毛甾醇，这 是胆固醇、类固醇激素和维生素D的生物合成中的关键早期限速步骤(参 考文献4)。发现LSS在晶状体中表达⁵。据先前报道，LSS和FDFT1(法 呢基二磷酸酯法呢基转移酶1)上的亚效等位基因突变的特定组合可以降低晶状体中的胆固醇水平并在Shumiya白内障大鼠(SCR)中导致白 内障⁶。这里我们在两个血缘家庭中鉴定LSS基因中的新型纯合突变， 并研究羊毛甾醇减轻蛋白质聚集和白内障形成的能力。

鉴定了来自高加索人血统的血缘家庭的患有重度先天性白内障的三 名儿童(图1a)。进行全外显子组测序至目标区域上平均不低于55倍深 度覆盖(表1a)，以便鉴定致病突变。平均在每个外显子组中检测到 60,800-80,800个SNP(表1b)。使用血缘隐性模型和针对包括dbSNP和 1000基因组计划(1000Genomes Project)在内的公共数据库中的共同变体(次等位基因频率为0.5％)过滤以及突变功能预测(通过SIFT⁷、 Polyphen2⁸、Phylop⁹和Mutationtaster¹⁰预测)，我们缩小了潜在的候选基 因变体，并将21号染色体上的LSS中的变体(G588S)鉴定为最可能的 候选物(表1c)。三名受影响的儿童对于LSS中的GRA转换(G588S) 是纯合的，(GRch37/hg19:chr21:47615645；NM_001001438.2:c.1762G.A， NM_001001438.1:p.G588S)，而未受影响的父亲、母亲和其余儿童对于 该变化是杂合的(图1a，图1b)。全基因组SNP基因分型通过 HomozygosityMapper¹¹鉴定了三个长的连续纯合区(chr2:q22.1–q24.1、chr2:q31.1–q32.1和chr21:q22.3；图6a和表1d)。LSS基因位于21号染色体上的一个纯合区中(图6B)。此外，我们在154个患有先天性白内 障的家庭中针对LSS基因中的突变进行筛选，并在第二个血缘家庭中鉴 定了另一个纯合突变，W581R(GRch37/hg19:chr21:47615666； NM_001001438.2:c.1741T.C，NM_001001438.1:p.W581R)(图1A，图1B，图1C)。这两种突变在11,000个对照染色体中是不存在的。

LSS中的氨基酸残基W581和G588是高度保守的(图2A)。我们 进行了计算建模分析，以研究W581R和G588S突变对LSS的3D结构 和功能的影响。已报道位置581处的氨基酸色氨酸对环化酶活性的催化 位点有贡献¹²。G588S突变体通过原位替换及随后的侧链精修(refinement) 来建模。S588侧链精修不能解决丝氨酸侧链与E578的骨架羰基之间的 范德华力碰撞，该骨架羰基与R639形成关键的盐桥。E579:C584环的取 向需要扭曲以适应该突变。突变S588的侧链碰撞到相邻的环，表明该 突变与LSS的正常酶结构和功能不相容(图2B)。该计算机模拟结果得 到以下证据的支持：细胞转染实验中野生型LSS的表达显示出环化酶活 性，并显著增加了HeLa细胞的脂质部分中羊毛甾醇的产生量，而W581R 和G588S突变蛋白质均未显示任何环化酶活性(图2C)。相反，胆固醇 水平未受野生型或突变LSS的表达的影响，这表明可能存在胆固醇体内 平衡的替代途径。与野生型LSS相比，W581R和G588S突变没有改变 亚细胞定位或导致LSS蛋白的聚集体，这表明白内障表型并非由于通过 突变LSS蛋白自身形成光散射粒子而产生(图7)。晶体蛋白——晶状体 中主要的结构蛋白质——的聚集是多种类型的白内障的主要病因³。为 了模拟白内障晶状体中的蛋白质聚集，在人晶状体祖细胞、人晶状体上 皮细胞系B-3(HLEB-3)或HeLa细胞中表达六种已知的致白内障突变 晶体蛋白。在全部三种转染的细胞系中，这些突变晶体蛋白形成p62-阳 性包涵体/聚集体，这表明聚集是突变晶体蛋白的固有特性(图3A以及 图8和图9)¹³。野生型LSS和致白内障的突变晶体蛋白的共表达显著 减小了细胞内晶体蛋白聚集体的数目和大小，而LSS突变体不能单独实 现这一点(图3B、图3C以及图8和图9)。蛋白质印迹分析表明，aA- 晶体蛋白的Y118D突变体从细胞内聚集体中释放，并且具有野生型LSS 的变得更易溶(图3D和图9C)。此外，在共表达LSS突变体和突变晶 体蛋白的细胞的培养基中添加羊毛甾醇而非胆固醇成功地减少了晶体蛋 白聚集(图3C以及图8和图9)。该结果表明，羊毛甾醇而非胆固醇可 能是从聚集释放突变晶体蛋白的有效药剂。

