CN117177742A

CN117177742A - 溶酶体相关膜蛋白靶向化合物及其用途

Info

Publication number: CN117177742A
Application number: CN202280028492.8A
Authority: CN
Inventors: O·卡隆; M·E·韦伊
Original assignee: Ramot at Tel Aviv University Ltd; Hadasit Medical Research Services and Development Co
Current assignee: Ramot at Tel Aviv University Ltd; Hadasit Medical Research Services and Development Co
Priority date: 2021-02-16
Filing date: 2022-02-16
Publication date: 2023-12-05
Also published as: US20240139167A1; CA3211099A1; EP4294386A1; JP2024506702A; MX2023009586A; IL305226A; AU2022222591A1; KR20230175183A; BR112023016482A2; WO2022175948A1

Abstract

本文公开了一种多肽，其包括用于预防或治疗与溶酶体贮积相关的疾病和障碍和自噬失调相关疾病的药物组合物。还提供了结合溶酶体相关膜蛋白1(LAMP‑1)的N‑端结构域的区域的药剂，以及在有需要的受试者中治疗或预防与溶酶体贮积、多葡聚糖积累或异常糖原积累和自噬失调相关的疾病或障碍的发展的方法。

Description

溶酶体相关膜蛋白靶向化合物及其用途

与相关申请的交叉引用

本申请要求2021年2月16日提交的美国临时专利申请第63/149,730号的优先权利益，所述临时申请的内容整体通过引用并入本文。

技术领域

本发明属于预防和治疗与溶酶体贮积、多葡聚糖积累或异常糖原积累、异常蛋白质积累相关的某些疾病或障碍以及自噬失调相关疾病的领域，并属于筛选预防和治疗这些疾病的药剂的领域。

背景技术

溶酶体是负责细胞组成成分的生理周转的亚细胞细胞器。它们含有需要低pH环境才能发挥最佳作用的分解代谢酶类。溶酶体贮积病(LSD)描述了一组由数十种罕见遗传疾病组成的异质性疾病，这些疾病的特征在于未消化或部分消化的大分子的积累，最终导致细胞功能障碍和临床异常。LSD由一种或多种溶酶体酶的基因突变引起，导致酶底物在溶酶体中的积累。可能导致器官肿大、结缔组织和眼部病理以及中枢神经系统功能障碍。

神经损伤和神经退行性过程与溶酶体功能障碍有关，并代表了大多数LSD中的主要特点。神经病理可以发生在多个大脑区域(例如丘脑、皮层、海马体和小脑)中并涉及独特的时空变化，这通常涉及早期区域特异性神经变性和炎症。例如，在许多这些疾病中，浦肯野神经元(Purkinje neurons)退化，导致小脑共济失调。

糖原是一种分子量为900万至1000万道尔顿的支链多糖。糖原分子平均含有约55000个由α-1,4糖苷键(92％)和α-1,6(8％)糖苷键连接的葡萄糖残基。糖原的合成由两种酶催化：(i)糖原合成酶，它“串联”葡萄糖形成线性链；和(ii)糖原分支酶(GBE)，其将葡萄糖单元的新的短分支以α-1,6糖苷键附连到线性链上。糖原主要储存在肝脏和肌肉中，在那里它代表着一种可以快速调动的能量储备。最常见的糖原代谢障碍见于糖尿病中，其中胰岛素量异常或胰岛素响应异常导致肝糖原的积累或耗尽。尽管糖原的合成和分解已经研究了几十年，但它们的控制还不完全清楚。

成人多葡聚糖体病(APBD)是一种糖原贮积病(GSD)，表现为从45-50岁开始的衰弱和致命性进行性轴突病性脑白质营养不良。APBD的进一步特征是周围神经病变、自主神经功能障碍、尿失禁和偶尔的痴呆，所有这些都是这种通常被误诊且广泛异质性疾病的重要诊断标准。APBD由糖原分支酶(GBE)缺乏引起，产生支化不良并因此不溶的糖原(多葡聚糖，PG)，它们沉淀、聚集并积累成PG体(PB)。PB在溶液外聚集，不能被糖原磷酸化酶消化。积聚的聚集体导致儿童肝衰竭和死亡(Andersen病；IV型GSD)。GBE的更轻度突变例如APBD中的p.Y329S导致更小的PB，它不干扰肝细胞和大多数其他细胞类型，只是在细胞侧面积累。然而，在神经元和星形胶质细胞中，随着时间的推移，PB堵塞轴突和突起的狭小空间，并导致APBD。

虽然目前缺少并迫切需要治愈APBD的有效方法，但APBD代表了更大的一组GSD。GSD是一组由15种不治之症组成的广泛疾病，结合频率为20000-43000分之一。从儿童肝脏障碍如GSD1到青少年肌阵挛性癫痫如拉福拉病(Lafora Disease)(LD)再到成人进行性神经变性障碍如APBD，所有GSD目前都无法治愈。对用于溶酶体贮积病和糖原贮积病的疗法、药剂和改进的相关诊断方法，仍存在着需求。

发明内容

在本发明的一个方面，提供了一种药物组合物，其用于预防或治疗选自溶酶体贮积相关疾病和自噬失调相关疾病的疾病或障碍，所述药物组合物包含一种化合物、其药学上可接受的盐、异构体或互变异构体，其中所述化合物由式I表示：

其中：

表示单键或双键；

n和m各自独立地表示1至3范围内的整数；

R和R¹各自独立地表示氢或不存在；并且

R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷和R⁸各自独立地表示氢或选自取代或未取代的烷基、环烷基、烷氧基、羟基、硫代羟基、硫代烷氧基、芳基氧基、硫代芳基氧基、氨基、硝基、卤素、三卤甲基、氰基、酰胺、羧基、磺酰基、磺氧基、亚磺酰基、磺酰胺。

在某些实施方案中，n和m是1。

在某些实施方案中，R²、R⁷和R⁸表示甲基。

在某些实施方案中，所述化合物选自：

或两者。

在某些实施方案中，所述溶酶体贮积相关疾病选自戈谢病(Gaucher disease)、法布里病(Fabry disease)、泰-萨二氏病(Tay-Sachs disease)、粘多糖(MPS)病、天冬氨酰葡糖胺尿症(aspartylglucosaminuria)、GM1神经节苷脂沉积症、克腊伯氏病(球形细胞性脑白质营养不良症或半乳糖神经酰胺脂沉积症)(Krabbe)、异染性脑白质营养不良症(Metachromatic leukodystrophy)、桑霍夫病(Sandhoff disease)、II型粘脂贮积病(I细胞病)、IIIA型粘脂贮积病(假Hurler性多发性营养不良)、C2型和C1型尼曼匹克病(Niemann-Pick disease type C2 and Cl)、Danon病、游离唾液酸贮积病、IV型粘脂贮积病和多发性硫酸酯酶缺乏症(MSD)、代谢障碍、肥胖症、II型糖尿病和胰岛素抗性(insulinresistance)。

在某些实施方案中，所述自噬失调相关疾病的特征在于自噬活性降低或失调。在某些实施方案中，所述以自噬活性降低或失调为特征的自噬失调相关疾病选自阿兹海默氏病和与自噬活性降低相关的癌症。

在本发明的另一方面，提供了一种用于在有需要的受试者中治疗或预防选自溶酶体贮积相关疾病和自噬失调相关疾病的疾病或障碍的发展的方法，所述方法包括向所述受试者给药治疗有效量的本发明的药物组合物。

在本发明的另一方面，提供了一种药剂，其结合溶酶体相关膜蛋白1(LAMP-1；SEQID NO：1；FSVNYDTKSGPKNMTFDLPSDATVVLNRSSCGKENTSDPSLVIAFGRG HTLTLNFTRNATRYSV)的N-端结构域的区域，其中所述区域包含下述任一者：SEQ ID NO：2(FSVNYD)；和SEQ ID NO：3(NVTV)。

在某些实施方案中，所述药剂抑制LAMP1:LAMP1相互作用。

在某些实施方案中，所述药剂用于预防或治疗与溶酶体贮积、多葡聚糖积累或异常糖原积累相关的疾病或障碍。在某些实施方案中，所述药剂用于预防或治疗自噬失调相关疾病。

在某些实施方案中，所述疾病或障碍选自糖原贮积病(GSD)、成人多葡聚糖体病(APBD)、and拉福拉病、戈谢病、法布里病、泰-萨二氏病、粘多糖(MPS)病、天冬氨酰葡糖胺尿症、GM1神经节苷脂沉积症、克腊伯氏病(球形细胞性脑白质营养不良症或半乳糖神经酰胺脂沉积症)、异染性脑白质营养不良症、桑霍夫病、II型粘脂贮积病(I细胞病)、IIIA型粘脂贮积病(假Hurler性多发性营养不良)、C2型和C1型尼曼匹克病、Danon病、游离唾液酸贮积病、IV型粘脂贮积病和多发性硫酸酯酶缺乏症、代谢障碍、肥胖症、II型糖尿病和胰岛素抗性。

在某些实施方案中，所述药剂选自：

在本发明的另一方面，提供了一种药物组合物，其包含本发明的药剂和药学上可接受的载体。

在某些实施方案中，所述药物组合物在溶液中具有4至6.5之间的pH。

在某些实施方案中，所述药物组合物包含100nM至5mM的所述药剂。

在本发明的另一方面，提供了一种用于在有需要的受试者中治疗或预防与溶酶体贮积、多葡聚糖积累或异常糖原积累相关的疾病或障碍和自噬失调相关疾病的发展的方法，所述方法包括向所述受试者给药治疗有效量的本发明的药物组合物。

在本发明的另一方面，提供了一种用于确定化合物对预防或治疗与溶酶体贮积、多葡聚糖积累或异常糖原积累相关的疾病或障碍和自噬失调相关疾病的适合性的方法，所述方法包括将所述化合物与溶酶体相关膜蛋白1(LAMP-1；SEQ ID NO：1)的N-端结构域内的口袋结构域接触，其中所述化合物与所述口袋的结合指示了所述化合物在治疗所述疾病或障碍中有效。

在某些实施方案中，所述结合是与下述一者或多者的结合：SEQ ID NO：2(FSVNYD)；和SEQ ID NO：3(NVTV)。

在某些实施方案中，所述结合通过LAMP1:LAMP1相互作用的抑制来确定。

在某些实施方案中，所述结合通过LAMP1间相互作用的抑制来确定。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实施方案的实践或测试中可以使用与本文所述的相似或等效的方法和材料，但下文将描述示例性方法和/或材料。在有冲突的情况下，以包括定义在内的本专利说明书为准。此外，所述材料、方法和实例仅为说明性的，并非打算必然是限制性的。

从下文给出的详细描述，本发明的其他实施方案和全部适用范围将变得显而易见。然而，应当理解的是，所述详细描述和具体实例尽管指示了本发明的优选实施方案，但仅仅是通过说明的方式给出的，因为从该详细描述，本发明的精神和范围之内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。

附图说明

图1A-1M包括化合物1的化学结构(1A)，基于每周两次用250mg/kg化合物1(144DG11)治疗的17只动物(n＝17)与用5％ DMSO载体治疗的9只动物(n＝9)相比的Kaplan-Meier生存曲线的图(1B)(对数秩(log-rank)检验p-值<0.000692)，重量曲线图(以g为单位)(1C)，野外运动中的平均持续时间的图(1D)，以及如所示在用载体治疗野生型(n＝8)小鼠和用载体(n＝8)或化合物1(n＝9)治疗Gbe^ys/ys小鼠后伸展反射(在从尾部抓住动物后后爪打开的程度)随时间变化的图(1E-1F)；运动热图的图片(上图，基于n＝9，9月龄雌性的平均值)，示出了野外表现实验的定量(1G)，下图示出了来自于单个动物的视觉跟踪实例。wt.，作为对照的未治疗的野生型动物；tg治疗的，用化合物1治疗的Gbe^ys/ys(转基因)小鼠；tg，用载体治疗的APBD小鼠，来自于每组n＝9只9月龄雌性小鼠的步态分析(步幅长度)的图(1H)；示出了平均(+/-s.d.)步幅长度；野外运动曲线中的平均持续时间的图(1I)，重量(以g为单位)曲线图(1J)，以及呈现了在6月龄时(发病时)在如所示用载体或化合物1治疗Gbe^ys/ys小鼠后伸展反射随时间变化的曲线的图(1K)。在拍照前用载体(1L)或化合物1(1M)治疗3个月的7月龄Gbe^ys/ys小鼠的照片。

图2A-2C包括了化合物1的组织病理学影响及其药代动力学的图像和图：右图呈现了牺牲小鼠的指定组织并在用淀粉糖化酶处理后用PAS对PG进行染色(箭头)的图像；左图呈现了在n＝2个野生型、n＝7个Gbe^ys/ys载体治疗的和n＝9个化合物1治疗的小鼠中，基于来自于每种组织的4个切片的分析，定量了PAS染色的条形图(2A)；定量了相应组织中的总糖原的条形图(2B)；化合物1的药代动力学的图(2C)；将9月龄Gbe^ys/ys小鼠以250mg/kg的剂量用150μL化合物1SC注射。在注射后3min、60min、90min和210min将小鼠处死，取出指定组织并抽取200μL血清。图示出了通过LC-MS/MS确定的不同组织中的化合物1水平。示出了在每个时间点从n＝3只小鼠获得的结果的平均值和SEM。重复测量双向ANOVA检验显示每种组织的药代动力学曲线明显不同于所有其他组织(p<0.05)。*，通过Student’s t-检验确定的显著差异(p<0.05)。

图3A-3I包括了化合物1对体内代谢的影响的图；在24hr时段内通过Promethion高清行为表型分型系统(Sable Instruments,Inc.)监测小鼠。有效质量以0.75的幂计算。数据是来自于野生型对照载体组中的n＝11只9月龄小鼠、GBE^ys/ys载体组中的n＝6只9月龄小鼠和Gbe^ys/ys 144DG11(化合物1)治疗组中的n＝7只9月龄小鼠的平均值±SEM。所有注射均从4月龄开始。与野生型对照相比，未治疗的GBE^ys/ys小鼠表现出较低的呼吸商(在光照下)(3A)、总能量消耗(TEE)(3B)和脂肪氧化(3C)。不受疾病状态显著影响的碳水化合物氧化和步行活动被化合物1增加，甚至超过了野生型对照水平(3D-3E)；与野生型对照相比，化合物1还逆转了在Gbe^ys/ys小鼠中观察到的食量和饮水量的减少(3F-3H)。基于如所示治疗的n＝5只9.5月龄小鼠的血液代谢检查(3I)。化合物1使Gbe^ys/ys细胞中的血糖升高，并且血液甘油三酯降低(p<0.05，Student’s t-检验)。*与野生型对照相比p<0.05，#与GBE^ys/ys载体治疗的小鼠相比p<0.05。

图4A-4D包括来自于不同APBD患者的皮肤成纤维细胞中总糖原的PAS染色的条形图(4A)，葡萄糖饥饿48h(左)或葡萄糖饥饿然后最后24h补充葡萄糖以诱导糖原负荷(右)的APBD87成纤维细胞中总糖原的PAS染色的图像(4B)，图像采集通过Nikon Eclipse Ti2显微镜，使用40×PlanFluor物镜和CY3滤光片进行；APBD成纤维细胞在如4B中所示48h葡萄糖饥饿或饥饿和葡萄糖补充下的基于图像的多参数表型分型的图(4C)，显著性水平p＝0.01；以及通过Agilent’s Seahorse机器和ATP速率测定试剂盒确定的糖酵解和线粒体ATP产生的条形图(4D)。健康对照(HC)和APBD患者的成纤维细胞未被处理或用10μM化合物1处理48h(慢性)或在测定中处理20min(急性)。将读数归一化到通过结晶紫染色确定的细胞数。示出了基于n＝6个重复实验的平均值和SD值。

图5A-5E包括示出了如实验1-3中形成的液态晶体所示，异源组装体在化合物1周围而不是内源分子周围形成的实验的图像(5A)；在化合物1的相互作用组水平上靶的STRING网络的图像(5B)；化合物1异源组装体的不同靶的细胞热漂移测定(CETSA)(5C)；化合物1与LAMP1结合的表面等离子体共振传感图(5D)；然后进行由在所指示的浓度范围和pH值下的结合和解离组成的传感图实验。结果显示LAMP1与化合物1的剂量响应性结合在pH 6时开始，在pH 5时是部分的，并且在溶酶体pH 4.5-5时被清楚地证实；根据通过SiteMap、fPocket和FtSite预测的LAMP1网格，化合物1的三种结合模式的图像(5E)。

