ES2967218T3

ES2967218T3 - Compuestos para el tratamiento de los trastornos de almacenamiento de glucógeno

Info

Publication number: ES2967218T3
Application number: ES18757731T
Authority: ES
Inventors: Or Kakhlon; Miguel Enrique Weil; Leonardo Javier Solmesky
Original assignee: Ramot at Tel Aviv University Ltd; Hadasit Medical Research Services and Development Co
Current assignee: Ramot at Tel Aviv University Ltd; Hadasit Medical Research Services and Development Co
Priority date: 2017-02-22
Filing date: 2018-02-22
Publication date: 2024-04-29
Anticipated expiration: 2038-02-22
Also published as: IL290955B2; EP3585786C0; IL268693B; IL290955A; IL268693A; IL297569A; EP4292652A3; US20230065065A1; US11053231B2; EP4292652A2; US11891381B2; IL290955B; EP3585786A4; US20210395237A1; EP3585786A1; WO2018154578A1; HUE064637T2; EP3585786B1; PL3585786T3; US20200017484A1

Abstract

Se describen los compuestos representados por las Fórmulas generales I a IV como se describen en el presente documento. Además se describen composiciones que utilizan los compuestos descritos en el presente documento y que los utilizan para el tratamiento de trastornos de almacenamiento de glucógeno. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Compuestos para el tratamiento de los trastornos de almacenamiento de glucógeno

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[001] La presente invención, en algunas formas de realización de la misma, se refiere a composiciones farmacéuticas para el tratamiento de trastornos por almacenamiento de glucógeno.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[002] El glucógeno es un polímero compacto de unidades de glucosa con enlaces alfa-1,4 regularmente ramificadas con enlaces alfa-1,6-glucosídicos, que sirven como principal almacén de carbohidratos y reserva de energía en muchos filos.

[003] Los dos sitios principales de almacenamiento de glucógeno son el hígado y los músculos. La función principal del glucógeno varía en diferentes tejidos. En el hígado, el glucógeno sirve como reserva de glucosa para el mantenimiento de los niveles de glucosa en sangre. En el músculo, el glucógeno proporciona energía para la contracción muscular. El metabolismo del glucógeno es un proceso complejo que involucra muchas enzimas diferentes que regulan directa o indirectamente la síntesis y degradación del glucógeno. En las células de mamíferos, el glucógeno se sintetiza en el citosol mediante dos enzimas, la glucógeno sintasa (SG) y la enzima ramificadora del glucógeno (ERG). La mayor parte del glucógeno se degrada en el citoplasma (glucogenólisis) mediante una acción combinada de la glucógeno fosforilasa (GF) (escinde los enlaces 1,4-glucosídicos) y la enzima desramificadora del glucógeno (EDG) (escinde los enlaces 1,6-glucosídicos en los puntos de ramificación). Una pequeña cantidad de glucógeno se transporta a los lisosomas y la enzima alfa-glucosidasa ácida (GAA) lo digiere en glucosa.

[004] Las mutaciones en los genes que codifican estas enzimas provocan una pérdida parcial o completa de las actividades enzimáticas en los trastornos o enfermedades por almacenamiento de glucógeno (EAG), un grupo de trastornos genéticos con un metabolismo anormal del glucógeno principalmente en el hígado, los músculos y el cerebro. Actualmente se identifican más de 13 formas de EAG y se observa un amplio espectro de presentaciones clínicas. Los EAG tipos I, II, III, VI, VII y IX se reconocen actualmente como las formas más comunes y representan más del 90 por ciento de todos los casos. Algunas deficiencias pueden afectar a varios tejidos (hígado, músculo y otros tejidos) provocadas por una acumulación excesiva de glucógeno. Algunas EAG (enfermedad de cuerpos de poliglucosano del adulto (ECPA), enfermedades de Tarui y Lafora) son causadas por la acumulación intracelular de inclusiones insolubles, llamadas cuerpos de poliglucosano (CP), que están compuestos principalmente de glucógeno mal construido.

[005] El documento WO 2017013660 divulga varios péptidos sintéticos (por ejemplo, Leu-Thr-Lys-Glu) y composiciones que los comprenden para su uso en el tratamiento de EAG, como la enfermedad del cuerpo de poliglucanos en adultos.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

[006] La presente invención, en un primer aspecto, proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto representado por la Fórmula:

que incluye un tautómero o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que:

n y m son cada uno números enteros que representan, independientemente, 1, 2 o 3;

cualquiera de R1 a R4 representa un sustituyente, seleccionándose independientemente en cada aparición del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, alcoxi, hidroxi, tiohidroxi, tioalcoxi, ariloxi, tioariloxi, amino, nitro, halo, trihalometilo, ciano, amida., carboxi, sulfonamida, -S(=O)-R' y -S(=O)<2>-R', en los que R' es hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo (unido a través de un carbono en el anillo) o heteroalicíclico (unido a través de un carbono en el anillo); y

uno cualquiera de R5a-c representa cada uno de ellos alquilo C<1>-<6>.

[007] La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto representado por la Fórmula:

que incluye un tautómero, cualquier enantiómero, un diastereómero o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que cualquiera de R0912, R13 *, R14a-R14c, R15, R16 y R17a-R17b representa un sustituyente, seleccionándose independientemente en cada aparición del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C<1>-<6>, y

k es un número entero que representa, independientemente, 1, 2 o 3.

[008] La invención, en un aspecto adicional, proporciona composiciones farmacéuticas para uso en el tratamiento de afecciones médicas, incluidos trastornos de almacenamiento de glucógeno y enfermedades neurogenerativas.

[009] La invención, en un aspecto adicional, proporciona un kit de diagnóstico que comprende un compuesto según el primer aspecto.

[0010] La invención se expone además en el conjunto de reivindicaciones adjunto.

[0011] A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y/o científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o prueba de formas de realización de la invención, a continuación, se describen métodos y/o materiales ejemplares. En caso de conflicto, prevalecerá la especificación de la patente, incluidas las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son sólo ilustrativos y no pretenden ser necesariamente limitantes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0012] Algunas formas de realización de la invención se describen en el presente documento, sólo a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos. Con referencia específica ahora a los dibujos en detalle, se destaca que los detalles mostrados son a modo de ejemplo y con fines de discusión ilustrativa de las formas de realización de la invención. A este respecto, la descripción tomada con los dibujos hace evidente para los expertos en la técnica cómo se pueden poner en práctica las formas de realización de la invención.

[0013] En los dibujos:

FIGs. 1A-C presenta una detección de alto rendimiento para compuestos capaces de reducir el cuerpo de poliglucosano (CP): los fibroblastos de la piel de una enfermedad de cuerpos de poliglucosano en adultos (ECPA) (izquierda) y los sujetos de control (derecha) se fijaron con formaldehído, se digirieron con amilasa y se tiñeron con Hoechst (azul) y APS (rojo), y luego se obtienen imágenes mediante el sistema de análisis de alto contenido InCell 2000 (FIG. 1A); Una imagen representativa de las células que muestra las diferentes tinciones empleadas (de izquierda a derecha, como se indica en la figura, nuclear, ácido periódico/base de Schiff (APS), máscara celular y una imagen fusionada) (FIG. 1B); Se cultivaron fibroblastos derivados de pacientes adultos con enfermedad de cuerpos de poliglucosano (ECPA) durante 24 h en DMEM (con 5 % de FBS) y luego se agregaron 10.084 compuestos diferentes de la biblioteca DiverSet CL (Chembridge) a cada pocillo diferente a una concentración de 10 pM. Después de una incubación adicional de 24 h, las células se fijaron, el fijador se neutralizó y luego las células se permeabilizaron, se trataron con diastasa y se tiñeron con Hoechst 33342, Cell Mask Deep Red y APS. A continuación, se adquirieron y analizaron las imágenes (FIG. 1C, panel superior izquierdo). La media de cada pocillo del área celular (basada en la tinción Cell Mask Deep Red) se normalizó mediante puntuaciones z de acuerdo con la media poblacional de todos los compuestos. Los compuestos que mostraban un efecto tóxico se descartaron manteniendo solo aquellos que mostraban una puntuación z superior a -1,5 para su media de área celular normalizada y más de 300 células por pocillo (FIG. 1C, panel superior derecho). Una vez realizada esta selección, los aciertos se seleccionaron en función de la intensidad media de los poliglucosanos (PG) normalizados. Se seleccionaron como aciertos aquellos compuestos que inducían una intensidad media de PG bien basada por debajo de -1,2 puntuación z. Así, de 10.084 compuestos analizados, se seleccionaron 85 como resultados positivos. Estos compuestos seleccionados se sometieron al mismo ensayo una vez más empleando concentraciones de 0, 1, 5, 10 y 50 pM. Estos experimentos de respuesta a la dosis redujeron los 85 aciertos seleccionados a 11 en los que se demostró una disminución dependiente de la concentración de la intensidad media de PG asociada a las células (FIG. 1C, panel inferior derecho).

FIGs. 2A-C presenta un gráfico que muestra la respuesta a la dosis de los aciertos reductores de CP, diagramas de cajas que representan para cada uno de los 11 aciertos dependientes de la concentración descubiertos la influencia de la concentración en la intensidad media de APS asociada a células, resistente a la diastasa, normalizada por puntuación z (FIG. 2A; de izquierda a derecha correspondiente a los aciertos 1 a 11 en la FIG. 2B): Puntas de flecha, intensidad APS media. Los cuadros delimitan los cuartiles superiores e inferiores de la mediana, y los “bigotes” superiores e inferiores muestran respectivamente los valores medios máximos y mínimos de intensidad de APS. Los puntos indican valores atípicos. Curvas de dosis-respuesta (DR) de los 11 aciertos dependientes de la concentración descubiertos (FIG. 2B): Se muestran curvas DR de intensidades medias de APS asociadas a células resistentes a la diastasa normalizadas por puntuación z. Sólo se muestran las fases descendentes de las curvas horméticas, ya que las concentraciones se dibujan en una escala logarítmica, excluyendo así la concentración cero. En la parte inferior se muestran los datos logCE50 y R2 para los 11 aciertos. Ver estructuras moleculares en la FIG. 2B [presionar “1” corresponde a UDP # 2 (véase Tablas 1 y 2); pulsar “2” corresponde a UDP # 8; pulsar “3” corresponde a UDP # 6; pulsar “4” corresponde a UDP # 19; pulsar “5” corresponde a UDP # 12; pulsar “6” corresponde a UDP # 11; pulsar “7” corresponde a UDP # 17; pulsar “8” corresponde a UDP # 14; pulsar “9” corresponde a UDP # 5; el acierto “10” corresponde al UDP #13, y el acierto “11” corresponde al UDP # 15]. La Figura 2C presenta además las estructuras moleculares de los compuestos 1-36, correspondientes a la Tabla 1 a continuación. Los compuestos 1-14, 17 23 y 25-36 de las Figuras 2B-C no son según la invención y tienen fines ilustrativos únicamente.

FIGs. 3A-B no presentan aciertos reductores de CP que no respondan a la dosis: FIG. 3A y FIG. 3B presentan datos para aciertos que redujeron la intensidad media normalizada de APS sin responder a la dosis como se presenta en la FIG. 2A y FIG. 2B, respectivamente, ver estructuras moleculares en la Figura 3B [presione “88D F9” corresponde a UDP # 18 (véase Tabla 2); presione “105D G8” corresponde a UDP # 1; pulsar “106D G2” corresponde a UDP # 10; presione “106D G5” corresponde a UDP # 3; presione “124D F11” corresponde a UDP # 16; presione “139D C2” corresponde a UDP # 9; presione “140D D4” corresponde a UDP # 7, y presione “144D G11” corresponde a UDP # 4].

FIGs. 4A-B presente: un gráfico de barras que muestra el efecto de impacto sobre la actividad de la glucógeno sintasa (SG): se realizó un ensayo de actividad enzimática SGin vitro(véase la sección de Ejemplos) para probar el efecto de los 19 aciertos descubiertos sobre la actividad de SG. Cada compuesto acertado se usó a una concentración final de 50 pM. UDP sirve como control positivo para la reducción de la actividad SG. Todos los aciertos, excepto el compuesto n.° 10, han cambiado significativamente la actividad de SG, aumentando los compuestos n.° 6, 7, 8, 12, 18 y 19 y disminuyendo el resto (pruebas t no apareadas, p<0,05). La Figura 4B presenta además la Tabla 2 para nombres de compuestos y estructuras moleculares (también presentada en la Tabla 1).

FIGs. 5A-B muestran dianas proteicas de los aciertos: FIG. 5A presenta un interactoma de los objetivos proteicos previstos de los 36 aciertos (incluidos tautómeros y estados de protonación) descubiertos.Pequeños círculos amarillos,alcanzan objetivos de proteínas;grandes círculos amarillosgolpean proteínas que interactúan y que sirven como centros para la interacción de proteínas;círculos rojos,objetivos proteicos de los aciertos que se sabe que interactúan con drogas;líneas azules,interacciones proteína-proteína;flechas rojas,interacciones regulatorias. Consulte http://www.unihi.org/ para conocer los nombres y descripciones de los símbolos genéticos que se muestran. FIG. 5B es un interactoma de la subsección de dianas de proteínas de impacto que se sabe que se unen a fármacos y que se prevé que se unen a derivados de carbohidratos (círculos rojos en la FIG. 5A).

FIG. 6 presenta la Tabla 3 que resume lo común y la diferencia entre los programas: QiqProp (por Schrodinger) SwissADME (el programa de Marvin/ChemAxon) y admetSAR @ LMMR.