该假设得到以下证据的支持：羊毛甾醇以浓度依赖性方式显著抑制 了野生型和突变的晶体蛋白的聚集体形成，而胆固醇没有效果(图3E、 图3F和图10)。羊毛甾醇而非胆固醇增加了细胞裂解物的可溶部分中突 变晶体蛋白的量(图3G和图11A)。利用表达aA-晶体蛋白的GFP-融合 Y118D突变体的细胞的连续活细胞成像，我们证明了添加羊毛甾醇可以有效减少半衰期为22268分钟的晶体蛋白聚集体(图3H)，而添加DMSO 或胆固醇没有减少聚集体形成(图11B)。活细胞中的单粒子跟踪清楚地 显示，羊毛甾醇在分解预先形成的细胞内蛋白质聚集体中具有重要作用。

为了研究羊毛甾醇是否对聚集的蛋白质的分解具有直接作用，通过 在1M盐酸胍的存在下加热野生型和突变的晶体蛋白获得了五种野生型 晶体蛋白和九种突变晶体蛋白的聚集体。在该条件下，如由硫代黄素T (ThT)荧光的增强、在负染色的透射电子显微镜(TEM)下的纤维结 构以及低浊度值所显示的(图4和图11C)，所有晶体蛋白均形成了淀粉样纤维。在此获得的淀粉样纤维的形态类似于先前报道的那些晶体蛋白 ¹⁴。由二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)形成的含PBS的脂质体用来增加甾 醇化合物的溶解度并模拟甾醇在细胞膜中的状态。如由负染色的TEM 照片中纤维结构的消失和ThT荧光强度的减小所示的(图4和图11D)， 羊毛甾醇而非胆固醇成功地以浓度依赖性方式再溶解了来自淀粉样纤维 的聚集的晶体蛋白。作为一个实例，再溶解的αA-晶体蛋白可以在负染 色的TEM图片中得到确认，并且大小为约15nm(图4A)¹⁵。

为了评估羊毛甾醇对减少晶状体组织中的白内障的作用，从兔子中 分离出天然存在的白内障晶状体，并将其在25mM羊毛甾醇溶液中温育 6天，并比较羊毛甾醇治疗前后的晶状体清晰度。如由晶状体清晰度的 增加所示的(P<0.003，Wilcoxon检验，图5A，图5B，表2A以及图12A、 图12B)，观察到强烈的白内障严重程度降低趋势。我们进一步研究了羊毛甾醇在体内逆转狗的白内障的作用。羊毛甾醇治疗显著降低了白内障 严重程度，并增加了晶状体清晰度(P<0.009，Wilcoxon检验，图5C， 图5D；表2B和图12C)。

影响LSS的催化功能的纯合突变导致伴有严重视觉丧失的广泛先天 性白内障。羊毛甾醇在白内障预防中的关键作用得到以下观察结果的支 持：携带复合LSS突变的大鼠品系概括了人白内障疾病表型⁶。与此见 解相一致的是，发现LSS抑制剂(也称为氧代角鲨烯环化酶抑制剂) U18666A对LSS的抑制导致白内障¹⁶。此外，羊毛甾醇治疗显著地减少 了在细胞培养物中由突变晶体蛋白引起的蛋白质聚集，同时在动物模型 中降低了预先形成的白内障严重程度，从而增加了晶状体清晰度。可以 想象，羊毛甾醇的两性性质允许其嵌入并包覆大蛋白质聚集体的疏水核 区域，从而有效地使这些聚集再次逐渐变为水溶性的。

