JP2017525769A - 視覚障害を処置する組成物と方法 - Google Patents

Abstract

本発明は視覚障害を処置するためのステロールおよびその使用を与えるものである。一実施形態において、薬学的に有効な量のラノステロールを含む組成物は、被験体の視覚障害を処置および／または予防するために用いられる。別の実施形態において、薬学的に有効な量のラノステロールを含む組成物は、被験体の白内障または盲目／視力低下を処置するために用いられる。さらに別の実施形態において、ラノステロールを含む組成物は、クリスタリンタンパク質のアミロイド様原線維を溶解するために用いられる。【選択図】図１Ａ

Description

＜関連出願への相互参照＞
本出願は、２０１４年８月２２日に出願された米国仮出願第６２／０４０，７２１号と２０１５年７月１７日に出願された米国仮出願第６２／１９４，１２０の優先権の利益を主張するものであり、該文献は参照により全体として本明細書に組み込まれる。

本開示は一般に、視覚障害を有するまたは発症させる危険のある被験体の眼の水晶体の正常な機能に影響を与える視覚障害を処置するためのステロールおよびその使用に関する。

本発明は、視覚障害を処置するまたは予防する方法を提供し、該方法は、それを必要としている個体に、有効な量のラノステロール；およびそのプロドラッグまたは薬学的に許容可能な塩を投与する工程を含む。

本発明はさらに、薬学的に許容可能な点眼用担体と、式Ｉの構造を有するラノステロール：および、そのプロドラッグまたは薬学的に許容可能な塩を含む点眼用医薬組成物を提供する。

方法の様々な態様において、視覚障害は、眼の水晶体の機能、清澄性、および／または構造に影響を与える眼の障害である。こうした眼疾患としては、限定されないが、眼の白内障、眼の老視、および眼水晶体の核硬化症が挙げられる。加えて、視覚障害とは、レフサム病、スミス−レムリ−オピッツ症候群（ＳＬＯＳ）やシュナイダー結晶状角膜ジストロフィー（ＳＣＣＤ）、無β−リポタンパク血症、および家族性の低β−リポタンパク血症などの網膜変性症を指す。

１つの実施形態では、本発明は、治療上または予防的に有効な量の式１のステロールを被験体に投与することにより、視覚障害に関連する少なくとも１つの症状を改善する方法を提供する。方法の様々な態様において、組成物は、局所的に、結膜下に、眼球後方に、眼周囲に、網膜下に、脈絡膜上に、または眼内に投与される。本発明のステロールを受け取る被験体は、限定されないが、哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類、および他の脊椎動物を含む。１つの実施形態では、被験体はウマ、ブタ、イヌ、ネコ、げっ歯類、および／または、他のペットである。別の実施形態では、被験体はヒトである。

１つの実施形態において、本発明は、点眼用の薬学的に許容可能な担体中に本発明のステロールを含む点眼用医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、点眼用の薬学的に許容可能な担体中ラノステロールまたはその誘導体を含む。本発明の実施形態では、薬学的に許容可能な担体は、水、緩衝剤、または塩化ナトリウム溶液である。いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な担体は無菌である。他の実施形態において、薬学的に許容可能な担体は軟膏である。さらに別の実施形態では、薬学的に許容可能な担体はゲルである。ゲルは、限定されないが、高粘度カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリエチレンオキシド、およびカルボマーを含む当該技術分野で周知のゲル配合材料を使用して、処方可能である。組成物のいくつかの態様では、薬学的に許容可能な点眼用担体はシクロデキストリンである。１つの実施形態では、シクロデキストリンは（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリンである。

本発明の実施形態はさらに、視覚障害に関連する症状を予防するおよび／または処置するのに役立つ成分を含むキットを企図している。こうしたキットは、視覚障害に関連する少なくとも１つの症状が改善されるかまたは予防されるように、薬学的に許容可能な担体中の本発明のステロールと本発明のステロールを投与するための説明書を含む容器を含んでいる。こうした視覚障害としては、限定されないが、眼水晶体の白内障、老視および核硬化症が挙げられる。加えて、視覚障害とは、レフサム病、スミス−レムリ−オピッツ症候群（ＳＬＯＳ）やシュナイダー結晶状角膜ジストロフィー（ＳＣＣＤ）、無β−リポタンパク血症、および家族性の低β−リポタンパク血症などの網膜変性症を指す。本明細書で企図されるキットのいくつかに含まれる容器は、目薬の投与用スポイトである。他の実施形態では、容器は、軟膏またはゲルを分注するためのチューブである。さらに別の実施形態では、容器は、限定されないがシリンジを含む薬物送達用の任意の適切な容器、または点眼による薬物の送達あるいは局所的な投与に適切な他の容器である。

他の態様では、本発明は、タンパク質凝集を阻害または予防する方法を提供する。方法の様々な態様において、タンパク質は、機能欠失型の疾患の基礎となるアミロイド形成タンパク質またはタンパク質である。いくつかの態様では、アミロイド形成タンパク質は、Ｈｓｐ２７、αＡ−クリスタリン、αＢ−クリスタリン、βＢ２−クリスタリン、βＢ１−クリスタリン、γＤ−クリスタリン、Ｈｓｐ２２、Ｈｓｐ２０、タウ、アルファ−シヌクレイン、ＩＡＰＰ、ベータ−アミロイド、ＰｒＰ、ハンチンチン、カルシトニン、心房性ナトリウム利尿因子、アポリポタンパク質ＡＩ、血清アミロイドＡ、Ｍｅｄｉｎ、プロラクチン、トランスサイレチン、リゾチーム、ベータ２ミクログロブリン、ゲルゾリン、ケラトエピセリン（Ｋｅｒａｔｏｅｐｉｔｈｅｌｉｎ）、シスタチン、免疫グロブリン軽鎖ＡＬ、および、Ｓ−ＩＢＭからなる群から選択される。他の態様では、機能欠失型の疾患の基礎となるタンパク質は、突然変異体β−グルコシダーゼ、嚢胞性線維症膜貫通受容体、ヘキソサミニダーゼＡ、ヘキソサミニダーゼＢ、β−ガラクトシダーゼ、およびアルファ−グルコシダーゼからなる群から選択される。

本開示の他の特徴と利点は以下の詳細な記載から明らかになる。しかしながら、詳細な記載と特定の例は、本開示の特定の実施形態を示しているが、単なる例証として与えられているにすぎず、本開示の精神と範囲内の様々な変化と修飾はこの詳細な記載から当業者に明らかになることを理解されよう。すべての書類は、一体化された開示として関連づけられることを目的としており、本明細書に記載される特徴のすべての組み合わせは、本書類の同じ文章、段落、または節で一緒に見られなくても企図されていることを理解されたい。前述に加えて、本発明は、追加の態様として、とりわけ上で言及された変化よりも、任意の方法でより狭い範囲で本発明のすべての実施形態を含んでいる。例えば、本発明の態様がある特徴を「含む」と記載されている場合、その特徴「からなる」または「から実質的になる」実施形態も同様に企図される。

１つの実施形態では、本発明は被験体の視覚障害を処置および／または予防するための薬物の調製のための組成物の使用を開示しており、上記組成物は薬学的に許容可能な点眼用担体と薬学的に有効な量のラノステロールを含む。被験体は眼の中の水晶体の標準構造に影響を与える視覚障害を有しているか、それを発症させる危険がある。上記の被験体は、両生類、爬虫類、鳥類、および哺乳類からなる群から選択されてもよく、ここで、上記哺乳類は、げっ歯動物、ネコ、イヌ、ブタ、ウマ、およびヒトからなる群から選択されてもよい。別の実施形態では、上記視覚障害は、白内障、先天性白内障、皮質の混濁、後嚢下白内障、老視、核硬化症、網膜変性障害、レフサム病、スミス−レムリ−オピッツ症候群、シュナイダー結晶状角膜ジストロフィー、ドルーゼン、加齢黄斑変性、および糖尿病性網膜症からなる群から選択され、ラノステロールはクリスタリンタンパク質凝集を阻害する。

さらに別の実施形態では、本発明は、被験体の白内障または盲目／視力低下を処置するための薬物の調製のための組成物の使用を開示しており、上記組成物は、薬学的に許容可能な点眼用担体と薬学的に有効な量のラノステロールを含み、上記ラノステロールは上記被験体の眼の中の水晶体クリスタリンタンパク質凝集体を溶かし、ここで、水晶体クリスタリンタンパク質は、α−クリスタリン、β−クリスタリン、またはγ−クリスタリンのいずれかである。上述した組成物は、点眼液、眼科用軟膏剤、点眼洗浄剤、眼内輸液、前眼房用の洗浄剤、内服薬、注射液、または抽出された角膜用の保存剤として処方されることがある。

さらに別の実施形態において、本発明は、クリスタリンタンパク質のアミロイド様原線維を溶解するための方法を開示し、該方法は、クリスタリンタンパク質のアミロイド様原線維を溶かすために十分な量と時間で、ラノステロールにアミロイド様原線維を接触させる工程を含み、ここで、上記方法はインサイツ、インビトロ、またはインビボで行われてもよい。上記方法は、両生類、爬虫類、鳥類、および哺乳類からなる群から選択された被験体に対して行われもよく、ここで、上記哺乳類は、げっ歯動物、ネコ、イヌ、ブタ、ウマ、およびヒトからなる群から選択されてもよい。

別の実施形態において、本発明は、被験体の眼の標準構造に影響を与える視覚障害を処置するおよび／または予防するためのキットを開示しており、該キットは、薬学的に有効な量のラノステロールの製剤、薬学的に許容可能な担体、上記視覚障害を処置および／または予防するように上記製剤を投与するための説明書を含む。さらに別の実施形態では、本発明は、被験体の視覚障害を処置するおよび／または予防するための点眼用医薬組成物を開示しており、上記組成物は、薬学的に許容可能な点眼用担体と薬学的に有効な量のラノステロールを含み、ここで、上記組成物は、点眼液、眼科用軟膏剤、点眼洗浄剤、眼内輸液、前眼房用の洗浄剤、内服薬、注射液、または抽出された角膜用の保存剤として処方されてもよい。

別の実施形態では、本発明は、眼の中で水晶体クリスタリンタンパク質凝集体の形成に関連する白内障または盲目／視力低下を発症させる危険のある被験体を特定するおよび／または処置する方法を開示しており、該方法は：ａ）被験体のラノステロールシンターゼ活性の量について分析する工程；ｂ）ラノステロールシンターゼ活性の量が白内障または盲目／視力低下のない対照母集団のその活性量未満であるかどうかを判定する工程であって、対照母集団のその活性量未満のであるラノステロールシンターゼ活性の量は、水晶体クリスタリンタンパク質凝集体の形成に関連する白内障または盲目／視力低下を発症させる危険性が高いことを示す、工程、および、ｃ）被験体の眼の中の水晶体クリスタリンタンパク質凝集体の形成を防ぐまたは覆すために有効な量と時間でラノステロールで被験体を処置する工程であって、それによって、被験体の眼の中の水晶体クリスタリンタンパク質凝集体の形成に関連する白内障または盲目／視力低下を発症させる危険のある被験体を特定し処置する、工程を含む。

別の実施形態では、本発明は、被験体の眼の中で水晶体クリスタリンタンパク質凝集体の形成に関連する白内障または盲目／視力低下を発症させる危険のある被験体を特定するおよび／または処置する方法を開示しており、該方法は：ａ）ラノステロールシンターゼ遺伝子の両方の対立遺伝子がラノステロールシンターゼの発現または活性を低下させる突然変異に影響されるかどうかを判定する工程であって、ラノステロールシンターゼの両方の対立遺伝子中での突然変異の存在は、被験体の眼の中の水晶体クリスタリンタンパク質凝集体の形成に関連する白内障または盲目／視力低下を発症させる危険を増加させる、工程、および、ｂ）被験体の眼の中の水晶体クリスタリンタンパク質凝集体の形成を防ぐまたは覆すために 有効な量と時間でラノステロールで被験体を処置する工程であって、それによって、被験体の眼の中の水晶体クリスタリンタンパク質凝集体の形成に関連する白内障または盲目／視力低下を発症させる危険のある被験体を特定し処置する、工程を含む。１つの実施形態では、ラノステロールシンターゼ遺伝子中の突然変異は、コドン５８１でトリプトファン（Ｗ）をアルギニン（Ｒ）に、コドン５８８でグリシン（Ｇ）をセリン（Ｓ）に変化させている。