FIG. 7 presenta la Tabla 4 que resume los resultados de QikProp para descriptores con excepciones. Los compuestos 1-14, 17-23 y 25-36 no son según la invención y tienen fines ilustrativos únicamente.

FIG. 8 presenta la Tabla 5 que resume los resultados de SwissADME para descriptores con excepciones. Los compuestos 1-14, 17-23 y 25-36 no son según la invención y tienen fines ilustrativos únicamente.

FIGs. 9A-B presentan la Tabla 6 que resume los resultados de AdmetSAR para descriptores con excepciones (FIG. 9A) y la Tabla 7 que resume los candidatos preferidos, asumiendo que los candidatos tienen menos de 4 excepciones (FIG. 9B). Las consideraciones sobre la barrera hematoencefálica (BHE) y el sistema nervioso central (SNC) no se incluyen en el resumen presentado en la FIG. 9A. Además, para la predicción de la distribución (local en la célula), consulte la Tabla 6. Los compuestos 1-14, 17-23 y 25-36 no están de acuerdo con la invención y tienen fines ilustrativos únicamente.

FIG. 10 presenta un gráfico que muestra la caracterización fenotípica celular multiparamétrica de fibroblastos de piel de control sano (CS) y ECPA. Panel superior: el grado de desviación del control saludable de las características celulares mostradas, ordenado por la cantidad de desviación (-log (valor P)). Las características donde el valor está por encima de la línea discontinua (marco rojo) demuestran una desviación de CS con un valor de p < 0,01. Las diferentes comparaciones analizadas se muestran en la parte inferior del panel. El panel inferior muestra la desviación como porcentaje de CS (línea horizontal), según los tratamientos indicados debajo del panel.

FIGs. 11A-D muestran el peso (en g) en función del tiempo después de tratar ratones modeladores de ECPA con vehículo, o: compuesto A, como se indica a los 4 meses de edad (FIG. 11A); como se indica a los 6 meses de edad (al inicio) (FIG. 11B); o compuesto B como se indica a los 4 meses de edad (2 meses antes del inicio) (FIG. 11C) o como se indica a los 6 meses de edad (al inicio) (FIG. 11D).

FIGs. 12A-D muestran el reflejo de extensión (el grado en el que las patas traseras se abren después de sujetar al animal por la cola) en función del tiempo después de tratar ratones modelados con ECPA con vehículo, o: compuesto A, como se indica a los 4 meses de edad (FIG.12A); como se indica a los 6 meses de edad (al inicio) (FIG. 12B); o compuesto B como se indica a los 4 meses de edad (2 meses antes del inicio) (FIG. 12C) o como se indica a los 6 meses de edad (al inicio) (FIG. 12D).

FIGs. 13A-D muestran la fuerza de agarre promedio de la pata delantera (la fuerza necesaria para superar el agarre del alambre de la jaula con la pata delantera) como una función del tiempo después de tratar ratones modelados con ECPA con vehículo o: compuesto A, como se indica a los 4 meses de edad (FIG. 13A); como se indica a los 6 meses de edad (al inicio) (FIG. 13B); o compuesto B como se indica a los 4 meses de edad (2 meses antes del inicio) (FIG. 13C) o como se indica a los 6 meses de edad (al inicio) (FIG. 13D).

FIGs. 14A-D muestran la anchura media de la marcha en función del tiempo después de tratar ratones modeladores de ECPA con vehículo, o: compuesto A, como se indica a los 4 meses de edad (FIG. 14A); como se indica a los 6 meses de edad (al inicio) (FIG. 14B); o compuesto B como se indica a los 4 meses de edad (2 meses antes del inicio) (FIG. 14C) o como se indica a los 6 meses de edad (al inicio) (FIG. 14D).

FIGs. 15A-D muestran la longitud media de la marcha en función del tiempo después de tratar ratones modeladores de ECPA con vehículo o: compuesto A, como se indica a los 4 meses de edad (FIG. 15A); como se indica a los 6 meses de edad (al inicio) (FIG. 15B); o compuesto B como se indica a los 4 meses de edad (2 meses antes del inicio) (FIG. 15C) o como se indica a los 6 meses de edad (al inicio) (FIG. 15D).

FIGs. 16A-D muestran la regularidad promedio de la distancia de los pasos (el coeficiente de varianza de todas las distancias de los pasos R-R y L-L [siglas en inglés para derecha e izquierda]) como una función del tiempo después de tratar ratones modelados con ECPA con vehículo o: compuesto A, como se indica a los 4 meses de edad (FIG. 16A); como se indica a los 6 meses de edad (al inicio) (FIG. 16B); o compuesto B como se indica a los 4 meses de edad (2 meses antes del inicio) (FIG. 16C) o como se indica a los 6 meses de edad (al inicio) (FIG. 16D).

FIGs. 17A-D muestran la uniformidad promedio de la alternancia de pasos expresada como la media del valor absoluto de 0,5 menos la relación entre la distancia R-L y la distancia de pasos R-R (|0,5 - (R-L/R-R)|) y viceversa. La uniformidad de la alteración del paso se representa en función del tiempo después de tratar ratones modelados con ECPA con vehículo o: compuesto A, como se indica a los 4 meses de edad (FIG. 17A); como se indica a los 6 meses de edad (al inicio) (FIG. 17B); o compuesto B como se indica a los 4 meses de edad (2 meses antes del inicio) (FIG. 17C) o como se indica a los 6 meses de edad (al inicio) (FIG. 17D). FIGs. 18A-D muestran la duración promedio del movimiento en una prueba de campo abierto como función del tiempo después de tratar ratones modeladores de ECPA con vehículo o: compuesto A, como se indica a los 4 meses de edad (FIG. 18A); como se indica a los 6 meses de edad (al inicio) (FIG. 18B); o compuesto B como se indica a los 4 meses de edad (2 meses antes del inicio) (FIG. 18C) o como se indica a los 6 meses de edad (al inicio) (FIG. 18D).

FIGs. 19A-D muestran la latencia promedio para caerse de un alambre metálico en función del tiempo después de tratar ratones modeladores de ECPA con vehículo o: compuesto A, como se indica a los 4 meses de edad (FIG. 19A); como se indica a los 6 meses de edad (al inicio) (FIG. 19B); o compuesto B como se indica a los 4 meses de edad (2 meses antes del inicio) (FIG. 19C) o como se indica a los 6 meses de edad (al inicio) (FIG.

19D).

FIGs. 20A-D muestran la latencia promedio para caerse de un cilindro giratorio (rotarod) en función del tiempo después de tratar ratones modeladores de ECPA con vehículo o: compuesto A, como se indica a los 4 meses de edad (FIG. 20A); como se indica a los 6 meses de edad (al inicio) (FIG. 20B); o compuesto B como se indica a los 4 meses de edad (2 meses antes del inicio) (FIG. 20C) o como se indica a los 6 meses de edad (al inicio) (FIG. 20D).

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0014] La presente invención, en algunas formas de realización de la misma, se refiere a compuestos y composiciones que los comprenden para reducir o prevenir enfermedades o trastornos caracterizados por la deposición, acumulación o agregación de cuerpos de poliglucosano.

[0015] Según un aspecto de algunas formas de realización de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto representado por la Fórmula I):

donde n y m son cada uno números enteros que representan, independientemente, 1, 2 o 3;

en donde:

R1 a R4 representan sustituyentes, que independientemente en cada aparición comprenden o se seleccionan del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, alcoxi, hidroxi, tiohidroxi, tioalcoxi, ariloxi, tioariloxi, amino, nitro, halo, trihalometilo, ciano, amida., carboxi, sulfonilo, sulfinilo, sulfonamida, sustituido o no sustituido, y R5a-c representan alquilo C<1>-<6>, en el que sulfinilo es S(=O)-R', y en el que sulfonilo es -S(=O)<2>-R', y en el que R' es hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo (unido a través de un anillo de carbono) o heteroalicíclico (unido a través de un anillo de carbono).

[0016] En algunas formas de realización, R5a es metilo. En algunas formas de realización, R5b es metilo. En algunas formas de realización, R5c es metilo. En algunas formas de realización, cada uno de R5a-c representa metilo.

[0017] En algunas formas de realización, al menos uno, dos o tres sustituyentes de R1 a R4 representan hidrógeno. En algunas formas de realización, cada uno de R1 a R4 representa hidrógeno.

[0018] En algunas formas de realización, n es 1.

[0019] En algunas formas de realización, m es 1.

[0020] En algunas formas de realización, m y n son cada uno 1.

[0021] En formas de realización ejemplares, el compuesto de Fórmula I está representado por la Fórmula Ia (compuesto 16 en la Tabla 1, o un tautómero del mismo, compuesto 15 en el mismo, ver Figura 2C):

N-(2-metoxietil)-6-metil-N-[ (3-metil-2-tienil)metil]-2-oxo-1,2-dihidropiridin-4-carboxamida

[0022] En todo el presente documento, por “compuesto” también se entiende que incluye una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

[0023] Según un aspecto de algunas formas de realización de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un compuesto representado por la Fórmula IV:

en donde R12, R13, R14a - R14c, R15, R16 y R17a-R17b representan sustituyentes, que independientemente en cada caso comprenden o se seleccionan del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C<1>-<6>; y

k es un número entero que representa, independientemente, 1, 2 o 3.

[0024] En algunas formas de realización, k es 1.

[0025] En algunas formas de realización, R12, R13 y R15 son metilo.

[0026] En algunas formas de realización, R17a y R17b son hidrógeno.

[0027] En algunas formas de realización, el compuesto representado por la Fórmula IV está en la forma de Fórmula IVa (compuesto 24 en la Tabla 1):

(1S*,6R*)-9-{[4-(metoximetil)-5-metilisoxazol-3-ilo ]carbonil}-3-metil-3,9-diazabicido[4.2.1]nonan-4-ona

[0028] Según un aspecto de algunas formas de realización de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto seleccionado de cualquiera de los compuestos 15-16 y 24 descritos en la Tabla 1 a continuación (véase estructura molecular en la Figura 2C):

Tabla 1

(continuación)

[0029] En algunas formas de realización, la composición farmacéutica que comprende el compuesto representado por la Fórmula I, en una forma de realización de la misma, es para uso en el tratamiento de una afección médica. En algunas formas de realización, la composición farmacéutica que comprende el compuesto representado por la Fórmula IV, en una forma de realización de la misma, es para uso en el tratamiento de una afección médica.

[0030] En algunas formas de realización, la composición farmacéutica que comprende el compuesto representado por cualquiera de las fórmulas 15-16 y 24 (presentadas en la Tabla 1 y en la Figura 2C) son para uso en el tratamiento de una afección médica.

[0031] En algunas formas de realización, la afección médica es una enfermedad o trastorno. En algunos, la enfermedad o trastorno es el trastorno de almacenamiento de glucógeno (EAG). En algunas formas de realización, la EAG está asociada con deficiencias de enzimas ramificadoras de glucógeno.

[0032] En algunas formas de realización, la afección médica es una o más de, entre otras, trastorno del cuerpo de poliglucosano del adulto (ECPA), enfermedad de Andersen, enfermedad de Forbes y enfermedad de Danon.

[0033] En algunas formas de realización, por EAG, o por “condición médica asociada con” deficiencias de enzimas ramificadoras de glucógeno”, se entiende que se refiere a enfermedades o trastornos caracterizados por la deposición, acumulación o agregación de cuerpos de poliglucosano en músculos, nervios y/o varios otros tejidos del cuerpo. En algunas formas de realización, la afección médica se caracteriza por una disfunción de los sistemas nerviosos central y/o periférico de un sujeto.

[0034] En las formas de realización de la invención se abarcan diversos usos de la composición farmacéutica que comprende los compuestos descritos en el presente documento para personalizar el tratamiento, la prevención o la reducción de la incidencia o gravedad de EAG y otros trastornos relacionados con la acumulación de cuerpos de poliglucosano.

[0035] Como se usa en el presente documento, el término “tratar” (o cualquier derivado gramatical del mismo) incluye anular, profilaxis, inhibir sustancialmente, retardar o revertir la progresión de una afección/enfermedad, mejorar sustancialmente los síntomas clínicos o estéticos de una afección/enfermedad o prevenir sustancialmente la aparición de síntomas clínicos o estéticos de una condición/enfermedad.

[0036] Según una forma de realización, la composición farmacéutica que comprende compuestos de este aspecto de la presente invención se usa para tratar enfermedades neurodegenerativas. Según una forma de realización, la composición farmacéutica que comprende compuestos de la presente invención se usa para tratar enfermedades inflamatorias.

[0037] Según una forma de realización, la composición farmacéutica que comprende compuestos de este aspecto de la presente invención se usa para tratar el cáncer asociado a EAG.

[0038] En algunas formas de realización, la composición farmacéutica que comprende un compuesto de Fórmulas I y/o IV Fórmulas I y/o IV se caracteriza por una actividad que disminuye el contenido celular de cuerpos de poliglucosano (CP). En algunas formas de realización, “disminuye el contenido celular de CP” pretende referirse a dar forma (por ejemplo, reducir) el tamaño de CP. En algunas formas de realización, “disminuye el contenido celular de CP” pretende referirse a la degradación del CP. (p. ej., modulando la enzima ramificadora de glucógeno, ERG).

[0039] En algunas formas de realización, la composición farmacéutica que comprende el compuesto de Fórmulas I y/o IV se utiliza para modular (por ejemplo, inhibir o, en algunas formas de realización, aumentar) una actividad de al menos una enzima.

[0040] En algunas formas de realización, la composición farmacéutica que comprende el compuesto de Fórmulas I y/o IV es para inhibir una o más enzimas. Ejemplos no limitantes de dicha enzima son la glicosiltransferasa, por ejemplo, la glucógeno sintasa (SG) y la proteína fosfatasa-1 (PF1). El control de la glucógeno sintasa puede ser un paso clave en la regulación del metabolismo del glucógeno y el almacenamiento de glucosa.