总之，羊毛甾醇在抑制晶状体蛋白质聚集和减少白内障形成方面发 挥关键作用，这提出了预防和治疗白内障的新策略。白内障是失明的主 要病因，并且每年有数百万患者接受白内障手术以去除不透明的晶状体。 该手术虽然非常成功，但伴随有并发症和发病率。因此，用于逆转白内 障的药理学治疗可具有巨大的健康和经济影响。此外，通过鼓励研究小 分子方法，如本文所示的方法，我们的结果对于治疗蛋白质聚集疾病可 具有更广泛的意义，该蛋白质聚集疾病包括神经变性疾病和糖尿病，它 们共同成为老年人群中发病率和死亡率的重要病因。

方法

研究参与者。所有参与者均进行标准的全面眼科检查和影像学研究。 在首次访视时收集人口数据、风险因素和血液样品。我们招募了一个由 两名成人和四名儿童组成的血缘家庭。父母是嫡堂表亲，并且他们四个 孩子中的三个被诊断为患有视网膜变性和白内障(图1A)。我们在另外 154个先天性白内障系谱中针对LSS突变进行筛选，并鉴定了另一个具有纯合W581R突变的家庭。

外显子组捕获和测序。使用Agilent SureSelect Human All Exon试剂 盒(溶液中)根据制造商的方案进行外显子组捕获。简而言之，通过 Covaris将基因组DNA样品进行随机片段化，其中所得片段的碱基对峰 为150-200bp，并且衔接子与片段的两端连接。使用Agencourt AMPure SPRI珠子对衔接子连接的模板进行纯化，并且切下插入片段大小约为250bp的片段。提取的DNA通过连接介导的PCR进行扩增，纯化，并 与SureSelectBiotinylated RNA文库(BAITS)杂交以供富集。杂交的片 段与链霉亲和素珠子结合，而非杂交的片段在24h后被洗出。使捕获的 连接介导的PCR产物在Agilent 2100生物分析仪上分析以估算富集的量 级。随后将每个捕获的文库加载到Illumina Genome Analyzer II平台上， 并以读长90bp进行配对末端测序，这为每个样品提供了至少50×的平 均覆盖深度。由采用默认参数的Illumina碱基判定软件处理原始图像文 件。

读序作图和变体检测。使用BWA¹⁷(0.5.9–r16版)将每个个体的序 列读序与人参考基因组(NCBI版本37，hg19)进行比对。随后利用基 因组分析工具箱(Genome AnalysisToolKit)(GATK 2.8版)用GATK¹⁸最佳实践管线(best practice pipeline)处理由BWA创建的BAM文件， 以进行再比对和变异(SNV和插入缺失)检测。提取通过VQSR过滤标 准的变异以供后续分析。

使用推荐的参数通过SOAPsnp(v1.03)和BWA(0.5.9–r16版)对 目标区域中的共有基因型进行判定。Phred样质量至少为20且覆盖深度 至少为4×的共有基因型被认为是高可信度基因型。提取与参考不同的基 因型作为候选SNP，并且如下过滤SNP结果：Phred样SNP质量≥20， 总深度为4×至200×，拷贝数估计值<2，并且两个邻近SNP之间的距离 不小于5bp。

遗传变体的功能注释。变体使用ANNOVAR进行功能注释并分类为 错义突变、无义突变、连读突变和剪接位点突变，它们与同义突变和非 编码突变相比很可能是有害的。基于这些注释，首先针对非同义、剪接 受体位点和供体位点对变体进行过滤，随后针对可获得的公共数据库 (dbSNP129和1000基因组变体数据库)进行过滤。被发现在所述三位 受影响的受试者中是纯合突变且在携带者(父母)中是杂合突变但在公 共数据库中不存在的变体，被认为是候选致病变体。