先天性白内障を引き起こすＬＳＳの突然変異の同定を示す。影響を受けた家族の系図および白内障表現型である。四角と円はそれぞれ男性と女性を示す。１、野生型対立遺伝子；Ｗ５８１ＲとＧ５８８Ｓは２つの突然変異である。 先天性白内障を引き起こすＬＳＳの突然変異の同定を示す。上のパネルは、影響を受けていない個体と、同型接合体のＷ５８１Ｒ突然変異を有する影響を受けた小児（ＩＩ−１）のＤＮＡ塩基配列決定データであり、下のパネルは、影響を受けていない個体と、同型接合体のＧ５８８Ｓ突然変異を有する影響を受けた小児（ＩＶ−１）のＤＮＡ塩基配列決定データである。下線を引いた配列は核酸変化を示す。 先天性白内障を引き起こすＬＳＳの突然変異の同定を示す。左は全白内障を抱えた最初の系図（ＩＶ−１）の患者１の右眼のカラー写真であり、右は白内障を抱える同じ系図（ＩＶ−３）の患者２の右眼のカラー写真である。 ＬＳＳ突然変異がシクラーゼ酵素機能を消失させたことを示す。Ａ、各種のＬＳＳ内のＷ５８１ＲおよびＧ５８８の保持であり、各種とはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓおよびＤａｎｉｏ ｒｅｒｉｏである。Ｂ、ＬＳＳ構造のコンピュータモデルとＷ５８１ＲおよびＧ５８８Ｓの突然変異の影響を示す。コンピュータモデル分析で、Ｃ５８４から開始しＥ５７８で終了するループを同定した。そのループの先端に位置するＷ５８１の主要な側鎖は、ステロールを安定化させる。ループはジスルフィド結合およびＥ５７８−Ｒ６３９の塩橋によって固定されている。Ｇ５８８のアミド窒素Ｎは、前ヘリカルターン由来のＣ５８４と相互作用し、また、Ｇ５８８のＣａ水素は重要なＥ５７８と隣接し、同サポーティングへリックス上のＲ６３９と強い塩橋を作る。突然変異体のＧ５８８Ｓは、そのセリン側鎖がループ上のＥ５７８残基との衝突を引き起こすため、構造に合わない。矢印は、突然変異体側鎖の位置を示す。Ｃ、ステロール内容物においての、野生型タンパク質（ＷＴ ＬＳＳ）の工学的発現およびＬＳＳ突然変異体の影響を示す。野生型ＬＳＳは、著しくラノステロール生産を増大させた。ところが、Ｗ５８１ＲやＧ５８８Ｓの突然変異体のいずれもシクラーゼ活性を示さなかった。各郡ｎ＝３であり、^＊＊＊Ｐ＜０．００１である。 ラノステロールが様々なクリスタリン突然変異タンパク質の細胞内凝集を減少させたことを示す。ヒト水晶体前駆細胞中のクリスタリンタンパク質凝集体の共焦点像である。白内障を引き起こすαＡ−クリスタリンのＹ１１８Ｄ突然変異体は、ｐ６２−陽性の細胞内封入体またはアグリソームを形成した。緑は、ｅＧＦＰ−クリスタリンタンパク質であり、赤は、ｐ６２であり、青は、核である。対照として、ｐｅＧＦＰ−Ｎ１を遺伝子導入した細胞が用いられた。 ラノステロールが様々なクリスタリン突然変異タンパク質の細胞内凝集を減少させたことを示す。クリスタリン凝集体におけるＬＳＳの妨害効果の共焦点像である。 ラノステロールが様々なクリスタリン突然変異タンパク質の細胞内凝集を減少させたことを示す。突然変異体ＬＳＳまたはコレステロールではない、野生型ＬＳＳ（ＷＴ ＬＳＳ）およびラノステロールによるクリスタリン突然変異体凝集の阻害を示す。 ラノステロールが様々なクリスタリン突然変異タンパク質の細胞内凝集を減少させたことを示す。ＬＳＳ突然変異体ではない野生型ＬＳＳの共発現による、可溶のαＡ−クリスタリン（Ｙ１１８Ｄ）突然変異タンパク質の増加を示す。（対照として、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｎ−Ｆｌａｇと共発現したＹ１１８Ｄが用いられた。）定量分析は、細胞溶解物の上澄みまたは不溶性画分のウエスタンブロット解析により、クリスタリンタンパク質の濃度測定をすることで、実行された。各郡ｎ＝３であり、代表的なウエスタンブロット解析は図９のＣに示され、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１である。 ラノステロールが様々なクリスタリン突然変異タンパク質の細胞内凝集を減少させたことを示す。ラノステロールにより再形成されたクリスタリン凝集体の再溶解の共焦点像である。 ラノステロールが様々なクリスタリン突然変異タンパク質の細胞内凝集を減少させたことを示す。濃度に依存した手法において、ラノステロールは白内障を引き起こす様々な突然変異体クリスタリンタンパク質による細胞内凝集を著しく減少させた（ｎ＝３、Ｐ＜１×１０^−４）。コレステロールは細胞内凝集を減少させなかった（ｎ＝３、Ｐ＞０．１）。 ラノステロールが様々なクリスタリン突然変異タンパク質の細胞内凝集を減少させたことを示す。ラノステロールは、ヒト水晶体前駆細胞中の様々なクリスタリン突然変異体の可溶性画分を増大させた。ｎ＝３であり、Ｐ＜０．００１である。 ラノステロールが様々なクリスタリン突然変異タンパク質の細胞内凝集を減少させたことを示す。一連の生細胞イメージングによる、ヒト水晶体前駆細胞中のαＡ−クリスタリンＹ１１８Ｄ凝集物に対する、ＤＭＳＯまたはコレステロール、ラノステロールの影響を示す。 ラノステロールが様々なクリスタリン突然変異タンパク質の細胞内凝集を減少させたことを示す。細胞内クリスタリン凝集体の溶解に対する、ラノステロールの経時的な効果を示す（３つの生物学的複製から選択されたｎ＝２２）。平均標準偏差値（±）は黒いシンボルで表される。本データは崩壊過程の単一指数に最良適合する（赤線）。 ラノステロールが、再形成された、クリスタリンタンパク質のアミロイド様原線維を再溶解したことを示す。Ａ、リポソームビヒクル、コレステロールまたはラノステロールにより、リポソーム中で処置されたαＡ−クリスタリン突然変異タンパク質凝集体の、ネガティブ染色されたＴＥＭ写真である。ラノステロール群の右欄の画像は、左の５倍率画像である。Ｂ、ＴｈＴ蛍光により観察された、クリスタリン凝集体の再溶解におけるラノステロールの影響を示す（ｎ＝３）。Ｂ（ｉ）は、ｂ／ガンマクリスタリン突然変異体であり、Ｂ（ｉｉ）は、ａ−クリスタリン突然変異体である。各バーは３つの独立したサンプルに起因する。 ラノステロールが白内障の重症度を減少させ、清澄性を増大させることを示す。水晶体の清澄性を増大させたことを示すラノステロールで処置された、白内障を抱えるウサギの水晶体の写真を示す。（ｉ）、左は処置前であり、（ｉｉ）、右は処置後である。 ラノステロールが白内障の重症度を減少させ、清澄性を増大させることを示す。ラノステロール処置の効果を定量化した箱ひげ図である（ｎ＝１３）。 ラノステロールが白内障の重症度を減少させ、清澄性を増大させることを示す。水晶体の清澄性を増大させたことを示すラノステロールで処置された、白内障を抱えるイヌの水晶体の写真である。（ｉ）、左は処置前であり、（ｉｉ）、右は処置後である。 ラノステロールが白内障の重症度を減少させ、清澄性を増大させることを示す。ラノステロールの処置効果を定量化した箱ひげ図である（ｎ＝７）。幅および中央値（横線）、平均（丸）が描かれている。クロスは、測定された最大および最小の白内障のグレードである。ひげは標準偏差を示し、また箱は４０％の信頼区間を包含している。 Ａ、同型接合性マッパーが、ゲノム規模の同型接合性を棒グラフとして描写することを示す。関心領域を強調するために、この研究で達した最高スコアの８０％を超える任意のスコアを赤色とする。Ｂ、同型接合性のスコアは、ＬＳＳ遺伝子を含む染色体２１上の物理的な位置に対して描写されていることを示す。赤いバーは、最も高いスコアの領域を示す。染色体の右側は長い連続的な同型接合体の領域を含んでおり、その領域にＬＳＳ遺伝子は存在する。 Ｆｌａｇ−ＬＳＳとｅＧＦＰを共遺伝子導入した細胞の、代表的な共焦点像を示す。野生型もしくは突然変異ＬＳＳ遺伝子およびｅＧＦＰ遺伝子をヒト水晶体前駆細胞に４時間かけて共遺伝子導入し、新鮮な培地で１６時間培養した。その後、ＬＳＳの細胞分布は、抗Ｆｌａｇ抗体（紫）を使用して視覚化された。対照として、ｅＧＦＰの分布（緑）が用いられた。核は、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（青）で染色され視覚化された。 ＬＳＳおよび白内障を引き起こす様々なクリスタリン突然変異体が共遺伝子導入された細胞の、代表的な共焦点像を示す。αＡ−クリスタリンのＲ１１６Ｃ突然変異体である。野生型もしくは突然変異Ｆｌａｇ−ＬＳＳ遺伝子および突然変異ＧＦＰ−クリスタリン遺伝子をヒト水晶体前駆細胞に４時間かけて共遺伝子導入し、新鮮な培地で１６時間培養した。クリスタリン突然変異体はすべて、突然変異体クリスタリンおよびｐ６２の共局在により示されるようなｐ６２−陽性凝集体を形成した。対照として、ＧＦＰ−クリスタリンおよびｐｃＤＮＡ３．１−Ｎ−Ｆｌａｇが共遺伝子導入された細胞が用いられた。ＧＦＰ蛍光（緑）により、様々なクリスタリンタンパク質の細胞内凝集体の形成を視覚化した。野生型または突然変異ＬＳＳは抗Ｆｌａｇ抗体（赤）により検出され、ｐ６２は抗−ｐ６２抗体を用いて染色された。一方、核はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色剤（青）により染色され視覚化された。凝集体細胞の定量分析は図３Ｃで説明される。 ＬＳＳおよび白内障を引き起こす様々なクリスタリン突然変異体が共遺伝子導入された細胞の、代表的な共焦点像を示す。αＢ−クリスタリンのＲ１２０Ｇ突然変異体である。野生型もしくは突然変異Ｆｌａｇ−ＬＳＳ遺伝子および突然変異ＧＦＰ−クリスタリン遺伝子をヒト水晶体前駆細胞に４時間かけて共遺伝子導入し、新鮮な培地で１６時間培養した。クリスタリン突然変異体はすべて、突然変異体クリスタリンおよびｐ６２の共局在により示されるようなｐ６２−陽性凝集体を形成した。対照として、ＧＦＰ−クリスタリンおよびｐｃＤＮＡ３．１−Ｎ−Ｆｌａｇが共遺伝子導入された細胞が用いられた。ＧＦＰ蛍光（緑）により、様々なクリスタリンタンパク質の細胞内凝集体の形成を視覚化した。野生型または突然変異ＬＳＳは抗Ｆｌａｇ抗体（赤）により検出され、ｐ６２は抗−ｐ６２抗体を用いて染色された。一方、核はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色剤（青）により染色され視覚化された。凝集体細胞の定量分析は図３Ｃで説明される。 ＬＳＳおよび白内障を引き起こす様々なクリスタリン突然変異体が共遺伝子導入された細胞の、代表的な共焦点像を示す。βＢ２−クリスタリンのＶ１８７Ｅ突然変異体である。野生型もしくは突然変異Ｆｌａｇ−ＬＳＳ遺伝子および突然変異ＧＦＰ−クリスタリン遺伝子をヒト水晶体前駆細胞に４時間かけて共遺伝子導入し、新鮮な培地で１６時間培養した。クリスタリン突然変異体はすべて、突然変異体クリスタリンおよびｐ６２の共局在により示されるようなｐ６２−陽性凝集体を形成した。対照として、ＧＦＰ−クリスタリンおよびｐｃＤＮＡ３．１−Ｎ−Ｆｌａｇが共遺伝子導入された細胞が用いられた。ＧＦＰ蛍光（緑）により、様々なクリスタリンタンパク質の細胞内凝集体の形成を視覚化した。野生型または突然変異ＬＳＳは抗Ｆｌａｇ抗体（赤）により検出され、ｐ６２は抗−ｐ６２抗体を用いて染色された。一方、核はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色剤（青）により染色され視覚化された。凝集体細胞の定量分析は図３Ｃで説明される。 ＬＳＳおよび白内障を引き起こす様々なクリスタリン突然変異体が共遺伝子導入された細胞の、代表的な共焦点像を示す。γＣ−クリスタリンのＧ１２９Ｃ突然変異体である。野生型もしくは突然変異Ｆｌａｇ−ＬＳＳ遺伝子および突然変異ＧＦＰ−クリスタリン遺伝子をヒト水晶体前駆細胞に４時間かけて共遺伝子導入し、新鮮な培地で１６時間培養した。クリスタリン突然変異体はすべて、突然変異体クリスタリンおよびｐ６２の共局在により示されるようなｐ６２−陽性凝集体を形成した。対照として、ＧＦＰ−クリスタリンおよびｐｃＤＮＡ３．１−Ｎ−Ｆｌａｇが共遺伝子導入された細胞が用いられた。ＧＦＰ蛍光（緑）により、様々なクリスタリンタンパク質の細胞内凝集体の形成を視覚化した。野生型または突然変異ＬＳＳは抗Ｆｌａｇ抗体（赤）により検出され、ｐ６２は抗−ｐ６２抗体を用いて染色された。一方、核はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色剤（青）により染色され視覚化された。凝集体細胞の定量分析は図３Ｃで説明される。 ＬＳＳおよび白内障を引き起こす様々なクリスタリン突然変異体が共遺伝子導入された細胞の、代表的な共焦点像を示す。γＤ−クリスタリンのＷ４３Ｒ突然変異体である。野生型もしくは突然変異Ｆｌａｇ−ＬＳＳ遺伝子および突然変異ＧＦＰ−クリスタリン遺伝子をヒト水晶体前駆細胞に４時間かけて共遺伝子導入し、新鮮な培地で１６時間培養した。クリスタリン突然変異体はすべて、突然変異体クリスタリンおよびｐ６２の共局在により示されるようなｐ６２−陽性凝集体を形成した。対照として、ＧＦＰ−クリスタリンおよびｐｃＤＮＡ３．１−Ｎ−Ｆｌａｇが共遺伝子導入された細胞が用いられた。ＧＦＰ蛍光（緑）により、様々なクリスタリンタンパク質の細胞内凝集体の形成を視覚化した。野生型または突然変異ＬＳＳは抗Ｆｌａｇ抗体（赤）により検出され、ｐ６２は抗−ｐ６２抗体を用いて染色された。一方、核はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色剤（青）により染色され視覚化された。凝集体細胞の定量分析は図３Ｃで説明される。 ＨＬＥＢ−３細胞（Ａ）またはＨｅＬａ細胞（Ｂ）内の、野生型ＬＳＳおよびラノステロールによるクリスタリン突然変異体凝集の阻害を示す。ＬＳＳとクリスタリン突然変異体構成物が共遺伝子導入された細胞は、凝集体を分析する前に２４時間培養された。レスキュー実験（ｒｅｓｃｕｒｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）は、細胞培養培地に４０μＭのステロール（ラノステロールまたはコレステロール）を２時間かけて添加し、その後、ステロール培地を新鮮な培地と取り換え、そして細胞をさらに１２時間培養することで実施された。クリスタリン凝集体が含まれる細胞の割合は、不規則に選択された１０の観察領域から計算された。野生型ＬＳＳ群、突然変異体群または突然変異体とラノステロール群の値が計算された。野生型ＬＳＳ群およびラノステロール群の凝集体は、対照群（Ｐ＞０．１×１０^−４）と比較すると著しく低かった、一方、突然変異体ＬＳＳ群またはコレステロール群の凝集体は、対照群（Ｐ＜０．１）との差異を示さなかった。Ｃ、ヒト水晶体前駆細胞に、野生型ＬＳＳまたは突然変異体ＬＳＳとαＡ−クリスタリン（Ｙ１１８Ｄ）を共遺伝子導入した。対照として、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｎ−Ｆｌａｇと共発現したαＡ−クリスタリン（Ｙ１１８Ｄ）が用いられた。４時間かけての遺伝子導入、および新鮮な培養培地上でさらに２４時間培養後、上澄みと不溶性画分を分離するために、細胞を溶解し遠心分離機にかけた。ＬＳＳおよびクリスタリン融合タンパク質は、ＦｌａｇおよびＧＦＰに対する抗体により、それぞれ検知された。赤い矢印は、ＷＴ−ＬＳＳを含んでいる細胞内の不溶性画分と可溶性画分のより高いクリスタリン含有量を示す。３つの独立した実験からデータが定量され、図３Ｄで説明されている。 ＨＬＥＢ−３またはＨｅＬａ細胞を分析した際、ラノステロールが、白内障を引き起こす様々な突然変異体クリスタリンタンパク質によって引き起こされた細胞内凝集を濃度に依存した手法で著しく減少させたことを示す。白内障を引き起こす様々なクリスタリン突然変異体が遺伝子導入された、ＨＬＥＢ−３細胞の代表的な共焦点像である。細胞に様々なクリスタリン構成物を４時間かけて遺伝子導入し、新鮮な培地上で更に２４時間培養した。その後、細胞を１％（ＨＬＥＢ−３細胞）または２％のＤＭＳＯ（ＨｅＬａ細胞）内で、１０、２０のおよび４０μＭのラノステロールにより２時間かけて処置し、さらに１２時間培養した。１％（ＨＬＥＢ−３細胞）または２％のＤＭＳＯ（ＨｅＬａ細胞）で処置された細胞が、対照として使用された。ＧＦＰ蛍光（緑）により、様々なクリスタリンタンパク質の細胞内凝集体の形成を視覚化し、それらの核はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（青）で染色した。典型的な細胞内凝集体は、矢印によって示される。 ＨＬＥＢ−３またはＨｅＬａ細胞を分析した際、ラノステロールが、白内障を引き起こす様々な突然変異体クリスタリンタンパク質によって引き起こされた細胞内凝集を濃度に依存した手法で著しく減少させたことを示す。白内障を引き起こす様々なクリスタリン突然変異体が遺伝子導入された、ＨｅＬａ細胞の代表的な共焦点像である。細胞に様々なクリスタリン構成物を４時間かけて遺伝子導入し、新鮮な培地上で更に２４時間培養した。その後、細胞を１％（ＨＬＥＢ−３細胞）または２％のＤＭＳＯ（ＨｅＬａ細胞）内で、１０、２０のおよび４０μＭのラノステロールにより２時間かけて処置し、さらに１２時間培養した。１％（ＨＬＥＢ−３細胞）または２％のＤＭＳＯ（ＨｅＬａ細胞）で処置された細胞が、対照として使用された。ＧＦＰ蛍光（緑）により、様々なクリスタリンタンパク質の細胞内凝集体の形成を視覚化し、それらの核はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（青）で染色した。典型的な細胞内凝集体は、矢印によって示される。 ＨＬＥＢ−３またはＨｅＬａ細胞を分析した際、ラノステロールが、白内障を引き起こす様々な突然変異体クリスタリンタンパク質によって引き起こされた細胞内凝集を濃度に依存した手法で著しく減少させたことを示す。ＨＬＥＢ−３細胞を分析した際の、ラノステロールの凝集体溶解効果の濃度依存を示す。 ＨＬＥＢ−３またはＨｅＬａ細胞を分析した際、ラノステロールが、白内障を引き起こす様々な突然変異体クリスタリンタンパク質によって引き起こされた細胞内凝集を濃度に依存した手法で著しく減少させたことを示す。ＨｅＬａ細胞を分析した際の、ラノステロールの凝集体溶解効果の濃度依存を示す。 対照群または突然変異体ＬＳＳ群と比較した際に、ラノステロールによる処置（コレステロールではない）が、可溶性画分中の、白内障を引き起こす突然変異体クリスタリンを増大させたことを示す。ヒト水晶体前駆細胞に、突然変異体クリスタリン遺伝子を４時間かけて遺伝子導入し、その後、新鮮な培地でさらに２４時間培養したものを示す。その細胞を採取し、溶解させた。上澄みと不溶性画分を遠心分離機で分離し、ウエスタンブロット解析により分析した。ＬＳＳおよびクリスタリン融合タンパク質は、ＦｌａｇとＧＦＰタグに対する抗体によりそれぞれ同定された。ラノステロール処置群を赤枠で強調した。対照として、１％ＤＭＳＯで処置された細胞が用いられた。全細胞溶解物（ＴＣＬ）の内在性タンパク質ローディング・コントロールとして、β−アクチンが用いられた。Ｓは、上澄みであり、Ｐは、不溶性画分である。 対照群または突然変異体ＬＳＳ群と比較した際に、ラノステロールによる処置（コレステロールではない）が、可溶性画分中の、白内障を引き起こす突然変異体クリスタリンを増大させたことを示す。生細胞イメージングの単粒子追跡により評価された、ヒト水晶体前駆細胞のαＡ−クリスタリン（Ｙ１１８Ｄ）凝集体のサイズ変化に対する、ＤＭＳＯ（ｎ＝４）およびコレステロール（ｎ＝７）の効果を示す。 対照群または突然変異体ＬＳＳ群と比較した際に、ラノステロールによる処置（コレステロールではない）が、可溶性画分中の、白内障を引き起こす突然変異体クリスタリンを増大させたことを示す。クリスタリン凝集体の溶解に対する、ラノステロールの効果の、濁度を用いた評価を示す。クリスタリン凝集体は、５ｍｇ ｍｌ^−１のタンパク質溶液を１Ｍのグアニジン塩化物の存在下で、６０℃で２時間（α−クリスタリン）または３７℃で４８時間（βおよびγ−クリスタリン）培養することにより、形成された。最終的なタンパク濃度０．２ｍｇ ｍｌ^−１で、凝集体をＰＢＳ中で再懸濁し、ＤＰＰＣリポソーム５００μＭ中でステロール５００μＭを用いて処置し、３７℃で２４時間培養した。ＤＰＰＣリポソーム５００μＭで処置された凝集体は、対照としてのみ用いられた。 対照群または突然変異体ＬＳＳ群と比較した際に、ラノステロールによる処置（コレステロールではない）が、可溶性画分中の、白内障を引き起こす突然変異体クリスタリンを増大させたことを示す。ＴｈＴ蛍光により評価されたαＡ−クリスタリン突然変異体により明らかとなった、アミロイド様原線維の再溶解におけるラノステロール濃度依存の影響を示す。ＤＰＰＣリポソーム５００μＭで処置された凝集体は、対照としてのみ用いられた。 白内障水晶体の評価方法を示す。Ａ、水晶体はグリッド上に置かれ、撮影された。透明度は、０を澄んだ水晶体で混濁がない状態（グリッド線が明確に視認できる、ａ’）、１をかすんだ水晶体で、少々混濁している状態（グリッド線は少し曇っているが、まだ視認できる、ｂ’）、２を曇った水晶体で、水晶体のほとんど全体に混濁の拡散が見られる状態（グリッド線は中程度曇っているが、中心のグリッド線は視認できる、ｃ’）、また３を不透明な水晶体で、水晶体全体の広範囲にわたる濃い混濁が見られる状態（グリッド線は完全に曇りがかり、グリッド線が全く視認できない、ｄ’）として、評価された。１２Ｂ、ラノステロールは、単離した白内障を抱えたウサギの水晶体の白内障重症度を減少させ、清澄性を増大させた。ウサギの水晶体（ｎ＝１３）を解剖し、ラノステロールを用いて６日間培養した。そして、続けて水晶体の清澄性および透明性を評価した。処置前後の、白内障を抱えたウサギの各水晶体の写真のペアをその下のスコアと共に示す。Ｃ、ラノステロールは、単離した白内障を抱えたイヌの水晶体の白内障重症度を減少させ、清澄性を増大させた。白内障を抱えたイヌの眼（ｎ＝７）をラノステロールで６日間処置し、そして、水晶体の清澄性および透明性を評価した。処置前後の各観察対象の写真のペアをその下のスコアと共に示す。ビヒクルのみで処置された、対照となる３つの眼も示した。