[0041] Otras formas de realización de la actividad inhibidora se describen en la sección de Ejemplos a continuación.

[0042] El término “inhibidor” o cualquier derivado gramatical del mismo, como se usa en el presente documento en el contexto de enzimas, se refiere a ser capaz de prevenir, bloquear, atenuar o reducir la actividad de una enzima.

[0043] En algunas formas de realización, “reducir la actividad” significa hacer referencia a una actividad que se reduce en al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos 80 %, o al menos 90 %, incluido cualquier valor y rango entre ellos, en relación con una situación comparable que carece de la presencia del compuesto divulgado o una composición de materia que lo contenga.

[0044] La expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” como se utiliza en el presente documento se refiere a una cantidad de un agente que es eficaz, tras la administración de dosis única o múltiple al sujeto, para proporcionar un beneficio terapéutico al sujeto y/o para prevenir daños a tejidos y células. En una forma de realización, el beneficio terapéutico es inhibir o mejorar los síntomas de dicho daño. Como se usa en el presente documento, el término “administrar” se refiere a poner en contacto células de mamíferos con el compuesto o composición de la presente invención. La cantidad eficaz de la composición utilizada para practicar la presente invención para el tratamiento terapéutico de afecciones causadas por la forma de administración, la edad, el peso corporal y la salud general del paciente. En última instancia, el médico tratante puede decidir la cantidad y el régimen de dosificación adecuados. Como se describe con más detalle a continuación, dicha cantidad se denomina cantidad efectiva.

[0045] Los compuestos divulgados, solos o en combinación con los mismos o con cualquier otro agente terapéuticamente activo, pueden diseñarse y utilizarse para ejercer una actividad dual y posiblemente sinérgica cuando se combinan con los mismos o con cualquier otro agente terapéuticamente activo.

[0046] Según un aspecto de algunas formas de realización de la presente invención, se proporciona el uso de uno o más de los compuestos I a IV divulgados, o un compuesto divulgado en la Tabla 1, según una forma de realización del mismo, o la composición farmacéutica divulgada según cualquier forma de realización del mismo, para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad o trastorno.

[0047] En algunas formas de realización, la enfermedad o trastorno está asociado con una enfermedad por almacenamiento de glucógeno, o con un trastorno asociado con una acumulación de CP, enfermedad de cuerpos de poliglucosano del adulto (ECPA) como se describió anteriormente, por ejemplo, EAG en cualquier tipo de la misma (por ejemplo, tipo IV).

[0048] En algunas formas de realización, la composición farmacéutica de la invención es para uso en el tratamiento de formas de EAG, que incluyen, entre otras, EAG-IV, -VI, IX, XI y glucogenosis cardíaca debido a la deficiencia de la subunidad gamma 2 de la proteína quinasa activada por AMP. En algunas formas de realización, la composición farmacéutica divulgada puede reducir la acumulación de CP patógeno en el CP que involucra EAG, EAG tipo IV (ECPA y enfermedad de Andersen), EAG tipo VII (enfermedad de Tarui) y enfermedad de Lafora (LD).

[0049] Otras formas de realización ejemplares de composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos de Fórmulas I y/o IV, y los compuestos 15-16, 24 de la Tabla 1 se describen en la sección Ejemplos a continuación.

Composición farmacéutica que comprende los compuestos divulgados:

[0050] Según un aspecto de las formas de realización de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende uno o más compuestos como se describe en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

[0051] Según algunas formas de realización de la invención, la composición se envasa en un material de embalaje y se identifica impresa, en o sobre el material de embalaje, para su uso en el tratamiento de una afección médica asociada con cualquier enfermedad, afección médica o trastorno como se describe. en todo el presente.

[0052] Según un aspecto de las formas de realización de la invención, la composición farmacéutica es para uso en el tratamiento de una afección médica asociada con cualquier enfermedad, afección médica o trastorno como se describe en el presente documento en un sujeto que lo necesita, mediante la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica como se describe en el presente documento.

[0053] En algunas formas de realización, la composición farmacéutica es para uso en el tratamiento de una enfermedad por almacenamiento de glucógeno administrando a un paciente que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica que comprende uno o más de los compuestos de Fórmulas I y/o IV, y de los compuestos 15-16, 24 de la Tabla 1.

[0054] En algunas formas de realización, la composición farmacéutica es para uso en el tratamiento de una enfermedad por almacenamiento de glucógeno administrando a un paciente que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica que comprende uno o más de los compuestos A y B como se describe en el presente documento.

[0055] Como se usa en el presente documento, la frase “cantidad terapéuticamente eficaz” describe una cantidad del compuesto que se administra que aliviará en cierta medida uno o más de los síntomas de la afección que se está tratando.

[0056] El término “sujeto” (que debe leerse incluye “individuo”, “animal”, “paciente” o “mamífero” cuando el contexto lo permita) define cualquier sujeto, particularmente un sujeto mamífero, para quien está indicado el tratamiento.

[0057] En algunas formas de realización, el sujeto es un ser humano. En otra forma de realización, el sujeto es un ser humano que padece un trastorno neurológico.

[0058] Según un aspecto de las formas de realización de la invención, se proporciona cualquiera de los compuestos de Fórmulas I y/o IV, y los compuestos 15-16, 24 de la Tabla 1 como se describe en el presente documento para uso como medicamento.

[0059] Según un aspecto de las formas de realización de la invención, se proporciona el uso de cualquiera de los compuestos de Fórmulas I y/o IV, y los compuestos 15-16, 24 de la Tabla 1 como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para tratar una condición médica asociada con cualquier enfermedad, condición médica o trastorno asociado con una acumulación de CP, como se describe anteriormente.

[0060] Los compuestos de Fórmulas I y/o IV, y los compuestos 15-16, 24 de la Tabla 1 descritos anteriormente en el presente documento se pueden administrar o utilizar de otro modo dentro de la composición farmacéutica tal cual, o como una sal farmacéuticamente aceptable, un enantiómero, un tautómero, un diastereómero, una forma protonada o no protonada, un solvato, un hidrato del mismo.

[0061] La frase “sal farmacéuticamente aceptable” se refiere a una especie cargada del compuesto original y su contraión, que normalmente se usa para modificar las características de solubilidad del compuesto original y/o para reducir cualquier irritación significativa de un organismo por el compuesto original sin anular la actividad biológica y las propiedades del compuesto administrado. Las formas neutras de los compuestos se pueden regenerar poniendo en contacto la sal con una base o ácido y aislando el compuesto original de manera convencional. La forma original del compuesto difiere de las diversas formas de sal en ciertas propiedades físicas, tales como la solubilidad en disolventes polares, pero por lo demás las sales son equivalentes a la forma original del compuesto para los fines de la presente invención.

[0062] La frase “sales farmacéuticamente aceptables” pretende abarcar sales de los compuestos activos que se preparan con ácidos o bases relativamente no tóxicos, dependiendo de los sustituyentes particulares que se encuentran en los compuestos descritos en el presente documento.

[0063] Los ejemplos de sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas derivadas de ácidos inorgánicos como los ácidos clorhídrico, bromhídrico, nítrico, carbónico, monohidrógenocarbónico, fosfórico, monohidrógenofosfórico, dihidrógenofosfórico, sulfúrico, monohidrógenosulfúrico, yodhídrico o fosfórico y similares, así como las sales derivadas de ácidos orgánicos relativamente no tóxicos como acético, propiónico, isobutírico, maleico, malónico, benzoico, succínico, subérico, fumárico, láctico, mandélico, Itálico, bencenosulfónico, p-tolilsulfónico, cítrico, tartárico, metanosulfónico y similares. También se incluyen sales de aminoácidos tales como arginato y similares, y sales de ácidos orgánicos como ácidos glucurónico o galactunórico y similares (véase, por ejemplo, Berge et al., “Pharmaceutical Salts”, Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19). Ciertos compuestos específicos de la presente invención contienen funcionalidades tanto básicas como ácidas que permiten que el compuesto como se describe en el presente documento para convertirse en sales de adición de bases o ácidos.

[0064] En algunas formas de realización, las formas neutras de los compuestos descritos en el presente documento se regeneran poniendo en contacto la sal con una base o ácido y aislando los compuestos originales de una manera convencional. La forma original de los compuestos difiere de las diversas formas de sal en ciertas propiedades físicas, tales como la solubilidad en disolventes polares, pero por lo demás las sales son equivalentes a la forma original del compuesto para los fines de la presente invención.

[0065] En algunas formas de realización, los compuestos descritos en el presente documento poseen átomos de carbono asimétricos (centros ópticos) o dobles enlaces; los racematos, diastereómeros, tautómeros, isómeros geométricos e isómeros individuales están abarcados dentro del alcance de la presente invención.

[0066] Tal como se utiliza en el presente documento y en la técnica, el término “enantiómero” describe un estereoisómero de un compuesto que es superponible con respecto a su contraparte sólo mediante una inversión/reflexión completa (imagen especular) de uno al otro. Se dice que los enantiómeros tienen “mano derecha” ya que se refieren entre sí como la mano derecha y la izquierda. Los enantiómeros tienen propiedades químicas y físicas idénticas, excepto cuando están presentes en un entorno que por sí solo tiene lateralidad, como todos los sistemas vivos.

[0067] En algunas formas de realización, los compuestos descritos en el presente documento pueden existir en formas no solvatadas, así como en formas solvatadas, incluidas formas hidratadas. En general, las formas solvatadas son equivalentes a las formas no solvatadas y están incluidas dentro del alcance de la presente invención. Ciertos compuestos de la presente invención pueden existir en múltiples formas cristalinas o amorfas. En general, todas las formas físicas son equivalentes para los usos contemplados por la presente invención y están destinadas a estar dentro del alcance de la presente invención.

[0068] El término “solvato” se refiere a un complejo de estequiometría variable (por ejemplo, di-, tri-, tetra-, penta-, hexa-, etc.), que está formado por un soluto (el conjugado descrito en el presente documento) y un disolvente., por lo que el disolvente no interfiere con la actividad biológica del soluto. Los disolventes adecuados incluyen, por ejemplo, etanol, ácido acético y similares.

[0069] El término “hidrato” se refiere a un solvato, como se define anteriormente en el presente documento, donde el disolvente es agua.

[0070] En algunas formas de realización, la “composición farmacéutica” se refiere a una preparación de uno o más de los compuestos descritos en el presente documento (como ingrediente activo), o sales fisiológicamente aceptables de los mismos, con otros componentes químicos que incluyen, entre otros, vehículos, excipientes fisiológicamente adecuados., lubricantes, agentes tampón, agentes antibacterianos, agentes de carga (por ejemplo, manitol), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico o bisulfito de sodio), agentes antiinflamatorios, agentes antivirales, agentes quimioterapéuticos, antihistamínicos y otros.

[0071] En algunas formas de realización, el propósito de una composición farmacéutica es facilitar la administración de un compuesto a un sujeto. El término “ingrediente activo” se refiere a un compuesto que es responsable de un efecto biológico.

[0072] Los términos “vehículo fisiológicamente aceptable” y “vehículo farmacéuticamente aceptable”, que pueden usarse indistintamente, se refieren a un vehículo o diluyente que no causa irritación significativa a un organismo y no anula la actividad biológica y las propiedades del compuesto administrado.

[0073] En el presente documento el término “excipiente” se refiere a una sustancia inerte añadida a una composición farmacéutica para facilitar aún más la administración de un fármaco. Ejemplos, sin limitación, de excipientes incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, diversos azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles.

[0074] Las técnicas para la formulación y administración de fármacos se pueden encontrar en “Remington's Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición.

[0075] En algunas formas de realización, las composiciones farmacéuticas para uso de acuerdo con la presente invención se pueden formular de manera convencional usando uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares, que facilitan el procesamiento de los compuestos en preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente. La formulación adecuada depende de la vía de administración elegida. La dosificación, como se describe y especifica en el presente documento, puede variar dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. La formulación exacta, la vía de administración y la dosificación pueden ser elegidas por el médico individual en vista del estado del paciente (ver, por ejemplo, Fingl et al., 1975, en “The Pharmacological Basis of Therapeutics”, Ch. 1 p.1).

[0076] En algunas formas de realización, la composición farmacéutica se puede formular para administración en una o más rutas dependiendo de si se elige el tratamiento o la administración local o sistémica, y del área a tratar. Como se describe con más detalle en el presente documento, la administración se puede realizar por vía oral, dental, por inhalación o por vía parenteral, por ejemplo, mediante goteo intravenoso o inyección intraperitoneal, subcutánea, intramuscular o intravenosa, o por vía tópica (incluyendo por vía oftálmica, vaginal, rectal o intranasal).

[0077] Las formulaciones para administración tópica y/o dental pueden incluir, entre otras, lociones, ungüentos, geles, cremas, supositorios, gotas, líquidos, aerosoles y polvos. Pueden ser necesarios o deseables vehículos farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo u oleosas, espesantes y similares.

[0078] Las composiciones para administración oral pueden incluir polvos o gránulos, suspensiones, composiciones dentales o soluciones en agua o medios no acuosos, sobres, píldoras, comprimidos, cápsulas o tabletas. Pueden ser deseables espesantes, diluyentes, saborizantes, coadyuvantes de dispersión, emulsionantes o aglutinantes.

[0079] Las formulaciones para administración parenteral pueden incluir, entre otras, soluciones estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados. Para el tratamiento se prevén composiciones de liberación lenta.