LSS和基因的突变筛选。进行Sanger DNA测序以验证LSS中的 G588S突变。将LSS基因中的22个外显子通过PCR进行扩增，并在遗 传分析仪(Genetic Analyzer)3130(AppliedBiosystems)上进行测序。 用来扩增LSS中的外显子的引物示于表3A中。我们在154个患有先天 性白内障的家庭中针对LSS基因中的突变进行了筛选，并在第二个血缘 家庭中鉴定了另一个纯合突变W581R。这两种突变在11,000个对照染 色体(包括来自San Diego的未受影响的对照人群和1000基因组计划的 2,000个染色体，以及来自华盛顿大学外显子组测序数据库的8,000个染 色体)中不存在。由于先前报道FDFT1突变修饰白内障表型，因此我们筛选了FDFT1基因中的变体，鉴定了仅一个共同的非同义变体rs4731 (GRch37/hg19:chr8:11666337；NM_001287742.1: c.134A.G,NM_001274671.1:p.K45R)。因为未受影响的女儿携带相同的纯 合变化，并且相对较高频率的一般人群具有该变体(在1000基因组计划 数据中次等位基因频率为.4％)(表1E)，所以该变体作为致病突变被排 除。

G588S突变的3D建模。由Ruf等人²⁰确定并且以条目1W6K和1W6J¹²登录在蛋白质数据库中的两个结构来构建G588S突变体的模型。 使用X射线坐标构建该酶的全原子模型，并且使用内坐标力学程序 (Internal Coordinate Mechanics program)(ICM)及其PDB转换方案²¹将该模型精细化。为了分析G588S突变诱导的碰撞对羊毛甾醇结合的影 响，我们使用1W6K结构分析了与羊毛甾醇相互作用的酶的口袋所涉及 的所有侧链。将接触面积计算为具有羊毛甾醇与不具有羊毛甾醇的每个 残基的溶剂可及面积之间的差，并且使用ICM程序²²按大小对接触面积 进行排序。

质粒构建体和定点诱变。含有LSS cDNA的克隆购自Thermo Scientific Inc.。将野生型LSS的编码序列克隆并插入pcDNA3.1-N-Flag 质粒(Invitrogen)中。通过使用PCR的重叠延伸经由定点诱变来构建 突变体。共同PCR引物为：NdeI正向，59-CATATGACGGAGGGCACGTGTCT-39，以及XhoI反向， 59-CTCGAGTCAGGGGTGGCCA GCAAG-39。用于构建W581R和 G588S突变体的引物为：W581R正向， 59-TGGGAAGGCTCCCGGGGAGTTTGCT-39；反向， 59-GTGAAGCAAACTCCCCGGGAGCCTTC-39；G588S正向， 59-GCTTCACCTACAGCACCTGGTTTG-39；G588S反向，59- CCAAACCAGGTGCTGTAGGTGAAG-39。将含有野生型或突变的LSS 基因的重组pcDNA3.1-N-Flag质粒转化到大肠杆菌(E.coli)DH5a细胞 中。如先前所述^23-26，从人晶状体的总cDNA克隆aA-、aB-、bB2-、cC- 和cD-晶体蛋白的cDNA。使用表3B中列出的引物通过定点诱变构建突 变体。扩增的片段用XhoI和BamHI消化，随后插入真核表达载体 peGFP-N1或原核表达载体pET28a中。使用Plasmid Maxiprep试剂盒 (Vigorous)获得质粒，并通过DNA测序进行验证。将晶体蛋白基因构 建体制备为C-末端eGFP融合蛋白，而将LSS制备为N-末端Flag标记 的蛋白质。

细胞培养和转染。HeLa细胞和人晶状体上皮B-3细胞(HLEB-3) 从ATCC获得。从人胎儿眼中分离出人晶状体祖细胞²⁷。将HeLa细胞 在含有10％FBS的DMEM培养基(Gibco)中培养。将HLEB-3细胞在 含有20％FBS的F12培养基中培养，而将人晶状体祖细胞在含有20％FBS和10mg ml^-1FGF的MEM培养基(Gibco)中培养。所有细胞均在 37℃下在5％CO₂培养箱中培养。细胞经常规测试为支原体污染阴性。

为了评估LSS表达对甾醇含量的影响，将HeLa细胞用在编码区的 N-末端处与Flag标记物融合的野生型LSS或LSS突变体进行转染。在 24h转染后收获细胞并提取脂质部分以供LC–MS分析。用载体 pcDNA3.1-N-Flag质粒转染的细胞用作对照。通过使用小鼠抗-Flag(F1804；Sigma-Aldrich)和小鼠抗肌动蛋白抗体(BS6007M；Bioworld Technology)的蛋白质印迹分析对野生型和突变LSS的表达水平进行归 一化。