图6A-6E包括通过脂质化与非脂质化LC3比率(LC3II/LC3I)的溶酶体抑制剂依赖性增加的程度确定的自噬通量的条形图(6A)；来自于用化合物11或5％ DMSO载体处理的9.5月龄Gbe^ys/ys小鼠的肝组织的代表性TEM图像(6B)，G：糖原(α颗粒)和多葡聚糖(具有可变电子密度的结构)，L：溶酶体，M：线粒体；右图：通过ImageJ“计数粒子”工具定量的溶酶体糖原染色；用或不用化合物1和溶酶体抑制剂(LI)处理或不处理的LAMP1敲除和对照APBD原代皮肤成纤维细胞的显微照片以及3个实验的定量和Student’s t-检验的结果。*，p<0.1；**，p<0.05；***，p<0.01(6C)；在用编码GFP或GFP-shLAMP1的慢病毒转导并用或不用化合物1处理24h的APBD原代成纤维细胞中确定的溶酶体pH变化的图，和用Lysosensor处理并进行PAS染色的细胞的共聚焦显微镜图像(6D)；以及在用化合物1处理24h(慢性)或在测定中处理(急性)的LAMP1-KD和GFP(对照)细胞中的ATP产生速率测定的条形图(6E)。

图7A-7F包括HC和APBD成纤维细胞中的IBP参数的图，以及作为对x轴上指示的不同变量(细胞特点)进行的随机森林分类的输出的变量重要性图。随机森林分析表明，APBD和HC细胞群体以93％的置信水平分开(7A)；n＝5HC和n＝5APBD患者皮肤成纤维细胞的多参数细胞表型表征的图：所示细胞特点与HC的偏离程度，按偏离量排序(-log(P值))。值高于虚线(框)的特点表现出与HC偏离，p值<0.01。示出了所分析的不同比较(化合物A＝化合物1)(7B)；通过IBP分析的APBD和HC细胞中受化合物1影响的溶酶体参数的条形图(7C)；在饥饿和糖原负荷条件下受APBD和化合物1影响的蛋白质的火山图(7D)；在饥饿(48)和糖原负荷(48+24)条件下被APBD下调并被化合物1上调以及正好相反的蛋白质的维恩图(7E)；以及被化合物1上调(左)和下调(右)的蛋白质的基因本体(7F)。

图8包括计算机ADMET(吸收、分布、代谢和排泄毒性)相容性降低多葡聚糖的化合物；三种不同ADMET算法的分析。

图9包括ADMET不相容性化合物(图8中的88095528)在Gbe^ys/ys小鼠中引起伤口的结果的图像。

图10包括用化合物1治疗3个月的野生型C57Bl6J小鼠的体重图。每周两次向小鼠注射150μL浓度为250mg/kg的于5％ DMSO中的化合物1或等体积的5％ DMSO(V，载体)对照。第一个月静脉内注射，随后2个月皮下注射。

图11包括用化合物1治疗3个月的野生型C57Bl6J小鼠的大脑、肝脏、骨骼肌和心脏组织切片的图像。切片通过H&E染色进行染色以观察病变。在任一种治疗中均无明显病变。比例尺：500μm(大脑)，100μm(肝脏)，200μm(肌肉)，100μm(心脏)。

图12A-12B包括在短(24h)或长(72h)透析后通过用QC胶体考马斯染色剂(#1610803，Bio-Rad)染色的15％ SDS-PAGE迁移率变动凝胶测试的LAMP1和RNase B的糖基化状态的显微照片(12A)；以及显示在脱糖基化LAMP1-Nter蛋白(degLAMP1-Nt)与化合物11之间不存在相互作用的传感图(12B)。

图13A-13B包括在LAMP1的N-端结构域和LAMP1 N-端：LAMP1 N-端蛋白质：蛋白质对接计算中化合物1的预测结合位点的图像(13A)，以及溶酶体膜(LM)、LAMP1、LAMP2和潜在抑制剂化合物1的示意图(13B)。

图14A-14B包括在存在10^-6M化合物1和OKMW-XXC(阴性对照)的情况下，在APBD患者成纤维细胞(14A)或HC成纤维细胞(14B)上通过获得的异源组装体(圆圈)的图像。每个实验进行一式三份。在不添加任何化合物的情况下获得技术阴性对照。每张图片代表96孔板的一个孔。

图15包括显微照片和垂直条形图，示出了血清饥饿并用(或未用)50μM 144DG11(标为化合物A)处理的PD患者来源的皮肤成纤维细胞中的自噬通量。

图16包括荧光显微照片和垂直条形图，示出了用144DG11(50μM，24h)处理PD初代成纤维细胞显著降低PAS染色(洋红色)，指示糖原减少。黄色，用于细胞分割的钙黄绿素，蓝色，DAPI核染色。中图显示了血清饥饿并用(或未用)50μM 144DG11(标为化合物A)处理的PD患者来源的皮肤成纤维细胞中的分割自噬通量的定量。

图17包括垂直条形图，示出了通过Agilent’s Seahorse机器和ATP速率测定试剂盒确定的糖酵解(1)和线粒体(2)ATP生产。将HC和PD患者成纤维细胞血清/葡萄糖饥饿48h，然后在没有(未处理)或具有(慢性)50μM 144DG11的情况下补充全培养基24h。急性，在补充血清/葡萄糖24h后，在20min的测定中添加50μM 144DG11。将读数归一化到通过结晶紫染色确定的细胞数。示出了基于n＝6个重复实验的平均值和SD值。在急性144DG11处理的PD成纤维细胞中，与未处理的PD细胞相比糖酵解和总ATP生产增加(p<0.002，单向ANOVA和Sidak的多重比较事后校正)。

图18包括垂直条形图，示出了基于n＝5-6只按指示治疗3个月的6月龄野生型或Agl^-/-小鼠的血液代谢检查。血液甘油三酯被144DG11降低，表明高脂血症的校正。*p<0.049，**p<0.004(t-检验)。

图19A-19B包括示出了通过CD11b磁珠从AD模型5XFAD小鼠的大脑分离的小神经胶质细胞的荧光显微照片。然后将小神经胶质细胞与(处理的)或不与(未处理的)50μM144DG11温育24h，固定并均如所示对自噬底物LC3(19A)和p62(19B)进行染色并通过PAS对糖原进行染色。LC3和p62两者水平的降低表明诱导了降解这些底物的自噬。

图20A-20B包括示出了原发性非小细胞肺癌的荧光显微照片。与19A-19B相同，对细胞进行处理并对自噬底物LC3(20A)和p62(20B)进行染色。

图21包括垂直条形图，显示了将源自于Gsd1a患者的皮肤成纤维细胞用溶剂或50μM化合物A处理24h，并通过Promega试剂盒分析NAD+/NADH比率(左图)，通过western免疫印迹分析Sirt1(中图)和p62(右图)表达。

具体实施方式

本发明涉及一种药物组合物，其用于预防或治疗与溶酶体贮积相关的疾病或障碍。

本发明还涉及一种药物组合物，其用于预防或治疗与多葡聚糖积累或异常糖原积累相关的疾病或障碍。

本发明还涉及一种药物组合物，其用于预防或治疗与异常蛋白质积累相关的疾病或障碍。

本发明还涉及一种药物组合物，其用于预防或治疗自噬失调相关疾病。本发明还涉及一种药物组合物，其用于预防或治疗与自噬减少相关的疾病或障碍。

本发明还涉及一种药剂，其结合溶酶体相关膜蛋白1(LAMP-1)的N-端结构域的区域。

本发明还涉及一种用于在有需要的受试者中治疗或预防与溶酶体贮积、多葡聚糖积累或异常糖原积累相关的疾病或障碍的发展的方法。

根据某些实施方案，本发明提供了一种化合物、其药学上可接受的盐、异构体或互变异构体，其用于预防或治疗选自溶酶体贮积相关疾病和自噬失调相关疾病的疾病或障碍，其中所述化合物由式I表示：

其中：

表示单键或双键；n和m各自独立地表示1至3范围内的整数；R和R¹各自独立地表示氢或不存在；并且R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷和R⁸各自独立地表示氢或选自取代或未取代的烷基、环烷基、烷氧基、羟基、硫代羟基、硫代烷氧基、芳基氧基、硫代芳基氧基、氨基、硝基、卤素、三卤甲基、氰基、酰胺、羧基、磺酰基、磺氧基、亚磺酰基、磺酰胺。

在某些实施方案中，R或R¹中的任一者表示氢。在某些实施方案中，R是氢并且R¹不存在。在某些实施方案中，R¹是氢并且R不存在。

在某些实施方案中，n和m是1。

在某些实施方案中，R²、R⁷和R⁸表示甲基。

在某些实施方案中，所述化合物选自：

或两者。

根据某些实施方案，本发明提供了一种用于预防或治疗选自溶酶体贮积相关疾病和自噬失调相关疾病的疾病或障碍的药物组合物，所述药物组合物包含化合物、其药学上可接受的盐、异构体或互变异构体，其中所述化合物由如上所述的式I表示。

根据某些实施方案，本发明提供了一种药物组合物，其用于预防或治疗选自与溶酶体贮积相关的障碍、肥胖症、II型糖尿病和胰岛素抗性的疾病，所述药物组合物包含化合物、其药学上可接受的盐、异构体或互变异构体，其中所述化合物由如上所述的式I表示。

在某些实施方案中，与溶酶体贮积相关的疾病或障碍是指与溶酶体酶不能分解积累的底物、溶酶体膨胀、溶酶体爆裂、溶酶体信号转导受损或其任何组合相关的疾病或障碍。

在某些实施方案中，所述药物组合物用于预防或治疗与溶酶体酶不能分解积累的底物相关的疾病或障碍。在某些实施方案中，所述药物组合物用于预防或治疗与溶酶体膨胀相关的疾病或障碍。在某些实施方案中，所述药物组合物用于预防或治疗与溶酶体爆裂(导致有毒内容物溢出到胞质溶胶中)相关的疾病或障碍。

在某些实施方案中，所述与溶酶体贮积相关的疾病或障碍选自戈谢病、法布里病、泰-萨二氏病、粘多糖(MPS)病、天冬氨酰葡糖胺尿症、GM1神经节苷脂沉积症、克腊伯氏病(球形细胞性脑白质营养不良症或半乳糖神经酰胺脂沉积症)、异染性脑白质营养不良症、桑霍夫病、II型粘脂贮积病(I细胞病)、IIIA型粘脂贮积病(假Hurler性多发性营养不良)、C2型和C1型尼曼匹克病、Danon病、游离唾液酸贮积病、IV型粘脂贮积病和多发性硫酸酯酶缺乏症和代谢障碍。

术语“溶酶体贮积”、“溶酶体贮积病”和“溶酶体贮积障碍”(LSD)在本文中可互换使用，是指一组以溶酶体功能障碍和神经变性为特征的遗传疾病。这些疾病通常由单基因缺陷造成：通常分解糖胺聚糖(GAG)所需的特定酶的缺乏使细胞无法排出糖类残基，从而使其在细胞的溶酶体中积累。这种积累破坏了细胞的正常功能，并导致LSD的临床表现。与溶酶体贮积相关的疾病或障碍的非限制性实例包括神经鞘脂病、神经酰胺酶(例如Farber病、克拉伯病)、半乳糖唾液酸贮积病、神经节苷脂贮积病包括α-半乳糖苷酶(例如法布里病(α-半乳糖苷酶A)、辛德勒病(α-半乳糖苷酶B))、β-半乳糖苷酶(例如GM1神经节苷脂贮积病、GM2神经节苷脂贮积病、桑霍夫病、泰-萨二氏病)、脑苷脂贮积病(例如戈谢病(I型、II型、III型)、鞘磷脂酶(例如溶酶体酸性脂肪酶缺乏症、尼曼匹克病)、脑硫脂贮积病(例如异染性脑白质营养不良症、多发性硫酸脂酶缺乏症)、粘多糖贮积病(例如I型(MPS I(Hurler综合征、MPS I S Scheie综合征、MPS I H-S Hurler-Scheie综合征)、II型(Hunter综合征)、III型(Sanfilippo综合征)、IV型(Morquio)、VI型(Maroteaux-Lamy综合征)、VII型(Sly综合征)、IX型(透明质酸酶缺乏症))、粘脂贮积病(例如I型(唾液酸贮积病)、II型(I-细胞病)、III型(伪Hurler多营养不良症/磷酸转移酶缺乏症)、IV型(mucolipidin1缺乏症))、脂贮积病(例如尼曼匹克病)、神经元蜡样脂褐质沉积症(例如1型Santavuori-Haltia病/婴儿NCL(CLN1 PPT1))、2型Jansky-Bielschowsky病/迟发性婴儿NCL(CLN2/LINCL TPP1)、3型Batten-Spielmeyer-Vogt病/青少年NCL(CLN3)、4型Kufs病/成人NCL(CLN4)、5型芬兰变体/迟发性婴儿(CLN5)、6型迟发性婴儿变体(CLN6)、7型CLN7、8型北部癫痫(CLN8)、8型土耳其迟发性婴儿(CLN8)、9型德国/塞尔维亚迟发性婴儿、10型先天性组织蛋白酶D缺乏症(CTSD))、沃尔曼病、寡醣症(例如α-甘露糖贮积病、β-甘露糖贮积病、天冬氨酰葡糖胺尿症、岩藻糖贮积病)、溶酶体转运疾病(例如胱氨酸病、致密成骨不全症、Salla病/唾液酸贮积病、婴儿游离唾液酸贮积病)、II型庞贝病、lib型Danon病)、胆固醇酯贮积病等。

在某些实施方案中，由式1表示的化合物、其药学上可接受的盐、异构体或互变异构体在预防或治疗与溶酶体贮积相关的疾病或障碍中的用途不包括或排除糖原贮积病(GSD)或与其相关的病症。在某些实施方案中，由式1表示的化合物、其药学上可接受的盐、异构体或互变异构体在预防或治疗与溶酶体贮积相关的疾病或障碍中的用途不包括或排除GSD IV型、GSD VII型、APDB或其任何组合。

在某些实施方案中，由式1表示的化合物、其药学上可接受的盐、异构体或互变异构体在预防或治疗与溶酶体贮积相关的疾病或障碍中的用途不包括或排除糖原贮积病(GSD)相关的神经变性疾病。

根据某些实施方案，本发明提供了一种用于在有需要的受试者中治疗或预防与溶酶体贮积相关的疾病或障碍的发展的方法，所述方法包括向所述受试者给药治疗有效量的上文描述的药物组合物。

在某些实施方案中，治疗有效量是有效减缓溶酶体贮积疾病或障碍的进展、停止或逆转与其相关的蛋白质积累/聚集的量。在某些实施方案中，治疗有效量是有效减缓多葡聚糖积累或异常糖原积累的进展、停止或逆转多葡聚糖积累或异常糖原积累的量。在某些实施方案中，治疗有效量是有效提高自噬活性的量。

在某些实施方案中，治疗有效量是有效改善与溶酶体贮积病相关的病理的一种或多种症状和/或减轻与溶酶体贮积病相关的神经变性和/或神经炎症的量。

另一方面，本发明提供了一种治疗或预防与自噬活性降低或失调相关的疾病或障碍的发展的方法。

在某些实施方案中，所述自噬失调相关疾病是由错误折叠的蛋白质聚集体引起的疾病。在这一方面的另一个实施方案中，所述由错误折叠的蛋白质聚集体引起的疾病选自阿兹海默氏病(Alzheimer's disease)、帕金森氏症、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿病(Huntington's disease)、脊髓小脑共济失调、眼咽肌营养不良、朊病毒病、致命性家族性失眠症、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、齿红-苍白球萎缩、额颞叶痴呆、进行性核上性麻痹、x连锁脊髓延髓肌萎缩和神经元核内透明质包涵体病。

术语“自噬失调相关疾病”还包含任何疾病或障碍，其包括但不限于癌症、心血管、神经变性、代谢、肺、肾、感染性、肌肉骨骼和眼部障碍，其中自噬的诱导将有助于延迟与所述疾病或障碍相关的一种或多种症状的发作、减缓、停止或逆转其进展。

术语“自噬失调相关疾病”还包括癌症，例如其中自噬的诱导将抑制细胞生长和分裂，减少突变，去除被活性氧物质破坏的线粒体和其他细胞器或杀死正在发育的肿瘤细胞的任何癌症。术语“自噬失调相关疾病”还包括精神疾病或障碍，例如其中自噬的诱导将有助于延迟与所述精神疾病或障碍相关的一种或多种症状的发作，减缓、停止或逆转其进展的任何精神疾病或障碍。在一个实施方案中，所述精神疾病或障碍选自精神分裂症和双相情感障碍。