[0080] La cantidad de una composición a administrar dependerá, por supuesto, del sujeto que se esté tratando la gravedad de la aflicción, la forma de administración, el criterio del médico que prescribe, etc.

[0081] La composición farmacéutica puede comprender además agentes farmacéuticamente activos o inactivos adicionales tales como, entre otros, un agente antibacteriano, un antioxidante, un agente tampón, un agente de volumen, un tensioactivo, un agente antiinflamatorio, un agente antiviral. un agente quimioterapéutico y antihistamínico.

[0082] Las composiciones de la presente invención pueden, si se desea, presentarse en un paquete o dispositivo dispensador, tal como un kit aprobado por la FDA, que puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contienen el ingrediente activo. El paquete puede comprender, por ejemplo, una lámina metálica o plástica, tal como un blíster. El paquete o dispositivo dispensador puede ir acompañado de instrucciones para la administración. El paquete o dispensador también puede estar acompañado por un aviso asociado con el contenedor en una forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos, aviso que refleja la aprobación por parte de la agencia de la forma de las composiciones o humanos. o administración veterinaria. Dicho aviso, por ejemplo, puede ser de una etiqueta aprobada por la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU. para medicamentos recetados o de un prospecto de producto aprobado.

[0083] En algunas formas de realización, el método comprende administrar al sujeto una cantidad farmacéuticamente eficaz de uno o más de los compuestos o composiciones descritos en el presente documento (por ejemplo, compuestos que tienen una de las “Fórmulas I o II” generales descritas anteriormente en el presente documento, en cualquier forma de realización de los mismos.

[0084] En algunas formas de realización, el método puede comprender además la administración de un fármaco adicional destinado a tratar una infección antimicrobiana.

[0085] Se reconocerá que estas formas de realización son susceptibles a diversas modificaciones y formas alternativas bien conocidas por los expertos en la técnica.

Método de detección

[0086] Según un aspecto de algunas formas de realización de la presente invención, se proporciona un método para detectar CP en células. En algunas formas de realización, las células son células humanas, por ejemplo, células de fibroblastos.

[0087] En algunas formas de realización, el método comprende una etapa de selección computacional de bibliotecas de compuestos.

[0088] En algunas formas de realización, el método comprende detectar la reducción de CP ejercida por uno o más compuestos seleccionados (por ejemplo, una molécula pequeña).

[0089] Se apreciará que en virtud de permitir la selección computacional de bibliotecas de compuestos que tienen esencialmente cualquiera de diversas características químicas, biológicas y/o físicas, el método permite la identificación de un compuesto capaz de mostrar una farmacocinética in vivo óptima, una inmunogenicidad óptimamente baja y efectividad óptima en relación con todos los compuestos de la técnica anterior capaces de disminuir el contenido celular de CP, por ejemplo, corrigiendo la actividad enzimática deteriorada asociada con la enfermedad de almacenamiento de glucógeno, por ejemplo, glucógeno sintasa o enzima ramificadora de glucógeno.

[0090] En algunas formas de realización, el método comprende calificar bioquímicamente la capacidad del compuesto para disminuir el contenido celular de CP.

[0091] En algunas formas de realización, la calificación bioquímica comprende someter las células a tinción con ácido periódico de Schiff (APS) para proporcionar células teñidas con APS. En algunas formas de realización, el método comprende además lavar la muestra para eliminar los reactivos de Schiff que no reaccionaron seguido de detectar una señal (por ejemplo, luz fluorescente) derivada de la muestra teñida con APS a una longitud de onda definida.

[0092] En la sección de Ejemplos a continuación se proporcionan formas de realización adicionales del método divulgado.

Definiciones

[0093] Tal como se utiliza en el presente documento, el término “alquilo” describe un hidrocarburo alifático que incluye grupos de cadena lineal y de cadena ramificada. Preferiblemente, el grupo alquilo tiene de 21 a 100 átomos de carbono, y más preferiblemente de 21 a 50 átomos de carbono. Siempre que sea un rango numérico; por ejemplo, “21-100”, se indica en el presente documento, implica que el grupo, en este caso el grupo alquilo, puede contener 21 átomos de carbono, 22 átomos de carbono, 23 átomos de carbono, etc., hasta e incluyendo 100 átomos de carbono. En el contexto de la presente invención, un “alquilo largo” es un alquilo que tiene al menos 20 átomos de carbono en su cadena principal (la ruta más larga de átomos continuos unidos covalentemente). Por tanto, un alquilo corto tiene 20 o menos carbonos en la cadena principal. El alquilo puede estar sustituido o no sustituido, como se define en el presente documento.

[0094] El término “alquilo”, como se usa en el presente documento, también abarca hidrocarburo saturado o insaturado, por lo que este término abarca además alquenilo y alquinilo.

[0095] El término “alquenilo” describe un alquilo insaturado, como se define en el presente documento, que tiene al menos dos átomos de carbono y al menos un doble enlace carbono-carbono. El alquenilo puede estar sustituido o no sustituido con uno o más sustituyentes, como se describe anteriormente en el presente documento.

[0096] El término “alquinilo”, tal como se define en el presente documento, es un alquilo insaturado que tiene al menos dos átomos de carbono y al menos un triple enlace carbono-carbono. El alquinilo puede estar sustituido o no sustituido con uno o más sustituyentes, como se describe anteriormente en el presente documento.

[0097] El término “cicloalquilo” describe un grupo de anillo monocíclico o fusionado totalmente de carbono (es decir, anillos que comparten un par adyacente de átomos de carbono) donde uno o más de los anillos no tiene un sistema de electrones pi completamente conjugado. El grupo cicloalquilo puede estar sustituido o no sustituido, como se indica en el presente documento.

[0098] El término “arilo” describe grupos monocíclicos o policíclicos de anillos fusionados (es decir, anillos que comparten pares adyacentes de átomos de carbono) que tienen un sistema de electrones pi completamente conjugado. El grupo arilo puede estar sustituido o no sustituido, como se indica en el presente documento.

[0099] El término “alcoxi” describe tanto un grupo -O-alquilo como un grupo -O-cicloalquilo, como se define en el presente documento.

[00100] El término “ariloxi” describe un -O-arilo, como se define en el presente documento.

[00101] Cada uno de los grupos alquilo, cicloalquilo y arilo en las fórmulas generales del presente documento puede estar sustituido con uno o más sustituyentes, por lo que cada grupo sustituyente puede ser independientemente, por ejemplo, haluro, alquilo, alcoxi, cicloalquilo, alcoxi, nitro, amina, hidroxilo, tiol, tioalcoxi, tiohidroxi, carboxi, amida, arilo y ariloxi, dependiendo del grupo sustituido y su posición en la molécula. También se contemplan sustituyentes adicionales.

[00102] El término “haluro”, “halógeno” o “halo” describe flúor, cloro, bromo o yodo.

[00103] El término “haloalquilo” describe un grupo alquilo como se define en el presente documento, además sustituido por uno o más haluro(s).

[00104] El término “haloalcoxi” describe un grupo alcoxi como se define en el presente documento, además sustituido por uno o más haluro(s).

[00105] El término “hidroxilo” o “hidroxi” describe un grupo -OH.

[00106] El término “tiohidroxi” o “tiol” describe un grupo -SH.

[00107] El término “tioalcoxi” describe tanto un grupo -S-alquilo como un grupo -S-cicloalquilo, como se define en el presente documento.

[00108] El término “tioariloxi” describe tanto un grupo -S-arilo como un grupo -S-heteroarilo, como se define en el presente documento.

[00109] El término “amina” describe un grupo -NR'R”, con R' y R” como se describe en el presente documento.

[00110] El término “heteroarilo” describe un grupo de anillo monocíclico o condensado (es decir, anillos que comparten un par de átomos adyacentes) que tiene en el (los) anillo(s) uno o más átomos, tales como, por ejemplo, nitrógeno, oxígeno y azufre y, además, tener un sistema de electrones pi completamente conjugado. Ejemplos, sin limitación, de grupos heteroarilo incluyen pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, pirazol, piridina, pirimidina, quinolina, isoquinolina y purina.

[00111] El término “heteroalicíclico” o “heterociclilo” describe un grupo de anillo monocíclico o condensado que tiene en el (los) anillo(s) uno o más átomos tales como nitrógeno, oxígeno y azufre. Los anillos también pueden tener uno o más dobles enlaces. Sin embargo, los anillos no tienen un sistema de electrones pi completamente conjugado. Ejemplos representativos son piperidina, piperazina, tetrahidrofurano, tetrahidropirano, morfolino y similares.

[00112] El término “carboxi” o “carboxilato” describe un grupo -C(=O)-OR', donde R' es hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo (unido a través de un carbono del anillo) o heteroalicíclico (unido a través de un carbono del anillo) como se define en el presente documento.

[00113] El término “carbonilo” describe un grupo -C(=O)-R', donde R' es como se define anteriormente en el presente documento.

[00114] Los términos anteriores también abarcan sus tioderivados (tiocarboxi y tiocarbonilo).

[00115] El término “tiocarbonilo” describe un grupo -C(=S)-R', donde R' es como se define anteriormente en el presente documento.

[00116] Un grupo “tiocarboxi” describe un grupo -C(=S)-OR', donde R' es como se define en el presente documento.

[00117] Un grupo “sulfinilo” describe un grupo -S(=O)-R', donde R' es como se define en el presente documento.

[00118] Un grupo “sulfonilo” o “sulfonato” describe un grupo -S(=O)<2>-R', donde Rx es como se define en el presente documento.

[00119] Un grupo “carbamilo” o “carbamato” describe un grupo -OC(=O)-NR'R”, donde R' es como se define en el presente documento y R” es como se define para R'.

[00120] Un grupo “nitro” se refiere a un grupo -NO<2>.

[00121] Un grupo “ciano” o “nitrilo” se refiere a un grupo -C=N.

[00122] Como se usa en el presente documento, el término “azida” se refiere a un grupo -N<3>.

[00123] El término “sulfonamida” se refiere a un grupo -S(=O)<2>-NR'R”, con R' y R” como se definen en el presente documento.

[00124] El término “fosfonilo” o “fosfonato” describe un grupo -OP(=O)(OR')<2>, con R' como se define anteriormente en el presente documento.

[00125] El término “fosfinilo” describe un grupo -PR'R”, con R' y R” como se definen anteriormente en el presente documento.

[00126] El término “alcarilo” describe un alquilo, como se define en el presente documento, que está sustituido por un arilo, como se describe en el presente documento. Un alcarilo ejemplar es bencilo.

[00127] El término “heteroarilo” describe un grupo de anillo monocíclico o condensado (es decir, anillos que comparten un par de átomos adyacentes) que tiene en el (los) anillo(s) uno o más átomos, tales como, por ejemplo, nitrógeno, oxígeno y azufre y, además, tener un sistema de electrones pi completamente conjugado. Ejemplos, sin limitación, de grupos heteroarilo incluyen pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, pirazol, piridina, pirimidina, quinolina, isoquinolina y purina. El grupo heteroarilo puede estar sustituido o no sustituido con uno o más sustituyentes, como se describe anteriormente en el presente documento. Ejemplos representativos son tiadiazol, piridina, pirrol, oxazol, indol, purina y similares.

[00128] Como se usan en el presente documento, los términos “halo” y “haluro”, a los que se hace referencia en el presente documento indistintamente, describen un átomo de un halógeno, es decir, flúor, cloro, bromo o yodo, también denominado en el presente documento fluoruro, cloruro, bromuro y yoduro.

[00129] El término “haloalquilo” describe un grupo alquilo como se define anteriormente, además sustituido con uno o más haluro(s).

General

[00130] Tal como se utiliza en el presente documento, el término “aproximadamente” se refiere a ± 10 %.

[00131] Los términos “comprende”, “que comprende”, “incluye”, “que incluye”, “que tiene” y sus conjugados significan “que incluye, pero no se limita a”.

[00132] El término “que consta de” significa “que incluye y se limita a”.

[00133] El término “que consiste esencialmente en” significa que la composición, método o estructura puede incluir ingredientes, etapas y/o partes adicionales, pero sólo si los ingredientes, etapas y/o partes adicionales no alteran materialmente las características básicas y novedosas de la composición, método o estructura reivindicada.

[00134] La palabra “ejemplar” se utiliza en el presente documento con el significado de “que sirve como ejemplo, instancia o ilustración”. Cualquier forma de realización descrita como “ejemplar” no debe interpretarse necesariamente como preferida o ventajosa sobre otras formas de realización y/o para excluir la incorporación de características de otras formas de realización.

[00135] La palabra “opcionalmente” se usa en el presente documento para significar “se proporciona en algunas formas de realización y no se proporciona en otras formas de realización”. Cualquier forma de realización particular de la invención puede incluir una pluralidad de características “opcionales” a menos que dichas características entren en conflicto.

[00136] Tal como se utiliza en el presente documento, la forma singular “un”, “una”, “el” y “ella” incluye referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, el término “un compuesto” o “al menos un compuesto” puede incluir una pluralidad de compuestos, incluidas mezclas de los mismos.

[00137] A lo largo de esta solicitud, se pueden presentar varias formas de realización de esta invención en un formato de rango. Debe entenderse que la descripción en formato de rango es simplemente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible al alcance de la invención. Por consiguiente, se debe considerar que la descripción de un rango ha revelado específicamente todos los subrangos posibles, así como los valores numéricos individuales dentro de ese rango. Por ejemplo, se debe considerar que la descripción de un rango tal como de 1 a 6 tiene subrangos específicamente divulgados tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 al 6, etc., así como números individuales dentro de ese rango, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del rango.