本発明を行う発明者によって企図される最良の方法を含む本発明の特定の実施形態についてここから詳細に言及される。こうした特定の実施形態の例は添付の図面で例証されている。本発明はこのような特定の実施形態と共に記載されているが、本発明を記載される実施形態に限定することを意図しないことを理解されたい。これとは逆に、本発明は、添付の請求項によって定義されるような本発明の精神と範囲内に含まれ得るような代替物、修飾、および等価物を包含することを意図している。以下の記載では、本発明を完全に理解するために具体的な詳細が説明されている。本発明はこうした具体的な詳細の一部またはすべてがなくても実行され得る。加えて、周知の特徴は、本発明を不必要に分かりにくくすることのないように詳細に記載していないこともある。

本発明は、視覚障害を有するまたは発症させる危険のある被験体の眼の標準構造に影響を与える視覚障害を処置または予防する方法と組成物に関し、該方法は、薬学的に許容可能な担体と式Ｉを有する薬学的に有効な量のステロールを含む組成物を上記被験体に投与する工程を含む。例えば、本発明の典型的な化合物は、眼科用の薬学的に有効な量のラノステロール（３β−ヒドロキシ−８，２４−ラノスタジエン；８，２４−ラノスタジエン−３β−オール）を患者に投与することを含む。

他の実施形態では、本開示はステロールと、ステロールを使用する方法を記載されている。例えば、式Ｉのステロールは、クリスタリンタンパク質凝集を阻害するために薬学的に許容可能な点眼用担体を含む点眼用医薬組成物で処方される。ある他の実施形態では、本開示は、クリスタリンタンパク質凝集を阻害するために式１のステロールを使用する方法を記載している。さらに他の実施形態では、本発明の化合物は、クリスタリンタンパク質の凝集を食い止め、クリスタリンタンパク質のさらなる凝集を阻害することができる。

視覚障害を処置または予防する方法
本発明は、視覚障害を有するまたは発症させる危険のある個体の眼の中の水晶体の標準構造に影響を与える視覚障害を処置するおよび／または予防する際に本発明を使用する点眼用医薬組成物と方法を提供する。本明細書で記載されるように、眼の中の水晶体の標準構造に影響を与える視覚障害（本明細書では成句「視覚障害」として呼ぶ）とは、水晶体の構造に影響を与えて眼の水晶体の清澄性または硬さの変化といった視覚機能障害をもたらす疾患を指す。こうした疾患は白内障、老視および核硬化症を含んでいる。加えて、視覚障害とは、レフサム病、スミス−レムリ−オピッツ症候群（ＳＬＯＳ）やシュナイダー結晶状角膜ジストロフィー（ＳＣＣＤ）、無β−リポタンパク血症、および家族性の低β−リポタンパク血症などの網膜変性症を指す。ある実施形態では、本発明は、クリスタリンタンパク質凝集をその緩和するまたは覆すための組成物とその使用方法を提供する。代替的な実施形態では、水晶体の清澄性や屈折率に必要不可欠なマクロ構造を形成するタンパク質内またはタンパク質間の相互作用の破壊を阻害、処置、および／または予防するための組成物と方法が提供される。

本発明で言及されるような用語「白内障」とは、水晶体の表面および／または内部の濁りまたは混濁を引き起こすか、あるいは水晶体の腫脹を引き起こす症状を示す疾患または疾病を意味し、これは先天性白内障と後天性白内障の両方を含む（ＰＤＲ Ｓｔａｆｆ， “ＰＤＲ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ ２０１３”， ＰＤＲ Ｎｅｔｗｏｒｋ， ２０１２を参照）。いくつかの実施形態において、白内障は加齢性の白内障、糖尿病性白内障、外科手術に関連する白内障、放射線への暴露に起因する白内障、遺伝性疾患に起因する白内障、感染に起因する白内障、または薬物に起因する白内障である。いくつかの実施形態では、個体は、早期発症型の白内障の遺伝的な形態を有する。その具体的な例は、先天性の偽白内障、先天性膜白内障、先天性の冠状白内障、先天性の層状白内障、先天性の点状白内障、および、先天性の糸状白内障などの先天性白内障；および、老人性白内障、続発性白内障、褐色白内障、併発白内障、糖尿病性白内障、外傷性白内障、ならびに電気ショック、放射線、超音波、薬物、全身性疾患、および栄養障害によって誘発され得る他の白内障などの後天性白内障である。後天性白内障はさらに術後の白内障を含み、これは、白内障を処置するために挿入された水晶体を包む後嚢の濁りを引き起こす症状を有する。

核硬化症は、同様に水晶体の混濁を引き起こす一般的に年を取った動物における疾病を指す。新しい繊維形成による核中のより古い水晶体線維の圧縮によって引き起こされるのは、水晶体核の加齢性の密度変化である。

老視とは眼の水晶体が柔軟性を失う視力状態を指し、接近してくる対象に焦点を合わせることが難しくなる。

いくつかの実施形態では、本発明は、視覚障害を処置するまたは予防する方法を提供し、該方法は、構造式Ｉを有する化合物を含む有効な量の組成物を、それを必要としている個体に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、化合物は構造式Ｉを有するステロールである。

本発明に係る処置を「必要としている」個体は、眼の中の水晶体の正常な機能に影響を与える視覚障害に苦しんでいる個体である。例えば、個体は、加齢性の白内障または白内障を有するか、あるいは発症させる危険がある。白内障を発症させる危険がある個体としては、限定されないが、白内障を発症させる家族歴のある個体、白内障に関連する突然変異を有する個体、放射線にさらされた個体、糖尿病患者などが挙げられる。例えば、１つの態様では、個体は片方の眼の中で白内障と診察され、化合物は反対側の眼における白内障の形成を予防するまたは遅らせるために投与される。同様に、本発明に係る処置を「必要としている」個体は、老視を有するまたは発症させる危険のある個体である。同様に、本発明に係る処置を「必要としている」個体は、核硬化症を有するまたは発症させる危険のある個体である。個体はヒトであることが好ましいが、眼疾患に苦しんでいるか、または眼疾患を発症させる危険のある動物（処置を必要とする動物）も当業者は識別することができる。ネコ、イヌ、ブタ、ウマ、ウシ、およびげっ歯動物などの処置を必要としている哺乳類も識別することができる。さらに、処置を必要としている鳥類、爬虫類、両生類、および魚などの動物を識別することができる。

視覚障害を「処置すること」は、視覚障害の１００％の根絶または回復を必要としない。いくつかの実施形態において、（例えば、革新的な方法の本発明の組成物または化合物に晒されない生物学的に一致した対照被験体または検体において）革新的な方法にしたがって視覚障害を「処置すること」は、革新的な組成物または方法の欠如下で観察されるレベルと比較して、水晶体の機能不全、例えば、水晶体の混濁または硬直化を、例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、緩和する、阻害する、予防する、および／または覆す。いくつかの実施形態では、機能不全（水晶体上または水晶体中の白内障形成、混濁、またはクリスタリン凝集など）は、革新的な方法の化合物がない状態の水晶体の機能不全と比較して、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、またはそれ以上（約１００％）処置される。混濁または濁りまたは白内障などの水晶体の機能不全は一般に、限定されないが視力検査、眼底検査、スリットランプ検査、角膜曲率測定、眼圧測定、コントラスト試験、グレア感受性、波面マッピングを含む、多くの眼の試験のいずれかを用いて検知される。

同様に、「予防」とは、視覚障害の１００％の阻害または抑止を必要としない。例えば、濁りまたは混濁の任意の減少または白内障進行の減速が、被験体における有益な生物学的作用を構成する。同様に、典型的には、眼の水晶体中のクリスタリン凝集の任意の減少も有益な生物学的作用を構成する。この点では、本発明は、（例えば、革新的な方法の化合物に晒されない生物学的に一致した対照被験体または検体において）革新的な方法のない状態で観察されたレベルと比較して、視覚障害を例えば少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％減少させる。いくつかの実施形態では、視覚障害は、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％または少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％またはそれ以上（約１００％）減らされる。

機能不全の阻害、予防、または回復は１００％の阻害、予防、根絶または回復を必要としない。例えば、凝集の任意の阻害は被験体における有益な生物学的作用を構成する。この点では、本発明は、（例えば、革新的な方法の化合物に晒されない生物学的に一致した対照被験体または検体において）革新的な方法のない状態で観察されたレベルと比較して、被験体の眼の水晶体の正常な機能に影響を与える視覚障害を、例えば少なくとも約５％、少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％阻害する。いくつかの実施形態において、視覚障害は、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、阻害され、防がれ、および／または覆される。いくつかの実施形態では、革新的な方法は、革新的な方法の化合物のない状態でのアミロイド形成と比較して、アミロイド形成を少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、またはそれ以上（約１００％）阻害する。

式１の化合物を含む有効な量の点眼用「医薬組成物」は、個体中の水晶体の機能不全を阻害する、予防する、または覆す量である。本発明の点眼用医薬組成物は、視覚障害を処置する有効な量で必要としている被験体に投与されている。本明細書で使用されるように、「治療上有効な量」とは、視覚障害の徴候、症状、または原因の少なくとも１つを緩和する投与量、または生体系の他の望ましい変質も意味する。予防的用途において、用語「予防的に有効な量」とは、または特定の疾患になりやすい、またはさもなければ特定の疾患の危険のある患者に投与される投与量を意味し、これは、治療上有効な量と同じこともあれば異なることもある。特定の個体のための組成物の有効な量は、個体、個体の疾患の重症度、適用されている製剤のタイプ、投与の頻度、および処置の期間次第であり得る。本発明に合わせて、本発明の点眼用医薬製剤、例えば、液滴中の比較的低い濃度 例えば、少なくとも１０^−９Ｍ、少なくとも０．５乃至１ｘ１０^−８Ｍ、少なくとも０．５乃至１ｘ１０^−７Ｍ、少なくとも０．５乃至１ｘ１０^−６Ｍ、少なくとも０．５乃至１ｘ１０^−５Ｍ、少なくとも０．５乃至１ｘ１０^−４Ｍ、または少なくとも０．５乃至１ｘ１０^−３Ｍ、あるいは、または、これらの値（例えば、１０^−９Ｍ〜１０^−３Ｍ）の間の範囲に含まれる任意の濃度のラノステロールなどの投与は、わずか１、２、３回、または複数回の毎日の投与だけでこうした視覚障害を覆すことがあり、実際には非常に迅速に覆す。

投与経路
当業者によって理解されるように、被験体へ化合物を投与する最も適切な方法は多くの因子に依存する。様々な実施形態では、本発明に係る化合物は、眼に局在的に、例えば、局所的に、結膜下に、眼球後方に、眼周囲に、網膜下に、脈絡膜上に、または眼内に投与される。

とりわけ眼への直接投与に有用な医薬組成物は、目薬として処方される水溶液および／または懸濁液、ならびに、点眼用ゲル剤（ゲル形成性溶液を含む）または軟膏剤として処方される増粘液および／または懸濁液を含み、点眼液、眼科用軟膏剤、点眼洗浄剤、眼内輸液、前眼房用の洗浄剤、内服薬、注射液、または抽出された角膜用の保存剤である。点眼薬用の他の剤形は、眼の挿入物、硝子体内注射剤、および移植片を含んでいる。注射剤は、細い針を使用して、角膜、水晶体、および硝子体のまたは隣接する組織に、直接注入が可能である。さらに組成物は、眼内の灌流液として投与可能である。