一方面，本发明公开了一种在细胞中诱导自噬的方法，所述方法包括将所述细胞与能够在所述细胞中诱导自噬的有效量的本发明的药物组合物接触。

在一个实施方案中，所述细胞存在于受试者中。在另一个实施方案中，所述细胞存在于体外细胞培养物中。所述细胞的非限制性实例是神经细胞、神经胶质细胞例如星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、施旺细胞、淋巴细胞、上皮细胞、内皮细胞、淋巴细胞、癌细胞和造血细胞。

术语“自噬”是指涉及细胞自身组分例如长寿蛋白、蛋白质聚集体、细胞器、细胞膜、细胞器膜和其他细胞组分的降解的分解代谢过程。自噬的机制可能包括：(i)在细胞的靶区域周围形成膜，将内容物与细胞质的其余部分分离开，(ii)得到的囊泡与溶酶体融合，随后降解囊泡内容物。

在某些实施方案中，提供了一种用于减少神经变性、减少神经炎症、减缓进展或减少记忆缺陷、减少异常溶酶体尺寸、重新激活自噬通量或其任何组合的方法，所述方法包括向所述受试者给药治疗有效量的上述药物组合物。

在某些实施方案中，所述方法包括在患有其中自噬被扰乱的疾病或障碍的受试者中重新激活自噬通量。在某些实施方案中，所述方法包括在患有如本文所公开的LDS的受试者中重新激活自噬通量。在某些实施方案中，所述方法包括在患有庞贝病的受试者中重新激活自噬通量。在某些实施方案中，所述癌症是与自噬活性降低相关的癌症。

在某些实施方案中，提供了一种用于改善选自脑白质营养不良、脊柱侧弯、肝脾肿大、精神运动功能减退和鱼鳞病的一种或多种症状，和/或延迟这些症状中的一者或多者的发作，减缓、停止或逆转这些症状中的一者或多者的进展的方法。

在某些实施方案中，通过溶酶体贮积病的遗传标志物的存在将所述受试者鉴定为患有溶酶体贮积病。

在某些实施方案中，给药在出生后1个月、出生后2个月、出生后3个月、出生后6个月、出生后1年或出生后3年内进行，包括其间的任何值。每种可能性代表本发明的独立实施方案。

在某些实施方案中，如上所述的化合物和药物组合物能够抑制和/或调节一种或多种蛋白质的聚集，和/或促进蛋白质原纤维或其他蛋白质聚集体的解聚，或两者兼有。在某些实施方案中，如上所述的化合物和药物组合物能够抑制和/或调节一种或多种淀粉样生成蛋白(例如a-突触核蛋白、Ab、tau等中的一者或多者)的聚集，和/或促进淀粉样蛋白原纤维或其他淀粉样蛋白聚集体的解聚，或两者兼有。

溶酶体膜蛋白1(LAMP1)靶向药剂

根据某些实施方案，本发明提供了一种药剂，其结合溶酶体相关膜蛋白1(LAMP-1；SEQ ID NO：1；FSVNYDTKSGPKNMTFDLPSDATVVLNRSSCGKENTSDPSLVIAFGRGHTLTLNFTRNATRYSV)的N-端结构域的区域。

本文所使用的LAMP1是指具有UniProt登记号P11279的溶酶体相关膜糖蛋白1。在某些实施方案中，所述LAMP1具有SEQ ID NO：4中阐述的氨基酸序列(MAAPGSARRPLLLLLLLLLLGLMHCASAAMFMVKNGNGTACIMANFSAAFSVNYDTKSGPKNMTFDLPSDATVVLNRSSCGKENTSDPSLVIAFGRGHTLTLNFTRNATRYSVQLMSFVYNLSDTHLFPNASSKEIKTVESITDIRADIDKKYRCVSGTQVHMNNVTVTLHDATIQAYLSNSSFSRGETRCEQDRPSPTTAPPAPPSPSPSPVPKSPSVDKYNVSGTNGTCLLASMGLQLNLTYERKDNTTVTRLLNINPNKTSASGSCGAHLVTLELHSEGTTVLLFQFGMNASSSRFFLQGIQLNTILPDARDPAFKAANGSLRALQATVGNSYKCNAEEHVRVTKAFSVNIFKVWVQAFKVEGGQFGSVEECLLDENSMLIPIAVGGALAGLVLIVLIAYLVGRKRSHAGYQTI)。

在某些实施方案中，所述药剂结合选自下述任一者的LAMP1的至少一个区域：SEQID NO：2(FSVNYD)和SEQ ID NO：3(NVTV)，或其同源物。

在某些实施方案中，所述药剂结合选自LAMP-1(即SEQ ID NO：4)的残基F50-D55、N62、L67、F118、Y120-L122、T125、L127-S133、N164-V166的氨基酸残基。在某些实施方案中，所述药剂结合选自LAMP-1(即SEQ ID NO：4)的残基F50-D55、N62、L67、F118、Y120-L122、T125、L127-S133、N164-V166的氨基酸残基的组合。

本文所使用的SEQ ID NO：2(FSVNYD)和SEQ ID NO：3(NVTV)的同源物是指具有至少一个突变(例如替换)，但所述药剂仍可结合LAMP-1(SEQ ID NO：1)的N-端结构域的口袋区并提供所需的生物或药物效果(例如阻碍或抑制LAMP1:LAMP1相互作用或抑制LAMP1间相互作用)。

在某些实施方案中，LAMP-1的N-端结构域的区域是口袋。

鉴定口袋的非限制性实例包括被SiteMap、FtSite或fPocket利用的下述算法。在某些实施方案中，口袋使用SiteMap、FtSite或fPocket程序来鉴定。

本文所使用的术语“口袋”是指蛋白质分子表面中的空腔、缩进或凹陷，其作为肽链折叠成使蛋白质具有功能的三维结构的结果而产生。口袋可以通过检查蛋白质结构和/或通过使用可商购的建模软件容易地识别。

本文所使用的术语“药剂”是指能够进入如上所述的蛋白质口袋和/或与其结合的任何小有机分子。

本文所使用的术语“小有机分子”是指尺寸与通常用于制药的有机分子可比的分子。所述术语排除了天然生物大分子(例如蛋白质、核酸等)。在某些实施方案中，有机分子具有高达5,000Da、高达2,000Da或高达1,000Da的尺寸，包括其间的任何值。每种可能性代表本发明的独立实施方案。

在某些实施方案中，所述药剂不是由式1表示的化合物。

在某些实施方案中，所述药剂选自：

在某些实施方案中，所述结合是特异性结合。

术语“特异性结合”或“优选性结合”是指发生在两种配对物质(例如酶/底物、受体/激动剂、抗体/抗原和凝集素/碳水化合物)之间的结合，其可能由共价和/或非共价相互作用介导。当所述两种物质的相互作用通常产生非共价结合的复合物时，发生的结合通常是静电的和/或氢键，和/或是亲脂性相互作用的结果。因此，“特异性结合”发生在成对物质之间，其中两者之间存在相互作用，产生结合的复合物。具体来说，特异性结合的特征在于，一对中的一个成员与特定物质的结合与该对中的该成员与该物质所属的化合物家族中的其他物质的结合相比更加优先。因此，例如，药剂可能对LAMP-1分子上的特定口袋(即本文定义的口袋)显示出的亲和力，所述亲和力比其对相同或相关蛋白质上的不同口袋的亲和力高至少两倍，优选地至少10倍、至少100倍、至少1000倍或至少10000倍，包括其间的任何值。每种可能性代表本发明的独立实施方案。

在某些实施方案中，所述药剂抑制LAMP1:LAMP1相互作用。在某些实施方案中，所述药剂抑制LAMP1间相互作用。

在某些实施方案中，所述药剂用于预防或治疗选自与溶酶体贮积相关的疾病或障碍、与多葡聚糖积累或异常糖原积累和异常蛋白质积累相关的疾病或障碍和自噬失调相关疾病的疾病或障碍。

在某些实施方案中，所述药剂用于预防或治疗与溶酶体酶不能分解积累的底物相关的疾病或障碍。在某些实施方案中，所述药剂用于预防或治疗与溶酶体膨胀相关的疾病或障碍。在某些实施方案中，所述药剂用于预防或治疗与溶酶体爆裂(导致有毒内容物溢出到胞质溶胶中)相关的疾病或障碍。

在某些实施方案中，所述疾病或障碍选自糖原贮积病(GSD)、成人多葡聚糖体病(APBD)和拉福拉病、戈谢病、法布里病、泰-萨二氏病、粘多糖(MPS)病、天冬氨酰葡糖胺尿症、GM1神经节苷脂沉积症、克腊伯氏病(球形细胞性脑白质营养不良症或半乳糖神经酰胺脂沉积症)、异染性脑白质营养不良症、桑霍夫病、II型粘脂贮积病(I细胞病)、IIIA型粘脂贮积病(假Hurler性多发性营养不良)、C2型和C1型尼曼匹克病、Danon病、游离唾液酸贮积病、IV型粘脂贮积病和多发性硫酸酯酶缺乏症、代谢障碍、肥胖症和胰岛素抗性。

在某些实施方案中，所述疾病或障碍是糖原贮积病(GSD)。在某些实施方案中，所述GSD GSD与糖原分支酶缺乏有关。在某些实施方案中，所述GSD选自I-XV型GSD。在某些实施方案中，所述GSD是0型GSD。在某些实施方案中，所述GSD是1型GSD。在某些实施方案中，所述GSD是2型GSD。在某些实施方案中，所述GSD是3型GSD。在某些实施方案中，所述GSD是4型GSD。在某些实施方案中，所述GSD是5型GSD。在某些实施方案中，所述GSD是6型GSD。在某些实施方案中，所述GSD是7型GSD。在某些实施方案中，所述GSD是9型GSD。在某些实施方案中，所述GSD是10型GSD。在某些实施方案中，所述GSD是11型GSD。在某些实施方案中，所述GSD是12型GSD。在某些实施方案中，所述GSD是13型GSD。在某些实施方案中，所述GSD是14型GSD(也被归类为先天性糖基化障碍1型(CDG1T))。在某些实施方案中，所述GSD是15型GSD。

在某些实施方案中，所述医学病症是选自但不限于成人多葡聚糖体障碍(APBD)、Andersen病、Forbes病和Danon病的一者或多者。

在某些实施方案中，GSD或“与糖原分支酶缺乏相关的医学病症”意指以多葡聚糖体在肌肉、神经和/或身体的各种其他组织中的沉积、积累或聚集为特征的疾病或障碍。在某些实施方案中，所述医学病症以受试者的中枢和/或外周神经系统的功能障碍为特征。

在本发明的实施方案中，涵盖了用于个性化治疗、预防或降低GSD和与多葡聚糖体积累相关的其他障碍的发生率或严重程度的方法。

在某些实施方案中，所述药剂被用于治疗神经变性疾病。在某些实施方案中，所述药剂被用于治疗炎性疾病。在某些实施方案中，所述药剂被用于治疗GSD相关癌症。

在某些实施方案中，所述癌症是与自噬活性降低相关的癌症。在某些实施方案中，癌症包括肺癌或者是肺癌。在某些实施方案中，肺癌是或包括非小细胞肺癌(NSCLC)。

在某些实施方案中，所述药剂的特征在于降低多葡聚糖体(PB)细胞含量的活性。在某些实施方案中，“降低PB细胞含量”意指塑造(例如减小)PB的尺寸。在某些实施方案中，“降低PB细胞含量”意指降解所述PB(例如通过调节糖原分支酶GBE)。

在某些实施方案中，所述药剂能够调节(例如抑制或在某些实施方案中提高)至少一种酶的活性。

在某些实施方案中，所述药剂能够抑制一种或多种酶。此类酶的非限制性实例是糖基转移酶，例如糖原合成酶(GS)和蛋白磷酸酶-1(PP1)。

在某些实施方案中，所述自噬失调相关疾病是由错误折叠的蛋白质聚集体引起的疾病。在这一方面的另一个实施方案中，所述由错误折叠的蛋白质聚集体引起的疾病选自阿兹海默氏病、帕金森氏症、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿病、脊髓小脑共济失调、眼咽肌营养不良、朊病毒病、致命性家族性失眠症、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、齿红-苍白球萎缩、额颞叶痴呆、进行性核上性麻痹、x连锁脊髓延髓肌萎缩和神经元核内透明质包涵体病。术语“自噬失调相关疾病”还包括癌症，例如其中自噬的诱导将抑制细胞生长和分裂，减少突变，去除被活性氧物质破坏的线粒体和其他细胞器或杀死正在发育的肿瘤细胞的任何癌症。术语“自噬失调相关疾病”还包括精神疾病或障碍，例如其中自噬的诱导将有助于延迟与所述精神疾病或障碍相关的一种或多种症状的发作，减缓、停止或逆转其进展的任何精神疾病或障碍。在一个实施方案中，所述精神疾病或障碍选自精神分裂症和双相情感障碍。

本文在酶的上下文中所使用的术语“抑制性”或其任何语法衍生物是指能够预防、阻断、减弱或降低酶的活性。

在某些实施方案中，“降低活性”意指相对于不存在所公开的化合物或含有所述化合物的主题组合物的可比情况，活性降低至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％，包括其间的任何值和范围。

所公开的药剂单独地或其组合或与任何其他治疗活性剂组合，可以被设计和利用，以在其组合或与任何另一种治疗活性剂组合时发挥双重且可能协同的活性。

根据某些实施方案，本发明提供了一种药物组合物，其包含上述药剂。

在某些实施方案中，所述药物组合物在溶液中具有4至6.5之间、4.5至6.5之间、4至6之间、4至5.5之间、4至5之间、4.5至6之间、4.5至5.5之间或4.5至5之间的pH，包括其间的任何范围。每种可能性代表本发明的独立实施方案。

在某些实施方案中，所述药剂在溶液中，在4至6.5之间、4.5至6.5之间、4至6之间、4至5.5之间、4至5之间、4.5至6之间、4.5至5.5之间或4.5至5之间的pH下显示出与LAMP-1的特异性结合，包括其间的任何范围。每种可能性代表本发明的独立实施方案。

在某些实施方案中，所述药剂在溶液中，在4至6.5之间、4.5至6.5之间、4至6之间、4至5.5之间、4至5之间、4.5至6之间、4.5至5.5之间或4.5至5之间的溶酶体pH下显示出与LAMP-1的特异性结合，包括其间的任何范围。每种可能性代表本发明的独立实施方案。

在某些实施方案中，所述药物组合物包含100nM至5mM之间、150nM至5mM之间、200nM至5mM之间、500nM至5mM之间、700nM至5mM之间、900nM至5mM之间、1mM至5mM之间、2mM至5mM之间、100nM至3mM之间、150nM至3mM之间、200nM至3mM之间、500nM至3mM之间、700nM至3mM之间、900nM至3mM之间、1mM至3mM之间、2mM至3mM之间、100nM至1mM之间、150nM至1mM之间、200nM至1mM之间、500nM至1mM之间或700nM至1mM之间的所述药剂，包括其间的任何范围。每种可能性代表本发明的独立实施方案。

根据某些实施方案，本发明提供了一种在有需要的受试者中治疗或预防与溶酶体贮积、多葡聚糖积累或异常糖原积累相关的疾病或障碍的发展的方法，所述方法包括向所述受试者给药治疗有效量的上文描述的药物组合物。

在某些实施方案中，所述与溶酶体贮积相关的疾病或障碍选自戈谢病、法布里病、泰-萨二氏病、粘多糖(MPS)病、天冬氨酰葡糖胺尿症、GM1神经节苷脂沉积症、克腊伯氏病(球形细胞性脑白质营养不良症或半乳糖神经酰胺脂沉积症)、异染性脑白质营养不良症、桑霍夫病、II型粘脂贮积病(I细胞病)、IIIA型粘脂贮积病(假Hurler性多发性营养不良)、C2型和C1型尼曼匹克病、Danon病、游离唾液酸贮积病、IV型粘脂贮积病和多发性硫酸酯酶缺乏症、代谢障碍、肥胖症和胰岛素抗性。

在某些实施方案中，本发明提供了一种治疗或预防多种形式的GSD的发展的方法，所述GSD形式包括但不限于GSD-IV、-VI、IX、XI和由于AMP激活的蛋白激酶γ亚基2缺乏引起的心脏糖原生成。在某些实施方案中，所公开的化合物可减少参与GSD、GSD IV型(APBD和Andersen病)、GSDVII型(Tarui病)和拉福拉病(LD)的PB中的致病性PB积累。