[00138] Siempre que en el presente documento se indique un rango numérico, se pretende incluir cualquier número citado (fraccional o integral) dentro del rango indicado. Las frases “que van/varían entre” un primer número indicado y un segundo número indicado y “que van/varían desde” un primer número indicado “hasta” un segundo número indicado se utilizan en el presente documento de forma intercambiable y pretenden incluir el primer y el segundo número indicados y todos los números fraccionarios e integrales entre ellos.

[00139] Se aprecia que ciertas características de la invención, que, para mayor claridad, se describen en el contexto de formas de realización separadas, también pueden proporcionarse en combinación en una única forma de realización. Por el contrario, diversas características de la invención, que, por brevedad, se describen en el contexto de una única forma de realización, también pueden proporcionarse por separado o en cualquier subcombinación adecuada o según sea adecuado en cualquier otra forma de realización descrita de la invención. Ciertas características descritas en el contexto de diversas formas de realización no deben considerarse características esenciales de esas formas de realización, a menos que la realización no funcione sin esos elementos.

[00140] Se aprecia que ciertas características de la invención, que, para mayor claridad, se describen en el contexto de formas de realización separadas, también pueden proporcionarse en combinación en una única forma de realización. Por el contrario, diversas características de la invención, que, por brevedad, se describen en el contexto de una única forma de realización, también pueden proporcionarse por separado o en cualquier subcombinación adecuada o según sea adecuado en cualquier otra forma de realización descrita de la invención. Ciertas características descritas en el contexto de diversas formas de realización no deben considerarse características esenciales de esas formas de realización, a menos que la realización no funcione sin esos elementos.

EJEMPLOS

[00141] Ahora se hace referencia a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores ilustran algunas formas de realización de la invención de forma no limitativa.

EJEMPLO 1

ENSAYO DE DETECCIÓN

Ensayo de detección de alto contenido (basado en imágenes)

[00142] Todos los pasos del ensayo se realizaron automáticamente utilizando un robot de manipulación de líquidos Freedom Evo 150 (Tecan). Se sembraron fibroblastos derivados de pacientes con ECPA a una densidad de 800 células/pocillo en DMEM (Gibco) suplementado con piruvato de sodio 1 mM (Gibco), antibióticos al 1% (Biological Industries, Israel) y suero bovino fetal al 5% (Hyclone) en 384 placas bien microclaras (Greiner). Las placas fueron transferidas por el brazo robótico (RoMa) a una incubadora automatizada (Liconic), integrada con el sistema robótico, donde se incubaron a 37 °C con 5% de CO<2>. Después de 24 h de incubación, el robot reemplazó el medio utilizando medio suplementado con 10 pM de cada compuesto seleccionado (concentración final de DMSO al 0,1%, todo preparado por el robot). Los compuestos analizados formaban parte de la colección Diverset CL adquirida en ChemBridge (10.084 de 50.000 moléculas).

[00143] A continuación, estas células se cultivaron durante otras 24 h en la incubadora automática y, utilizando el robot, se lavaron con PBS (Biological Industries, Israel), las células se fijaron con paraformaldehído (PFA) al 4%, se lavaron nuevamente con PBS y se neutralizaron el PFA previamente añadido por cloruro de amonio (Sigma Aldrich), se lavó con PBS, se permeabilizó con Triton X-100 al 0,1% (Sigma Aldrich), y se lavó nuevamente con PBS.

[00144] A continuación, se utilizó un robot para tratar las células fijadas con 0,5 g/dl de diastasa (o amilasa, Sigma Aldrich) durante 5 minutos a 37 °C en la incubadora automática, se lavaron con PBS y se tiñeron con APS (Merck), Hoechst 33342. (Sigma Aldrich) y Cell Mask Deep Red (Molecular Probes) y lavar con P<b>S. A continuación, el IN Cell Analyzer 2000 (GE Healthcare) adquirió imágenes de células teñidas y las analizó utilizando el IN Cell Investigator (GE Healthcare) aplicando un algoritmo que cuantificó la señal APS dentro de cada célula teñida con máscara celular.

Análisis de imágenes y determinación de aciertos.

[00145] Las imágenes se segmentaron en función de la señal de la máscara celular que se vinculó con la segmentación de los núcleos, empleando una sensibilidad y un tamaño de núcleo establecidos empíricamente para permitir la mejor segmentación. Una vez seleccionados estos objetos complejos núcleocitoplasma, el software calculó el número de estos objetos (número de células), así como la intensidad de la señal APS dentro de cada uno de ellos. Todos los parámetros del ensayo (incluidos los tiempos de exposición de adquisición, el objetivo y los parámetros de análisis) se mantuvieron constantes durante toda la campaña de detección para permitir la comparación de señales obtenidas de diferentes lotes de ensayo dentro de la campaña.

Curvas dosis-respuesta

[00146] El ensayo se realizó como se mencionó anteriormente, pero con concentraciones de compuesto de 1, 5, 10 y 50 pM, en lugar de una concentración constante de 10 pM.

Ensayo de actividad SG in vitro.

[00147] La reacción se llevó a cabo en placas de 96 pocillos que contenían 50 pl de volumen de reacción (Tris 50 mM, pH 8, EDTA 20 mM, KF 25 mM, glucógeno 2 mg/ml, glucosa-6-fosfato 10 mM, 1,65 mM UDP[14C]glucosa y UDP-glucosa 100 mM). Para probar el efecto inhibidor de los aciertos, cada uno se incluyó en la reacción a una concentración final de 50 pM. La reacción se inició con la adición de GS1 humano recombinante 20 nM, seguido de una incubación a 37 °C durante 30 min. A continuación, se detuvo la reacción con la adición de 100 pl de etanol al 100 % frío y la suspensión total se transfirió a una placa de filtro de 96 pocillos. Se aplicó vacío para eliminar el etanol. Cinco pasos de lavado con 150 pl de etanol al 66% frío eliminaron por completo cualquier UDP[14C]glucosa no incorporada, mientras que el glucógeno marcado permaneció en los filtros de los pocillos. La placa se secó en una incubadora a 37°C durante 30 min. Se añadieron 50 pl de líquido de centelleo a cada pocillo y se leyó la señal de 14C en la placa en el contador de centelleo y luminiscencia de microplacas Top Count (Perkin Elmer).

Perfil de ligando

[00148] Para identificar posibles objetivos biológicos (requeridos debido a la naturaleza fenotípica del análisis), los compuestos activos se analizaron en la base de datos de farmacóforos PharmaDB utilizando el protocolo de perfil de ligando, implementado en Discovery Studio (DS) versión 4.1. PharmaDB es una base de datos de farmacóforos creada a partir del banco de datos de proteínas sc-PDB (http://bioinfo-pharma.u-strasbg.fr/scPDB/). Consta de más de 132.000 modelos de farmacóforos, generados a partir de 283 sitios de unión de 3.678 proteínas únicas y 5.608 ligandos únicos. Muchos objetivos proteicos están representados por múltiples farmacóforos con restricciones de forma generadas a partir de volúmenes excluidos.

Agrupación de aciertos y drogas conocidas

[00149] La agrupación jerárquica se realizó basándose en huellas dactilares dendríticas con una distancia de fusión de 0,99 utilizando Canvas v. 2.7. Se utilizó el criterio de Kelley para obtener un número óptimo de conglomerados. El número total de conglomerados que se obtuvo en nuestro análisis fue cinco. Sin embargo, cuatro de estos grupos incluían sólo 1 o 2 fármacos conocidos y sólo un grupo era informativo e incluía todos los resultados junto con 21 de los 27 fármacos que interactuaban con supuestas proteínas de unión a hits que también se unen a derivados de carbohidratos.

Análisis de similitud

[00150] La similitud de aciertos con los medicamentos se calculó utilizando el protocolo Buscar moléculas similares mediante huellas dactilares implementado en DS utilizando la clave pública MDL, huellas dactilares ECFP 4, ECFP 6, FCFC 2, FCFP 4 y que requiere una puntuación de similitud mínima de 0,5.

Un ensayo de alto rendimiento para detectar CP

[00151] Dado que en ECPA las neuronas sufren degeneración debido a la acumulación de CP, se analizó una pequeña biblioteca de moléculas para encontrar compuestos capaces de disminuir el contenido celular de CP. Para ello, se desarrolló un ensayo basado en la tinción APS de CP en fibroblastos derivados de la piel de un paciente con ECPA.

[00152] Se realizó otro trabajo para demostrar que, a diferencia de los fibroblastos de piel derivados de individuos sanos, los fibroblastos de piel de pacientes con ECPA muestran CP detectable.

[00153] Aprovechando la observación de que los PG son resistentes, hasta cierta concentración máxima y tiempo de exposición, a la enzima amilasa que digiere el glucógeno, para definir operativamente el PG, se administró, después de la fijación con paraformaldehído, amilasa a fibroblastos no afectados y ECPA para digerir el glucógeno soluble, evitando así el PG relativamente resistente a la amilasa, que por consiguiente pudo detectarse. Como muestran los resultados (FIG. 1A), la tinción resistente a la amilasa y, por lo tanto, PG y CP, se observaron únicamente en ECPA y no en los fibroblastos de control.

[00154] En procedimientos ejemplares adicionales, tanto el tiempo de exposición celular como la concentración de amilasa se optimizaron para lograr el grado máximo de degradación de glucógeno que ahorra PG. Las condiciones elegidas después de este paso de optimización fueron 0,5 g de diastasa/dl y 5 minutos de digestión a 370 °C.

[00155] Además, se optimizaron varios otros aspectos del ensayo estableciendo también el tiempo de exposición a los compuestos (1 día), la composición del medio (5% FCS en DMEM), el paso de fibroblastos empleado (#11), la técnica de fijación (4% PFA durante 10 minutos seguido de neutralización con cloruro de amonio), la permeabilización (5 minutos con Triton X-100 al 0,1%), tinción adicional (Hoechst 33342 para núcleos y CellMask Deep Red para referencia de citoplasma), tipo de placa (microplacas de 384 pocillos) y densidad celular. (800 fibroblastos/pocillo.

Establecimiento de criterios para la identificación de compuestos reductores de CP

[00156] Una vez optimizado, el ensayo se utilizó para detectar 10.084 compuestos de la colección Diverset CL (ChemBrige) exponiendo fibroblastos derivados de pacientes con ECPA a estas moléculas a una concentración de 10 mM. Las imágenes se analizaron realizando una segmentación de células basada en la tinción Cell Mask Deep Red y usando la tinción Hoescht 33342 para determinar si dos células estaban segmentadas juntas como una entidad única (en caso de que fueran demasiado adyacentes para permitir la segregación por parte del software). Esta característica permite reducir la posible subsegmentación.

[00157] En la Figura 1B se muestra una imagen representativa de la tinción obtenida. La Figura 1C muestra los puntos de datos compilados de la selección, ilustrando el enfoque empleado para seleccionar resultados. Brevemente, una vez que se estableció el área celular en función de la señal Cell Mask Deep Red, se determinó la señal APS en cada una de las células (correspondiente a la intensidad media de CP asociada a la célula). Los datos del área de celda promediados a nivel de pozo se normalizaron de acuerdo con la población general de pozos en toda la campaña de detección utilizando el método de puntuación z.

[00158] Según el entrenamiento de imágenes previo, solo se consideraron para el tratamiento aquellos pocillos tratados con compuestos cuya población de área celular normalizada inducida media superior a -1,5 puntuación z y que mostraban al menos 300 células supervivientes (es decir, núcleos teñidos vinculados al objeto teñido con Cell Mask Deep Red) por pocillo se consideraron para un análisis mas extenso. Los datos descartados presumiblemente estaban asociados con células afectadas por compuestos tóxicos. En los datos restantes, la intensidad media de CP de la población medida se normalizó. Según una serie de imágenes utilizadas para el entrenamiento, los compuestos se consideraron positivos solo cuando, después del tratamiento, la intensidad media de CP normalizada estaba al menos por debajo de -1,2 puntuación z de la escala. Siguiendo este enfoque, se seleccionaron 85 posibles resultados de los 10.084 compuestos analizados (0,84%). La Figura 1C muestra que estas moléculas seleccionadas provocaron una disminución en la intensidad media de CP sin ninguna evidencia de toxicidad (sin reducción del área celular o del recuento celular).

Descubrimiento de fármacos candidatos para el tratamiento de EAG que implica CP

[00159] Después de esta evaluación primaria, se decidió establecer curvas de dosis-respuesta para los 85 resultados para su posterior validación. Para ello, se realizó el mismo ensayo, excepto en concentraciones de compuesto de 0, 1, 5, 10 y 50 |<j>M. Las Figuras 2 (A y B) muestran las fórmulas moleculares y las curvas de respuesta a la dosis de 11 compuestos seleccionados como los que mejor responden a la dosis de los 85 resultados. Estos 11 compuestos reducen la intensidad media de CP asociada a las células de forma hermética o bifásica dependiente de la dosis (FIG.

2A) hasta una concentración de 1<j>M, la intensidad media de CP aumenta ligeramente, posiblemente como una respuesta adaptativa para mantener la homeostasis, y luego, en concentraciones superiores a 1<j>M, se observa una disminución dependiente de la dosis.

[00160] Si bien la capacidad de respuesta a la dosis es un criterio de validación aceptado, en el análisis actual también se incluyeron 8 compuestos (Figuras 3 A y B) que fueron efectivos para reducir de manera reproducible los niveles de CP, aunque de una manera monofásica, aparentemente sin respuesta a la dosis.

[00161] Se supone que el rango dinámico del efecto de reducción de CP dependiente de la concentración de estos compuestos en fibroblastos es demasiado estrecho para ser detectado por el ensayo. Estos 8 aciertos se denominaron aciertos “monofásicos”.