为了评估羊毛甾醇对晶体蛋白聚集的影响，将人晶状体祖细胞用 LSS和多个晶体蛋白构建体共转染4h。用晶体蛋白突变体和 pcDNA3.1-N-Flag共转染的细胞用作对照。在分析聚集体之前将用LSS 和晶体蛋白突变体构建体共转染的人晶状体祖细胞培养12h。在16h后 通过向细胞培养基中添加40mM甾醇(羊毛甾醇或胆固醇， Sigma-Aldrich)进行拯救实验2h，随后将培养基替换为新鲜培养基并培 养细胞24h。从十个随机选择的视野计算具有晶体蛋白聚集体的细胞的 百分比。计算野生型LSS组、突变体组和突变体加羊毛甾醇组的值。用 1％DMSO处理的细胞用作对照。

在单盲观察者研究中评估LSS和羊毛甾醇对细胞内晶体蛋白聚集的 影响。实验重复至少三次。使用Student t检验计算P值。荧光显微镜检 查。将等量的人晶状体祖细胞、HLEB-3细胞或HeLa细胞接种在用TC (Solarbio)预处理的玻璃盖玻片上。在培养24小时达到90％汇合后， 将细胞用含有不同LSS或晶体蛋白基因的质粒进行转染，或用含有某个 晶体蛋白基因的质粒和含有野生型或突变的LSS基因的质粒进行共转染。 对照是用含有peGFP-N1和/或peDNA3.1-N-Flag的质粒转染的细胞。使 用Lipofectamine 3000(Invitrogen)根据制造商的说明进行转染和共转染。

根据Flag–LSS和晶体蛋白–GFP在人晶状体祖细胞、HLEB-3细胞 或HeLa细胞中的共表达来评估野生型或突变的LSS对多种致白内障的 晶体蛋白突变体的细胞内聚集的影响。使用GFP或抗Flag抗体对蛋白 质的细胞内分布进行可视化。在共转染4h之后，将细胞在新鲜培养基 中培养24h，随后通过显微镜检查进行分析。

通过用含有不同晶体蛋白基因的质粒转染细胞来研究羊毛甾醇或胆 固醇对多种晶体蛋白的聚集体形成的影响。将细胞温育24h以实现高效 的蛋白质表达和聚集体形成。随后用在1％(对于人晶状体祖细胞)或 2％DMSO(对于HeLa细胞)中的0–40mM甾醇处理细胞。用1％或2％ DMSO处理的细胞用作对照。在处理2h之后，将培养基替换为新鲜培 养基。在12h之后，将细胞用于显微镜分析。

如下制备显微镜检查样品：将玻片用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤 三次。将细胞用4％低聚甲醛固定40min，接着用PBS另外洗涤三次。 将细胞用在PBS中的0.1％Triton X-100(Sigma)透化处理10min，并 用在PBS中的5％正常山羊血清在37℃下封闭1h。如下进行免疫染色： 添加在含有5％正常山羊血清的PBS缓冲液中的小鼠抗-Flag抗体(1:500) 或小鼠抗-p62抗体(1:200，ab56416；Abcam)，并在37℃下温育1h。 随后将玻片用PBS洗涤三次，并进一步与Alexa 649缀合的山羊抗小鼠 IgG(1:250)一起在环境温度下温育1h。用Hoechst 33342(Invitrogen) 对细胞核进行复染。使用Carl Zeiss LSM 710共聚焦显微镜分析所固定 的细胞。

活细胞成像。将人晶状体祖细胞用含有αA-晶体蛋白(Y118D)突 变体的质粒进行转染。在24h转染期之后，通过在含有0.8mg m1^-1 G418 的培养基中温育7天来筛选具有αA-晶体蛋白(Y118D)突变体的稳定 表达的细胞。随后，将获得的细胞接种到玻璃底细胞培养皿(In Vitro Scientific)上，并用1％DMSO、在1％DMSO中的40mM胆固醇或在 1％DMSO中的40mM羊毛甾醇处理4h。添加新鲜培养基，并通过连 续活细胞成像来分析细胞。用OlympusIX81显微镜观察活细胞图像并用 CellSens Dimension软件(Olympus)捕获图像。通过在活细胞成像中使 用单粒子跟踪测量p62-阳性聚集体的荧光密度进行聚集体大小的定量分析。使用三个生物重复品(每个重复1-8次)进行活细胞成像。