本文所使用的“溶酶体膜蛋白”是指LAMP-1、LAMP-2、CD63/LAMP-3、DC-LAMP或任何溶酶体相关膜蛋白或同源物、直向同源物、变体(例如等位基因变体)和修饰形式(例如包含一个或多个天然存在的或工程化改造的突变)。一方面，LAMP多肽是哺乳动物溶酶体相关膜蛋白，例如人或小鼠溶酶体相关膜蛋白质。更通常，“溶酶体膜蛋白”是指包含在内体/溶酶体隔室或溶酶体相关细胞器的膜中发现的结构域并进一步包含腔内结构域的任何蛋白质。

包含所公开的化合物和药剂的药物组合物

根据本发明的实施方案的一个

方面，提供了一种药物组合物，其包含一种或多种本文所描述的化合物和/或药剂以及药学上可接受的载体。

根据本发明的实施方案的一个方面，提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的一种或多种本文所描述的化合物和/或药剂。

本文所使用的短语“治疗有效量”描述了所给药的化合物将在一定程度上减轻所治疗的病症的一种或多种症状的量。

术语“受试者”(在上下文允许的情况下，应被理解为包括“个体”、“动物”、“患者”或“哺乳动物”)定义了需要治疗的任何受试者，尤其是哺乳动物受试者。在某些实施方案中，受试者是人。

上文所述的化合物可以原样或作为其药学上可接受的盐、对映异构体、互变异构体、非对映异构物、质子化或非质子化形式、溶剂化物、水合物或前体药物给药或以其他方式使用。

短语“药学上可接受的盐”是指母体化合物的带电粒种及其平衡离子，通常用于改变母体化合物的溶解特性和/或减少母体化合物对生物体的任何显著刺激，同时不废除给药的化合物的生物活性和特性。化合物的中性形式可以通过将所述盐与碱或酸接触并以常规方式分离母体化合物来再生。化合物的母体形式在某些物理性质、例如在极性溶剂中的溶解度方面不同于各种盐形式，但在其他方面，对于本发明的目的来说所述盐等同于所述化合物的母体形式。

短语“药学上可接受的盐”意在涵盖取决于本文所述化合物上存在的特定取代基，用相对无毒的酸或碱制备的所述活性化合物的盐。

药学上可接受的酸加成盐的实例包括衍生自无机酸如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、单氢碳酸、磷酸、单氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、单氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等的盐，以及衍生自相对无毒的有机酸如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等的盐。还包括氨基酸的盐如精氨酸盐等，以及有机酸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等的盐(参见例如Berge等，Pharmaceutical Salts，Journal of Pharmaceutical Science,1977,66,1-19)。本发明的某些特定化合物同时含有碱性和酸性官能团，使得本文所述的化合物能够转变成碱加成盐或酸加成盐。

在某些实施方案中，本文所述的化合物的中性形式通过将所述盐与碱或酸接触并以常规方式分离母体化合物来再生。化合物的母体形式在某些物理性质、例如在极性溶剂中的溶解度方面不同于各种盐形式，但在其他方面，对于本发明的目的来说所述盐等同于所述化合物的母体形式。

术语“前体药物”是指在体内转变成活性化合物(活性母体药物)的药剂。前体药物通常可用于促进母体药物的给药。与母体药物相比，前体药物也可能在药物组合物中具有提高的溶解度。前体药物也经常用于实现活性化合物在体内的持续释放。

在某些实施方案中，本文所述的化合物具有不对称碳原子(光学中心)或双键；外消旋体、非对映异构体、互变异构体、几何异构体和单个异构体被包含在本发明的范围之内。

本文和本领域中使用的术语“对映异构体”描述了化合物的一种立体异构体，其相对于其对应物只能通过彼此的完全反转/反射(镜像)重叠。对映异构体被认为具有“偏手性”，因为它们像右手和左手一样相互指代。对映异构体具有相同的化学和物理性质，除非存在于本身具有偏手性的环境例如所有生命系统中。

在某些实施方案中，本文所述的化合物可以以非溶剂化形式以及溶剂化形式、包括水合形式存在。一般来说，溶剂化形式等同于非溶剂化形式，并且包含在本发明的范围之内。本发明的某些化合物可以以多种结晶或无定形形式存在。一般来说，所有物理形式对于本发明所设想的用途而言都是等效的，并且都在本发明的范围之内。

术语“溶剂化物”是指由溶质(本文所述的共轭物)和溶剂形成的化学计量可变(例如二、三、四、五、六等)的络合物，其中溶剂不干扰溶质的生物活性。适合的溶剂包括例如乙醇、乙酸等。

术语“水合物”是指其中溶剂为水的上文定义的溶剂化物。

在某些实施方案中，“药物组合物”是指一种或多种本文所述的化合物(作为活性成分)或其生理上可接受的盐或前体药物与其他化学组分的制剂，所述其他化学组分包括但不限于生理上适合的载体、赋形剂、润滑剂、缓冲剂、抗细菌剂、增量剂(例如甘露糖醇)、抗氧化剂(例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠)、抗炎剂、抗病毒剂、化学治疗剂、抗组胺剂等。

在某些实施方案中，药物组合物的目的是便于化合物向受试者的给药。术语“活性成分”是指可以对生物效应负责的化合物。

可以互换使用的术语“生理上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”是指不会对生物体造成显著刺激并且不会废除给药的化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。

本文中，术语“赋形剂”是指添加到药物组合物以进一步促进药物给药的惰性物质。赋形剂的非限制性实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。

用于药物配制和给药的技术可以在《Remington制药学》(Remington’sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.,Easton,PA，最新版，其通过引用并入本文)中找到。

在某些实施方案中，根据本发明使用的药物组合物因此可以使用一种或多种药学上可接受的载体(包含赋形剂和辅助剂)以常规方式配制，这有助于将所述化合物加工成可药用的制剂。正确的配方取决于所选择的给药途径。如本文所描述和规定的，剂量可以根据所使用的剂型和所使用的给药途径而变。具体的配方、给药途径和剂量可由各个医生根据患者的状况进行选择(例如参见Fingl等，1975，《治疗剂的药理学基础》(ThePharmacological Basis of Therapeutics)，Ch.1p.1)。

在某些实施方案中，药物组合物可以配制成以一种或多种途径给药，这取决于所选择的是局部还是全身治疗或给药以及待治疗的区域。如本文通篇进一步描述的，给药可以通过口服、牙、吸入或肠胃外进行，例如通过静脉内滴注或腹膜内、皮下、肌肉内或静脉内注射，或局部(包括眼、阴道、直肠、鼻内)。

用于局部和/或牙给药的制剂可包括但不限于洗剂、软膏、凝胶、霜剂、栓剂、滴剂、液体、喷剂和粉剂。常规的药物载体、水性、粉末或油性基料、增稠剂等，可能是必要的或期望的。

用于口服给药的组合物可以包括粉剂或颗粒剂、悬液、牙科组合物或在水或非水性介质中的溶液、袋剂、丸剂、胶囊或片剂。可能需要增稠剂、稀释剂、调味剂、分散助剂、乳化剂或黏合剂。

用于胃肠外给药的制剂可以包括但不限于无菌溶液，其也可以含有缓冲液、稀释剂和其他适合的添加剂。设想了将缓释组合物用于治疗。

当然，待给药的组合物的量将取决于所治疗的受试者、病痛的严重程度、给药方式、处方医生的判断等。

药物组合物可以进一步包含其他的药物活性或非活性试剂，例如但不限于抗细菌剂、抗氧化剂、缓冲剂、增量剂、表面活性剂、抗炎剂、抗病毒剂、化学治疗剂和抗组胺剂。

如果需要，本发明的组合物可以提供在包装或分配器装置、例如FDA批准的药剂盒中，其可以含有一个或多个含有活性成分的单位剂型。例如，包装可以包括金属或塑料箔，例如泡罩包装。包装或分配器装置可以附有用于给药的说明书。包装或分配器也可以提供有与容器相伴的通知，其形式由监管药品生产、使用或销售的政府机构规定，所述通知反映了该机构对组合物的形式或人类或兽医给药的批准。例如，此类通知可能是美国食品药品监督管理局批准的处方药标签或批准的产品说明书。

将会认识到，这些实施方案易受本领域技术人员公知的各种修改和替代形式的影响。

筛选方法

根据本发明的某些实施方案的一个方面，提供了一种确定化合物治疗或预防与溶酶体贮积相关的疾病或障碍、与多葡聚糖积累或异常糖原积累和异常蛋白质积累相关的疾病或障碍和自噬失调相关疾病的适合性的方法，所述方法包括将所述化合物与溶酶体相关膜蛋白1(LAMP-1；SEQ ID NO：1)的N-端结构域内的口袋结构域接触，其中所述化合物与所述口袋的结合指示了所述化合物在治疗所述疾病或障碍中有效。

在某些实施方案中，所述结合是与下述一者或多者的结合：SEQ ID NO：2(FSVNYD)和SEQ ID NO：3(NVTV)。

在某些实施方案中，所述方法包括化合物文库的计算筛选的步骤。

在某些实施方案中，所述方法包括检测由一种或多种所选化合物(例如小分子)造成的PB的减少。

应当理解，由于能够对基本上具有各种化学、生物和/或物理特征中的任何特征的化合物文库进行计算筛选，所述方法能够鉴定相对于能够降低PB细胞含量的所有现有技术化合物能够显示出最佳体内药代动力学、最佳低免疫原性以及最佳有效性的化合物，例如通过校正与糖原贮积病相关的受损酶活性，例如糖原合成酶或糖原分支酶。

在某些实施方案中，所述方法包括对所述化合物降低PB细胞含量的能力进行生物化学鉴定。

在某些实施方案中，所述生物化学鉴定包括对细胞进行过碘酸-希夫(PAS)染色以提供PAS染色的细胞。在某些实施方案中，所述方法还包括清洗样品以去除未反应的希夫试剂，然后在限定波长下检测源自于PAS染色样品的信号(例如光致荧光)。

所公开方法的进一步实施方案提供在下面的实施例部分中。

定义

本文所使用的术语“烷基”描述包括直链和支链基团的脂族烃。优选地，烷基具有21至100个碳原子，更优选地21-50个碳原子。每当在本文中陈述一个数值范围例如“21-100”时，意味着所述基团、在这种情况下是烷基，可以含有21个碳原子、22个碳原子和23个碳原子等，直至并包括100个碳原子。在本发明的上下文中，“长烷基”是在其主链(连续共价连接原子的最长路径)中具有至少20个碳原子的烷基。因此，短烷基具有20个或更少的主链碳。正如本文所定义的，烷基可以是被取代或未取代的。

本文所使用的术语“烷基”也涵盖饱和或不饱和烃，因此该术语进一步涵盖烯基和炔基。

术语“烯基”描述具有至少两个碳原子和至少一个碳-碳双键的不饱和的如本文所定义的烷基。正如上文中所述，烯基可以被一个或多个取代基取代，或者是未取代的。

本文所定义的术语“炔基”是具有至少两个碳原子和至少一个碳-碳叁键的不饱和烷基。正如上文中所述，炔基可以被一个或多个取代基取代，或者是未取代的。

术语“环烷基”描述了全碳单环或稠合环(即共享一对相邻碳原子的环)基团，其中一个或多个环不具有完全共轭的π电子系统。如本文中所示，环烷基可以是取代或未取代的。

术语“芳基”描述了具有完全共轭的π电子系统的全碳单环或稠合环多环(即共享相邻成对碳原子的环)基团。芳如本文中所示，基可以是取代或未取代的。

术语“烷氧基”描述了本文中所定义的-O-烷基和-O-环烷基两者。

术语“芳基氧基”描述了本文中所定义的-O-芳基。

本文通式中的烷基、环烷基和芳基中的每一者可以被一个或多个取代基取代，其中每个取代基可以独立地是例如卤化物、烷基、烷氧基、环烷基、烷氧基、硝基、胺、羟基、硫醇、硫代烷氧基、硫代羟基、羧基、酰胺、芳基和芳基氧基，这取决于被取代的基团及其在分子中的位置。还考虑了另外的取代基。

术语“卤化物”、“卤素”或“卤”描述氟、氯、溴或碘。

术语“卤代烷基”描述了进一步被一个或多个卤素取代的本文所定义的烷基。

术语“卤代烷氧基”描述了进一步被一个或多个卤素取代的本文所定义的烷氧基。

术语“羟基”描述了-OH基团。

术语“硫代羟基”或“硫醇”描述了-SH基团。

术语“硫代烷氧基”描述了本文所定义的-S-烷基和-S-环烷基两者。

术语“硫代芳基氧基”描述了本文所定义的-S-芳基和-S-杂芳基两者。

术语“胺”描述了-NR’R”基团，其中R’和R”如本文中所描述。

术语“杂芳基”描述了在环中具有一个或多个原子(例如氮、氧和硫)，此外还具有完全共轭的π电子系统的单环或稠合环(即共享一对相邻原子的环)基团。杂芳基的非限制性实例包括吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、吡啶、嘧啶、喹啉、异喹啉和嘌呤。

术语“杂脂环族”或“杂环基”描述在环中具有一个或多个原子(例如氮、氧和硫)的单环或稠合环基团。所述环也可以具有一个或多个双键。然而，所述环不具有完全共轭的π电子系统。代表性实例是哌啶、哌嗪、四氢呋喃、四氢吡喃、吗啉等。

术语“羧基”或“羧酸酯或盐”描述了-C(＝O)-OR'基团，其中R'是本文所定义的氢、烷基、环烷基、烯基、芳基、杂芳基(通过环碳键合)或杂脂环族(通过环碳键合)。

术语“羰基”描述了-C(＝O)-R'基团，其中R'如上文中所定义。

上述术语还涵盖其硫代衍生物(硫代羧基和硫代羰基)。

术语“硫代羰基”描述了-C(＝S)-R'基团，其中R'如上文中所定义。

“硫代羧基”描述了-C(＝S)-OR'基团，其中R'如本文所定义。

“亚磺酰基”描述了-S(＝O)-R'基团，其中R'如本文所定义。

“磺酰基”或“磺酸酯或盐”基团描述了-S(＝O)₂-R'基团，其中Rx如本文所定义。

“氨基甲酰基”或“氨基甲酸酯或盐”基团描述了-OC(＝O)-NR'R”基团，其中R'如本文所定义，并且R”如为R'所定义。

“硝基”是指-NO₂基团。

“氰基”或“腈”基团是指-C≡N基团。

本文所使用的术语“叠氮基”是指-N₃基团。

术语“磺酰胺”是指-S(＝O)₂-NR'R”基团，其中R'和R”如本文所定义。

术语“膦酰基”或“膦酸”描述了-O-P(＝O)(OR')₂基团，其中R'如上文中所定义。

术语“膦基”描述了-PR'R”基团，其中R'和R”如上文中所定义。

术语“烷芳基”描述了如本文所定义的烷基，其被如本文所述的芳基取代。示例性的烷芳基是苯甲基。

术语“杂芳基”描述了在环中具有一个或多个原子(例如氮、氧和硫)，并且此外还具有完全共轭的π电子系统的单环或稠合环(即共享一对相邻原子的环)基团。杂芳基的非限制性实例包括吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、吡啶、嘧啶、喹啉、异喹啉和嘌呤。杂芳基可以被一个或多个如上所述的取代基取代，或者是未取代的。代表性实例是噻二唑、吡啶、吡咯、噁唑、吲哚、嘌呤等。

本文所使用的术语“卤素”和“卤化物”在本文中可互换地指称卤素原子，即氟、氯、溴或碘，其在本文中也被称为氟化物、氯化物、溴化物和碘化物。

术语“卤代烷基”描述了如上所定义的烷基，其进一步被一个或多个卤化物取代。

通则

本文所使用的术语“约”是指±10％。

术语“包含”、“包括”、“具有”及其词形变化形式意味着“包括但不限于”。

术语“由……组成”意味着“包括且限于”。

术语“基本上由……组成”意味着组合物、方法或结构可能包括额外的成分、步骤和/或部分，但仅在所述额外的组分、步骤和/或部分不实质性改变所宣称的组合物、方法或结构的基本和新颖特征的情况下。

词语“示例性”在本文中用于表示“作为示例、实例或例证”。被描述为“示例性”的任何实施方案不必然被解释为优选或优于其他实施方案和/或排除来自于其他实施方案的特点的并入。

词语“任选地”在本文中用于表示“在某些实施方案中提供而在其他实施方案中不提供”。本发明的任何特定实施方案均可能包括多个“任选的”特点，除非这些特点有冲突。

本文所使用的没有具体数目的指称包括复数指称物，除非上下文另有明确规定。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。

在整个本申请中，本发明的各个实施方案可以以范围的格式呈现。应当理解，采用范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应当被解释为是对本发明范围的刻板限制。因此，对范围的描述应该被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对诸如1至6的范围的描述应当被认为已经具体公开了诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等的子范围，以及该范围内的各个数字例如1、2、3、4、5和6。不论范围的宽度如何这均适用。