さらなる企図される投与経路としては、限定されないが、以下の１つ以上が挙げられる：経口（例えば、錠剤、カプセルとして、または摂取可能な溶液として）、粘膜（例えば、点鼻薬または吸入用のエアロゾルとして）、経鼻、非経口（例えば、注射可能な形態によって）、胃腸、脊髄内、腹腔内、筋肉内、静脈内、子宮内、皮内、頭蓋内、気管内、膣内、脳室内、大脳内、皮下、経皮的、直腸、頬側、硬膜外、および、舌下。

いくつかの実施形態では、眼への本発明の組成物の送達の方法は、コンタクトレンズを介する。コンタクトレンズは所望の化合物を用いてあらかじめ処置されることもある。代替的に、コンタクトレンズはコーティングされたレンズを調製するための成分とともにキットで提供され、該成分は再構成のための凍結乾燥された粉末、あるいは濃縮された溶液または使用準備の整った溶液として提供される。組成物は単回用または複数回用のキットとして提供されることもあり得る。

いくつかの実施形態では、眼への本発明の組成物の送達方法は、眼の桿状体を介する（Ｇｗｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ． １９８６ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ； ９３（９ Ｓｕｐｐｌ）：８２−５）。いくつかの実施形態では、眼への本発明の組成物の送達の方法は、眼内レンズ−ヒドロゲルアセンブリを介する（Ｇａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ， ２０１１ Ａｕｇ． ３； ５２（９）：６１０９−１６）。

投与量
化合物を含む組成物は、医学的に許容可能なレベルの毒性で所望の生物学的作用を達成する治療上有効な量で提供される。組成物の量は、投与経路とその病気の重症度に依存して変動することもある。投与量は処置される各患者の体重、年齢、性別、および／または症状の程度に依存して調節されてもよい。正確な投与量と投与経路は最終的には付添いの医師または獣医の裁量である。処置される疾患の重症度と同様に患者の年齢と重量に依存して、投与量に通常の変化を付けることが必要なこともあることが認識されよう。投与の頻度は製剤と前述のパラメータに依存する。例えば、１日当たり２、３、４、または５回を含む、一日あたり少なくとも一度目薬を差すことが望ましいこともある。

当業者は最適な投与量、投与方法、および反復率を容易に決定することができる。最適な量は、特定の医薬組成物の相対的な効能と投与の方法に依存して変わることがある。許容可能な量は一般に、生体外および生体内の動物モデルに効果的であると分かっているＥＣ５０（試験群の５０％の有効濃度）に基づいて評価可能である。一般に、投与量は体重１ｋｇ当たり０．０１μｇから１００ｇであり、毎日、毎週、毎月、または毎年に一度、あるいは２〜２０年毎に一度与えられることもある。当業者は、体液または体組織中の薬物の測定された滞留時間と濃度に基づいて、投薬の反復率を容易に評価することができる。成功した処置の後に、疾患状態の再発を防ぐために患者に維持療法を受けさせることが望ましいこともあり、本明細書に記載される治療用組成物は、毎日１回以上から２０年ごとに１回まで、体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ乃至１００ｇの範囲の維持量で投与される。全身的な経路を介する（およそ７０ｋｇの体重の）ヒトへの投与のための化合物の典型的な投与量は、単位投与量あたり化合物の０．１ｍｇから５ｇ、例えば１ｍｇから２．５ｇである。

式Ｉの化合物の好ましい濃度は、１μｇ／ｍｌ−５００μｇ／ｍｌ、例えば、約１μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌ、約３μｇ／ｍｌ、約４μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ、約３０μｇ／ｍｌ、約４０μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約６０μｇ／ｍｌ、約７０μｇ／ｍｌ、約８０μｇ／ｍｌ、約９０μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約１２０μｇ／ｍｌ、約１４０μｇ／ｍｌ、約１６０μｇ／ｍｌ、約１８０μｇ／ｍｌ、約２００μｇ／ｍｌ、約２５０μｇ／ｍｌ、約３００μｇ／ｍｌ、約３５０μｇ／ｍｌ、約４００μｇ／ｍｌ、約４５０μｇ／ｍｌ、または約５００μｇ／ｍｌに及ぶ。阻害剤は他の薬学的に有効な薬剤と組み合わせて提供されてもよい。

本明細書に記載される医薬組成物は、単回用量または複数回用量として投与可能であり、個々の治療薬として、または他の治療薬と組み合わせて投与可能であり、および、従来の療法と組み合わせ可能であり、連続してまたは同時に投与されることもある。本発明の１つの実施形態では、本点眼用製剤のヒトおよび／または動物の治療における毎日の投与量は、片目につき約１滴、片目につき約２滴、片目につき約３滴、片目につき約４滴、片目につき約５滴、片目につき約６滴、片目につき約７滴、片目につき約８滴、片目につき約９滴、片目につき約１０滴、片目につき約１１滴、片目につき約１２滴、または片目につき約１２滴を超える。本発明の別の実施形態では、ヒトおよび／または動物の治療における本点眼用製剤のための毎日の投与スケジュールは、１日当たり約１回、１日当たり約２回、１日当たり約３回、１日当たり約４回、１日当たり約５回、１日当たり約６回、１日当たり約７回、１日当たり約８回、１日当たり約９回、１日当たり約１０回、１日当たり約１１回、１日当たり約１２回、または１日当たり約１２回を超える。投与量は、例えば、垂直保持した際に２５°Ｃで全重量０．９〜１．１グラムの２０滴の水を送達する３ｍｍの外径の標準的な薬局方の薬用スポイトによって標準化可能である。

上記の投与スケジュールによって投与されると、ヒトおよび／または動物における処置レジメンは、無期限に、またはさらなる改善が観察されなくなるまで、継続可能である。代替的に、処置レジメンは、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、３５日、３６日、３７日、３８日、３９日、４０日、４１日、４２日、４３日、４４日、４５日、４６日、４７日、４８日、４９日、５０日、６０日、７０日、８０日、９０日、１００日、１５０日、２００日、２５０日、３００日、４００日、５００日、７５０日、１０００日、または１０００日以上にわたって続くことがある。

白内障を処置するまたは予防するのに効果的な化合物
様々な実施形態では、革新的な方法または組成物の化合物は、式Ｉの化合物を有するラノステロール：

またはそのプロドラッグあるいは薬学的に許容可能な塩である。

例えば、革新的な方法または組成物の化合物はラノステロール；そのプロドラッグまたは薬学的に許容可能な塩である。１つの実施形態では、化合物はラノステロールである。別の実施形態では、上記の化合物の任意のプロドラッグまたは薬学的に許容可能な塩も本発明の範囲内であるように企図される。

医薬組成物
本発明のいくつかの実施形態では、１つ以上の治療用化合物の医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体中に１つ以上のこうした治療用化合物を処方することにより調製可能である。本明細書で使用されるように、「薬学的にまたは治療的に許容可能な担体」とは、活性成分の生物学的活性の有効性に干渉せず、宿主または患者に毒性ではない担体媒体を指す。医薬品の調製時に使用される担体の種類は、治療用化合物を投与する方法に依存する。様々な投与経路のために医薬組成物を調製する多くの方法が当該技術分野で周知である。

本明細書で使用されるように、「薬学的に許容可能な点眼用担体」とは、眼にまたは眼の付近に直接的または間接的に構造式１の化合物を送達するための薬学的に許容可能な賦形剤、担体、結合剤、および／または希釈剤を指す。これに応じて、本発明は、構造式Ｉの化合物と薬学的に許容可能な点眼用担体を含む組成物をさらに含む。

随意に、組成物は、構造式Ｉの化合物の遊離酸、遊離塩基、塩（例えば、酸付加塩または塩基付加塩）、水和物、またはプロドラッグを含んでいる。成句「薬学的に許容可能な塩」または「薬学的に許容可能な酸」とは、本明細書で使用されるように、式Ｉの化合物の薬学的に許容可能な有機的なまたは無機的な塩または酸をそれぞれ指す。対イオンは、親化合物に対する電荷を安定させる任意の有機的または無機的な部分であり得る。さらに、薬学的に許容可能な塩（または酸）は、その構造中に１つを超える電荷を帯びた原子を有することがある。複数の電荷を帯びた原子が薬学的に許容可能な塩（または酸）の一部である例は、複数の対イオンを有し得る。従って、薬学的に許容可能な塩（酸）は、１つ以上の電荷を帯びた原子および／または１つ以上の対イオンを有し得る。

典型的な塩としては、限定されないが、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチラート、酸クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、琥珀酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、糖酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、およびパモ酸塩（つまり、１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエ酸塩））塩が挙げられる。薬学的に許容可能な塩は、酢酸イオン、琥珀酸塩イオン、または他の対イオンのような別の分子を含有したものも含むことがある。

プロドラッグは、担体部分に共有結合した構造式Ｉの化合物を含む材料である。担体部分がインビトロまたはインビボで構造式Ｉの化合物から放出されることによって、構造式１の化合物を得ることができる。プロドラッグ形態は、Ｓｌｏａｎ， Ｋ． Ｂ．， Ｐｒｏｄｒｕｇｓ， Ｍ． Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９２； ａｎｄ Ｔｅｓｔａ， Ｂ． ａｎｄ Ｍａｙｅｒ， Ｊ． Ｍ．， Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ａｎｄ ｐｒｏｄｒｕｇ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ： ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ａｎｄ ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ， Ｚｕｒｉｃｈ， ２００３で例証されるように当該技術分野で周知である。

本発明のいくつかの実施形態では、医薬組成物は適切な溶媒中に本発明の組成物を溶かすことにより調製される。適切な溶媒としては、限定されないが、水、食塩水（例えば、ＮａＣｌ）、緩衝液、軟膏剤、ゲル、または他の溶媒が挙げられる。ある実施形態では、溶媒は無菌である。

目薬の調製で使用される懸濁液用の水溶液と希釈剤は、蒸留水、生理食塩水などを含み得る。こうした医薬組成物は、従来の方法に従って、随意に賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、希釈剤、緩衝剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、および溶解助剤などの適切な医薬品添加物に、化合物を混合するか、希釈するか、または溶解することにより、ならびに、剤形に依存した従来のやり方で処方することによって、製剤化可能である。懸濁液用の非水性の溶液と希釈剤は、食用の（例えば、野菜）油、（流動パラフィン）、鉱油、プロピレングリコール、ｐ−オクチルドデカノール、ポリソルベート、マクロゴール、モノステアリン酸アルミニウム、および同様の溶媒を含み得る。

様々な添加剤が必要に応じて目薬、点眼用ゲル剤、および／または眼科用軟膏剤に含まれ得る。これらは、過度の毒性、不適合性、不安定性、刺激、アレルギー反応などを伴うことなく、眼または眼の周りに接触して使用するのに適した追加の成分、添加剤、または担体を含み得る。溶媒、塩基、溶液、アジュバント、懸濁化剤、増粘剤、乳化剤、安定化剤、緩衝剤、薬剤を調節する等張性調整剤、ｐＨ調整剤、キレート剤、無痛化剤、保存剤、矯味薬、香料、着色料、賦形剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、吸収促進剤、分散剤、保存剤、可溶化剤などの添加剤が、必要に応じて製剤に加えられ得る。

例えば、目薬は、界面活性剤が溶けている滅菌水に化合物を溶かすことにより、および、随意に、保存剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤、および増粘剤などの適切な医薬品添加物を加えることにより処方可能である。

例えば、緩衝剤は、ｐＨを一定に保つために加えられ、ホウ酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、酒石酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液、酢酸緩衝液、またはトリス−ＨＣｌ緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとＨＣｌを含む）などの薬学的に許容可能な緩衝剤を含むことができる。例えば、７．４のｐＨを有するトリス−ＨＣｌ緩衝液は、３ｇ／ｌのトリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタンと０．７６ｇ／１のＨＣｌを含む。また別の態様では、緩衝剤は１０ｘリン酸塩緩衝液食塩水（「ＰＢＳ」）または５ｘＰＢＳ溶液である。緩衝剤は、予想される生理学的条件に十分な緩衝能を供給する量で含まれる。

他の緩衝剤としては、限定されないが、２５°Ｃで７．５のｐＫ_ａと約６．８−８．２の範囲のｐＨを有するＨＥＰＥＳ（Ｎ−｛２−ヒドロキシエチル｝ピペラジン（ｐｅｐｅｒａｚｉｎｅ）−Ｎ’−｛２−エタンスルホン酸｝；２５°Ｃで７．１のｐＫ_ａと約６．４−７．８の範囲のｐＨを有するＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス｛２−ヒドロキシエチル｝２−アミノエタンスルホン酸）；２５°Ｃで７．２のｐＫ_ａと約６．５−７．９の範囲中のｐＨを有するＭＯＰＳ（３−｛Ｎ−モルホリノ｝プロパンスルホン酸）；約６．８−８．２の範囲に２５°Ｃ．とｐＨで７．４のｐＫ_ａを有するＴＥＳ；（Ｎ−トリス｛ヒドロキシメチル｝−メチル−２−アミノエタンスルホン酸）；約６．９−８．３の範囲に２５°Ｃ．とｐＨで７．６のｐＫ_ａを有するＭＯＢＳ；（４−｛Ｎ−モルホリノ｝ブタンスルホン酸）；２５°Ｃで７．５２のｐＫ_ａと約７−８．２の範囲のｐＨを有するＤＩＰＳＯ（３−（Ｎ，Ｎ−ビス｛２−ヒドロキシエチル）アミノ）−２−ヒドロキシプロパン））；２５°Ｃで７．６１のｐＫ_ａと約７−８．２の範囲のｐＨを有するＴＡＰＳ（｛（２−ヒドロキシ−３｛トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ｝−１−プロパンスルホン酸））；２５°Ｃで８．４のｐＫ_ａと、約７．７−９．１の範囲のｐＨを有するＴＡＰＳ（｛（２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル）アミノール−１−プロパンスルホン酸））；２５°Ｃで８．９のｐＫ_ａと、約８．２−９．６の範囲のｐＨを有するＴＡＢＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−４−アミノブタンスルホン酸）；２５°Ｃで９．０のｐＫ_ａと、約８．３−９．７の範囲のｐＨを有するＡＭＰＳＯ（Ｎ−（１，１−ｄｉｍｅｔｈｙ１−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸；２５°Ｃで９．５のｐＫ_ａと、約８．６−１０．０の範囲のｐＨを有するＣＨＥＳ（２−シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸）；２５°Ｃで９．６のｐＫ_ａと、約８．９−１０．３の範囲のｐＨを有するＣＡＰＳＯ（３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸）；および、２５°Ｃで１０．４のｐＫ_ａと、約９．７−１１．１の範囲のｐＨを有するＣＡＰＳ（３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸）に基づく緩衝剤が挙げられる。

緩衝剤に加えて、等張化剤（ｉｓｏｔｏｎｉｚｅｒｓ）は、涙で調製物を等張にするために目薬に加えられ得る。等張化剤としては、限定されないが、デキストロース、グルコース、スクロース、およびフルクトースなどの糖；マンニトールとソルビトールなどの糖アルコール；グリセロール、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコールなどの多価アルコール；ならびに、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、塩化エフェドリン（ｐｈｅｄｒｉｎｅ）、塩化カリウム、塩化プロカイン、クロラムフェニコール、およびコハク酸ナトリウムなどの塩が挙げられる。等張化剤は、点眼薬の浸透圧を涙の浸透圧と等しくする量で加えられる。

保存剤は点眼薬および／または眼科用軟膏剤の完全性を維持するために加えられ得る。保存剤の例としては、限定されないが、ソルビン酸、塩化ベンザルコニウム、臭化ベンゾドデシニウム、パラベン、クロロブタノール、ベンジル型アルコール、フェニルエチルアルコール、貧歯類の二ナトリウム、ソルビン酸、ポリクオタニウム−１、または当業者に知られている他の薬剤が挙げられる。