细胞的脂质提取。使用Bligh和Dyer的方法²⁸进行脂质的提取。简 而言之，将约1×10⁶-10⁷个HeLa细胞用PBS洗涤3-5次，随后在400-ml 冰冷的甲醇中刮下，并转移至添加有200ml氯仿的1.5ml Eppendorf管 中。将样品涡旋搅拌1min，随后与300ml的1M KCl混合。通过在4℃ 下以20,817×g微量离心5min来分离有机相和水相。分离后，收集下 部的有机相。随后使用300ml氯仿将剩余的水相再萃取两次。使用 SpeedVac样品浓缩器在真空下干燥收集的有机相。将干燥的样品在280 ℃下储存以供进一步的LC-MS分析。

LC–MS分析。将干燥的脂质提取物重悬于100ml甲醇中。将样品 涡旋搅拌10min，通过80W超声波降解法处理30min，在20,817g下 微量离心10min，随后将上清液转移至新的Eppendorf管中。微量离心 处理重复三次。使用替代的气压化学电离(APCI)源，通过Agilent 1290/6460三级四极(triple quadrupole)LC/MS分析得到的样品。使用 AgilentSB-C18柱分离脂质。使用电子电离模式进行选择性离子监测。 使用高纯度的羊毛甾醇和胆固醇作为对照。使用350℃的气体温度、4 l min^-1的气体流速、60p.s.i.的喷雾器、350℃的汽化器、3,500V的毛细 管和4mA的电晕电流进行MS测定。为了优化灵敏度和特异性，针对每种化合物的MS分析选择两种限定离子(qualifier ion)(对于胆固醇为 369.3/161.1和369.3/147，而对于羊毛甾醇为409.2/191.3和409.2/109)。 蛋白质印迹法。在含有50mMTris(pH 8.0)、150mM NaCl、1％Triton X-100、1mM EDTA、0.5％脱氧胆酸钠和0.1％SDS的RIPA缓冲液中制 备细胞裂解物。通过离心分离上清液和沉淀部分。通过12.5％SDS–PAGE分离蛋白质并将该蛋白质转移至PVDF膜(GE Healthcare)。分别使用小 鼠抗Flag抗体(F1804；Sigma-Aldrich)或抗GFP抗体(MB2005；Bioworld Technology)鉴定超表达的LSS和晶体蛋白。使用软件GELPRO(Media Cybernetics)来实现对蛋白质印迹条带的定量。从三个独立实验计算所 呈现的定量数据。

蛋白质表达和纯化。使His标记的重组野生型和突变b-和c-晶体蛋 白在大肠杆菌中超表达，并使用Ni-NTA亲和柱及随后的凝胶过滤色谱 法，采用如别处所述^23,24,26,29的相同方案进行纯化。如先前所述³⁰进行非 标记的αA-和αB-晶体蛋白的超表达和纯化。如通过12.5％SDS–PAGE、 10％非变性PAGE上的一个均质条带和尺寸排阻色谱图中的单峰所评估的，蛋白质的纯度被估计为95％以上。通过使用BSA作为标准，根据 Bradford法测定蛋白质浓度³¹。在含有150mM NaCl、1mM EDTA和1 mM DTT的20mM PBS缓冲液中制备所有蛋白质样品。

蛋白质聚集和聚集体分解。通过在60℃下加热含有1M盐酸胍(超 纯，Sigma-Aldrich)的浓度为5mg/ml的蛋白质溶液2h获得野生型和 突变的αA-和αB-晶体蛋白的聚集体。通过在37℃下加热含有1M盐酸 胍的蛋白质溶液48h制备野生型和突变的b-和c-晶体蛋白的聚集体。聚 集体的形成通过ThT荧光、浊度(400nm下的吸光度)和透射电子显微 镜(TEM)观察来确认。将预先形成的聚集体以0.2mg/ml(约10mM) 的最终浓度重悬于20mM PBS中。在37℃下用在由500mM DPPC (Sigma-Aldrich)形成的脂质体中的500mM羊毛甾醇或胆固醇处理重 悬的聚集体。用500mM DPPC脂质体处理的聚集体用作阴性对照。在 处理24h之后，将蛋白质溶液用于ThT荧光、浊度和负染色的TEM观 察。通过将蛋白质溶液沉积到新鲜辉光放电的碳涂覆的铜网格上来制备 TEM样品。通过用1.25％乙酸铀酰对网格染色30s获得负染色样品。在 电压为120kV且放大倍数为48,000的Hitachi H-7650B透射电子显微镜上得到负染色的TEM图片。