无论何时在本文中指示数值范围时，它都意味着包括所指示范围内的任何引用数字(分数或整数)。短语“在第一指示数字和第二指示数字之间的范围”和“从第一指示数字至第二指示数字的范围”在本文中可互换使用，并且意味着包括所述第一指示数字和第二指示数字以及其间的所有分数和整数。

本文所使用的术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的或容易从已知的方式、手段、技术和程序发展而来的那些方式、手段、技术和程序。

本文所使用的术语“治疗”包括废止、实质上抑制、减缓或逆转病症的进展，实质性改善病症的临床或美学症状，或实质性预防病症的临床和美学症状的出现。

应当理解，为清晰起见，在单独的实施方案的上下文中描述的本发明的某些特点也可以组合地提供在单个实施方案中。相反，为简洁起见，在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种特点也可以单独地或以任何适合的子组合提供，或适合地提供在本发明的任何其他描述的实施方案中。在各个实施方案的上下文中描述的某些特点不应被认为是那些实施方案的必不可少的特点，除非所述实施方案在没有那些要素的情况下不起作用。

上文中所描述和下文权利要求部分中所要求保护的本发明的各种实施方案和方面，将在下述实施例中发现实验支持。

实施例

现在参考下述实施例，这些实施例与上文的描述一起以非限制性方式说明了本发明的一些实施方案。

材料和方法

研究设计

所提出的实验组合了对新发现的化合物即化合物1治疗APBD的治疗潜力的体内、离体和体外研究。在体内部分中，发明人测试了化合物1在Gbe^ys/ys雌性小鼠中校正疾病表型的能力。使用了最初n＝7-9只动物的两个组，5％ DMSO载体和化合物1。这些数字被回顾性地证明提供了足够的效力，因为根据获得的平均值和SD，在n＝5只动物/组时已获得了80％的效力。额外的野外、步态和伸展反射测试(图1E-1H)还包括了n＝9只动物的C57BL/6野生型对照组。如果在连续称重之间体重减少>10％或与开始时相比体重减少>20％，则将所述动物排除在实验之外。由于死亡，样本量随时间略微减少。每周两次注射150μL浓度为250mg/kg的于5％ DMSO中的化合物1。载体对照是5％ DMSO。第一个月是注射在静脉内(IV)，然后是皮下注射(SC)，这是因为动物尾巴上缺少注射空间和瘢痕形成。本发明人在4月龄即疾病发作前两个月时(假设具有优选的预防效果)或在6月龄发病时开始注射，以进行比较。治疗持续到10月龄。约每两周一次测试化合物1对各种运动参数的影响。在这些实验结束时，通过颈部脱位将一些小鼠处死，并收集来自于n＝2只野生型、n＝7只Gbe^ys/ys载体治疗的和n＝9只化合物1治疗的小鼠的组织，切片、固定，并通过PAS进行淀粉糖化酶抗性PG染色(图2A-2C)。组织糖原如所述进行生物化学测定。此外，通过LC-MS/MS确定源自于n＝3只小鼠/时间点的血清和组织中化合物1的药代动力学曲线。实验人员对治疗分配不知情。

离体研究在来源于APBD患者的皮肤成纤维细胞和来自于Gbe^ys/ys小鼠的肝脏切片中进行，因为肝脏具有最高的PG水平。体外研究在细胞裂解物中进行。

组织学PG和糖原测定

分离来自于野生型以及化合物1和载体处理的Gbe^ys/ys动物的大脑、心脏、肌肉、神经束(外周神经)和肝组织，以表征化合物1的组织病理学效应。提取组织，将其固定、包埋在石蜡中并切片。在脱石蜡后，将切片用0.5％淀粉糖化酶处理5min以消化非多葡聚糖糖原，留下多葡聚糖。然后清洗切片，用PAS对多葡聚糖进行染色，用苏木精复染，并通过光学显微镜进行分析，所有这些都如以前所述。对于生物化学糖原测定来说，对100mg的每种组织进行碱性水解和煮沸，然后用乙醇沉淀糖原。然后通过淀粉葡糖苷酶(Sigma)将糖原酶促消化成葡萄糖。消化后，使用Sigma GAGO20试剂盒根据葡萄糖含量确定总糖原。

成像和基于图像的表型分型

将APBD皮肤成纤维细胞以1000个细胞/孔接种，并在专门的显微镜级96孔板(Grenier Bio-One，Germany)中培养。在不同的处理之后，向每个孔添加ThermoScientific细胞荧光染料于PBS中的混合物，在5％CO₂培养箱中在37℃下30min。该混合物(图4C和7B)包括DAPI(1μg/ml，细胞核(DNA)染色剂)、MitoTracker Green(500nM，电位不依赖性线粒体染色剂)、TMRE(500μM，电位依赖性线粒体染色剂)和Cell Mask Deep Red(0.5μg/ml，胞质溶胶染色剂)。在图7C中，只有溶酶体被LysoTracker Deep Red(75nM)染色。然后将细胞用4％多聚甲醛(PFA)固定，用PBS清洗，并将板转移到InCell2200(GE Healthcare，U.K.)机器中，以40×放大率进行图像采集。产生的输出基于可比较的荧光强度。在GE分析工作站中使用多靶分析进行对象分割，以鉴定细胞核和细胞边界。在所有测定重复中所有测定参数(包括采集曝光时间、物镜和分析参数)保持恒定。对于糖原的PAS染色(图4和6C)来说，将固定的细胞用PBS清洗，用0.1％ Triton X-100通透化，再次清洗并染色，然后成像。

药代动力学

对于药代动力学分析，按照既定指南，收集100μL血清以及大脑、肾脏、后肢四头肌、心脏、肝脏和脾脏组织，匀浆，并用乙腈提取。使用于作为内标(IS)的1mg/ml 4-叔丁基-2-(4H-1,2,4-三唑-4-基)苯酚(ChemBridge)溶液中的0、1、10、100和1000ng/ml化合物1制作校准曲线。然后将组织样品溶解在1mg/ml IS溶液中，并掺入0-1000ng/ml化合物1以产生标准曲线，从其确定化合物1的组织水平。样品通过LC-MS/MS Sciex Triple Quad TM 5500质谱仪进行分析。

伦理学

体内研究获得希伯来大学IACUC的批准。

统计分析

在图1A-1M中，通过重复测量的双向ANOVA检验了总体趋势的显著性。该检验确定了响应如何受两个因素的影响：被重复给药(因此重复测量)的化合物1相比于对照，以及给药持续时间。Bonferroni检验用于在化合物1和载体之间进行比较，其校正了多次比较，因此非常稳健(因为在每个时间点确定显著性的阈值以与比较的次数成反比的方式降低)。因此，由于比较的次数的增加，在特定时间点的大多数差异变得不显著，并且有时发明人还选择显示对多次比较不进行校正的多次t-检验的数据。在图4D和6E中，发明人使用了单向ANOVA和Sidak的多重比较事后校正。使用的其他统计检验是Student t-检验。

通过向列式蛋白质组织技术(NPOT)的靶鉴定

将应用于人类健康成纤维细胞和来自于两位APBD患者的成纤维细胞。所有分析均由Inoviem Scientific Ltd.以盲法进行。通过快速冷冻(液氮)和缓慢解冻(在冰上)的三个循环从这些成纤维细胞的干颗粒制备蛋白质匀浆物，并以最大涡旋振荡速度混合30秒。通过BCA方法测定的样品蛋白质浓度为50-66mg/ml。/>是由InoviemScientific提供的专有技术，专门用于在基本条件下或病理情况下直接从人体组织进行特定的大分子支架的分离和鉴定。所述技术基于Kirkwood-Buff分子拥挤和聚集理论。它使参与生理或病理过程的大分子复合物的形成和无标记物鉴定成为可能。Inoviem Scientific的特殊优势是能够直接在人体组织中从复杂的混合物中分析药物-蛋白质和蛋白质-蛋白质相互作用，而不会破坏天然分子构象，从而保持在初始生理或病理条件下。

在层流和无菌条件下，将10^-6M化合物即化合物1和来自于HTS筛选的阴性对照单独地与蛋白质匀浆物(含有可溶性和膜蛋白)混合，并进行分离。使用差异微透析系统分离与配体结合的大分子组装体，其中大分子(蛋白质基团)基于其物理化学性质在液相中迁移。由于测试药物与其靶之间的分子相互作用，迁移的大分子逐渐从向列晶体生长为大分子异源组装体。在通过LC-MS/MS鉴定之前，将所述异源组装体在96孔板中放置过夜并分离。

在APBD患者和HC成纤维细胞中，在化合物1和阴性对照存在下形成的异源组装体如图14A-14B中所示。与所指示的蛋白质匀浆物接触的每种化合物产生具有常见网状形态的明确定义的异源组装体。对于每种化合物，实验进行一式三份。对于这些生物重复实验中的每一者，分离异源组装体并通过LC-MS/MS分析其蛋白质含量。阴性对照在不添加化合物的条件下使用蛋白质匀浆物获得，并且不存在任何聚集。这进一步证实了异源组装体的形成由所述化合物而不是内源小分子通过其与主要靶的相互作用引发。/>

在Zeiss显微镜SteREO Discovery V8下，通过显微切割分离每个形成的异源组装体，并在丙酮中清洗，然后溶解在标准HBSS溶液中。将溶解的蛋白质通过4-15％mini-PROTEAN凝胶过滤。在迁移后，将凝胶用胶体蓝溶液染色，以便目测估算凝胶中存在的蛋白质的数量以及蛋白质的相对量，用于下述的消化步骤和注射在LC-MS/MS仪器中用于蛋白质组学分析。

蛋白质组学被外包给UMR 7178的“Laboratoire de Spectrométrie de MasseBio-Organique”(LSMBO)。将异源组装体直接溶解在10μL 2D缓冲液(7M尿素、2M硫脲、4％CHAPS、20mM DTT、1mM PMSF)中。将蛋白质在乙酸盐缓冲液中沉淀，并以7,500g离心20分钟。然后将丸粒用胰蛋白酶金(Promega)在37℃下消化1小时。将胰蛋白酶金以1μg/μL重悬浮在50mM乙酸中，然后在40mM NH₄HCO₃中稀释至20μg/mL。将样品在室温下在Speed中干燥。使用/>移液器头(Millipore Corporation)对肽进行纯化和浓缩，然后在ESI-QUAD-TOF机器中通过1小时纳米-LC-MS/MS分析方案进行质谱分析。使用Mascot软件鉴定蛋白质(秩＝1，得分＝25，最小长度＝6个氨基酸，FDR＝1％)。对于肽作图来说，使用以下数据库：-HumaniRTUN_DCpUN_JUSBank(用于人类样本)。

为了进行数据分析和靶去卷积，Inoviem Scientific开发了自己的数据库和软件，以便对数据集中存在的蛋白质进行准确和稳健的分析，并在去除蛋白质杂质的同时简化蛋白质排序。Inoviem蛋白质排名和分析/>数据库包括在各种组织、器官或细胞系、不同物种和无关化合物上获得的所有/>数据集。然后，软件能够计算一个给定基因在整个数据库或与物种、器官等的限定标准相匹配的特定数据集中的出现率。Inoviem移除了在人体组织和细胞中进行的/>中观察到的杂质，这对应于613个/>偶联的LC-MS/MS分析。因此，该工具能够快速突出数据集中的稀有蛋白质，从而形成新的治疗靶点(图5B)。

另一种生物信息学资源DAVID也被用于发现组织特异性表达、基因本体论和功能相关基因组富集。使用STRING分析(string-db.org)对数据集中的网络富集进行了调查。STRING是ELIXIR的核心数据资源之一(Ensembl或UniProt也是如此)，其含有已知和预测的蛋白质-蛋白质相互作用。Inoviem使用了严格的参数，只保留已知的相互作用(“实验确定”和“仔细挑选的数据库”相互作用源)。这使得能够在复杂的数据集中破译蛋白质-蛋白质关联，从而进一步完成DAVID途径分析。此外，还使用了Reactome(reactome.org)——一个免费、开源、仔细挑选和同行评审的途径数据库。该数据库为途径知识的可视化、解释和分析提供了直观的生物信息学工具，以支持在其他地方获得的发现。

在生物信息学管道中，第一个过滤步骤包括去除质谱“假阳性”，即在一个平行测定中发现并且只有一种特定肽的蛋白质。然后，在2乘2矩阵(144DG11及其相应的阴性对照)中比较人皮肤成纤维细胞组织中的数据集。下一个蛋白质列表分析步骤是鉴定非特异性蛋白质，即在所有实验/>中反复发现的蛋白质。去除在人皮肤成纤维细胞中观察到的杂质(或“频繁命中物”)。因此，相互作用组的清除的蛋白质列表代表了化合物1的潜在特异性靶。使用该管线，发现了28种蛋白质与化合物1特异性相互作用。然后通过DAVID独立地分析化合物1相互作用组的特异性蛋白质列表，以发现组织特异性表达、基因本体论和功能相关基因组的富集。构成化合物1相互作用组(interactome)的主要经典以及疾病和功能途径是溶酶体膜(参考文献：GO:0005765和KEGG途径hsa04142)。同时，使用STRING分析(string-db.org)可视化突出的节点和富集的网络。对于化合物相互作用组的特异性蛋白质的这种第一次排序，本发明人没有使用通过MS测序的肽的信号强度，因为1)所述技术的内在特性不能基于蛋白质定量(与例如经典的免疫沉淀方案相反)，和2)本发明人不使用LC-MS/MS定量方案(这意味着更高成本和更长时间的分析)。这种无偏的分析使Inoviem能够对潜在的相关蛋白质进行分级，并根据它们在特定途径中的参与或与特定疾病的关系对它们进行分类。在这种生物信息学选择后，发现了8种属于自噬体-自溶酶体途径的蛋白质(图5B)。这个定义明确且富集的网络的发现证明了/>实验的总体成功。

计算对接分析

LAMP1分为五个结构域：(1)残基M1-A28：信号序列；(2)残基A29-R195：N-端结构域；(3)残基P196-S216：结构域之间的接头；(4)残基S217-D378：C-端结构域；和(5)残基E379-I417：跨膜区段。本发明人仅分析了N-端结构域和C-端结构域，因为：1.信号序列和跨膜区段被认为与小分子的结合无关；和2.结构域之间的接头是非结构化且高度糖基化的(20个残基中的7个)，因此太复杂而无法建模。本发明人没有考虑N-端和C-端的糖基化。C-端和N-端结构域基于小鼠LAMP1C-端结构域(PDB ID 5gv0)的已知晶体结构进行建模，所述结构域在结构上与N-端结构域高度相似。将MODELLER软件工具用于同源性建模，为每个结构域产生5个任选模型。通过在Schrodinger 2020-2中实施的“蛋白质制备向导”，在pH 5下制备了所述得到的10个模型(以及5gv0本身)。通过三种不同的计算工具鉴定了可能的结合位点：SiteMap、FtSite和fSocket。总体而言，在11个LAMP1 3D结构中鉴定了130个任选位点。对每个假定的结合位点进行对接计算：根据化合物1的适用域(Lipinski规则性质)，从～3000万个分子的大型多样数据库中选择出418个分子作为诱饵。基于化学相似性将诱饵库缩小到233个(Tanimoto系数>＝0.7)。在由化合物1和这233个诱饵(在pH 5下制备)组成的一组分子中，在每个模型中对每个假定结合位点(总共130个位点)进行化合物1的对接计算。所述计算使用在Schrodinger 2020-2中实施的Glide算法进行。根据对接结果分析，在130个位点中的18个位点中，化合物1排名在前10％：3个网格来自于SiteMap，3个来自于FtSite，12个来自于fPocket。8个网格位于C-端结构域中，10个网格位于N-端结构域中。

本发明人注意到，根据N-端结构域的模型之一(4号模型)，化合物1在这18个位点中的6个位点中排名在前10％。分析所述结果，本发明人意识到SiteMap的位点1、fPocket的位点3和FtSite的位点2意指相同的口袋(残基F50-D55、N62、L67、F118、Y120-L122、T125、L127-S133、N164-V166)。

发明人研究了三种结合模式之间的差异(图5E)：似乎三种结合模式中的两种(SiteMap和fPocket)是相同的，并且在第三种模式(FtSite)中，相对于其他两种模式化合物1的一部分经历了旋转。