いくつかの実施形態では、増粘剤は、目薬、点眼用ゲル剤、および／または眼科用軟膏剤などの点眼用調製物の粘性を増加させるために使用される。使用可能な増粘剤としては、限定されないが、グリセロール、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、およびカルボキシビニルポリマーが挙げられ得る。

上記のものに加えて、いくつかの実施形態では、限定されないが以下を含む追加薬剤を使用することが望ましい：亜硫酸ナトリウム、安定化剤、炭酸ナトリウム、およびプロピレングリコールなどの安定化剤；アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、トコフェロール、チオ硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；および／または、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール−ビス−（２−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−四酢酸、およびクエン酸ナトリウムなどのキレート剤。

点眼剤、眼科用ゲル剤、及び／又は眼科用軟膏剤は、無菌操作により調製され得、又は代替的に、滅菌は調製の適切な段階で実行される。例えば、滅菌医薬組成物は、滅菌成分を無菌で混合することにより調製され得る。代替的に、滅菌医薬組成物は、最初に成分を混合し、次いで最終的な調製物を滅菌することにより調製され得る。滅菌方法は、限定されないが、加熱滅菌、照射、及び濾過を含む。

眼科用軟膏剤（眼軟膏剤）は、活性成分を、眼軟膏剤の調製、その後に当該技術分野で既知の任意の方法による医薬製剤への処方のために使用される基剤に混合することにより、無菌で調製され得る。眼軟膏剤のための典型的な基剤は、ワセリン、ｊｅｌｅｎｅ ５０、プラスチベース、及びマクロゴールにより例示される。加えて、界面活性物質を加えて吸水性を増加させてもよい。

活性剤の制御放出のための多くの有効な方法が利用可能である。例えば、眼の剤形及び薬物送達システムに使用される、Ｗａｇｈ Ｖ． Ｄ．， Ｉｎａｍｄａｒ Ｂ．， Ｓａｍａｎｔａ Ｍ． Ｋ．， Ｐｏｌｙｍｅｒｓを参照。Ａｓｉａｎ Ｊ Ｐｈａｒｍ ２， ２００８， １２−１７、及びその中で引用される参考文献については、その内容が参照により本明細書に組み込まれている。ポリマー（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）及びヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）などのセルロース誘導体、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）、ポリアクリル酸塩、シクロデキストリン、及び天然のゴム、ポリオルソエステル（ＰＯＥ）、及び粘膜付着性ポリマー）；ゲル、フィルム、及び他の挿入物などの半固体；イオン交換樹脂などの樹脂；イオントフォレーシス送達；及び、小球体やナノ粒子などのコロイド粒子の使用は、具体的に考慮される。

本発明の化合物は、他の治療剤と組み合わせて提供されてもよい。幾つかの実施形態において、本発明の化合物は、他の活性剤と同時に処方され得、他の活性剤は限定されないが、抗感染剤、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗原虫剤、抗炎症薬、抗ヒスタミン、人工涙液、血管収縮薬、血管拡張薬、局所麻酔薬、鎮痛剤、眼圧低下剤、免疫制御薬、抗酸化剤、ビタミン、及び無機質を含む抗アレルギー剤、酵素阻害剤、又は代替的に、プロテアーゼ及びペプチダーゼ、サイトカイン阻害剤などを含む。

様々な実施形態において、本発明の化合物は、以下から成る群から選択される眼治療と組み合わせても提供され得る：Ａｃｕｌａｒ（ケトロラクトロメタミン点眼液）０．５％、Ａｃｕｖａｉｌ（ケトロラクトロメタミン）、ＡＫ−Ｃｏｎ−Ａ（眼科用ナファゾリン）、Ａｋｔｅｎ（塩酸リドカイン）、Ａｌａｍａｓｔ、Ａｌｐｈａｇａｎ（ブリモニジン）、Ａｌｒｅｘ、Ａｓｔｅｐｒｏ（塩酸アゼラスチンの鼻内噴霧）、ＡｚａＳｉｔｅ（アジスロマイシン）、Ｂｅｐｒｅｖｅ（ベシル酸ベポタスチン点眼液）、Ｂｅｓｉｖａｎｃｅ（ベシフロキサシン眼科用懸濁液）、Ｂｅｔａｘｏｎ、ＢＳＳ Ｓｔｅｒｉｌｅ Ｉｒｒｉｇａｔｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｃｏｓｏｐｔ、Ｄｕｒｅｚｏｌ（ジフルプレドナート）、Ｅｙｌｅａ（アフリバーセプト）、Ｌｏｔｅｍａｘ、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（ラニビズマブ）、Ｌｕｍｉｇａｎ（ビマトプロスト点眼液）、Ｍａｃｕｇｅｎ（ペガプタニブ）、Ｏｃｕｆｌｏｘ（オフロキサシン点眼液）０．３％、ＯｃｕＨｉｓｔ、Ｏｚｕｒｄｅｘ（デキサメタゾン）、Ｑｕｉｘｉｎ（レボフロキサシン）、Ｒｅｓｃｕｌａ（ウノプロストンイソプロピル点眼液）０．１５％、Ｒｅｓｔａｓｉｓ（シクロスポリン眼科用エマルジョン）、Ｓａｌａｇｅｎ Ｔａｂｌｅｔ、Ｔｒａｖａｔａｎ（トラボプロスト点眼液）、Ｖａｌｃｙｔｅ（バルガンシクロビルＨＣｌ）、Ｖｉｒｏｐｔｉｃ、Ｖｉｓｔｉｄｅ（シドフォビル）、Ｖｉｓｕｄｙｎｅ（注射用のベルテポルフィン）、Ｖｉｔｒａｓｅｒｔ Ｉｍｐｌａｎｔ、Ｖｉｔｒａｖｅｎｅ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、ＺＡＤＩＴＯＲ、Ｚｉｏｐｔａｎ（タフルプロスト点眼液）、Ｚｉｒｇａｎ（ガンシクロビル眼科用ゲル）、Ｚｙｍａｘｉｄ（ガチフロキサシン点眼液）、アトロピン、フルルビプロフェン、フィゾスチグミン、Ａｚｏｐｔ、ゲンタマイシン、ピロカルピン、バシトラシン、Ｇｏｎｉｏｓｏｌ、ポリミキシンＢ、ベータダイン、グラミシジン、プレドニゾロン、ベタキソロール、Ｈｕｍｏｒｓｏｌ、プロパラカイン、ベトプティック、Ｈｙｌａｒｔｉｎ、プロピン、ブリンゾラミド、高張性ＮａＣｌ、Ｐｕｒａｌｕｂｅ、ＢＳＳ、インドシアニングリーン、ローズベンガル、カルバコール、イトラコナゾール、ヒアルロン酸ナトリウム、セファゾリン、ラタノプロスト、スプロフェン、Ｃｅｌｌｕｖｉｓｃ、マンニットール、テラマイシン、クロラムフェニコール、メタゾラミド、チモロール、Ｃｉｌｏｘａｎ、ミコナゾール、トブラマイシン、シプロフロキサシン、Ｍｉｏｓｔａｔ、トリアムシノロン、Ｃｏｓｏｐｔ、Ｍｕｒｏ １２８、トリフリジン、デメカリウム、ネオマイシン、トロピカミド、デキサメタゾン、ネプタザン、トルソプト、ジピベフリン、Ｏｃｕｆｌｏｘ、ビダラビン、ドルゾラミド、オフロキサシン、Ｖｉｒａ−Ａ、エピネフリン、オキシテトラサイクリン、Ｖｉｒｏｐｔｉｃ、フルオレセイン、フェニレフリン、及びキサラタン。

＜キット＞
本発明の幾つかの実施形態は、眼疾患に関連した１以上の症状を予防及び／又は改善するためのキットに関するものである。キットは、本明細書に記載される治療用化合物の１以上を含有する１以上の容器を含み得る。化合物は、調製された医薬組成物として容器に存在し得、又は代替的に、化合物は処方されない場合もある。そのような実施形態において、キットは、容器の中に処方されていない化合物を含み得、これは薬学的に許容可能な担体とは別に存在している。使用前に、化合物は希釈されるか、又はそうでなければ薬学的に許容可能な担体と混合される。

本明細書に提供されるキットの幾つかの実施形態はまた、癌疾患に関連する１以上の症状が処置されるように医薬組成物を投与する方法を記載する説明書も含み、前記眼疾患は、網膜変性、老眼、白内障、及び／又は眼水晶体の核性硬化を含むがこれらに限定されない。幾つかの実施形態において、説明書はまた、キットの中に含まれる治療用化合物を眼科用の薬学的に許容可能な担体と混合するための手順も記載している。

本発明の幾つかの実施形態において、本明細書に記載される治療用化合物を含む容器は、点眼投与に使用される容器である。特定の実施形態において、容器は、点眼剤を投与するための滴瓶である。他の実施形態において、容器は、眼科用ゲル又は眼科用軟膏剤を投与するためのチューブである。

本発明の幾つかの実施形態は、制限されるものとして解釈されるべきでない、以下の実施例により更に例示される。以下の実施例に開示される技術は、本明細書に記載される発明の実施形態の実施において十分に機能すると、本発明者により発見された技術を表わすものであり、故に、このような実施形態の実施に好ましい形態を持続することを考慮され得ることが、当業者に認識されることになる。しかし、当業者は、本開示に照らして、本明細書に開示されると共に、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく同様の結果を今なお獲得する、特定の実施形態において多くの変更がなされ得ることを認識する。

＜装置＞
本発明の幾つかの実施形態は、被験体に本発明のステロールを投与するための装置に関するものである。幾つかの実施形態において、装置は、薬学的に許容可能な担体において処方される本発明のステロールを含有する、内部、キャビティ、又はリザーバを含む。そのような実施形態において、薬学的に許容可能な担体は、限定されないが、溶液、ゲル剤、及び軟膏剤を含む。特定の実施形態において、内部、キャビティ、又はリザーバは、本明細書に記載される本発明のステロールを含有する医薬製剤の１つ以上を含有する。

幾つかの実施形態において、本明細書で考慮される装置は、装置の内部、キャビティ、又はリザーバに繋がれる塗布具も含む。塗布具は、本発明のステロールを含有する医薬製剤が内部、キャビティ、又はリザーバから眼に送達されるのを可能にする、円柱状、円錐状、又は任意の他の形状であり得る。好ましい実施形態において、塗布具は先が細くなった円柱状であり、ここで、幅広い端部は、内部、キャビティ、又はリザーバに繋がれ、先が細くなった端部は、本発明のステロールを含有する医薬製剤の眼までの通路のための出口開口部を形成する。

他に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術分野における当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものに類似又は同等である任意の方法、装置、及び物質が、本発明の実施又は試験において使用され得るが、好ましい方法、装置、及び物質がここに記載される。

本明細書で言及される刊行物及びは全て、刊行物に記載される方法を説明及び開示する目的で、参照によって本明細書に完全に組み込まれ、前記方法は、現在記載される本明細書に関連して使用され得る刊行物に記載されている。上記、及び本文全体で議論される刊行物は、本出願の出願日前にそれらが開示されたことを示すためにのみ、提供されるものである。本明細書においては、本発明者が、先行発明によるそのような開示より先立つ権利がないという承認として解釈されるものは何もない。

以下の実施例は、例示を意図したものであるが、任意の方法、形状、又は形態で本発明を明確に又は暗黙に制限するようには意図されていない。それらは使用され得るものの典型である一方で、当業者に既知の他の手順、方法、又は技術が代替的に使用されてもよい。

＜実施例１＞
ヒトの水晶体は、水晶体の透明度及び屈折率に不可欠な、高規則性の（ｈｉｇｈｌｙ ｏｒｄｅｒｅｄ）相互に作用する肉眼組織に集められたクリスタリンタンパク質で主に構成される。タンパク質内又はタンパク質間の相互作用の任意の崩壊は、この繊細な構造を変化させ、それにより疎水性表面がさらされ、結果としてタンパク質凝集及び白内障形成が生じる。白内障は、何千万もの人々に影響を及ぼす、世界中における盲目の最も共通的な原因であり^１、現在では、白内障水晶体の外科切除が唯一の処置である。水晶体タンパク質が凝集を防ぎ、且つ水晶体の透明度を維持する正確な機構は、大きく知られてはいない。ラノステロールは、水晶体中で豊富な両親媒性分子である。これは、コレステロール合成経路の重要な環化反応においてラノステロールシンターゼ（ＬＳＳ）により合成される。ここで我々は、２つの家族における２つの別個のホモ接合ＬＳＳミスセンス突然変異（Ｗ５８１Ｒ及びＧ５８８Ｓ）を、広範囲の先天性白内障と同定する。これら突然変異は共に、高度に保存されたアミノ酸残基に影響を及びし、ＬＳＳの主要な触媒機能を損なわせる。突然変異型ではなく野生型のＬＳＳの操作された発現は、様々な白内障を引き起こす突然変異型クリスタリンの細胞内タンパク質凝集を妨げる。コレステロールではなくラノステロールによる処置は、インビトロ及び細胞遺伝子導入実験の両方において、予め形成されたタンパク質凝集体を著しく減らした。我々は更に、ラノステロール処置が白内障の重症度を低下させ、解剖されたウサギの白内障水晶体及びイヌにおけるインビボでの白内障の重症度における透明度を増大することができることを示す。我々の研究は、ラノステロールを水晶体タンパク質凝集の予防における重要な分子と同定し、白内障の予防と処置のための新しい戦略を指摘する。

白内障は、世界中の盲目の全ての症例の半分以上を占めており、唯一確立された処置は、不透明になった水晶体の外科切除を含む。先進国において、白内障手術は、老齢人口における疾患の完全な流行による医療費の大部分を占める。加えて、発展途上国において白内障に関連する主な罹患率が存在し、そこでは、外科介護へのアクセスが制限されている。

水晶体線維における高濃度のクリスタリンタンパク質が、水晶体の透明度と屈折特性に起因する^２。クリスタリンのスーパーファミリーは、ａ−、ｂ−、及びｃ−クリスタリンで構成され、これらは、人体における一部の最も大いに濃縮した細胞内タンパク質である。タンパク質凝集は、白内障の形成において単一の最も重要な要因である^３。タンパク質凝集に通じる要因は、先天性白内障を引き起こすと知られる、クリスタリンタンパク質における突然変異、又は、加齢に関連した白内障に次々に起因する、酸化ストレスを含む。しかし、水晶体タンパク質が透明度を維持するか、又は不透明化を引き起こす、正確な機構は、完全に理解されていない。

ラノステロールシンターゼ（２，３−オキシドスクアレン−ラノステロールシクラーゼ、ＬＳＳ；ＥＣ ５．４．９９．７）は、ＬＳＳ遺伝子によりコード化される。ＬＳＳタンパク質は、コレステロール、ステロイドホルモン、及びビタミンＤの生合成における主要な初期の律速段階である、（Ｓ）−２，３−オキシドスクアレンのラノステロールへの変換を触媒する（参考文献４）。ＬＳＳは、水晶体において発現されることが見出された^５。ＬＳＳ上の低形質突然変異と、ＦＤＦＴ１（ファルネシル二リン酸塩ファルネシルトランスフェラーゼ１）との特異的な組み合わせは、水晶体におけるコレステロール値を下げると共に、結果としてＳｈｕｍｉｙａの白内障ラット（ＳＣＲ）に白内障をもたらすことが、以前に報告されていた^６。ここで我々は、２つの血縁家族におけるＬＳＳ遺伝子の新たなホモ接合突然変異を確認し、ラノステロールがタンパク質凝集及び白内障形成を緩和する能力を調査する。