白内障兔子晶状体的处理。通过吸入CO₂对兔子施以安乐死且立即 切开晶状体，并用媒介物或溶解于媒介物中的羊毛甾醇处理以制成25 mM溶液。将晶状体组织在室温下、黑暗中在这些溶液中温育6天。在 显微镜下检查白内障并拍照。白内障的程度由不知情的检查者使用先前 描述的浑浊分级系统进行评估，如下所示^32,33。通过目测和分级对晶状 体清晰度和透明度的改善进行定量。通过透光性、晶状体下面的网格图 像的清晰度(图12)以及晶状体总体清晰度的改善或皮质性白内障局部 区域的清晰度的改善来对晶状体清晰度进行评分。使用Wilcoxon检验来 评估治疗效果。

白内障分级系统。0级：不存在浑浊(网格线清晰可见)；N 1级： 轻微程度的浑浊(网格线最低程度的混浊，但网格线仍然可见)；N 2级： 存在涉及几乎整个晶状体的弥漫性浑浊(网格线中度混浊，但主要的网 格线可见)；N 3级：存在涉及整个晶状体的广泛、密集的浑浊(网格线 完全混浊，且网格线根本不可见)。

载药纳米颗粒的制备。通过修改的纳米沉淀法³⁴将羊毛甾醇负载到 脂质-聚合物混合纳米颗粒中。简而言之，将所需浓度的羊毛甾醇与溶解 在乙腈中的聚己内酯(PCL)聚合物混合。以该PCL聚合物重量的20％， 将卵磷脂和1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-羧基(聚乙二醇) 2000(DSPE-PEG-COOH)溶解在4％乙醇水溶液中，并加热至60℃以上。随后在轻柔搅拌下将羊毛甾醇/PCL溶液添加至预热的脂质溶液中， 接着剧烈涡旋3min。随后将该混合溶液搅拌2h以使纳米颗粒形成并使 乙腈蒸发。然后，使用截留分子量为10kDa的Amicon Ultra-4离心过滤 器(Millipore)将纳米颗粒溶液洗涤三次，以去除剩余的有机溶剂和游 离分子。随后将所得纳米颗粒重悬于PBS缓冲液中以供后续使用。通过动态光散射表征载药纳米颗粒的大小、大小分布和表面ζ电位。通过高 效液相色谱法对羊毛甾醇的负载量进行定量。

狗的白内障晶状体的治疗。为了评估羊毛甾醇治疗对活动物的白内 障的效果，采用肌肉内注射乙酰丙嗪(acepromaxine)和布托啡诺对狗 进行预先药物治疗。20min之后，通过静脉内施用异丙酚进行麻醉诱导。 随后立即给狗插管并保持2l min^-1的氧气和2％异氟烷。首先使用28号 针头将负载羊毛甾醇(100mg)的纳米颗粒注射到测试眼的玻璃体腔中， 随后在实验期间每3天给予一次。治疗眼或假治疗眼是随机的。向对照 眼给予具有空纳米颗粒载体的注射剂作为阴性对照。采用在局部滴眼剂 中的羊毛甾醇(参见以下滴眼剂配方)对治疗眼进行治疗。在6周内， 每日三次将一滴50-ml羊毛甾醇施用于测试眼。通过裂隙灯检查白内障 严重程度并在6周治疗期开始和结束时拍照。在检查之前，用1％托品 酰胺和10％苯肾上腺素散瞳。白内障严重程度由不知情的检查者来评估， 并根据如下所示的犬白内障阶段进行评分³⁵。对晶状体清晰度和透明度 的改善进行定量。使用Wilcoxon检验评估治疗效果。

犬白内障的分级系统。0级：不存在浑浊(无白内障)；N 1级：轻 微程度的浑浊(初期)；N 2级：存在涉及几乎整个晶状体的弥漫性浑浊 (未成熟期)；N 3级：存在涉及整个晶状体的广泛、密集的浑浊(成熟 期)局部媒介物溶液。将双蒸H₂O添加至与0.055g烷基二甲基苄基氯 化铵组合的1.1g(EDTA)₂Na中，直到最终体积达到1.1l(pH 5.66)。局 部媒介物溶液中的25mM羊毛甾醇。将双蒸H₂O添加到12.5g羊毛甾醇、 1.1g(EDTA)₂Na、0.055g烷基二甲基苄基氯化铵和200ml EtOH的混合 物中至最终体积为1.1l。