El efecto de los aciertos reductores de CP sobre la actividad de SG

[00162] Una vez que se descubrieron los aciertos reductores de CP, se exploró un posible mecanismo mediante el cual estos aciertos podrían reducir los niveles de CP. Si bien son instigados por glucógeno mal construido, los CP son una entidad más compleja que involucra proteínas reguladoras y de andamiaje. Por lo tanto, el control del tamaño de CP puede estar mediado por varias enzimas, capaces de generar PG (p. ej., S<g>y proteína fosfatasa-1 (PF1)), darles forma (p. ej., ERG) o degradarlas (p. ej., enzima desramificante del glucógeno (EDG) y PG). Sin embargo, la enzima controladora de PG más sencilla y con un mecanismo regulador bien estudiado es la SG. Por lo tanto, se realizó un ensayoin vitroinicial para probar el efecto del acierto sobre la actividad de SG.

[00163] Como se puede ver en la Figura 4A, se encontró que, a una concentración de 50 mM, 13 de los 19 aciertos reducen significativamente la actividad de SG en más del 30%. Esto puede sugerir que el efecto inhibidor observado en la reducción de CP para la mayoría de los ataques en las células se debe a la inhibición directa de la enzima SG sola o en combinación con otros modos de acción, como la inhibición de PF1.

Predicción computacional de posibles modos de acción de los aciertos.

[00164] Para obtener una idea preliminar de los posibles modos de acción mediante los cuales los aciertos identificados han reducido los niveles de CP, se realizó un análisis computacional. Primero se confirmó que de los 19 aciertos bifásicos y monofásicos descubiertos (representados por 36 entidades moleculares donde ciertos aciertos estaban representados por múltiples estados tautoméricos y de protonación) se predijo que solo dos serían aglutinantes promiscuos (según una lista de 28 fragmentos conocidos por caracterizar a los aglutinantes promiscuos). A continuación, los compuestos se perfilaron frente a un amplio conjunto de modelos de farmacóforos derivados de ligandos y sitios de unión a proteínas únicos, como se detalla en Materiales y Métodos. Este procedimiento de elaboración de perfiles predijo los sitios de proteínas que podrían interactuar con los aciertos. Utilizando el software UniHI, se generó un mapa de interactoma de estas proteínas (véase Figura 5A). A partir de este mapa del interactoma, se identificaron proteínas que son dianas farmacológicas.

[00165] A continuación, se utilizaron herramientas de ontología genética para filtrar de los objetivos del fármaco las proteínas que se predijo que se unirían a derivados de carbohidratos (FIG. 5B) bajo el supuesto de que estas proteínas serán más relevantes para el metabolismo de PG. UniHI ha identificado 27 fármacos que interactúan con proteínas que también se unen a derivados de carbohidratos. Estos 27 medicamentos se agruparon junto con los 19 resultados identificados (bifásicos y monofásicos). El grupo más grande incluía 21 fármacos y todos los resultados (incluida su posible protonación (pH 7) y estados tautoméricos). Aproximadamente la mitad de estos medicamentos (9 de 21, identificadores del Drug Bank (https://www.drugbank.cal) DB04012, DB01712, DB08520, DB02888, DB01723, DB00877, DB00337, DB00864, DB03621) interactúan con la proteína fosfatasa inhibidora de SG 1 (PF1), seis directamente (DB04012, DB08520, DB02888, DB00877, DB00864, DB03621) y tres (DB01712, DB01723, DB00337) a través de la proteína FKBP1A complejada con PF1. Cuando los resultados se clasificaron según su similitud con estas 9 drogas que interactúan con PF1, sólo cuatro (de las 36 entidades afectadas) cumplieron el requisito mínimo de similitud. Tres de estos cuatro aciertos están por encima de la mediana de la potencia de inhibición de SG (véase Tablas 1 y 2). Por lo tanto, este análisis sugiere la inhibición de la activación de SG mediada por PF1 como un posible mecanismo de reducción de CP común a algunos de los resultados descubiertos.

[00166] Para confirmar que el resultado medido es el resultado de una verdadera reducción en el contenido de CP y no de una contracción celular (posiblemente causada por toxicidad celular), el ensayo APS de detección de CP se optimizó incorporando una tercera tinción como referencia citoplasmática. Esta referencia citoplasmática permitió asociar la intensidad media de CP medida a una célula determinada y determinar si esa área celular se vio afectada significativamente por el compuesto probado. Este enfoque permitió además confirmar que el resultado seleccionado refleja un efecto real del compuesto sobre el contenido de CP, filtrando compuestos tóxicos.

[00167] La distribución de aciertos entre las placas (datos no mostrados) fue lo suficientemente homogénea como para sugerir que los resultados no pueden atribuirse a un artefacto resultante de una tinción desigual de las placas. Sólo se seleccionaron para el análisis 11 aciertos bifásicos y 8 aciertos monofásicos, con un efecto estable. Las tasas de aciertos típicas de respuesta a la dosis de HTS experimental pueden oscilar entre 0,01% y 0,14%, en alta concordancia con la tasa de aciertos observada para los 11 candidatos con respuesta a la dosis bifásica, que constituyen el 0,11% del total de moléculas analizadas.

[00168] Como la ECPA es una condición genética, las mutaciones ERG implicadas en ella deberían producir un fenotipo no solo en las neuronas sino también en las células que no están directamente involucradas en la patogenicidad, como los fibroblastos, que son más fáciles de obtener y cultivar que las neuronas.

[00169] Los resultados obtenidos antes del desarrollo del ensayo (Fig. 1A) mostraron que los fibroblastos ECPA tienen un contenido de CP mayor que los fibroblastos derivados de sujetos no afectados. Es de destacar que, a diferencia de los fibroblastos ECPA (tanto derivados de pacientes como de ratones), las líneas celulares de fibroblastos de pacientes o ratones con enfermedad de Lafora (LD) no forman CPper se.Una explicación probable para esta diferencia es que las líneas celulares que se replican en LD, derivadas de pacientes adolescentes a diferencia de las de mediana edad y avanzada en ECPA, simplemente no tienen el lapso de tiempo necesario para que se materialice CP en toda regla.

[00170] El ensayo de detección que se empleó aprovechó la selección fenotípica de aciertos basada en una lectura única (intensidad media de PG asociada a células), que puede ser causada por múltiples factores, como lo sugiere la complejidad de las interacciones entre las proteínas que interactúan con los aciertos candidatos (Figuras 5A-B). Por lo tanto, el efecto compuesto observado en las imágenes analizadas no necesariamente revela si el fármaco candidato está actuando como inhibidor de SG, estabilizador de ERG o promoviendo de alguna manera la degradación de PG. Sin embargo, los datos (FIG. 4A) sugieren que un posible modo de acción del 70% de los resultados (13 de 19) es, al menos en parte, la inhibición de la actividad de SG, lo cual es lógico dado que SG es la única enzima capaz de formar los enlaces interglucosídicos a 1-4 que constituyen el PG. Estos datos son corroborados por el análisis computacional según el cual la mitad de los fármacos agrupados con todos los aciertos interactúan con el activador SG PF1.

[00171] El modo de acción de inhibición de SG ya se ha demostrado para la rapamicina, un fármaco utilizado para tratar la esclerosis tuberosa, que, si bien es un inductor de autofagia bien establecido, en realidad suprime los niveles de CP no mediante la eliminación autofágica, sino mediante la inhibición de la actividad de SG. La rapamicina redujo el PG en neuronas que modelan ECPA y el glucógeno en ratones que modelan la enfermedad de Pompe EAG. Sin embargo, sus efectos tóxicos en ratones ECPA (nuestros datos no publicados) lo descalificaron para un mayor desarrollo. Dado que CP es el factor patogénico en los EAG que involucran CP, los hallazgos actuales de que la mayoría de los compuestos reductores de CP también son inhibidores leves de SG requieren una estrategia terapéutica de EAG basada en una inhibición leve de la actividad de SG, que también se espera que sea menos citotóxica. Es de destacar que la rapamicina, además de sus efectos pleiotrópicos, es un inhibidor potente, más que leve, de la actividad SG (que redujo en un 70%).

[00172] En uno de los EAG asociados con LB, LD, se ha demostrado que una simple reducción del 30 % de la actividad de SG, mediante la eliminación de la subunidad PF1 (Ptg) que dirige la fosfatasa a SG, rescata el modelo animal de la enfermedad. Los fármacos candidatos actuales alcanzan este umbral de reducción de la actividad SG (FIG. 4A), por lo que constituyen una estrategia terapéutica prometedora. Por otro lado, los aciertos reductores de CP que no inhibieron S<g>(e incluso aumentaron su actividad, Figura 4A) apuntan a una regulación multifacética de los niveles de CP, susceptible no sólo de la manipulación de su síntesis (por SG), sino también de su degradación y dando forma.

[00173] Por lo tanto, los datos sugieren que los aciertos descubiertos están realmente relacionados con la formación neta de poliglucosano, ya sea directa o indirectamente.

[00174] Encontrar un efecto inhibidor de la mayoría de los aciertos sobre la actividad de SG (FIG. 4A) y la predicción computacional de que 3 de los aciertos inhibidores de SG también podrían interactuar con PF1 (véase Tabla 2 en la Figura 4B) son especialmente importantes en vista de la no especificidad innata de algunos ensayos de detección, revelados, por ejemplo, por los llamados compuestos de interferencia pan-ensayo (PAINS). Por lo tanto, se debe proporcionar evidencia que respalde un modo de acción esperado y relevante, ya que la inhibición de SG sirve para reducir los niveles de CP, en todos los HTS para evitar el “descubrimiento” de falsos positivos que pueden desperdiciar tiempo y recursos en investigaciones inútiles.

EJEMPLO 2

RESUMEN DE ADMET

[00175] Para implementar en el futuro en la clínica nuestros candidatos a fármacos descubiertos, tendrán que cumplir ciertos criterios ADMET (Absorción, Distribución, Metabolismo, Excreción y Toxicidad), que es la práctica común para muchos fármacos diseñados de novo. Por lo tanto, se realizó un análisis ADMET exhaustivo, basado en tres herramientas independientes como se describe a continuación. Este análisis pudo reducir nuestra lista de 11 compuestos que responden a la dosis y 8 que no responden a la dosis a solo 4 que eran farmacológicamente preferidos. De los cinco compuestos priorizados en base a una única herramienta ADME (qik_prop (predicción ADME) en el programa Maestro 11.2), solo uno (N-[3-(2,7-diazaspiro[4.5]dec-2-ilcarbonil)-2-metilfenil]-2-furamida) cumplió con los estrictos criterios ADMET, lo que enfatiza la importancia de comparar varias herramientas de predicción ADMET.

[00176] Se describen los resultados de 3 programas diferentes:

1. QiqProp (de Schrodinger)

2. SwissADME (el programa de Marvin/ChemAxon)

admetSAR @ LMMR

[00177] La Figura 6 presenta la Tabla 3 que resume lo común y la diferencia entre los programas.

Resultados

[00178] UDP-1 desde el principio debido a muchos valores problemáticos.

QikProp

[00179] La Figura 7 presenta la Tabla 4 que resume los resultados para los descriptores con excepciones.

SuizaADME

[00180] La Figura 8 presenta la Tabla 5 que resume los resultados.

AdmetSAR

[00181] La Figura 9A presenta la Tabla 6 que resume los resultados.

Resumen

[00182] La Figura 9B presenta la Tabla 7 que resume los candidatos preferidos, asumiendo que los candidatos tienen menos de 4 excepciones.

EJEMPLO 3

RESULTADOSEXe IN VIVO

[00183] Para implementar los fármacos candidatos descubiertos en la clínica, deben cumplir ciertos criterios ADMET (Absorción, Distribución, Metabolismo, Excreción y Toxicidad), que es la práctica común para muchos fármacos diseñados de novo.

[00184] Por lo tanto, se realizó un análisis ADMET exhaustivo, basado en tres herramientas independientes, como se describe anteriormente.

[00185] Este análisis podría reducir la lista de 11 compuestos que responden a la dosis y 8 que no responden a la dosis a solo 4 que eran farmacológicamente preferidos.

[00186] Cabe destacar que de los cinco compuestos priorizados en base a una única herramienta ADME (qik_prop (predicción ADME) en el programa Maestro11.2), solo uno (N-[3-(2,7-diazaspiro[4.5]dec-2-ilcarbonil)-2-metilfenil]-2-furamida) cumplió con los estrictos criterios ADMET, lo que enfatiza la importancia de comparar varias herramientas de predicción ADMET.

[00187] A continuación, se realizó el fenotipado multiparamétrico de este compuesto (N-[3-(2,7-diazaspiro[4.5]dec-2-ilcarbonil)-2-metilfenil]-2-furamida) y tres más que cumplían los criterios ADMET: N-(2-metoxietil)-6-metil-N-[(3-metil-2-tienil)metil]-2-oxo-1,2-dihidropiridin-4-carboxamida (compuesto A), 5-metil-1-[4-(4H-1,2,4-triazol-4-il)fenil]pirrolidin-2-ona y 4-terc-butil-2-(4H-1,2,4-triazol-4-ilo)fenol continuaron.Nota:en términos de reducción de la acumulación corporal de poliglucosano, que es el punto final y el criterio más relevante para un supuesto fármaco reductor de poliglucosano, son válidos todos estos compuestos.

[00188] Sin embargo, se decidió centrarse en compuestos con perspectivas realistas de convertirse eventualmente en medicamentos aprobados, en lugar de compuestos que se predijo que serían superiores según criterios previos de similitud con los interactuantes de la proteína fosfatasa 1 (PF1) o la capacidad de inhibición de la glucógeno sintasa (GYS). Este es un paso importante en el proceso de optimización delhit to lead(acierto a potencial).