白人系の血縁家族からの重篤な先天性白内障を持つ３人の子供を確認した（図１Ａ）。因果的な突然変異を確認するために、全体のエキソーム配列決定を、標的部位（表１ａ）上の少なくとも５５倍の冗長度の被覆率の平均に対して行った。平均では、６０，８００−８０，８００のＳＮＰを各エキソームにおいて検出した（表１ｂ）。突然変異機能の予測（ＳＩＦＴ^７、Ｐｏｌｙｐｈｅｎ２^８、Ｐｈｙｌｏｐ^９、及びＭｕｔａｔｉｏｎｔａｓｔｅｒ^１０により予測される）と同様に、血縁的に劣性のモデル、及び、ｄｂＳＮＰ及び１０００のＧｅｎｏｍｅｓ Ｐｒｏｊｅｃｔを含む公開データベースにおける共通の変異体（マイナー対立遺伝子頻度．０．５％）に対するフィルタリングを使用して、我々は、潜在的な候補遺伝子変異体を絞り込むと共に、染色体２１上のＬＳＳにおける変異体（Ｇ５８８Ｓ）を最も有望な候補であると確認した（表１ｃ）。影響を受けた３人の子供は、ＬＳＳにおいてＧＲＡ転移（Ｇ５８８Ｓ）のためのホモ接合体であり（ＧＲｃｈ３７／ｈｇ１９：ｃｈｒ２１：４７６１５６４５；ＮＭ＿００１００１４３８．２：ｃ．１７６２Ｇ．Ａ、ＮＭ＿００１００１４３８．１：ｐ．Ｇ５８８Ｓ）、一方で影響を受けなかった父親、母親、及び残りの子供は、この変化に関してはヘテロ接合体であった（図１Ａ、Ｂ）。全体のゲノムＳＮＰ遺伝子型決定は、ＨｏｍｏｚｙｇｏｓｉｔｙＭａｐｐｅｒ^１１によりこのファミリーにおいて３つの長い連続的なホモ接合体の領域を識別した（ｃｈｒ２：ｑ２２．１−ｑ２４．１、ｃｈｒ２：ｑ３１．１−ｑ３２．１、及びｃｈｒ２１：ｑ２２．３； − 図６のＡ及び表１ｄ）。ＬＳＳ遺伝子は、染色体２１上のホモ接合体の領域の１つに位置していた（図６のＢ）。更に我々は、第２の血縁家族において、先天性白内障を持つ１５４のファミリーにおけるＬＳＳ遺伝子の突然変異についてスクリーニングを行い、別のホモ接合突然変異であるＷ５８１Ｒ（ＧＲｃｈ３７／ｈｇ１９： ｃｈｒ２１：４７６１５６６６； ＮＭ＿００１００１４３８．２：ｃ．１７４１Ｔ．Ｃ、ＮＭ＿００１００１４３８．１：ｐ．Ｗ５８１Ｒ）を確認した（図１Ａ、Ｂ、Ｃ）。これらの２つの突然変異は、１１，０００の対照染色体には存在しなかった。

ＬＳＳにおける、アミノ酸残基Ｗ５８１とＧ５８８を高度に保存する（図２のＡ）。我々は、ＬＳＳの３Ｄ構造と機能に対するＷ５８１ＲとＧ５８８Ｓの突然変異の効果を調査するために、計算上のモデリング分析を行った。位置５８１にあるアミノ酸、トリプトファンは、シクラーゼ活性の触媒部位に起因すると報告された^１２。Ｇ５８８Ｓ突然変異体を、適所での置換、その後の側鎖の改良によりモデル化した。Ｓ５８８側鎖の改良は、セリン側鎖と、Ｒ６３９と共に重要な塩橋を形成するＥ５７８のバックボーンカルボニルとの間の、ファンデルワールス衝突を解決することができなかった。Ｅ５７９：Ｃ５８４のループの配向は、突然変異を適応させるように歪められることを必要とされた。突然変異体Ｓ５８８の側鎖は隣接したループに衝突し、このことは、突然変異がＬＳＳの標準の酵素の構造及び機能に適合しなかったことを示している（図２のＢ）。インシリコの（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）の結果を支持すると、細胞遺伝子導入実験における野生型ＬＳＳの発現は、シクラーゼ活性を示すと共に、ＨｅＬａ細胞における脂質画分中のラノステロール生成の量を劇的に増大させ、一方でＷ５８１ＲもＧ５８８Ｓの突然変異タンパク質も、任意のシクラーゼ活性を実証しなかった（図２のＣ）。対照的に、コレステロール値は、野生型又は突然変異型ＬＳＳの発現による影響を受けず、このことは、コレステロール恒常性のための代替的な経路が存在し得ることを示唆している。Ｗ５８１ＲとＧ５８８Ｓの突然変異は、細胞内局在性を変化させず、又は、野生型ＬＳＳのものと比較した場合にＬＳＳタンパク質の凝集を引き起こさず、このことは、白内障表現型が、突然変異型ＬＳＳタンパク質自体による光散乱粒子の形成によるものではなかったことを示唆している（図７）。クリスタリン、水晶体中の主要な構造タンパク質の凝集は、様々なタイプの白内障の主な原因である^３。白内障水晶体における模倣タンパク質凝集に対して、６つの既知の白内障を引き起こす突然変異型クリスタリンタンパク質が、ヒトの水晶体前駆細胞、ヒトの水晶体上皮株Ｂ−３（ＨＬＥＢ−３）、又はＨｅＬａ細胞において発現された。これら突然変異型クリスタリンは、３つの遺伝子導入された細胞株全てにおいてｐ６２−陽性の封入体／凝集体を形成し、このことは、凝集が突然変異型クリスタリンの固有特性であることを示唆している（図３Ａ、図８及び９）^１３。野生型ＬＳＳと、白内障を引き起こす突然変異型クリスタリンタンパク質との同時発現は、細胞内のクリスタリン凝集体の数と大きさの両方を著しく減らした一方で、ＬＳＳ突然変異体は単独でそのように減らすことが出来なかった（図３Ｂ、Ｃ、及び図８と９）。ウェスタンブロット解析により、ａＡ−クリスタリンのＹ１１８Ｄ突然変異体が、細胞内凝集体から放たれると共に、野生型ＬＳＳを伴いより可溶性となったことが示された（図３Ｄ及び図９Ｃ）。更に、ＬＳＳ突然変異体と突然変異型クリスタリンを同時発現する細胞の培地における、コレステロールではなくラノステロールの添加が、クリスタリン凝集を上手く減少させた（図３Ｃ、図８、及び９）。この結果は、コレステロールではなくラノステロールが、凝集から突然変異型クリスタリンタンパク質を放つのに有効な薬剤であり得ることを示した。

この仮説を支持して、ラノステロールは、濃度依存性の様式で野生型及び突然変異型のクリスタリンタンパク質のアグリソーム形成を阻害した一方で、コレステロールにはそのような効果は無かった（図３Ｅ、Ｆ、及び図１０）。コレステロールではなくラノステロールは、細胞溶解物の可溶性画分における突然変異型クリスタリンの量を増大した（図３Ｇ及び図１１Ａ）。ａＡ−クリスタリンのＧＦＰ融合Ｙ１１８Ｄ突然変異体を発現する細胞の、連続する生細胞の撮像を用いて、我々は、ラノステロールの添加が２２２６８分の半減期を持つクリスタリン凝集体を効果的に減らし（図３Ｈ）、一方でＤＭＳＯ又はコレステロールの添加はアグリソーム形成を減少させなかった（図１１Ｂ）ことを示した。生細胞における単一粒子のトラッキングにより、ラノステロールが予め形成された細胞内タンパク質凝集体の分離において重要な役割を有していることが明確に示された。

ラノステロールが、凝集されたタンパク質の溶解に対する直接効果を有しているかどうかを研究するために、１Ｍのグアニジン塩化物の存在下で野生型及び突然変異型クリスタリンを加熱することにより、５つの野生型及び９つの突然変異型クリスタリンの凝集体を得た。この条件下で、クリスタリンタンパク質は全て、チオフラビンＴ（ＴｈＴ）の蛍光の増大、ネガティブ染色透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）の下の原繊維の構造、及び低い濁度の値により明らかにされるように、アミロイド様の原繊維を形成した（図４及び図１１Ｃ）。ここで得られたアミロイド様の原繊維の形態は、前に報告されたそのようなクリスタリンタンパク質と同様であった^１４。ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）により形成されたリポソームを含有するＰＢＳを使用して、ステロール化合物の可溶性を増大すると共に、細胞膜におけるステロールの状態を模倣した。コレステロールではなくラノステロールは、ネガティブ染色ＴＥＭ写真における原繊維性の構造の消失、及びＴｈＴ蛍光強度の減少により示されるように、濃度依存性の様式で、アミロイド様の原繊維から凝集されたクリスタリンタンパク質を上手く再溶解した（図４及び図１１Ｄ）。一例として、再溶解されたαＡクリスタリンは、ネガティブ染色ＴＥＭ写真において確認され得、約１５ｎｍの大きさであった（図４Ａ）^１５。

水晶体組織における白内障の減少に対するラノステロールの効果を評価するために、ウサギから自然に生じる白内障水晶体を分離し、６日間２５ｍＭのラノステロール溶液中でこれらをインキュベートし、ラノステロールの処置の前後に水晶体の清澄性を比較した。水晶体の清澄性の増加により実証されるように（Ｐ＜０．００３、ウィルコクソン検定、図５Ａ、Ｂ、表２Ａ、Ｂ、及び図１２のＡ）、白内障の重症度の減少の強い傾向が観察された。我々は更に、インビボでのイヌにおける白内障を覆す際のラノステロールの効果を調査した。ラノステロール処置により、白内障の重症度が著しく減少し、水晶体の清澄性が増大した（Ｐ＜０．００９、ウィルコクソン検定、図５Ｃ、Ｄ；表２Ｂ及び図１２のＣ）。

ＬＳＳの触媒機能に影響するホモ接合突然変異は、重篤な視力喪失を伴う広範囲の先天性白内障を引き起こす。白内障の予防におけるラノステロールの重大な役割は、化合物のＬＳＳ突然変異を抱くラット菌株が、ヒト白内障疾患の表現型を繰り返すという観察により支持される^６。この考えに一致して、Ｕ１８６６６ＡによるＬＳＳの阻害、即ちＬＳＳ阻害剤（オキシドスクアレンシクラーゼ阻害剤としても知られる）が、白内障を引き起こすと見出された^１６。更に、ラノステロール処置により、細胞培養において突然変異型クリスタリンタンパク質により引き起こされるタンパク質凝集が著しく減少した一方で、動物モデルにおいて予め形成された白内障の重症度を減少し、白内障水晶体の清澄性を増大させた。ラノステロールの両親媒性の性質により、ラノステロールは、大きなタンパク質凝集体の疎水性の中心領域に挿入すると共にそれらを覆うことができ、徐々にこのような凝集が再び水溶性になることを効果的に可能にすることが考えられる。

要約すると、ラノステロールは、水晶体タンパク質凝集を阻害すると共に白内障形成を減少させるのに重要な役割を果たし、白内障の予防と処置のための新たな戦略を示唆する。白内障は盲目の主要原因であり、毎年、何百万もの患者が、不透明になった水晶体を除去するために白内障手術を受けている。外科手術は、非常に上手くいったとしても、それにもかかわらず合併症と罹患率に関連してしまう。それ故、白内障を覆すための薬理学的処置は、大きな健康的且つ経済的な影響を備え得る。加えて、我々の結果は、本明細書で実証されたものなどの小分子（ｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の方法の研究の助長により、タンパク質凝集疾患の処置に関してより広範囲の意味合いを有し得、前記疾患は、神経変性疾患及び糖尿病を含み、それらは総体的に、高齢者人口における罹患率と死亡率の著しい原因である。

＜方法＞
研究の参加者。参加者は全員、標準の完全な眼科検査と撮像研究を受けた。人口統計データ、危険因子、及び血液サンプルを最初の訪問時に集めた。２人の成人及び４人の子供から成る血縁家族を募集した。両親は近親者であり、４人の子供のうち３人は網膜変性と白内障を患っていると診断された（図１Ａ）。追加で１５４の先天性白内障の系統におけるＬＳＳ突然変異についてスクリーニングを行い、ホモ接合体Ｗ５８１Ｒ突然変異を持つ別のファミリーを確認した。

エキソームの捕捉及び配列決定。製造業者のプロトコルに従い、Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｈｕｍａｎ Ａｌｌ Ｅｘｏｎ Ｋｉｔ（溶液中）を使用して、エキソームの捕捉を行った。簡潔に、１５０−２００ｂｐの塩基対のピークを用いてＣｏｖａｒｉｓによりゲノムＤＮＡサンプルを無作為に断片化し、結果として断片を得て、アダプターを断片の両端部にライゲートした。Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＳＰＲＩのビーズを用いてアダプターにライゲートされたテンプレートを精製し、挿入物の大きさが〜２５０ｂｐである断片を切除した。ライゲーションを媒介としたＰＣＲにより、抽出されたＤＮＡを増幅し、精製し、且つ、豊富化のためにＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ（ＢＡＩＴＳ）にハイブリダイズした。ハイブリダイズされた断片をストレプトアビジンビーズに結合し、一方でハイブリダイズされていない断片を２４時間後に洗い流した。捕捉されたライゲーションを媒介としたＰＣＲ生成物をＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒにさらして、豊富化の規模を推定した。次いで、捕捉された各ライブラリを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩのプラットフォームに載せ、端部対の配列決定を、９０ｂｐの読み取り長さで実行し、それは各サンプルについて少なくとも５０×平均被覆率の冗長度をもたらした。生の画像ファイルを、デフォルトパラメータを備えたＩｌｌｕｍｉｎａ ｂａｓｅ−ｃａｌｌｉｎｇのソフトウェアにより処理した。

マッピングの読み取り及び変異体の検出。ＢＷＡ^１７（バージョン０．５．９−ｒ１６）を用いて、各個体における配列の読み取りを、ヒト参照ゲノム（ＮＣＢＩ ｂｕｉｌｄ ３７、ｈｇ１９）に整列した。次いで、再整列と突然変異（ＳＮＶ及びインデル）の検出のために、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＴｏｏｌＫｉｔ（バージョンＧＡＴＫ ２．８）を用いたＧＡＴＫ^１８のベストプラクティス・パイプラインを使用して、ＢＷＡにより作成されたＢＡＭファイルを処理した。ＶＱＳＲフィルタ条件を通過した突然変異を、後の解析のために抽出した。

標的領域におけるコンセンサス遺伝子型を、推奨されたパラメータを持つＳＯＡＰｓｎｐ（ｖ１．０３）及びＢＷＡ（バージョン０．５．９−ｒ１６）により読み取った（ｃａｌｌｅｄ）。少なくとも２０×及び少なくとも４×の被覆率の冗長度のＲｈｒｅｄ様の性質を持つコンセンサス遺伝子型は、高い信頼性のある遺伝子型であると考えられた。参照とは異なる遺伝子型を候補ＳＮＰとして抽出し、ＳＮＰの結果を以下のようにフィルタ処理した：Ｐｈｒｅｄ様のＳＮＰの性質≧２０、４×から２００×の全体の冗長度、コピー数の推定＜２、及び５ｂｐもの２つの隣接したＳＮＰの間の距離。

遺伝子変異体の機能アノテーション。ＡＮＮＯＶＡＲを使用して突然変異体を機能的にアノテートし、ミスセンス、ナンセンス、リードスルー、及びスプライス部位の突然変異に分類し、それらは、同義突然変異及び非コード化突然変異と比較して有害である可能性が高い。これらのアノテーションに基づき、変異体を、最初に非同義的なスプライス受容部位及び供与部位についてフィルタ処理し、次いで、利用可能な公開データベース（ｄｂＳＮＰ１２９と１０００ Ｇｅｎｏｍｅ ｖａｒｉａｎｔｓのデータベース）に対してフィルタ処理した。３人の影響を受けた被験体においてはホモ接合突然変異であると共に、保因者（両親）においてはヘテロ接合突然変異であるが、公開データベースには存在しないと分かった変異体は、候補となる原因変異体であると考えられた。