为了预测获得仅对化合物1偶然观察到的独特结合的概率，本发明人对所有233种诱饵重复了以上对化合物1呈现的分析。仅在234种分子(233种诱饵+化合物1)中的14种分子中，本发明人观察到与化合物1相同的结果，即通过3种不同的工具预测到其与口袋的结合的分子(表1)。这表明这种机会相对小(14/234～6％)。此外，为化合物1鉴定到的口袋(图5E)是最常见的(14个分子中匹配了5个，表1)。这表明该口袋可能是可药用的并且结合相对大量的化合物，这对于化合物1的假定药物化学改进是有利的。所述表显示了其中根据3种不同的工具(用于预测结合位点)，分子进入同一口袋的情况。第一列中“位点”后面的3个数字表示通过SiteMap(第一个数字)、FtSite(第二个数字)和fSocket(第三个数字)进行的位点排序。

表1.通过3种不同工具预测的进入同一口袋的分子

*该分子结合到两个不同结合位点

本发明人在结合位点的受限较少的定义中重复所述分析，并获得类似结果：234种分子中的45种(～19％)成功对接到至少一个预测的口袋。然而，在所述45种分子中的14种分子中，本发明人观察到与一个以上位点的结合，这表明混杂。因此，总的来说，234种分子中的31种分子成功对接到假定位点之一(约12.7％)。总之，本发明人已通过计算鉴定了LAMP1的N-端结构域中化合物1的可能结合位点，并高度可信地预测这个结果对化合物1是特异的，因为诱饵分子获得相同结果的概率很低。

透射电子显微术(TEM)

将肝组织切碎，并在含有2％多聚甲醛、2.5％戊二醛(EM级)于0.1M二甲胂酸钠缓冲液(pH 7.3)中的溶液中在RT下固定2小时，然后在4℃下固定24h。然后将组织用二甲胂酸钠清洗4次，并用二甲胂酸钠中的1％四氧化锇和1.5％铁氰化钾后固定1h。然后将样品用相同的缓冲液清洗4次，并用分级系列的乙醇溶液(30、50、70、80、90、95％)脱水各10分钟，然后用100％乙醇脱水3次，每次20分钟。随后，将样品用环氧丙烷处理，更换2次。然后将样品用一系列环氧树脂浸润(25、50、75、100％——在每一者中24h)，并在60℃烘箱中聚合48小时。通过超薄切片机(Ultracut E，Riechert Jung)对样品块进行切片，并将得到的80nm切片用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色。通过Jeol JEM 1400 Plus透射电子显微镜观察切片，并使用Gatan Orius CCD相机拍摄图像。

蛋白质组学(图7)

用于MS分析的样品制备。将含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中的细胞裂解物通过离心进行澄清，并使用40μg蛋白质通过氯仿/甲醇法进行蛋白质沉淀。将沉淀的蛋白质溶解在100μl的8M尿素、10mM DTT、25mM Tris-HCl(pH 8.0)中，并在22℃下温育30min。添加碘乙酰胺(55mM)，将样品温育30min(22℃，在暗处)，然后添加DTT(10mM)。将50μl样品转移到新试管中，通过添加7体积的25mM Tris-HCl(pH 8.0)进行稀释，并添加测序级修饰的胰蛋白酶(Promega Corp.，Madison，WI)(0.35μg/样品)，然后在37℃和温和搅拌下温育过夜。通过添加0.2％甲酸将样品酸化，并在C18自制分级尖端(Stage tips)上脱盐。通过280nm处的吸光度确定肽浓度，并将0.75μg肽进样到质谱仪中。

纳米LC-MS/MS分析。使用在线偶联到纳升流UHPLC仪器Ultimate3000Dionex(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA USA)的QExactive-HF质谱仪(Thermo FisherScientific，Waltham，MA USA)进行MS分析。将溶解在0.1％甲酸中的肽在没有捕获柱的情况下，在25cm长的反相C18柱(75μm ID，2μm，Thermo PepMapRSLC)上，在以0.3μl/min的流速运行的120min乙腈梯度上分离。仪器设置如以前所述。获取调查扫描(300-1,650m/z，目标值3E6电荷，最大离子注入时间20ms)，然后进行基于高能碰撞离解(HCD)的片段化(归一化碰撞能量27)。将60000的分辨率用于调查扫描，并将最多达15个具有“肽优选”特征的动态选择的最丰富的前体离子片段化(分离窗口1.6m/z)。以15000的分辨率获取MS/MS扫描(目标值1E5电荷，最大离子注入时间25ms)。动态排除时间为20秒。使用Xcalibur软件(Thermo Scientific)获取数据。为了避免遗留，在各样品之间将柱用80％乙腈、0.1％甲酸清洗25min。

MS数据分析。质谱数据使用MaxQuant计算平台1.6.14.0版进行处理。将峰值列表针对从2020年5月19日起的Uniprot人类FASTA序列数据库进行搜索，所述数据库含有49974个条目。搜索包括半胱氨酸脲基甲基化作为固定修饰，N-端乙酰化和甲硫氨酸氧化作为可变修饰，并允许最多两次错误切割。使用了运行之间匹配(match-between-runs)选项。考虑长度为至少7个氨基酸的肽，并且在肽和蛋白质水平上将所需的FDR设置为1％。MaxQuant中的相对蛋白质定量使用无标记物定量(LFQ)算法来进行。统计分析使用Perseus统计软件包进行(n＝4-7)。只有在至少一个样本组中获得了至少3个有效LFQ值的蛋白质才被接受通过t-检验进行统计分析(p<0.05)。

实施例1

化合物1改善Gbe^ys/ys小鼠中的存活率和运动缺陷

本发明人测试了化合物1(图1A)在APBD小鼠模型Gbe^ys/ys中校正缺陷的运动表型和短寿命的能力。化合物1是本发明人以前发现的降低HTS的19种PG之一。它是通过对这些命中物进行计算机ADMET(吸收、分布、代谢、排泄和毒性)测试，以预测其中哪一种将是安全、在药理学和药效学上优选的并因此值得进一步研究而选出的(图8，化合物“A”)。事实上，ADMET评分低的化合物例如“B”(图8)，是无效的，并造成不良影响例如伤口(图9)。此外，野生型小鼠中的安全性评估证实，在5％ DMSO中以250mg/kg(由于溶解度和DMSO毒性问题，可能的最高剂量)给药3个月，化合物1不影响动物随时间的体重增加(图10)。在暴露3个月后，所述化合物也没有在大脑、肝脏、骨骼肌和心脏中产生任何组织病理学损伤或病变(图11)。在1h和24h的治疗后，还检测小鼠的异常自发行为，例如不动、过度奔跑、刻板运动和异常姿势(Irwin测试)。化合物1在这些Irwin测试中没有引起任何不良反应(表2)。

表2.化合物1的Irwin测试

重要的是，如图1B所示，与载体治疗的动物相比，使用化合物1的治疗显著提高了动物存活率(对数秩检验p-值<0.0000692)。寿命的延长可能反映了与动物茁壮成长的能力相关的几个参数的改善。在这方面最突出的参数是动物的体重。化合物1确实减轻了由疾病引起的动物体重随时间的下降(图1C)。本发明人还每两周一次测试了化合物1对各种运动参数的影响。化合物1从疾病进展的相对晚期阶段(8个月，注射后134天(图1D))改善了野外表现(图1D)。这些改善表现为运动能力增强和向中心移动的趋势的增加(图1E)，可能也与压力和焦虑的改善有关。Gbe^ys/ys小鼠野外表现的逐渐恶化与它们的步态缺陷有关。因此，本发明人在小鼠步态受到严重影响的9月龄时测试了化合物1对步态的影响。在该月龄时化合物1确实改善了步态或增加了步幅长度(图1F)。数据还显示，在所有测试的运动参数中，最显著改善的影响是对整体伸展反射的影响(图1G)。在整个研究期间，化合物1显著改善了整体伸展反射(图1G，p<0.05)，正如在9个特定时间点(图1G中的星号)所观察到的。这种影响尤其重要，因为其患者相关性是锥体四肢轻瘫或上运动神经元体征，这是APBD患者的主要神经缺陷之一。重要的是，尽管化合物1显著改善了野外表现(图1E)、步态(图1F)和伸展反射(图1H)，但它们没有恢复到野生型水平，表明化合物1的性能尽管有效，但仍有一些未来改进的空间。

为了研究化合物1对运动参数的影响，本发明人在疾病发作前两个月的4月龄时开始注射化合物1，假设具有优选的预防效果。这种效果在神经变性障碍例如APBD中是期望的，在所述障碍中已经死亡的神经元不能受到发病后治疗的影响。对于化合物1改善的所有参数——野外(图1I)、体重(图1J)和整体伸展反射(图1K)而言，这一假设得到了验证：当它在6月龄时发病后给药时，其改善效果没有发生。值得注意的是，伸展反射，这种受化合物1影响最大的参数，也是所述化合物在9月龄时从疾病晚期阶段改善的唯一参数(图1K)。化合物1的总体有益的效果可以通过动物照片得到最好的认识，动物照片显示治疗的动物脊柱后凸更小并且整洁性更好(图1L-1M)。

实施例2

化合物1根据其生物分布减少多葡聚糖和糖原的组织病理学积累

由于化合物1具有显著改善的运动和存活参数，因此本发明人开始研究其组织病理学效应。对于确定化合物1的离体发现的预期作用模式(降低成纤维细胞中的多葡聚糖水平)是否也发生在体内以及如果发生的话是在哪些组织中，这一信息是重要的。在9.5月龄时动物牺牲后，从化合物1和载体治疗的动物中收集大脑、心脏、肌肉、神经束(外周神经)和肝组织。使用来自于野生型小鼠的相同组织作为对照。在进行淀粉糖化酶处理以消化非多葡聚糖糖原留下多葡聚糖后，用过碘酸-希夫(PAS)试剂对切片进行多葡聚糖染色，用苏木精复染，并通过光学显微镜进行分析。结果(图2A)显示，大脑、肝脏、心脏和外周神经中的多葡聚糖水平显著降低，而对肌肉多葡聚糖没有明显影响。通过生物化学方法确定的总糖原水平也受到相应影响(图2B)。这些结果可能解释了在运动参数和动物茁壮成长方面观察到的改善(图1A-1M)。

药代动力学分析有助于解释化合物1在原位的作用，而不管其在分离细胞中修饰多葡聚糖的先天能力如何。原因是在组织中的到达时间、分布和稳定性是任何药剂的原位活性的关键决定因素。为了确定化合物1在不同组织中的分布和动力学参数，正如在功效实验中所做的那样，本发明人通过皮下注射用250mg/kg化合物1治疗Gbe^ys/ys小鼠。然后在给药后0、30、60、90和210min处死小鼠，并收集100μL血清以及大脑、肾脏、后肢骨骼肌、心脏、肝脏和脾脏组织，匀浆，提取，并通过液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)分析它们的化合物1水平。结果示出在图2C中。化合物1对不同组织中糖原和多葡聚糖含量的差异影响与其在每种相应组织中的差异分布和停留时间相匹配。在肝脏中观察到多葡聚糖/糖原减少的最高程度，与在所述器官中观察到的化合物1的最高停留时间/持久性相匹配(估计半衰期超过3h)。心脏和大脑显示出化合物1的中等水平。然而，这些水平持续到注射后60分钟，这可能解释了在这些组织中观察到的化合物1介导的多葡聚糖和糖原含量的减少。另一方面，肌肉仅显示出可忽略不计的化合物1积累，这与所述化合物对肌肉糖原和多葡聚糖含量缺乏影响相一致。基于所使用的取样时间，研究的所有组织达到C_max的时间均为30min，表明对所有这些组织来说吸收速率相近。在肝脏和肾脏中观察到最高的C_max，与它们公认的快速灌注相匹配。不出所料，在已知灌注不良的器官骨骼股四头肌肌肉中观察到最低的C_max。

实施例3

化合物1在体内增强糖类代谢并改善代谢检查(metabolic panel)

使用代谢笼在体内测定化合物1对各种代谢参数的影响。整个动物水平上的燃料偏好由呼吸商(RQ，产生的CO₂与消耗的O₂的比率)决定。RQ越低表示脂肪消耗越高，而RQ越高表示糖类消耗越高。如结果(图3A)所示，化合物1将RQ提高到甚至高于野生型(wt)动物的水平。由化合物1诱导的总能量消耗(图3B)和以脂肪消耗为代价的糖类消耗(图3C和3D)的平行增加，表明化合物1刺激糖原动员，这是一个治疗优势，因为Gbe^ys/ys小鼠将糖原储存为不溶性和病理性多葡聚糖。对步行活动(图3E)以及食量和水分摄入(图3F-3H)的刺激与受影响动物中的糖类分解代谢受到化合物1刺激这一观察相一致。此外，总的来说，增加的燃料燃烧和食物摄入表明化合物1可以提高受影响动物中的代谢效率。

本发明人进一步测试了化合物1是否能够校正在Gbe^ys/ys小鼠中观察到的低血糖和高脂血症。这种效果预期来自于能够诱导肝糖原分解代谢并随后升高血糖的药剂。9.5月龄Gbe^ys/ys小鼠的血液生物化学测试结果表明，在用化合物1治疗后，小鼠的特征性低血糖和高脂血症被校正到对照水平(图3I)。肌肉(肌酸激酶)和肝脏(丙氨酸转移酶)功能不受这种治疗的影响(图3I)。

实施例4

化合物1增强在糖原过载的APBD患者细胞中的分解代谢

在体内观察到的RQ向糖类分解代谢的迁移促使发明人研究糖类分解代谢是否也在细胞内被上调。为此，并且特别是由于糖原水平在源自于不同APBD患者的成纤维细胞中具有高度多样性(图4A)，本发明人首先旨在诱导生理性糖原过载或糖原负荷状况，相当于在各组织中发现的状况。本发明人发现糖原负荷可以通过48h葡萄糖饥饿，然后补充糖24h来产生，这可能诱导葡萄糖摄取加速和随后的糖原合成。这种饥饿/补充条件确实增加了细胞内糖原水平，正如PAS染色所证实的(图4B)。此外，一项基于多参数高含量成像的表型分析显示，在糖原负荷条件下，细胞面积、核强度以及更重要的是线粒体质量特征(参见图4C中的方框)与健康对照(HC)的偏差大于仅仅葡萄糖饥饿的细胞。因此，本发明人选择这种糖原负荷条件，以使用ATP速率测定法(Agilent’s Seahorse ATP速率测定法)在细胞水平上分析分解代谢。结果(图4D)显示，在细胞水平上，144DG11 A不仅提高了总ATP产量，还以线粒体(OxPhos)ATP产量为代价提高了糖酵解ATP产量的相对贡献。在HC和APBD患者的皮肤成纤维细胞中都观察到了这种现象。在增加糖酵解对ATP产生的贡献方面，在测定时急性补充144DG11比用所述化合物预处理48h更加有效。这些结果表明，源自于144DG11介导的增强的糖类分解代谢的葡萄糖可用于ATP的产生。

实施例5

化合物1与溶酶体膜蛋白LAMP1结合

本发明人研究了144DG11的作用机制。为此，本发明人首先决定确定其分子靶。将向列式蛋白质组织技术(NPOT，Inoviem,Ltd.)应用于APBD患者成纤维细胞的匀浆物。NPOT分析发现，只有当144DG11被添加到细胞匀浆物中时，才会在144DG11周围独特地产生蛋白质异源组装体(图5A)。该分析的下一步鉴定了APBD患者成纤维细胞中与144DG11相互作用的蛋白质靶的相互作用组。有趣的是，正如Inoviem的基于几种生物信息学工具的基因本体论分析所揭示的，在APBD患者成纤维细胞中与144DG11相互作用的异源组装体中的蛋白质是自噬或溶酶体蛋白(图5B)。此外，本发明人通过细胞热迁移测定法测试了144DG11与通过NPOT发现的8个靶中的6个靶的特异性相互作用。结果(图5C)表明LAMP1而不是其他蛋白质靶直接与144DG11相互作用。这一发现涉及一种新的致病假说，所述假说将细胞糖原过载与糖原通过含有淀粉结合结构域的蛋白1向溶酶体的运输联系起来。为了验证144DG11与LAMP1的相互作用，本发明人使用了表面等离子体共振(SPR)技术。SPR数据(图5D)显示，144DG11仅在溶酶体pH 4.5-5而不在细胞质pH 7下与LAMP1的腔体部分特异性且剂量依赖性结合，其中一些结合始于中间pH 6。总之，这些结果构成了144DG11的特异性靶是1型溶酶体蛋白LAMP1的有力和可接受的证据，所述LAMP1被广泛用作溶酶体标记物，并且是一种已知的溶酶体功能调节物。然而，这种结合的表观K_D相对高(6.3mM)，这可能通过缓慢的k_on(图5D中的结合速率，pH4.5)来解释。本发明人假设，这种缓慢的结合速率可以通过由于糖基化位点处大量的寡糖而使144DG11的扩散受到抑制来解释。因此，本发明人用化学去糖基化的腔体LAMP1结构域重复了SPR实验。然而，脱糖基化的LAMP1不结合144DG11，可能是由于脱糖基化诱导的深刻的结构变化(图12A-12B)，因此发明人无法测试寡糖空间位阻是否影响144DG11与LAMP1的结合动力学。本发明人通过基于结构的计算对接进一步研究了144DG11与LAMP1的结合。在搜索LAMP1中化合物1的推定结合位点的过程中，本发明人分析了其腔体结构域的N-端和C-端子结构域(分别为残基A29-R195和S217-D378)，它们具有相似的拓扑结构。基于小鼠LAMP1 C-端结构域的已知晶体结构(PDB ID 5gv0)，在溶酶体内pH5下对这些结构域进行建模并对抗诱饵计算对接到化合物1。图5E示出了通过三种不同算法预测的化合物1的LAMP1结合口袋(残基F50-D55、N62、L67、F118、Y120-L122、T125、L127-S133、N164-V166)：SiteMap、FtSite和fPocket。通过三种不同的程序预测到相同的结合位点是非常罕见的，因此强烈地表明化合物1与LAMP-1的N-端处的特定位点结合。正如可以在图5E中看到的，Asn连接的寡糖远离预测的化合物1结合位点，因此预计不会直接干扰其结合。然而，它们仍然可能影响化合物1的扩散。