在一个实施方案中，羊毛甾醇滴眼剂溶液的配方为：

配方

仅含媒介物的溶液：

随后添加ddH2O直到最终体积为1.1L(PH 5.66)

在媒介物中含有5mM羊毛甾醇的溶液：

随后添加ddH2O直到最终体积为1.1L(PH 5.66)

表1外显子组测序和变体

表1a.外显子组测序数据生成的总结

表1b.检测的变体的总结

表1c.外显子组测序后的变体优先化管线

*在受影响的儿童中为纯合的，在携带者中为杂合的，在未受影响的儿童中没有纯合突变体 表ld.全基因组基因分型数据的总结

表le.在基因FDFT1上检测到的编码变体

表2羊毛甾醇在兔子白内障晶状体和狗白内障中的治疗效果

表2a.羊毛甾醇在兔子白内障晶状体中的治疗效果

表2b.羊毛甾醇在狗白内障中的治疗效果

表3用于对人LSS基因中的每个外显子进行测序和构建晶体蛋白突变体的引物

表3a.用于PCR扩增和对人LSS基因中的每个外显子进行测序的引物

表3b.用于构建晶体蛋白突变体的引物

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Claims (16)

1.组合物在制备用于治疗和/或预防受试者的视觉障碍的药物中的用途，所述组合物包含药学上可接受的眼用载体和药学上有效量的羊毛甾醇。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述受试者患有视觉障碍或处于发展成视觉障碍的风险下，该视觉障碍影响眼内晶状体的正常结构。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述视觉障碍选自白内障、先天性白内障、皮质混浊、后囊下白内障、老视核硬化、视网膜退行性病症、雷夫叙姆病、Smith-Lemli-Opitz综合征、施奈德结晶状角膜营养不良、玻璃疣、年龄相关性黄斑变性和糖尿病视网膜病变。

4.根据权利要求1所述的用途，其中所述羊毛甾醇抑制晶体蛋白聚集。

5.组合物在制备用于治疗受试者的白内障或失明/视觉损伤的药物中的用途，所述组合物包含药学上可接受的眼用载体和药学上有效量的羊毛甾醇，其中所述羊毛甾醇溶解所述受试者的眼内的晶状体晶体蛋白聚集体。

6.根据权利要求4所述的用途，其中所述晶状体晶体蛋白为α–晶体蛋白、β–晶体蛋白或γ–晶体蛋白中的任一种。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的用途，其中所述组合物被配制成眼用溶液、眼用软膏、眼用洗剂、眼内输注溶液、用于前房的洗剂、内服药、注射剂或用于提取的角膜的防腐剂。

8.根据权利要求1-6中任一项所述的用途，其中所述受试者选自两栖动物、爬行动物、禽类和哺乳动物。

9.根据权利要求8所述的用途，其中所述哺乳动物选自啮齿动物、猫、狗、猪、马和人。

10.一种用于溶解晶体蛋白的淀粉样纤维的方法，该方法包括使淀粉样纤维与羊毛甾醇以足够的量和持续时间接触以便溶解晶体蛋白的淀粉样纤维的步骤。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述方法在原位、体外或体内进行。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述方法对受试者进行。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述受试者是人。

14.一种用于治疗和/或预防影响受试者眼睛的正常结构的视觉障碍的试剂盒，该试剂盒包含药学上有效量的羊毛甾醇、药学上可接受的载体的制剂，以及关于施用所述制剂使得所述施用治疗和/或预防所述视觉障碍的说明。

15.一种用于治疗和/或预防受试者的视觉障碍的眼用药物组合物，所述组合物包含药学上可接受的眼用载体和药学上有效量的羊毛甾醇。

16.根据权利要求15所述的眼用药物组合物，其中所述组合物被配制成眼用溶液、眼用软膏、眼用洗剂、眼内输注溶液、用于前房的洗剂、内服药、注射剂或用于提取的角膜的防腐剂。

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