ＬＳＳと遺伝子の突然変異のスクリーニング。Ｓａｎｇｅｒ ＤＮＡ配列決定を行い、ＬＳＳにおけるＧ５８８Ｓ突然変異を検証した。ＬＳＳ遺伝子の２２のエキソンをＰＣＲにより増幅し、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ ３１３０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で配列決定した。ＬＳＳにおけるエキソンを増幅するために使用されるプライマーを、表３Ａに提示する。先天性白内障を持つ１５４のファミリーにおけるＬＳＳ遺伝子中の突然変異についてスクリーニングし、第２の血縁家族において別のホモ接合突然変異、Ｗ５８１Ｒを確認した。これらの２つの突然変異は、サンディエゴに住む影響を受けていない対照人口からの２，０００の染色体、１０００のＧｅｎｏｍｅｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ、及びワシントン大学でのエキソーム配列決定のデータベースからの８，０００の染色体を含む、１１，０００の対照染色体には存在しなかった。ＦＤＦＴ１突然変異が白内障表現型を修飾するという以前の報告により、ＦＤＦＴ１遺伝子中の変異体をスクリーニングし、ほんの１つの共通の非同義変異体ｒｓ４７３１を確認した（ＧＲｃｈ３７／ｈｇ１９：ｃｈｒ８：１１６６６３３７；ＮＭ＿００１２８７７４２．１：ｃ．１３４Ａ．Ｇ、ＮＭ＿００１２７４６７１．１：ｐ．Ｋ４５Ｒ）。影響を受けない娘が同じホモ接合体の変化を抱いており、比較的高頻度の一般人口がこの突然変異体を有しているため、変異体を原因突然変異として除外した（１０００のＧｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔデータにおけるマイナー対立遺伝子頻度．４％）（表１Ｅ）。

Ｇ５８８Ｓ突然変異の３Ｄモデリング。Ｇ５８８Ｓ突然変異体のモデルは、Ｒｕｆらにより判定されるように２つの構造から構築され、エントリー１Ｗ６Ｋ及び１Ｗ６Ｊ^１２としてプロテインデータバンクに残されていた^２０。Ｘ線座標を使用して、酵素の完全な原子モデルを作成し、それを、Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ ｐｒｏｇｒａｍ（ＩＣＭ）及びそのＰＤＢ変換プロトコルを用いて精製した^２１。ラノステロール結合に対するＧ５８８Ｓ突然変異により誘発された衝突の効果を分析するために、我々は、１Ｗ６Ｋ構造を用いて、ラノステロールと相互に作用する酵素のポケットに含まれる側鎖を全て分析した。接触の領域を、ラノステロールの有無にかかわらず各残基の溶媒アクセス可能領域の間の差として計算すると共に、ＩＣＭプログラムを用いてその大きさを選別した^２２。

プラスミド構成物及び部位特異的突然変異誘発。ＬＳＳ ｃＤＮＡを含有するクローンをＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃから購入した。野生型ＬＳＳのコード配列をクローン化し、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｎ−Ｆｌａｇプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。ＰＣＲを用いて、重なりの拡張（ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）による部位特異的突然変異誘発を介して、突然変異体を構築した。共通のＰＣＲプライマーは以下の通りであった：ＮｄｅＩフォワード、５９−ＣＡＴＡＴＧＡＣＧＧ ＡＧＧＧＣＡＣＧＴＧＴＣＴ−３９、及びＸｈｏＩリバース、５９−ＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＧＧＧＴＧＧＣＣＡ ＧＣＡＡＧ−３９。Ｗ５８１Ｒ及びＧ５８８Ｓの突然変異体を構築するためのプライマーは以下の通りであった：Ｗ５８１Ｒフォワード、５９−ＴＧＧＧＡＡＧＧＣＴＣＣＣＧＧＧＧＡＧＴＴＴＧＣＴ−３９；リバース、５９−ＧＴＧＡＡＧＣＡＡＡＣＴＣＣＣＣＧＧＧＡＧＣＣＴＴＣ−３９；Ｇ５８８Ｓフォワード、５９−ＧＣＴＴＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＡＣＣＴＧＧＴＴＴＧ−３９；Ｇ５８８Ｓリバース、５９−ＣＣＡＡＡＣＣＡＧＧＴＧＣＴＧＴＡＧＧＴＧＡＡＧ−３９。野生型又は突然変異型ＬＳＳ遺伝子を含有する組み換え型ｐｃＤＮＡ３．１−Ｎ−Ｆｌａｇプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＨ５ａ細胞に形質転換した。ａＡ−、ａＢ−、ｂＢ２−、ｃＣ−、及びｃＤ−クリスタリンのｃＤＮＡを、前述のようにヒト水晶体の総合ｃＤＮＡからクローン化した^{２３−２６}。突然変異体を、表３Ｂに列挙したプライマーを用いて部位特異的突然変異誘発により構築した。増幅された断片をＸｈｏＩとＢａｍＨＩにより消化し、次いで真核細胞発現ベクターｐｅＧＦＰ−Ｎ１又は原核細胞発現ベクターｐＥＴ２８ａに挿入した。Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉｐｒｅｐキット（Ｖｉｇｏｒｏｕｓ）を使用してプラスミドを得て、ＤＮＡ配列決定により確認した。クリスタリン遺伝子構成物をＣ末端ｅＧＦＰ融合タンパク質として作成し、一方でＬＳＳを、Ｎ末端Ｆｌａｇタグを付けたタンパク質として作成した。

細胞培養及び遺伝子導入。ＨｅＬａ細胞及びヒト水晶体上皮Ｂ−３細胞（ＨＬＥＢ−３）をＡＴＣＣから得た。ヒト水晶体前駆細胞を、胎児のヒトの眼から分離した^２７。ＨｅＬａ細胞を、１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＤＭＥＭ培地の中で培養した。ＨＬＥＢ−３細胞を、２０％のＦＢＳを含むＦ１２培地において培養し、一方でヒト水晶体前駆細胞を、２０％のＦＢＳ及び１０ｍｇのｍｌ^−１ ＦＧＦ（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＭＥＭ培地において培養した。全ての細胞を、５％のＣＯ_２インキュベーターにおいて３７℃で培養した。細胞を慣例的に試験すると、マイコプラズマ汚染に対して陰性であった。

ステロール含有量に対するＬＳＳ発現の効果を評価するために、コード領域のＮ末端基においてＦｌａｇタグと融合された野生型ＬＳＳ又はＬＳＳ突然変異体により、ＨｅＬａ細胞を遺伝子導入した。細胞を遺伝子導入の２４時間後に集め、ＬＣ−ＭＳ分析のために脂質画分を抽出した。ベクターｐｃＤＮＡ３．１−Ｎ−Ｆｌａｇプラスミドで遺伝子導入された細胞を、対照として使用した。野生型及び突然変異型ＬＳＳの発現レベルを、マウス抗Ｆｌａｇ（Ｆ１８０４；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及びマウス抗アクチン抗体（ＢＳ６００７Ｍ；Ｂｉｏｗｏｒｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いたウェスタンブロット解析により標準化した。

クリスタリン凝集に対するラノステロールの効果を評価するために、ヒト水晶体前駆細胞を４時間、ＬＳＳ及び様々なクリスタリン構成物と共遺伝子導入した。クリスタリン突然変異体及びｐｃＤＮＡ３．１−Ｎ−Ｆｌａｇと共遺伝子導入された細胞を対照として使用した。ＬＳＳ及びクリスタリン突然変異型構築物と共遺伝子導入されたヒト水晶体前駆細胞を、凝集体をアッセイする前に１２時間培養した。４０ｍＭのステロール（ラノステロール又はコレステロール、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、２時間かけて細胞培養培地へと添加することにより、１６時間後にレスキュー実験を行い、細胞培養培地は後に、新鮮な培養培地と置き換えられ、細胞は２４時間培養された。クリスタリン凝集体を持つ細胞のパーセンテージを、１０の無作為に選択された視野から計算した。野生型ＬＳＳ群、突然変異体群、及び突然変異体＋ラノステロール群の値を計算した。１％のＤＭＳＯで処理した細胞を対照として使用した。

細胞内クリスタリン凝集上でのＬＳＳ及びラノステロールの衝突を、単盲検の観察者研究において評価した。実験を少なくとも３回繰り返した。スチューデントｔ検定を使用してＰ値を計算した。蛍光顕微鏡法。等量のヒト水晶体前駆細胞、ＨＬＥＢ−３細胞、又はＨｅＬａ細胞を、ＴＣ（Ｓｏｌａｒｂｉｏ）で予め処理されたガラスカバースリップ上に播種した。２４時間培養して９０％の集密度に達した後、細胞を、様々なＬＳＳ又はクリスタリン遺伝子を含有するプラスミドで遺伝子導入し、又は、特定のクリスタリン遺伝子を含有するプラスミド、及び野生型或いは突然変異型ＬＳＳ遺伝子を含有するプラスミドで共遺伝子導入した。対照は、ｐｅＧＦＰ−Ｎ１及び／又はｐｅＤＮＡ３．１−Ｎ−Ｆｌａｇを含有するプラスミドで遺伝子導入された細胞であった。遺伝子導入及び同時の遺伝子導入は共に、製造業者からの指示に従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行われた。

様々な白内障を引き起こすクリスタリン突然変異体の細胞内凝集に対する野生型又は突然変異型ＬＳＳの効果を、ヒト水晶体前駆細胞、ＨＬＥＢ−３細胞、又はＨｅＬａ細胞におけるＦｌａｇ−ＬＳＳ及びクリスタリン−ＧＦＰの同時発現により評価した。Ｆｌａｇに対してＧＦＰ又は抗体を使用して、タンパク質の細胞内分布を視覚化した。４時間の同時の遺伝子導入の後、細胞を新鮮培地の中で２４時間培養し、次いで顕微鏡検査により分析した。

様々なクリスタリンのアグリソーム形成に対するラノステロール又はコレステロールの効果を、様々なクリスタリン遺伝子を含有するプラスミドで細胞を遺伝子導入することにより研究した。細胞を２４時間インキュベートして、効果的なタンパク質発現及びアグリソーム形成を可能にした。その後、細胞を、１％（ヒト水晶体前駆細胞について）又は２％（ＨｅＬａ細胞について）のＤＭＳＯにおいて０−４０ｍＭのステロールで処理した。１％又は２％ＤＭＳＯで処理した細胞を対照として使用した。処理の２時間後、培地を新鮮培地と交換した。１２時間後、細胞を顕微鏡検査分析に使用した。

リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でスリップを３回洗浄することにより、顕微鏡検査サンプルを調製した。細胞を４０分間、４％のパラホルムアルデヒドで固定し、その後ＰＢＳで更に３回洗浄した。ＰＢＳにおいて０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）により細胞を１０分間透過処理し、３７℃で１時間、ＰＢＳにおいて５％の標準のヤギ血清で遮断した。５％の標準のヤギ血清を含有するＰＢＳ緩衝液においてマウス抗Ｆｌａｇ抗体（１：５００）又はマウス抗ｐ６２抗体（１：２００、ａｂ５６４１６；Ａｂｃａｍ）を加えることにより、免疫染色を行なうと共に、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、スリップをＰＢＳで３回洗浄し、周囲温度で１時間、Ａｌｅｘａ ６４９を抱合したヤギ抗マウスＩｇＧ（１：２５０）で更にインキュベートした。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で核を対比染色した。Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０焦点顕微鏡を使用して、載せられた細胞を分析した。

生細胞の撮像。ヒト水晶体前駆細胞を、αＡ−クリスタリン（Ｙ１１８Ｄ）突然変異体を含有するプラスミドで遺伝子導入した。２４時間の遺伝子導入期間の後、αＡ−クリスタリン（Ｙ１１８Ｄ）突然変異体が安定して発現された細胞を、７日間、０．８ｍｇのｍ１^−１ Ｇ４１８を含有する培地中でのインキュベーションによりスクリーニングした。次いで、得られた細胞を、底部がガラス製の細胞培養皿（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の上で播種すると共に、４時間にわたり、１％のＤＭＳＯで処理し、１％のＤＭＳＯ中には４０ｍＭのコレステロール又は４０ｍＭのラノステロールが含まれていた。新鮮培地を加え、細胞を連続的な生細胞の撮像により分析した。生細胞の画像を、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８１顕微鏡で視察し、ＣｅｌｌＳｅｎｓ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ）で捕捉した。生細胞の撮像における単一の粒子追跡を用いてｐ６２−陽性の凝集体の蛍光強度を測定することにより、凝集体の大きさの定量分析を行った。各々１−８の反復を含む３つの生物学的複写物を使用して、生細胞の撮像を行った。

細胞の脂質抽出。Ｂｌｉｇｈ及びＤｙｅｒの方法を使用して脂質の抽出を行った^２８。簡潔に、〜１×１０^６−１０^７のＨｅＬａ細胞をＰＢＳで３−５回洗浄し、次いで４００ｍｌの氷冷メタノール中で磨き、２００ｍｌのクロロホルムを添加した１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移した。サンプルを１分間ボルテックス撹拌し、次いで３００ｍｌの１Ｍ ＫＣ１と混合した。有機相と水相を、４℃で５分間、２０，８１７ｘｇでの微量遠心分離により分離した。分離後、より下方の有機相を集めた。その後、残りの水相を、３００ｍｌのクロロホルムを使用して２回再抽出した。集めた有機相を、真空下でＳｐｅｅｄＶａｃサンプル濃縮装置を使用して乾燥した。乾燥したサンプルを、更なるＬＣ−ＭＳ分析のために２８０℃で保存した。

ＬＣ−ＭＳ分析。乾燥した脂質抽出物を１００ｍｌのメタノールの中で再懸濁した。サンプルを１０分間ボルテックス撹拌し、３０分間８０Ｗの超音波処理により処理し、１０分間２０，８１７ｇで微量遠心分離して、次いで上清を新たなＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移した。この微量遠心分離処理を３回繰り返した。得られたサンプルを、代替的なＡｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ（ＡＰＣＩ）のソースを用いてＡｇｉｌｅｎｔ １２９０／６４６０三連四重極ＬＣ／ＭＳにより分析した。Ａｇｉｌｅｎｔ ＳＢ−Ｃ１８カラムを使用して脂質を分離した。電子衝撃イオン化モードを使用して、選択的なイオンモニタリングを行った。非常に純粋なラノステロールとコレステロールを対照として使用した。３５０℃のガス温度、４１ｍｉｎ^−１のガス流速、６０ｐ．ｓ．ｉの噴霧器、３５０℃の蒸発器、３，５００Ｖのキャピラリー、及び４ｍＡのコロナ電流を使用して、ＭＳの判定を行った。感受性及び特異性を最適化するために、２つのクオリファイアーイオンを、各化合物（コレステロールについて３６９．３／１６１．１及び３６９．３／１４７、並びにラノステロールについて４０９．２／１９１．３及び４０９．２／１０９）のＭＳの分析のために選択した。ウェスタンブロット法。細胞溶解物を、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｒｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、及び０．１％のＳＤＳを含有するＲＩＰＡ緩衝液の中で調製した。上清及び沈殿画分を遠心分離により分離した。タンパク質を１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に移した。Ｆｌａｇ（Ｆ１８０４；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）又はＧＦＰ（ＭＢ２００５；Ｂｉｏｗｏｒｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に対するマウス抗体を使用し、それぞれ過剰発現されたＬＳＳ及びクリスタリンタンパク質を確認した。ソフトウェアＧＥＬＰＲＯ（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）を使用して、ウェスタンブロットのバンドの定量化を達成した。提示された定量データを、３つの独立実験から計算した。