实施例6

化合物1增强LAMP1敲除诱导的糖原自溶酶体降解和分解代谢

化合物1在APBD原代成纤维细胞中具有增加的自噬通量。这通过在化合物1存在下对溶酶体抑制剂的敏感性增加来证明。正如可以在图6A中看到的，与未处理的细胞相比，在化合物1处理的细胞中溶酶体抑制剂更多地提高LC3ii/LC3i比率(自噬停止)。化合物1引起的自噬通量的增加也通过降低自噬底物p62的水平来说明(图6A)。此外，APBD模型Gbe^ys/ys小鼠肝脏切片的透射电子显微镜分析表明，在用化合物1治疗后溶酶体糖原减少(图6B)。

为了确定化合物1与LAMP1之间相互作用的功能重要性，本发明人使用携带针对LAMP1的带有GFP标签的shRNA的慢病毒载体敲除了LAMP1。由于LAMP1敲除(KD)在表达后24h(或慢病毒感染后96h)变得具有细胞毒性，因此图6C-6D中的LAMP1-KD实验在24h不补充葡萄糖的血清饥饿条件下进行(图4A-4D)，以诱导自噬并维持细胞活力。本发明人预期LAMP1-KD中和化合物1的据称由其与LAMP1的相互作用介导的作用。然而，令人惊讶的是，将化合物1补充到LAMP1敲除的细胞中增强了敲除效应：被LAMP1-KD增强的自噬通量被LAMP1相互作用的化合物1进一步增强(图6C)。化合物1增强LAMP1-KD效应的观察表明，化合物1与LAMP1的相互作用是抑制性的，就像许多其他小分子-蛋白质相互作用一样。此外，为了测试LAMP1-KD和化合物1是否通过改善溶酶体功能来增强自噬通量，本发明人使用pH比率的染料Lysosensor^TM来量化溶酶体酸化，所述染料基于黄色/蓝色发射比率来量化pH。结果显示，LAMP1-KD和化合物1处理(在GFP和LAMP1-KD APBD细胞中)都导致溶酶体酸化，但LAMP1-KD程度更高。本发明人通过流式细胞术(图6D，上图)显示总体上细胞酸化，因为375nm激发的黄色/蓝色发射增加，并且通过共聚焦显微镜显示，这种酸化与溶酶体中较亮的黄色荧光有关(图6D，中图)。重要的是，正如PAS染色所证实的，在用GFP对照和shLAMP1 GFP慢病毒两者转导的APBD成纤维细胞中，LAMP敲除降低了细胞糖原水平，化合物1略微增强了这种作用(图6D，下图)。

为了测试LAMP1-KD和化合物1对燃料利用的影响，本发明人再次在用化合物1急性或慢性处理的LAMP1-KD和对照APBD成纤维细胞中使用了ATP速率测定(图4A-4D)。结果(图6E)显示，与在GFP转导的对照中(对照UT-S相比于对照UT+S，p<0.36)相比，LAMP1-KD中的饥饿(LAMP1-KD-S UT相比于LAMP1-KD+S UT，p<0.0001)更具限制性(降低了总ATP产生)。在LAMP1-KD细胞中，饥饿还增加了呼吸对ATP产生的相对贡献(在LAMP1-KD-S UT中为78％，相比于LAMP1-KD+S UT中的48％(橙色条))。这些观察结果与呼吸与糖酵解相比更高的ATP生产效率并且可能与LAMP-KD与对照细胞相比更高的ATP需求相一致，正如它们在基础条件下更高的总ATP生产率所表明的(参见LAMP1-KD+S UT相比于对照+S UT，p<0.01)。化合物1对LAMP1-KD和对照细胞的作用与它在LAMP1-KD细胞与对照细胞中相比分解代谢(ATP产生)自噬通量的选择性增加相一致(图6C)：在非饥饿条件下，补充化合物1显著增加了LAMP1-KD细胞中的总ATP和呼吸ATP生产(参见LAMP1-KD+S UT相比于LAMP1-KD+S慢性(对于总ATP生产，p<0.03；对于呼吸ATP生产，p<0.0008)和LAMP1-D+S急性(对于总ATP和呼吸ATP生产，p<0.01))，而在对照细胞中它仅轻微影响ATP生产，甚至急剧降低它(参见对照UT+S相比于对照+S慢性(p<0.1)和对照UT+S急性(对于降低来，p<0.0008))。在饥饿条件下，对照细胞仅对急性补充的化合物1的瞬时效应做出响应增加呼吸ATP生产(参见对照UT-S相比于对照-S急性，p<0.004)。在对照细胞中未观察到慢性补充化合物1的显著效应(参见对照UT-S相比于对照-S慢性，p<0.3)。相反，饥饿的LAMP1-KD细胞作为对急性补充化合物1的响应增加了呼吸和糖酵解ATP两者，可能反映了源自于糖原降解生的葡萄糖向糖酵解的短期转移(参见LAMP1-KD-S UT相比于LAMP1-KD-S急性(对于glycoATP，p<0.0003；对于mitoATP，p<0.003)。对慢性施用化合物1做出响应，在LAMP-KD细胞中只有呼吸ATP生产增加(参见LAMP1-KD-SUT相比于LAMP1-KD-S慢性(对于glycoATP，p<0.15；对于mitoATP，p<0.0002)。

实施例7

化合物1在细胞水平上恢复异常的线粒体和溶酶体特征

由于发明人显示化合物1的作用模式涉及增加ATP生产的溶酶体分解代谢，因此本发明人决定研究由化合物1调节的细胞特征是否与其分解代谢作用有关。作为第一步，本发明人需要一种既是整体性又是特征特异性的分类方法，其将能够量化APBD与HC细胞之间的差异，从而预估化合物1对APBD细胞的恢复作用。使用InCell2200高含量图像分析仪，本发明人对APBD和年龄和性别匹配的HC皮肤成纤维细胞进行了全面的多参数分析。这项基于图像的表型(IBP)活动包括45个独立的细胞参数，涵盖了广泛的细胞形态谱。通过分析来自于17位APBD患者和5位HC的皮肤成纤维细胞，本发明人证明了来自于APBD患者的皮肤成纤维细胞在表型上与HC皮肤成纤维细胞是可区分的(图7A)。在确定了IBP是一种信息丰富且灵敏的分类工具后，本发明人测试了化合物1对IBP特征的影响：仅限于4个颜色通道并因此排除了溶酶体标记物(其被单独分析(图7C))的分析(图7B，上图)显示，化合物1主要影响细胞核和线粒体膜电位(TMRE)参数，这是受疾病表型影响最大的特征之一。正如预期，当将化合物1处理的APBD成纤维细胞与未处理的HC成纤维细胞进行比较时(所述比较与临床环境更加相关)，这种效果更为显著(-logP值更高)。正如为其他特征所证实的(图4D和6C-6E)，化合物1处理本身可能对受影响细胞和健康细胞两者具有相似的效果，因此可能使所述两种表型在处理的细胞中更紧密地结合在一起，部分掩盖了该化合物对APBD相比于HC的影响。图7B中的下图确实显示，对于大多数特征来说，化合物1在受影响细胞和健康细胞中都引起了相同的趋势(增加或减少)(注意，APBD/化合物1(带斑点的条)应与APBD(空白条)进行比较，HC/化合物1(黑色条)应与水平线进行比较)。化合物1还降低了APBD细胞中的溶酶体大小(图7C)，这可能与其改善自噬通量(图6)和溶酶体功能有关，正如在健康细胞与溶酶体受损细胞中相比所观察到的。此外，化合物1还使在APBD中被疾病状态去极化的线粒体膜电位(MMP)超极化(图7B)，这与增强的自噬分解代谢可能增加线粒体燃烧相符。

为了验证由疾病状态和化合物1调节的细胞特征的基于成像的分析，本发明人分析了疾病和治疗对蛋白质表达的影响。如图7D中所示，在48h饥饿下，与HC细胞相比，在APBD患者中所分析的2898种蛋白质中有12.2％和6.8％分别被上调和下调。作为重要的对照，GBE事实上在APBD细胞中被下调(图7D)。当在饥饿后补充葡萄糖(糖原负荷，图4A-4D)时，只有6％的蛋白质被上调，5％的蛋白质被下调，可能表明需要更特定的蛋白质子集来管理过量的糖原负荷。例如，自噬蛋白(Fyco1、Rab12、Rab7A、PIP4K2B、SQSTM1和SNAP29)仅在糖原负荷后在APBD细胞中上调。然后，本发明人研究了化合物1在饥饿(48h饥饿)和糖原过量(48h饥荒/24h Gluc)的APBD细胞中的蛋白质组学效应，其分别仅修饰了所有蛋白质的1.7％和1.3％。化合物1的明显校正作用可以通过被APBD患病状态下调或上调的蛋白质来揭示，这些蛋白质被化合物1反向上调或下调(图7E)。将发现的蛋白质(49种上调，39种下调，图7E)通过DAVID功能注释工具根据包括最高数量的蛋白质的细胞组分类别(CellularComponent category)进行分析。根据受化合物1调节的细胞特征(图7B)，被化合物1上调的蛋白质属于8个重要的基因本体论(GO)项，其包括溶酶体、分泌途径和氧化磷酸化蛋白(图7F，左图)。

有趣的是，在糖原负荷下，被APBD下调并被化合物1上调(“校正”)的蛋白质是溶酶体糖基化酶艾杜糖醛酸酶(Iduronidase)和磷酸甘露糖变位酶2(Phosphomannomutase2)，而在饥饿下则是核酸结合蛋白GRSF1和HNRPCL1，明显与糖原和溶酶体分解代谢没有直接关系。在两种条件下，脂肪生成蛋白HSD17B12被APBD降低并被化合物1诱导。被化合物1下调的蛋白质属于4个GO项，包括分泌途径和大分子复合物(图7F，右图)。被APBD提高并且相反被化合物1减少的蛋白质在饥饿细胞中属于溶酶体分选(VPS16)和糖类生物合成(NANS)，在糖原过载的细胞中属于转录(RUBL1)、信号转导(STAM2)和pH调节(SLC9A1)。有趣的是，在心肌细胞中Na⁺/H⁺反向转运体SLC9A1的药理学抑制诱导自噬通量，其在APBD成纤维细胞中被化合物1的下调也是如此(图6)。在饥饿和糖原负荷两种条件下被化合物1下调的蛋白质是也与溶酶体分选有关的逆向运输调控物VPS51。总之，化合物1的APBD校正作用至少部分与溶酶体功能有关，本发明人已经很好地确定了所述化合物对溶酶体功能的调节(图5-6)。

这项工作显示，HTS发现的命中化合物1可以在体内和离体模型中治疗APBD。在化合物1治疗后，本发明人观察到运动、存活率和组织学参数的改善(图1-2)。由于APBD由不可消化的糖类引起，这些改善表明化合物1影响糖类代谢，因此鼓励本发明人进行体内代谢研究(图3A-3I)。这是首次在GSD动物模型中进行体内代谢研究。由于APBD小鼠将糖原作为不溶性多葡聚糖储存，因此本发明人使用代谢笼(metabolic cage)来测试化合物1是否可以影响这些动物使用替代燃料(脂肪)而不是调动糖原的能力。然而，由化合物1诱导的RQ增加表明，治疗的动物实际上增加了糖类消耗而不是使用脂肪，或者化合物1增加了糖类分解代谢。这一结论得到了化合物1诱导的总能量消耗、步行活动、食量和水分摄入的增加的支持，所有这些都与分解代谢刺激相一致。由于Gbe^ys/ys小鼠和APBD患者将糖原作为不溶性和病理性多葡聚糖储存，其分解代谢构成了一种治疗优势。糖原分解代谢也是一种优选的治疗策略，原因如下：理论上，APBD的治疗方法应靶向PG的形成或预先形成的PG或糖原的降解。PG的形成依赖于GYS于GBE活性之间的平衡——GYS/GBE活性比越高，形成的可溶性糖原越细长、分支越少，它们与较短的链相比优先形成PG。另一方面，如化合物1所进行的，对预先存在的PG和糖原(PG前体)的降解是一个更直接的靶点，预计比GYS抑制剂愈创木酚对PG重新形成的抑制更加有效，这避免了预先制造的有害PG。事实上，在LD模型小鼠中的一项研究中，显示了在疾病发作后条件性GYS敲除不能清除预先存在且有害的拉福拉(Lafora)PG体。

药物发现的一个关键挑战是确定药物候选物的相关靶点和作用机制。为此，本发明人在这里应用了Inoviem的蛋白质靶鉴定方法。这种被公认为是鉴定小分子的蛋白质靶的领先工具并鉴定到了几个治疗相关靶的技术，在细胞的天然生理环境中鉴定化合物-靶的相互作用。这意味着所鉴定的实体并不像其他技术中那样是靶本身，而是主要靶及其信号传导通路或功能性四元网络。如对化合物1所做的那样，确定被测试化合物调节的细胞途径对于针对同一途径的其他药物的假定制剂来说是重要的，这可以在临床中在适当时候显著提高治疗效果。此外，/>还可以通过过滤掉混杂的结合物并排除与阴性对照(在这种情况下，HTS中的阴性化合物)和内源性配体的结合来确认靶结合的特异性(图5A)。然而，尽管根据这些标准，化合物1与LAMP1以及通过它与其功能性四元网络的结合(图5B)在SPR验证中是特异性的并表现出剂量响应和溶酶体pH依赖性(图5D)，但它的表观LAMP1结合K_D相对高(6.3mM)，这似乎可能阻碍它的临床应用。这个问题可以如下来解决：1.药理学相关发现是化合物1与溶酶体-自噬体相互作用组特异性相互作用(图5B)，并且它是无毒的(图8-11，表2)。

这一发现排除了与假定的脱靶点的非特异性相互作用，这是低亲和力(高K_D)配体的主要关注点。提高低亲和力药物候选物的亲和力的传统方法是基于药物化学。在GSD中，这种方法被用于提高GYS抑制剂的亲和力。然而，与GYS(它的减少相对可容忍)相反，LAMP蛋白属于内部整理的(house keeping)自溶酶体机制(图5B)，其抑制可能损害围产期生存能力，正如例如在LAMP2没有补偿性增加的情况下LAMP1-KD所发生的情况。因此，高亲和力LAMP1抑制剂可能是有毒的，正如LAMP1-KD对APBD成纤维细胞那样(图6)，并且本发明人发现的LAMP1抑制剂化合物1的低亲和力实际上可能通过减轻对内部整理功能的抑制而构成临床优势。此外，计算分析表明，LAMP1中的化合物1结合口袋(图5E)是高度可药用的，即药物化学分析有望发现化合物1的可以改善其效果的各种替代品。

含有LAMP1的异源组装体(图5B)作为功能性网络靶而不是单一蛋白质的发现，开启了一种基于自噬调节的治疗模式，这实际上扩展了治疗靶的范围。自溶酶体网络不仅在图5B中被发现，而且通过本发明人的多特征成像分析，结合生物能学参数，可能通过与燃料可利用性的自噬相关的变化来修改(图7B和7C)。蛋白质组学数据(图7D-7F)和细胞中化合物1对自噬通量的实际增强(图6)，为该途径作为化合物1的靶的相关性提供了额外的支持。