[00189] A continuación, se completó el análisis multiparamétrico del compuesto A, uno de los compuestos probados en el modelo de ratón GbeY329S/Y329S para ECPA. Los resultados se presentan en la Figura 10. Las diferentes características celulares en los fibroblastos ECPA de varios pacientes se ordenaron según el grado de desviación de las mismas características en los fibroblastos sanos.

[00190] Como se puede observar en la Figura 10 (panel superior), el compuesto A afectó principalmente a los parámetros del potencial de membrana nuclear y mitocondrial (TMRE), que se encontraban entre las características más afectadas por el fenotipo de la enfermedad. Como se esperaba, este efecto fue más pronunciado cuando se compararon los fibroblastos ECPA tratados con el compuesto A con los fibroblastos CS no tratados (una comparación más relevante para los entornos clínicos): el tratamiento con el compuesto A por sí solo probablemente tenga efectos similares tanto en las células afectadas como en las sanas y, por lo tanto, probablemente acerca los dos fenotipos, enmascarando parcialmente el efecto de este compuesto frente al control sano (CS).

[00191] Se descubrió que el compuesto A tiene un valor terapéutico a nivel animal (como se muestra en los resultados in vivo) y que de todas las características diferentes entre las células CS y ECPA, el núcleo y el potencial de membrana mitocondrial (MMP) se vieron afectados principalmente por el compuesto A. Estos descubrimientos sugieren que la manipulación de estas características, quizás por efectores establecidos, podría ser eficaz en la clínica al menos como terapia conjunta con otros agentes.

[00192] Los resultados que se muestran en el panel inferior de la Figura 10 revelan que, para la mayoría de las características, el compuesto A había causado la misma tendencia (aumento o disminución) tanto en las células afectadas como en las sanas. En general, en las células afectadas, el compuesto A ha provocado un cambio en la dirección preferida (es decir, más cerca del fenotipo CS) en las características más diferentes entre ECPA y CS, pero, a la inversa, en la dirección indeseable (más alejado del fenotipo CS) en características menos diferentes entre ECPA y CS.

[00193] Sin estar ligado a ninguna teoría particular, se especula que este fenómeno podría reflejar una sobrecompensación celular a la acción del compuesto A en características menos afectadas por el estado de enfermedad. Las características específicas más afectadas por el compuesto A son la intensidad nuclear, que aumenta, y el área de las mitocondrias respiratorias (marcadas con TMRE), que disminuye. Los aparentes efectos beneficiosos del compuesto A sobre el fenotipo de las células ECPA se están aclarando en los estudios del mecanismo de acción como parte del proceso de optimización del éxito.

En dos resultados

[00194] Se probó la eficacia del compuesto A y (1S*,6R*)-9-{[4-(metoximetil)-5-metilisoxazol-3-il]carbonil}-3-metil-3,9-diazabiciclo[4.2.1]nonan-4-ona (compuesto B) para corregir fenotipos de enfermedades motoras en nuestro modelo celular ECPA. Este estudio se realizó en los compuestos A y B según los esquemas descritos en las Tablas 8 y 9, respectivamente.

[00195] Todos los compuestos se inyectaron a la concentración máxima predeterminada de 250 mg/kg, lo que mostró efectos secundarios nulos en animales de tipo salvaje. Como control del vehículo se utilizó DMSO al 0,1%. Es de destacar que, para tener un número de animales estadísticamente significativo, se probó el compuesto A en ratones macho y el compuesto B en hembras (no se permitieron jaulas mixtas).

[00196] ECPA es una enfermedad autosómica sin síntomas relacionados con el género y se supuso que este diseño experimental es óptimo. El modo de administración de los compuestos fue inyección intravenosa (IV) durante el primer mes, seguida de inyección subcutánea debido a la falta de espacio para la inyección y cicatrices en las colas de los animales.

[00197] Este régimen de inyección se seleccionó por dos razones: a. Se supone que la concentración plasmática es mayor y aumenta más rápido en la inyección intravenosa en comparación con la inyección intraperitoneal (IP). Por lo tanto, en igualdad de condiciones (cruce BBB, etc.), se supone que las concentraciones más altas del compuesto llegan al cerebro antes en la inyección IV en comparación con la inyección IP y también sus concentraciones deberían ser más altas. b. El riesgo de inyección incidental en el intestino existe para las inyecciones IP y no para las inyecciones IV.

[00198] Las Tablas 8 y 9 describen el diseño del estudio para los compuestos A y B. Ambos compuestos se probaron a la edad de 4 meses, dos meses antes del inicio de la enfermedad, para evaluar posibles efectos profilácticos, y a la edad de 6 meses, en el momento del inicio de la enfermedad, con el fin de evaluar los efectos correctivos.

EJEMPLO 4

LA INFLUENCIA DE LOS COMPUESTOS A YB EN LOS PARÁMETROS MOTORES EN RATONES DE MODELADO ECPA

[00199] Cada dos semanas se probó el efecto de los compuestos A y B sobre diversos parámetros motores. Los resultados se muestran en el presente documento.

[00200] Brevemente, los datos muestran que de todos los parámetros probados el efecto de mejora más pronunciado fue el reflejo de extensión (Fig. 12A) y la fuerza de agarre (Figs. 13A-D). El compuesto (comp.) A, administrado antes de la aparición de la enfermedad a los 4 meses de edad, también parece mejorar la regularidad de la marcha probada mediante las pruebas con tinta (Fig. 16A).

[00201] Administrado después del inicio de la enfermedad, a la edad de 6 meses, el compuesto A también mejora la uniformidad de la alteración del paso (de una pata a la otra, Fig. 17B). Estos efectos también se pueden observar mediante la mejora de la cojera en las películas adheridas.

[00202] El compuesto A parece mejorar el reflejo de extensión, la fuerza de prensión y la marcha, y el compuesto B parece mejorar la fuerza de prensión. Además, los efectos de mejora del compuesto A sobre el reflejo de extensión (Fig. 12A) y la regularidad de la marcha (Fig. 16A) tienen lugar antes de la aparición de la enfermedad. Esta observación podría sugerir una ventaja del tratamiento profiláctico, aunque la uniformidad de los pasos, por otro lado, mejoró sólo después del inicio de la enfermedad (6 meses) y no antes (4 meses).

[00203] Un hallazgo sorprendente fue que los animales tratados con los compuestos A y B eran menos apáticos, más móviles y más receptivos a la intervención del experimentador.

[00204]Con más detalle:cada gráfico muestra el efecto de los compuestos indicados a la edad de 4 meses (2 meses antes del inicio) y 6 meses (al inicio) sobre los parámetros indicados. El punto de referencia es un momento anterior al inicio del tratamiento. Tenga en cuenta que, dado que los animales tratados por primera vez con los compuestos a los 6 meses de edad no recibieron ninguna inyección antes de esa edad, no podrían haberse comparado con los animales a los que se les preinyectó el vehículo. Por lo tanto, la duración de los estudios longitudinales para las cohortes tratadas por primera vez a la edad de 6 meses es más corta que la de los animales tratados por primera vez a los 4 meses de edad.

[00205] Se hace referencia a la Figura 11A, que muestra el peso (en g) en función del tiempo después de tratar ratones modeladores de ECPA con vehículo o compuesto A como se indica a los 4 meses de edad (2 meses antes del inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento no fue diferente del vehículo (p<0,1). La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni no mostró diferencias significativas (p<0,05) entre el vehículo y el tratamiento en ningún momento.

[00206] Se hace además referencia a la Figura 11B, que muestra el peso (en g) en función del tiempo después de tratar ratones modeladores de ECPA con vehículo o compuesto A como se indica a los 6 meses de edad (al inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento no fue diferente del vehículo (p<0,1). La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni no mostró diferencias significativas (p<0,05) entre el vehículo y el tratamiento en ningún momento.

[00207] Se hace además referencia a la Figura 11C, que muestra el peso (en g) en función del tiempo después de tratar ratones modelados con ECPA con vehículo, o comp. B según lo indicado a los 4 meses de edad (2 meses antes del inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento no fue diferente del vehículo (p<0,1). La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni no mostró diferencias significativas (p<0,05) entre el vehículo y el tratamiento en ningún momento.

[00208] Se hace además referencia a la Figura 11D, que muestra el peso (en g) en función del tiempo después de tratar ratones modelados con ECPA con vehículo, o comp. B como se indica a los 6 meses de edad (al inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento fue significativamente diferente del vehículo (p<0,08). La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni no mostró diferencias significativas (p<0,05) entre el vehículo y el tratamiento en ningún momento.

[00209] Se hace además referencia a la Figura 12A, que muestra el reflejo de extensión (el grado en el que se abren las patas traseras después de sujetar al animal por la cola) en función del tiempo después de tratar ratones modelados con ECPA con vehículo, o comp. A como se indica a los 4 meses de edad (2 meses antes del inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento fue diferente del vehículo con p<0,09. La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni no mostró diferencias significativas (p<0,05) entre el vehículo y el tratamiento en ningún momento.

[00210] Se hace además referencia a la Figura 12B, que muestra el reflejo de extensión en función del tiempo después de tratar ratones modeladores de ECPA con vehículo o compuesto A como se indica a los 6 meses de edad (al inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento no fue diferente del vehículo (p<0,1). La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni no mostró diferencias significativas (p<0,05) entre el vehículo y el tratamiento en ningún momento.

[00211] Se hace además referencia a la Figura 12C, que muestra el reflejo de extensión en función del tiempo después de tratar ratones modeladores de ECPA con vehículo o compuesto B como se indica a los 4 meses de edad (2 meses antes del inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento no fue diferente del vehículo (p<0,1). La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni no mostró diferencias significativas (p<0,05) entre el vehículo y el tratamiento en ningún momento.

[00212] Se hace además referencia a la Figura 12D, que muestra el reflejo de extensión en función del tiempo después de tratar ratones modelados con ECPA con vehículo, o comp. B como se indica a los 6 meses de edad (al inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento no fue diferente del vehículo (p<0,1). La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni no mostró diferencias significativas (p<0,05) entre el vehículo y el tratamiento en ningún momento.

[00213] Se hace además referencia a la Figura 13A, que muestra la fuerza de agarre promedio de la pata delantera (la fuerza necesaria para superar el agarre del alambre de la jaula con la pata delantera) como una función del tiempo después de tratar ratones modelados con ECPA con vehículo o compuesto A como se indica a los 4 meses de edad (2 meses antes del inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento no fue diferente del vehículo (p<0,1). La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni mostró una diferencia significativa (p<0,05) entre el vehículo y el tratamiento 32 días después del inicio del tratamiento.

[00214] Se hace además referencia a la Figura 13B, que muestra la fuerza de agarre promedio de la pata delantera en función del tiempo después de tratar ratones modeladores de ECPA con vehículo o compuesto A como se indica a los 6 meses de edad (al inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento fue diferente del vehículo con p<0,055. La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni no mostró diferencias significativas (p<0,05) entre el vehículo y el tratamiento en ningún momento.

[00215] Se hace además referencia a la Figura 13C, que muestra la fuerza de agarre promedio de la pata delantera en función del tiempo después de tratar ratones modeladores de ECPA con vehículo o compuesto B como se indica a los 4 meses de edad (al inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento fue diferente del vehículo con p<0,055. La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni no mostró diferencias significativas (p<0,05) entre el vehículo y el tratamiento en ningún momento.

[00216] Se hace además referencia a la Figura 13D, que muestra la fuerza de agarre promedio de la pata delantera en función del tiempo después de tratar ratones modeladores de ECPA con vehículo o compuesto B como se indica a los 6 meses de edad (al inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento era diferente del vehículo con p<0,1. La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni no mostró diferencias significativas (p<0,05) entre el vehículo y el tratamiento en ningún momento.

[00217] Se hace además referencia a la Figura 14A, que muestra la anchura media de la marcha en función del tiempo después de tratar ratones modeladores de ECPA con vehículo o comp. A como se indica a los 4 meses de edad (2 meses antes del inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento no fue diferente del vehículo (p<0,1). La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni no mostró diferencias significativas (p<0,05) entre el vehículo y el tratamiento en ningún momento.

[00218] Se hace además referencia a la Figura 14B, que muestra la anchura media de la marcha en función del tiempo después de tratar ratones modeladores de ECPA con vehículo o comp. A como se indica a los 6 meses de edad (al inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento no fue diferente del vehículo (p<0,1). La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni mostró que no hubo diferencias significativas (p<0,05) entre el vehículo y el tratamiento en ningún momento.

[00219] Se hace además referencia a la Figura 14C, que muestra la anchura media de la marcha en función del tiempo después de tratar ratones modeladores de ECPA con vehículo o comp. B según lo indicado a los 4 meses de edad (2 meses antes del inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento no fue diferente del vehículo (p<0,1). La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni no mostró diferencias significativas (p<0,05) entre el vehículo y el tratamiento en ningún momento.

[00220] Se hace además referencia a la Figura 14D, que muestra la anchura media de la marcha en función del tiempo después de tratar ratones modelados con ECPA con vehículo o comp. B como se indica a los 6 meses de edad (al inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento no fue diferente del vehículo (p<0,1). La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni no mostró diferencias significativas (p<0,05) entre el vehículo y el tratamiento en ningún momento.

[00221] Se hace además referencia a la Figura 15A, que muestra la longitud promedio de la marcha en función del tiempo después de tratar ratones modelados con ECPA con vehículo o comp. A como se indica a los 4 meses de edad (2 meses antes del inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento no fue diferente del vehículo (p<0,1). La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni no mostró diferencias significativas (p<0,05) entre el vehículo y el tratamiento en ningún momento.