タンパク質の発現及び精製。組み換え型のＨｉｓタグを付けた野生型及び突然変異型のｂ−クリスタリンタンパク質及びｃ−クリスタリンタンパク質を、大腸菌の中で過剰発現すると共に、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティカム、その後本明細書の他の部分に記載されるのと同じプロトコルを用いたゲル濾過クロマトグラフィーを使用して、精製した^{２３、２４、２６、２９}。タグを付けていないαＡ−及びαＢ−クリスタリンの過剰発現と精製を、前述のように行った^３０。１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、１０％の天然のＰＡＧＥ上の１つの均質なバンド、及びサイズ排除クロマトグラフィーの特性における単一ピークにより評価されるように、タンパク質の純度は９５％より上であると推測された。標準としてＢＳＡを使用することにより、Ｂｒａｄｆｏｒｄ方法に従いタンパク濃度を判定した^３１。タンパク質サンプルを全て、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び１ｍＭのＤＴＴを含有する２０ｍＭのＰＢＳ緩衝液の中で調製した。

タンパク質凝集及び凝集体の分離。６０℃で２時間、５ｍｇ／ｍｌの濃度で１Ｍのグアニジン塩化物（超高純度、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するタンパク質溶液を加熱することにより、野生型及び突然変異型のαＡ−及びαＢ−クリスタリンタンパク質の凝集体を得た。３７℃で４８時間、１Ｍのグアニジン塩化物を癌油するタンパク質溶液を加熱することにより、野生型及び突然変異型のｂ−クリスタリン及びｃ−クリスタリンの凝集体を調製した。ＴｈＴ蛍光、濁度（４００ｎｍでの吸光度）、及び透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察により、凝集体の形成を確認した。予め形成された凝集体を、０．２ｍｇ／ｍｌ（約１０ｍＭ）の終末濃度を持つ２０ｍＭのＰＢＳの中で再懸濁した。再懸濁された凝集体を、３７℃で５００ｍＭのＤＰＰＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）により形成されたリポソーム中の５００ｍＭのラノステロール又はコレステロールにより処理した。５００ｍＭのＤＰＰＣリポソームにより処理された凝集体を、負の対照として使用した。処置の２４時間後、タンパク質溶液を、ＴｈＴ蛍光、濁度、及びネガティブ染色ＴＥＭの観察のために使用した。新たにグロー放電された炭素コーティング銅グリッド上にタンパク質溶液を堆積することにより、ＴＥＭサンプルを調製した。３０秒間、１．２５％の酢酸ウラニルでグリッドを染色することにより、ネガティブ染色サンプルを得た。ネガティブ染色ＴＥＭの写真を、１２０ｋＶの電圧及び４８，０００の倍率を備えた、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｈ−７６５０Ｂ透過型電子顕微鏡上で得た。

白内障のウサギ水晶体の処置。ウサギをＣＯ_２吸入により安楽死させ、水晶体を直ちに解剖し、ビヒクル、又は、２５ｍＭの溶液を作るためにビヒクルに溶解されたラノステロールで処理した。水晶体組織を、室温で暗所の中６日間、この溶液中でインキュベートした。白内障を顕微鏡下で検査し、撮影した。以下に示される、前述の不透明化採点システムを用いて、盲検の試験者が、白内障の程度を評価した^{３２、３３}。水晶体の清澄性及び透明度の改善を、目視検査及び採点により定量化した。光の伝達、水晶体の真下のグリッド像の清澄性（図１２）、及び水晶体の全体的な清澄性の改善或いは皮質白内障の局部の清澄性の改善により、水晶体の清澄性を採点した。Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を使用して、処置効果を評価した。

白内障採点システム。グレード０：不透明化の不在（はっきり目に見えるグリッド線）；Ｎグレード１：軽微な不透明化の程度（グリッド線が最小限に曇り、グリッド線はまだ目に見える）；Ｎグレード２：水晶体のほぼ全体に拡散した不透明化の存在（グリッド線が中程度に曇り、主要なグリッド線が眼に見える）；Ｎグレード３：水晶体全体に及ぶ広範囲で濃い不透明化の存在（グリッド線は完全に曇り、グリッド線は全く眼に見えない）

薬物を充填したナノ粒子の調製。適合したナノ沈殿法を介して、ラノテロールを、脂質ポリマーハイブリッドナノ粒子に充填した^３４。簡潔に、所望濃度のラノステロールを、アセトニトリルに溶解されたポリカプロラクトン（ＰＣＬ）ポリマーと混合した。レシチン及び１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−カルボキシ（ポリエチレングリコール２０００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ）を、２０重量％のＰＣＬポリマーで４％のエタノール水溶液に溶かして、６０℃より上に加熱した。次いで、ラノステロール／ＰＣＬ溶液を、穏やかな撹拌、その後３分間の激しい撹拌の下で、予め加熱した脂質溶液に加えた。その後、混合溶液を２時間撹拌すると、ナノ粒子が形成され、アセトニトリルは蒸発した。次に、分画分子量が１０ｋＤａであるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４遠心濾過機（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、ナノ粒子溶液を３回洗浄し、残りの有機溶媒と有利分子を除去した。その後、結果として生じるナノ粒子を、後の使用のためにＰＢＳ緩衝液中で再懸濁した。薬物を充填したナノ粒子の粒度、粒度分布、及び表面ゼータ電位は、動的光散乱を特徴としていた。ラノステロールの充填収量を、高速液体クロマトグラフィーにより定量化した。

イヌの白内障水晶体の処置。生きている動物における白内障に対するラノステロール処置の効果を評価するために、アセプロマジン（ａｃｅｐｒｏｍａｘｉｎｅ）とブトルファノールを筋肉内注射によりイヌに予め投薬した。２０分後、静脈内にプロポフォールを適用することにより麻酔導入を行った。その直後、イヌに管を挿し込み、２１ｍｉｎ^−１で酸素及び２％のイソフルラン上で維持させた。２８ゲージの針を使用して試験対象の目の硝子体腔に、ラノステロール（１００ｍｇ）を充填したナノ粒子を最初に注入し、次いで実験期間中３日ごとにそれを与えられた。処置対象の目又は偽の目を無作為化した。対照の目に、負の対照として空のナノ粒子担体を注入した。処置対象の目を、局所的点眼剤に含まれるラノステロールで処置した（点眼薬の製剤に関しては以下を参照）。１滴５０ｍｌのラノステロールを、６週間にわたり試験対象の眼に毎日３回投与した。白内障重症度の程度をスリットランプにより調べ、６週間の処置期間の始めと終わりに撮影した。診察前に、１％のトロピカミド及び１０％のフェニレフリンにより瞳を拡大させた。白内障重症度の程度を盲検試験者が評価し、以下に示されるイヌの白内障段階に基づき採点した^３５。水晶体の清澄性及び透明度の改善を定量化した。Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を使用して、処置効果を評価した。

イヌの白内障の採点システム。グレード０：不透明化の不在（白内障無し）；Ｎグレード１：軽微な程度の不透明化（発生期）；Ｎグレード２：眼のほぼ全体に拡散した不透明化の存在（発達期）；Ｎグレード３：水晶体全体にわたる広範囲で濃い不透明化の存在（最盛期）。局所ビヒクル溶液。１．１ｌ（ｐＨ５．６６）の最終容量を達成するまで、再蒸留Ｈ_２Ｏを、０．０５５ｇのアルキルジメチルベンジルアンモニウム塩化物と組み合わされた１．１ｇの（ＥＤＴＡ）_２Ｎａに加えた。局所ビヒクル溶液中の２５ｍＭのラノステロール。１．１ｌの最終容量になるまで、再蒸留Ｈ_２Ｏを、１２．５ｇのラノステロール、１．１ｇの（ＥＤＴＡ）_２Ｎａ、０．０５５ｇのアルキルジメチルベンジルアンモニウム塩化物、及び２００ｍｌのＥｔＯＨの混合物に加えた。

１つの実施形態において、ラノステロール点眼薬溶液の製剤は以下の通りである：
レシピ
ビヒクルのみの溶液：
ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン １６５ｇ
ポリソルベート ８０１ｇ
ＥＤＴＡ２Ｎａ １．１ｇ
アルキルジメチルベンジルアンモニウム塩化物 ０．０５５ｇ
ＥｔＯＨ ２００ｍｌ
次に、最終容量が１．１Ｌ（ＰＨ５．６６）になるまで、ｄｄＨ２Ｏを加える。
ビヒクル溶液中の５ｍＭのラノステロール：
Ｌａｎｏｓｔｅｒｏｌ２．５ｇ
ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン １６５ｇ
ポリソルベート ８０１ｇ
ＥＤＴＡ２Ｎａ １．１ｇ
アルキルジメチルベンジルアンモニウム塩化物 ０．０５５ｇ
ＥｔＯＨ ２００ｍｌ
次に、最終容量が１．１Ｌ（ＰＨ５．６６）になるまで、ｄｄＨ２Ｏを加える。

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２４． Ｇｕ，Ｆ．ｅｔａｌ．ＡｎｏｖｅｌｍｕｔａｔｉｏｎｉｎＡｌｐｈａＡ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ（ＣＲＹＡＡ）ｃａｕｓｅｄａｕｔｏｓｏｍａｌ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｃａｔａｒａｃｔ ｉｎ ａ ｌａｒｇｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｆａｍｉｌｙ． Ｈｕｍ． Ｍｕｔａｔ． ２９， ７６９（２００８）．
２５． Ｌｉ， Ｘ．−Ｑ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｍｐａｉｒｉｎｇｔｈｅ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃＣ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ（ＣＲＹＧＣ） ｌｅａｄｓ ｔｏ ｃａｔａｒａｃｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ａｎｄ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｌｅｎｓ． Ｈｕｍ． Ｍｕｔａｔ． ３３， ３９１-４０１（２０１２）．
２６． Ｎａｇｉｎｅｎｉ，Ｃ．Ｎ．＆Ｂｈａｔ，Ｓ．Ｐ．Ｈｕｍａｎｆｅｔａｌｌｅｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｉｎｃｕｌｔｕｒｅ：ａｎｉｎｖｉｔｒｏ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｌｅｎｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ． Ｃｕｒｒ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ． ８， ２８５−２９１（１９８９）．
２７． Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．＆Ｄｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．Ａｒａｐｉｄｍｅｔｈｏｄｏｆｔｏｔａｌｌｉｐｉｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｃａｎ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ３７， ９１１-９１７（１９５９）．
２８． Ｗａｎｇ， Ｓ．， Ｌｅｎｇ， Ｘ．−Ｙ． ＆ Ｙａｎ， Ｙ．−Ｂ． Ｔｈｅ ｂｅｎｅｆｉｔｓ ｏｆ ｂｅｉｎｇ ｂ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｓ： ｂＢ１−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｂＡ３−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ ａｇａｉｎｓｔ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｃｏ−ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５０， １０４５１−１０４６１（２０１１）．
２９． Ｓｕｎ，Ｔ．−Ｘ．，Ｄａｓ，Ｂ．Ｋ．＆Ｌｉａｎｇ，Ｊ．Ｊ．Ｎ． Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｌｅｎｓ ａＡ− ａｎｄ ａＢ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２， ６２２０-６２２５（１９９７）．
３０． Ｂｒａｄｆｏｒｄ， Ｍ． Ｍ． Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｇｒａｍ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｙｅ ｂｉｎｄｉｎｇ． Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７２， ２４８-２５４ （１９７６）．
３１． Ｇｅｒａｌｄｉｎｅ，Ｐ．ｅｔａｌ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｏｆｓｅｌｅｎｉｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄｃａｔａｒａｃｔｏｇｅｎｅｓｉｓｂｙａｃｅｔｙｌ−Ｌ−ｃａｒｎｉｔｉｎｅ： ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓｔｕｄｙ． Ｅｘｐ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ． ８３， １３４０-１３４９（２００６）．
３２． Ｍａｋｒｉ，Ｏ．Ｅ．，Ｆｅｒｌｅｍｉ，Ａ．Ｖ．，Ｌａｍａｒｉ，Ｆ．Ｎ．＆Ｇｅｏｒｇａｋｏｐｏｕｌｏｓ， Ｃ． Ｄ． Ｓａｆｆｒｏｎ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｓｅｌｅｎｉｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃａｔａｒａｃｔｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｍｏｌ． Ｖｉｓ． １９， １１８８-１１９７（２０１３）．
３３． Ｚｈａｎｇ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｌｉｐｉｄ-ｐｏｌｙｍｅｒ ｈｙｂｒｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ： ａ ｒｏｂｕｓｔ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｐｌａｔｆｏｒｍ． ＡＣＳ Ｎａｎｏ ２， １６９６−１７０２（２００８）． Ｌａ Ｃｒｏｉｘ， Ｎ． Ｃａｔａｒａｃｔｓ： Ｗｈｅｎ ｔｏ ｒｅｆｅｒ． Ｔｏｐ． Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ Ａｎｉｍ Ｍｅｄ． ２３， ４６−５０（２００８）．
３４． Ｌａ Ｃｒｏｉｘ， Ｎ． Ｃａｔａｒａｃｔｓ： Ｗｈｅｎ ｔｏ ｒｅｆｅｒ． Ｔｏｐ．Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ Ａｎｉｍ Ｍｅｄ． ２３， ４６−５０（２００８）．

Claims (16)

1. 被験体の視覚障害を処置および／または予防するための薬物の調製のための組成物の使用であって、前記組成物は薬学的に許容可能な点眼用担体と薬学的に有効な量のラノステロールを含む、使用。
2. 前記被験体は眼の中の水晶体の標準構造に影響を与える視覚障害を有しているか、それを発症させる危険がある、請求項１に記載の使用。
3. 前記視覚障害は、白内障、先天性白内障、皮質の混濁、後嚢下白内障、老視、核硬化症、網膜変性障害、レフサム病、スミス−レムリ−オピッツ症候群、シュナイダー結晶状角膜ジストロフィー、ドルーゼン、加齢黄斑変性、および糖尿病性網膜症からなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
4. 前記ラノステロールはクリスタリンタンパク質凝集を阻害する、請求項１に記載の使用。
5. 被験体の白内障または盲目／視力低下を処置するための薬物の調製のための組成物の使用であって、前記組成物は、薬学的に許容可能な点眼用担体と薬学的に有効な量のラノステロールを含み、前記ラノステロールは前記被験体の眼の中の水晶体クリスタリンタンパク質凝集体を溶かす、使用。
6. 水晶体クリスタリンタンパク質は、α−クリスタリン、β−クリスタリン、またはγ−クリスタリンのいずれかである、請求項４に記載の使用。
7. 前記組成物は、点眼液、眼科用軟膏剤、点眼洗浄剤、眼内輸液、前眼房用の洗浄剤、内服薬、注射液、または抽出された角膜用の保存剤として処方される、請求項１−６のいずれか１つに記載の使用。
8. 前記被験体は、両生類、爬虫類、鳥類、および哺乳類からなる群から選択される、請求項１−６のいずれか１つに記載の使用。
9. 前記哺乳類は、げっ歯動物、ネコ、イヌ、ブタ、ウマ、およびヒトからなる群から選択される、請求項８に記載の使用。
10. クリスタリンタンパク質のアミロイド様原線維を溶解するための方法であって、クリスタリンタンパク質のアミロイド様原線維を溶かすために十分な量と時間で、ラノステロールにアミロイド様原線維を接触させる工程を含む、方法。
11. 前記方法はインサイツ、インビトロ、またはインビボで行われる、請求項１０に記載の方法。
12. 前記方法は被験体に対して行われる、請求項１０に記載の方法。
13. 前記被験体はヒトである、請求項１２に記載の方法。
14. 被験体の眼の標準構造に影響を与える視覚障害を処置するおよび／または予防するためのキットであって、該キットは、薬学的に有効な量のラノステロールの製剤、薬学的に許容可能な担体、前記障害を処置および／または予防するように前記製剤を投与するための説明書を含む、キット。
15. 被験体の視覚障害を処置するおよび／または予防するための点眼用医薬組成物であって、前記組成物は、薬学的に許容可能な点眼用担体と薬学的に有効な量のラノステロールを含む、点眼用医薬組成物。
16. 前記組成物は、点眼液、眼科用軟膏剤、点眼洗浄剤、眼内輸液、前眼房用の洗浄剤、内服薬、注射液、または抽出された角膜用の保存剤として処方される、請求項１５に記載の点眼用医薬組成物。