从机制上讲，LAMP1是一种I型溶酶体膜蛋白，其与LAMP2一起在溶酶体的完整性和功能中发挥关键作用。因此，LAMP1，但更多的是LAMP2，对于溶酶体参与自噬过程也很重要。因此，LAMP1敲除通常伴有自噬减少。然而，与目前的结果一致，其他工作显示LAMP1-KD实际上提高了自噬功能，另一种跨膜溶酶体蛋白TMEM192的工作也显示了这一点。这些明显的差异可能取决于细胞类型、测定条件以及甚至是自噬的定义，因为自噬通量并不总是通过对溶酶体抑制剂的易感性来定义的。为了预测化合物1对LAMP1的作用的分子机制，本发明人使用了计算化学。计算结果预测化合物1结合位点位于LAMP1:LAMP1相互作用界面处(图13A)(位于N-端结构域)，并表明所述化合物抑制LAMP1间相互作用。根据实验数据，LAMP1的N-端结构域的切断损害LAMP1/LAMP1和LAMP1/LAMP2组装，而移动性更强的LAMP2 N-端结构域的切断导致相反的效果(图13B)。因此，本发明人可以假设LAMP1N-端结构域促进LAMP1/LAMP1和LAMP1/LAMP2相互作用，并且通过化合物1在N-端结构域处抑制LAMP1/LAMP1或LAMP1/LAMP2相互作用将降低LAMP1的有效溶酶体膜密度。因此，可以假设化合物1处理等同于LAMP1-KD，这可以解释其对LAMP1-KD效应的增强。化合物1诱导的LAMP1水平的轻微增加(1.2倍)可能反映了结合介导的稳定化(图5C)，并且很可能不会显著抵消化合物1介导的在膜密度方面的降低。本发明人假设化合物1介导的在LAMP1膜密度方面的降低通过记录到的LAMP1-KD后溶酶体膜中LAMP2的增加来提高糖吞噬。观察到LAMP2通过与自噬体外周蛋白GORASP2的相互作用来增强自噬体-溶酶体融合(以及因此自噬通量)。或者，LAMP1-KD/化合物1对溶酶体膜的间隔可以使糖原通过STBD1蛋白输入溶酶体(并随后降解)。重要的是，溶酶体糖原降解与其细胞质降解并行发生，并且特别是在也模拟了小鼠中的APBD的GSDIV小鼠模型中，溶酶体糖原酶α-葡萄糖苷酶的过表达校正了病理。

总之，这项工作证明化合物1是一种新的分解代谢化合物，能够通过激活自噬途径降解PG和过度积累的糖原。本研究为化合物1在治疗目前尚无治疗替代方案的APBD患者中的临床应用奠定了基础。此外，它将化合物1定位为通过安全减少糖原过载来治疗其他GSD的先导化合物。

实施例8

144DG11化合物的治疗特性

144DG11可以在自噬被扰乱的溶酶体贮积病(LSD)庞贝病(Pompe disease)(PD)中激活自噬(图15)。数据显示，在源自于PD患者的成纤维细胞中，自溶酶体抑制剂长春碱(vinblastine)提高了脂质化自噬标记物LC3(LC3II)与非脂质化LC3(LCOI)的比率。这个比率是最被认可的自噬和自噬通量的标志物。通过用50μM 144DG11处理源自于血清饥饿的PD患者的成纤维细胞24h，提高了对长春碱的敏感性(即LC3II/LC3I比率增加，表明未降解的自噬底物的积累)。这些观察结果表明，与GSD APBD中一样，144DG11也可以在自噬被扰乱的典型LSD PD中激活自噬。这有力地表明，144DG11对于其中自噬的扰乱是主要致病因素的LSD也具有治疗潜力。

在源自于PD患者的成纤维细胞中144DG11(24h，50μM)可以减少糖原，这也在源自于APBD患者的成纤维细胞中得到证明(图16)。

结果(图17)显示，144DG11增加总ATP产量，并在损害线粒体(OxPhos)ATP产量的情况下提高糖酵解ATP产量的相对贡献。这种现象在PD中被选择性地观察到，而在健康对照(HC)初代皮肤成纤维细胞中没有观察到。在增加糖酵解对ATP产量的贡献方面，144DG11的测定补充比用所述化合物预处理24h更加有效，所述预处理对ATP产量的影响并不显著，这可能是由于细胞适应。这些结果表明，源自于144DG11介导的增强的自噬分解代谢的葡萄糖可用于ATP生产。这些观察结果与在APBD成纤维细胞中做出的观察结果一致，因此证明144DG11是一种对总体来说贮积病具有广泛治疗能力的通用分解代谢增强剂。

图17中的结果表明，源自于增强的糖类分解代谢的葡萄糖可用于ATP生产，支持未来将144DG11开发成一种有效的抗肥胖药物。本发明人预期144DG11在西方饮食(高脂/高糖)诱导的肥胖症中更加有效。在GSD4(Kakhlon等，(2021))和GSD3(图18)中观察到144DG11可以降低血浆甘油三酯水平，这有力地表明144DG11可以被开发成一种有效的抗肥胖疗法。

正如144DG11介导的总LC3和p62的降低所示，该化合物在源自于阿兹海默氏病(AD)模型小鼠的脑小神经胶质细胞中诱导自噬(图19)。这一观察结果很重要，因为它证明了144DG11在治疗AD方面的治疗潜力。作为大脑中最促炎性的组织，小神经胶质细胞目前是AD创新治疗研究的中心。此外，由于神经炎症现在被公认是AD的主要致病因素，并且因为小神经胶质细胞自噬和线粒体自噬的激活是一种主要治疗策略(参见例如Eshraghi等，(2021))，144DG11有望成为一种潜在的AD治疗剂。

144DG11也在原发性人类非小细胞肺癌(NSCLC)细胞中诱导自噬(图20)。在NSCLC中自噬的诱导具有已被证实的治疗价值(参见例如Wang等，(2021))。值得注意的是，在小神经胶质细胞和NSCLC细胞中144DG11并未降低糖原水平，表明在这些细胞中糖原不被可以被144DG11改变的自溶酶体途径降解。这种对糖原缺乏影响的情况也表明，在这些细胞中糖原积累可能不是病理性的。然而，144DG11对有害包涵物的自噬清除可能在许多不同疾病状态下是有益的，正如本文所证实的。

NAD+和NADH是电子传递链、TCA循环、糖酵解、氨基酸合成、脂肪酸合成和核苷酸合成的关键前体。NAD+/NADH比率报告了总分解代谢的程度以及糖酵解与OxPhos之间的平衡。NAD+/NADH比率的提高意味着线粒体电子传递链中的电子流(注意，不是线粒体ATP生产)和糖酵解的加速，以更好地管理代谢需求。此外，通常与NAD+/NADH比率提高相关的Sirt1诱导，是一种有充分文献记载的创新性抗衰老、模拟卡路里限制和抗癌的治疗策略(参见例如Hyun等，(2020))。因此，Gsd1a细胞中显示了NAD+/NADH比率以及Sirt1的诱导的结果(图21)，表明144DG11是一种用于多种不同代谢障碍、衰老相关的并发症和癌症的有前途的疗法。此外，144DG11下调p62，表明Gsd1a细胞中自噬通量的增加，正如在GSD4和PD细胞中所证实的。

尽管本发明已结合其具体实施方案进行了描述，但很明显，许多替代方案、修改和变化对本领域技术人员来说是显而易见的。因此，本发明旨在涵盖落入随附的权利要求书的精神和广泛范围之内的所有此类替代方案、修改和变化。

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均整体通过引用并入本说明书，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体且单独地指示通过引用并入本说明书。此外，本申请中任何参考文献的引用或识别不应被解释为承认该参考文献可用作本发明的先有技术。在使用章节标题的情况下，它们不应被解释为必然是限制性的。

序列表

<110> 哈达斯特医疗研究服务和开发有限公司

雷蒙特亚特特拉维夫大学有限公司

<120> 溶酶体相关膜蛋白靶向化合物及其用途

<130> HDST-RMT-P-015-PCT

<150> US 63/149,730

<151> 2021-02-16

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 64

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 1

Phe Ser Val Asn Tyr Asp Thr Lys Ser Gly Pro Lys Asn Met Thr Phe

1 5 10 15

Asp Leu Pro Ser Asp Ala Thr Val Val Leu Asn Arg Ser Ser Cys Gly

20 25 30

Lys Glu Asn Thr Ser Asp Pro Ser Leu Val Ile Ala Phe Gly Arg Gly

35 40 45

His Thr Leu Thr Leu Asn Phe Thr Arg Asn Ala Thr Arg Tyr Ser Val

50 55 60

<210> 2

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 2

Phe Ser Val Asn Tyr Asp

1 5

<210> 3

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 3

Asn Val Thr Val

1

<210> 4

<211> 417

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Met Ala Ala Pro Gly Ser Ala Arg Arg Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Gly Leu Met His Cys Ala Ser Ala Ala Met Phe Met

20 25 30

Val Lys Asn Gly Asn Gly Thr Ala Cys Ile Met Ala Asn Phe Ser Ala

35 40 45

Ala Phe Ser Val Asn Tyr Asp Thr Lys Ser Gly Pro Lys Asn Met Thr

50 55 60

Phe Asp Leu Pro Ser Asp Ala Thr Val Val Leu Asn Arg Ser Ser Cys

65 70 75 80

Gly Lys Glu Asn Thr Ser Asp Pro Ser Leu Val Ile Ala Phe Gly Arg

85 90 95

Gly His Thr Leu Thr Leu Asn Phe Thr Arg Asn Ala Thr Arg Tyr Ser

100 105 110

Val Gln Leu Met Ser Phe Val Tyr Asn Leu Ser Asp Thr His Leu Phe

115 120 125

Pro Asn Ala Ser Ser Lys Glu Ile Lys Thr Val Glu Ser Ile Thr Asp

130 135 140

Ile Arg Ala Asp Ile Asp Lys Lys Tyr Arg Cys Val Ser Gly Thr Gln

145 150 155 160

Val His Met Asn Asn Val Thr Val Thr Leu His Asp Ala Thr Ile Gln

165 170 175

Ala Tyr Leu Ser Asn Ser Ser Phe Ser Arg Gly Glu Thr Arg Cys Glu

180 185 190

Gln Asp Arg Pro Ser Pro Thr Thr Ala Pro Pro Ala Pro Pro Ser Pro

195 200 205

Ser Pro Ser Pro Val Pro Lys Ser Pro Ser Val Asp Lys Tyr Asn Val

210 215 220

Ser Gly Thr Asn Gly Thr Cys Leu Leu Ala Ser Met Gly Leu Gln Leu

225 230 235 240

Asn Leu Thr Tyr Glu Arg Lys Asp Asn Thr Thr Val Thr Arg Leu Leu

245 250 255

Asn Ile Asn Pro Asn Lys Thr Ser Ala Ser Gly Ser Cys Gly Ala His

260 265 270

Leu Val Thr Leu Glu Leu His Ser Glu Gly Thr Thr Val Leu Leu Phe

275 280 285

Gln Phe Gly Met Asn Ala Ser Ser Ser Arg Phe Phe Leu Gln Gly Ile

290 295 300

Gln Leu Asn Thr Ile Leu Pro Asp Ala Arg Asp Pro Ala Phe Lys Ala

305 310 315 320

Ala Asn Gly Ser Leu Arg Ala Leu Gln Ala Thr Val Gly Asn Ser Tyr

325 330 335

Lys Cys Asn Ala Glu Glu His Val Arg Val Thr Lys Ala Phe Ser Val

340 345 350

Asn Ile Phe Lys Val Trp Val Gln Ala Phe Lys Val Glu Gly Gly Gln

355 360 365

Phe Gly Ser Val Glu Glu Cys Leu Leu Asp Glu Asn Ser Met Leu Ile

370 375 380

Pro Ile Ala Val Gly Gly Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ile Val Leu

385 390 395 400

Ile Ala Tyr Leu Val Gly Arg Lys Arg Ser His Ala Gly Tyr Gln Thr

405 410 415

Ile

Claims

1.一种药物组合物，其用于预防或治疗选自溶酶体贮积相关疾病和自噬失调相关疾病的疾病或障碍，所述药物组合物包含一种化合物、其药学上可接受的盐、异构体或互变异构体，其中所述化合物由式I表示：

其中：

表示单键或双键；

n和m各自独立地表示1至3范围内的整数；

R和R¹各自独立地表示氢或不存在；并且

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中n和m是1。

3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中R²、R⁷和R⁸表示甲基。

4.根据权利要求1至3中的任一项所述的药物组合物，其中所述化合物选自：

或两者。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的药物组合物，其中所述溶酶体贮积相关疾病选自戈谢病、法布里病、泰-萨二氏病、粘多糖(MPS)病、天冬氨酰葡糖胺尿症、GM1神经节苷脂沉积症、克腊伯氏病(球形细胞性脑白质营养不良症或半乳糖神经酰胺脂沉积症)、异染性脑白质营养不良症、桑霍夫病、II型粘脂贮积病(I细胞病)、IIIA型粘脂贮积病(假Hurler性多发性营养不良)、C2型和C1型尼曼匹克病、Danon病、游离唾液酸贮积病、IV型粘脂贮积病和多发性硫酸酯酶缺乏症(MSD)、代谢障碍、肥胖症、II型糖尿病和胰岛素抗性。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的药物组合物，其中所述自噬失调相关疾病的特征在于自噬活性降低或失调。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中所述以自噬活性降低或失调为特征的自噬失调相关疾病选自阿兹海默氏病和与自噬活性降低相关的癌症。

8.一种用于在有需要的受试者中治疗或预防选自溶酶体贮积相关疾病和自噬失调相关疾病的疾病或障碍的发展的方法，所述方法包括向所述受试者给药治疗有效量的权利要求1至7中任一项所述的药物组合物。

9.一种药剂，其结合溶酶体相关膜蛋白1(LAMP-1；SEQ ID NO：1；FSVNYDTKSGPKNMTFDLPSDATVVLNRSSCGKENTSDPSLVIAFGRG HTLTLNFTRNATRYSV)的N-端结构域的区域，其中所述区域包含下述任一者：

SEQ ID NO：2(FSVNYD)；和

SEQ ID NO：3(NVTV)。

10.根据权利要求9所述的药剂，其中所述药剂抑制LAMP1:LAMP1相互作用。

11.根据权利要求9或10所述的药剂，其用于预防或治疗选自溶酶体贮积病、多葡聚糖积累、异常糖原积累和自噬失调相关疾病的疾病或障碍。

12.根据权利要求9至10中任一项所述的药剂，其中所述疾病或所述障碍选自糖原贮积病(GSD)、成人多葡聚糖体病(APBD)和拉福拉病、戈谢病、法布里病、泰-萨二氏病、粘多糖(MPS)病、天冬氨酰葡糖胺尿症、GM1神经节苷脂沉积症、克腊伯氏病(球形细胞性脑白质营养不良症或半乳糖神经酰胺脂沉积症)、异染性脑白质营养不良症、桑霍夫病、II型粘脂贮积病(I细胞病)、IIIA型粘脂贮积病(假Hurler性多发性营养不良)、C2型和C1型尼曼匹克病、Danon病、游离唾液酸贮积病、IV型粘脂贮积病和多发性硫酸酯酶缺乏症(MSD)、代谢障碍、肥胖症、II型糖尿病和胰岛素抗性。

13.根据权利要求9至11中任一项所述的药剂，其中所述药剂选自：

14.一种药物组合物，其包含根据权利要求9至13中任一项所述的药剂和药学上可接受的载体。

15.根据权利要求14所述的药物组合物，其在溶液中具有4至6.5之间的pH。

16.根据权利要求14或15所述的药物组合物，其包含100nM至5mM的所述药剂。

17.一种用于在有需要的受试者中治疗或预防与溶酶体贮积、多葡聚糖积累或异常糖原积累相关的疾病或障碍的发展的方法，所述方法包括向所述受试者给药治疗有效量的根据权利要求14至16中任一项所述的药物组合物。

18.一种用于确定化合物对预防或治疗与溶酶体贮积、多葡聚糖积累或异常糖原积累相关的疾病或障碍和自噬失调相关疾病的适合性的方法，所述方法包括将所述化合物与溶酶体相关膜蛋白1(LAMP-1；SEQ ID NO：1)的N-端结构域内的口袋结构域接触，其中所述化合物与所述口袋的结合指示了所述化合物在治疗所述疾病或障碍中有效。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述结合是与下述一者或多者的结合：SEQ IDNO：2(FSVNYD)；和SEQ ID NO：3(NVTV)。

20.根据权利要求18所述的方法，其中所述结合通过LAMP1:LAMP1相互作用的抑制来确定。

21.根据权利要求18所述的方法，其中所述结合通过LAMP1间相互作用的抑制来确定。