[00222] Se hace además referencia a la Figura 15B, que muestra la longitud media de la marcha en función del tiempo después de tratar ratones modeladores de ECPA con vehículo o comp. A como se indica a los 6 meses de edad (al inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento no fue diferente del vehículo (p<0,1). La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni no mostró diferencias significativas (p<0,05) entre el vehículo y el tratamiento en ningún momento.

[00223] Se hace además referencia a la Figura 15C que muestra la longitud media de la marcha en función del tiempo después de tratar ratones modeladores de ECPA con vehículo o comp. B según lo indicado a los 4 meses de edad (2 meses antes del inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento no fue diferente del vehículo (p<0,1). La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni no mostró diferencias significativas (p<0,05) entre el vehículo y el tratamiento en ningún momento.

[00224] Se hace además referencia a la Figura 15D, que muestra la longitud media de la marcha en función del tiempo después de tratar ratones modelados con ECPA con vehículo o comp. B como se indica a los 6 meses de edad (al inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento no fue diferente del vehículo (p<0,1). La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni no mostró diferencias significativas (p<0,05) entre el vehículo y el tratamiento en ningún momento.

[00225] Se hace además referencia a la Figura 16A, que muestra la regularidad promedio de la distancia de paso (el coeficiente de varianza de todas las distancias de paso R-R y L-L) en función del tiempo después de tratar ratones modelados con ECPA con vehículo o comp. A como se indica a los 4 meses de edad (2 meses antes del inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento fue significativamente diferente del vehículo (p<0,01). La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni mostró una diferencia significativa (p<0,05) entre vehículo y tratamiento a los 81 días después del inicio de los tratamientos.

[00226] Se hace además referencia a la Figura 16B, que muestra la regularidad promedio de la distancia del paso en función del tiempo después de tratar ratones modelados con ECPA con vehículo o comp. A como se indica a los 6 meses de edad (al inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento no fue diferente del vehículo (p<0,1). La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni no mostró diferencias significativas (p<0,05) entre el vehículo y el tratamiento en ningún momento.

[00227] Se hace además referencia a la Figura 16C, que muestra la regularidad promedio de la distancia del paso en función del tiempo después de tratar ratones modelados con ECPA con vehículo o comp. B según lo indicado a los 4 meses de edad (2 meses antes del inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento no fue diferente del vehículo (p<0,1). La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni no mostró diferencias significativas (p<0,05) entre el vehículo y el tratamiento en ningún momento.

[00228] Se hace además referencia a la Figura 16D, que muestra la regularidad promedio de la distancia del paso en función del tiempo después de tratar ratones modelados con ECPA con vehículo o comp. B como se indica a los 6 meses de edad (al inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento no fue diferente del vehículo (p<0,1). La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni no mostró diferencias significativas (p<0,05) entre el vehículo y el tratamiento en ningún momento.

[00229] Se hace además referencia a la Figura 17A, que muestra la uniformidad promedio de la alternancia de pasos expresada como la media del valor absoluto de 0,5 menos la relación entre la distancia R-L y la distancia de paso R-R (| 0,5 - (R-L/R-R) |) y viceversa. Cuanto más uniforme es la alteración del paso, más cerca está la relación (R-L/R-R) de 0,5 y, por lo tanto, el parámetro de uniformidad se aproxima a cero. La uniformidad de la alteración del paso se representa en función del tiempo después de tratar ratones modelados con ECPA con vehículo o comp. A como se indica a los 4 meses de edad (2 meses antes del inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento no fue diferente del vehículo (p<0,1). La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni muestra una diferencia significativa (p<0,05) entre el vehículo y el tratamiento 95 días después del inicio del tratamiento.

[00230] Se hace además referencia a la Figura 17B, que muestra la uniformidad promedio de la alternancia de pasos (| 0,5 - (R-L/R-R) |) en función del tiempo después de tratar ratones modelados con ECPA con vehículo o comp. A como se indica a los 6 meses de edad (al inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento fue significativamente diferente del vehículo (p<0,06). La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni muestra una diferencia significativa (p<0,05) entre el vehículo y el tratamiento 95 días después del inicio del tratamiento.

[00231] Se hace además referencia a la Figura 17C, que muestra la uniformidad promedio de la alternancia de pasos (10,5 - (R-L/R-R)|) representada como una función del tiempo después de tratar ratones modelados con ECPA con vehículo o comp. B según lo indicado a los 4 meses de edad (2 meses antes del inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento no fue diferente del vehículo (p<0,1). La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni no mostró diferencias significativas (p<0,05) entre vehículo y tratamiento en cualquier momento.

[00232] Se hace además referencia a la Figura 17D, que muestra la uniformidad promedio de la alternancia de pasos (| 0,5 - (R-L/R-R) |) en función del tiempo después de tratar ratones modelados con ECPA con vehículo o comp. B como se indica a los 6 meses de edad (al inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento no fue diferente del vehículo (p<0,1). La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni mostró una diferencia significativa (p<0,05) entre el vehículo y el tratamiento 53 días después del inicio del tratamiento.

[00233] Se hace además referencia a la Figura 18A, que muestra la duración promedio del movimiento en una prueba de campo abierto como función del tiempo después de tratar ratones modelados con ECPA con vehículo o comp. A como se indica a los 4 meses de edad (2 meses antes del inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento no fue diferente del vehículo (p<0,1). La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni no mostró diferencias significativas (p<0,05) entre el vehículo y el tratamiento en ningún momento.

[00234] Se hace además referencia a la Figura 18B, que muestra la duración promedio del movimiento en una prueba de campo abierto como función del tiempo después de tratar ratones modelados con ECPA con vehículo o comp. A como se indica a los 6 meses de edad (al inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento no fue diferente del vehículo (p<0,1). La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni no mostró diferencias significativas (p<0,05) entre el vehículo y el tratamiento en ningún momento.

[00235] Se hace además referencia a la Figura 18C, que muestra la duración promedio del movimiento en una prueba de campo abierto como función del tiempo después de tratar ratones modelados con ECPA con vehículo o comp. B según lo indicado a los 4 meses de edad (2 meses antes del inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento no fue diferente del vehículo (p<0,1). La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni no mostró diferencias significativas (p<0,05) entre el vehículo y el tratamiento en ningún momento.

[00236] Se hace además referencia a la Figura 18D, que muestra la duración promedio del movimiento en una prueba de campo abierto como función del tiempo después de tratar ratones modelados con ECPA con vehículo o comp. B como se indica a los 6 meses de edad (al inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento no fue diferente del vehículo (p<0,1). La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni no mostró diferencias significativas (p<0,05) entre el vehículo y el tratamiento en ningún momento.

[00237] Se hace además referencia a la Figura 19A, que muestra la latencia promedio para caerse de un alambre metálico en función del tiempo después de tratar ratones modeladores de ECPA con vehículo o comp. A como se indica a los 4 meses de edad (2 meses antes del inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento no fue diferente del vehículo (p<0,1). La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni no mostró diferencias significativas (p<0,05) entre el vehículo y el tratamiento en ningún momento.

[00238] Se hace además referencia a la Figura 19B, que muestra la latencia promedio para caerse de un alambre metálico en función del tiempo después de tratar ratones modeladores de ECPA con vehículo o comp. A como se indica a los 6 meses de edad (al inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento no fue diferente del vehículo (p<0,1). La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni no mostró diferencias significativas (p<0,05) entre el vehículo y el tratamiento en ningún momento.

[00239] Se hace además referencia a la Figura 19C, que muestra la latencia promedio para caerse de un alambre metálico en función del tiempo después de tratar ratones modeladores de ECPA con vehículo o comp. B según lo indicado a los 4 meses de edad (2 meses antes del inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento no fue diferente del vehículo (p<0,1). La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni no mostró diferencias significativas (p<0,05) entre el vehículo y el tratamiento en ningún momento.

[00240] Se hace además referencia a la Figura 19D, que muestra la latencia promedio para caerse de un alambre metálico en función del tiempo después de tratar ratones modeladores de ECPA con vehículo o comp. B como se indica a los 6 meses de edad (al inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento no fue diferente del vehículo (p<0,1). La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni no mostró diferencias significativas (p<0,05) entre el vehículo y el tratamiento en ningún momento.

[00241] Se hace además referencia a la Figura 20A, que muestra la latencia promedio para caerse de un cilindro giratorio (rotarod) en función del tiempo después de tratar ratones modeladores de ECPA con vehículo o comp. A como se indica a los 4 meses de edad (2 meses antes del inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento no fue diferente del vehículo (p<0,1). La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni no mostró diferencias significativas (p<0,05) entre vehículo y tratamiento en ningún momento.

[00242] Se hace además referencia a la Figura 20B, que muestra la latencia promedio para caerse de un cilindro giratorio (rotarod) en función del tiempo después de tratar ratones modeladores de ECPA con vehículo o comp. A como se indica a los 6 meses de edad (al inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que el tratamiento no fue diferente del vehículo (p<0,1). La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni no mostró diferencias significativas (p<0,05) entre el vehículo y el tratamiento en ningún momento.

[00243] Se hace además referencia a la Figura 20C, que muestra la latencia promedio para caerse de un cilindro giratorio (rotarod) en función del tiempo después de tratar ratones modelados con ECPA con vehículo o comp. B según lo indicado a los 4 meses de edad (2 meses antes del inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que la latencia para caer fue más corta en los animales tratados (p<0,089). La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni mostró que 57 días después del inicio del tratamiento, la latencia para caer fue menor en los ratones tratados en comparación con el control con vehículo (p<0,05).

[00244] Se hace además referencia a la Figura 20D, que muestra la latencia promedio para caerse de un cilindro giratorio (rotarod) en función del tiempo después de tratar ratones modelados con ECPA con vehículo o comp. B como se indica a los 6 meses de edad (al inicio). El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró que la latencia para caer fue más corta en los animales tratados (p<0,089). La prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni no mostró diferencias significativas (p<0,05) entre el vehículo y el tratamiento en ningún momento.

[00245] Además, la cita o identificación de cualquier referencia en esta solicitud no se interpretará como una admisión de que dicha referencia está disponible como técnica anterior a la presente invención.

[00246] En la medida en que se utilicen títulos de sección, no deben interpretarse como necesariamente limitativos.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto representado por la Fórmula:

que incluye un tautómero o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que: n y m son cada uno números enteros que representan, independientemente, 1, 2 o 3; cualquiera de R1 a R4 representa un sustituyente, seleccionándose independientemente en cada aparición del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, alcoxi, hidroxi, tiohidroxi, tioalcoxi, ariloxi, tioariloxi, amino, nitro, halo, trihalometilo, ciano, amida, carboxi, sulfonamida, -S(=O)-R' y -S(=O)<2>-R', en los que R' es hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo (unido a través de un anillo de carbono) o heteroalicíclico (unido a través de un anillo de carbono); y uno cualquiera de R5a-c representa cada uno de ellos alquilo C<1>-<6>.
2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en la que n y m son 1.
3. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en la que R5a-c representan metilo.
4. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en la que el compuesto está en la forma de Fórmula:

o de Fórmula:
5. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto representado por la Fórmula:

que incluye un tautómero, cualquier enantiómero, un diastereómero o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que cualquiera de R12, R13, R14a - R14c, R15, R16 y R17a - R17b representa un sustituyente, seleccionándose independientemente en cada aparición del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C<1>-<6>, y k es un número entero que representa, independientemente, 1, 2 o 3.
6. La composición farmacéutica de la reivindicación 5, en la que cualquiera de: (i) k es 1; (ii) R12 y R13 son metilo; (iii) R15 es metilo; y (iv) R14a - R14c, y R16 son hidrógeno.
7. La composición farmacéutica de la reivindicación 5, en la que el compuesto es:
8. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, para uso en el tratamiento de una afección médica.
9. La composición farmacéutica para uso de la reivindicación 8, para el tratamiento de una afección médica asociada con la enfermedad por almacenamiento de glucógeno.
10. La composición farmacéutica para uso de la reivindicación 8, en la que dicha afección médica es una enfermedad neurodegenerativa.
11. La composición farmacéutica para uso de cualquiera de las reivindicaciones 9 y 10, formulada para administración parenteral, mucosal, nasal u oral.
12. La composición farmacéutica para uso de la reivindicación 9, en la que dicha enfermedad por almacenamiento de glucógeno (EAG) se selecciona del grupo que consiste en: EAG tipo IV y EAG tipo VII.
13. La composición farmacéutica para uso de la reivindicación 12, en la que dicha EAG es la enfermedad del cuerpo de poliglucosano del adulto (ECPA).
14. Un kit de diagnóstico que comprende un compuesto representado por la Fórmula:

que incluye un tautómero o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que: n y m son cada uno números enteros que representan, independientemente, 1, 2 o 3; cualquiera de R1 a R4 representa un sustituyente, seleccionándose independientemente en cada aparición del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, alcoxi, hidroxi, tiohidroxi, tioalcoxi, ariloxi, tioariloxi, amino, nitro, halo, trihalometilo, ciano, amida., carboxi, sulfonamida, -S(=O)-R' y -S(=O)<2>-R', en los que R' es hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo (unido a través de un anillo de carbono) o heteroalicíclico (unido a través de un anillo de carbono); y cualquiera de R5a-c representa alquilo C<1>-<6>.
15. El kit de diagnóstico de la reivindicación 14, adecuado para detectar EAG.