CN113395968B - 用于治疗疾病的fak抑制剂和btk抑制剂的组合 - Google Patents
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Abstract
本发明提供包含FAK抑制剂和BTK抑制剂的组合，其包括药物组合物和试剂盒，以及采用该组合治疗疾病、例如食管癌的方法。
Description
技术领域
本发明涉及包含FAK抑制剂和BTK抑制剂的组合，以及采用该组合治疗疾病。
背景技术
食管癌是常见的消化道肿瘤，全世界每年约有30万人死于食管癌。食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是一种致命疾病，预后不良，缺乏有效的靶向治疗。FAK过表达与食管癌细胞分化、肿瘤侵袭和转移密切相关。大约60％的食管癌患者具有高FAK表达，其5年生存率仅为非FAK高表达患者的一半(38％对69％)。FAK抑制剂可以减少肿瘤细胞的增殖并加速细胞凋亡，但它只能延缓食管癌肿瘤模型中肿瘤的生长，且效果有限。
布鲁顿酪氨酸激酶(Bruton’s tyrosine kinase，BTK)属于Tec家族的成员。它由独特的N-端结构域即PH(pleckstrin homology)结构域、TH(Tec homology)同源区、SH3(Src homology 3)结构域、SH2(Src homology 2)结构域和催化结构域，也称SH 1/TK(Srchomology1/Tyrosine kinase)结构域或者激酶结构域组成(Akinleye et al：Ibrutiniband novel BTK inhibitors in clinical development，Journal of Hematology&Oncology 2013，6：59)。在B淋巴细胞正常发育过程中，BTK基因不同蛋白区域的正确表达在B细胞的功能及多种转导途径中具有关键性作用。
BTK在自身免疫性疾病中的作用的证据已经由BTK-缺失型小鼠和BTK-充足型小鼠模型试验提供(Ki1 LP，et al：Bruton’s tyrosine kinase mediated signalingenhances leukemogenesis in a mouse model for chronic lymphocytic leukemia.AmJ Blood Res 2013，3(1)：71-83.)。在慢性淋巴细胞白血病(CLL)小鼠模型中，BTK-缺失型小鼠完全废止慢性淋巴细胞白血病，BTK过度表达会加速白血病发病，增加死亡率。
英国伦敦癌症研究所的Christopher Lord教授带领的科研团队最近的研究表明，BTK有望成为治疗食管癌的新靶点。BTK抑制剂依鲁替尼(ibrutinib)已在MYC和ERBB2扩增的癌症患者临床试验中进行，而作用机制尚不清楚。Lord教授已经开始进行二期临床试验，进一步验证ibrutinib对于MYC以及ERBB2基因活性上调的食管癌细胞的效果，但是尚未建立依鲁替尼治疗食管鳞状细胞癌的效果。
发明内容
根据本发明的一个方面，其提供包含FAK抑制剂和BTK抑制剂的组合，其用于治疗癌症、慢性自体免疫性病症、炎性病症或增生性病症。
根据本发明的一个方面，其提供包含FAK抑制剂和BTK抑制剂的组合，其用于治疗间变性大细胞淋巴瘤、非小细胞肺癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、炎性肌纤维母细胞瘤、间变性甲状腺癌、横纹肌肉瘤、乳腺癌、结直肠癌、食管癌、肾细胞癌、套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞白血病、携带17p缺失的慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞白血病、巨球蛋白血症、边缘带淋巴瘤、慢性移植物抗宿主病。FAK高表达实体瘤。系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿关节炎(RA)。
根据本发明的一个方面，其提供包含FAK抑制剂和BTK抑制剂的组合，其用于治疗食管癌，系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿关节炎(RA)。根据本发明的一个方面，其提供包含FAK抑制剂和BTK抑制剂的组合，其用于治疗食管鳞状细胞癌(ESCC)。
根据本发明，FAK抑制剂包括式I、式II、式III、式IV、式V、式VI的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物。例如5-氯-N2-(2-异丙氧基-5-甲基-4-(1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)苯基)-N4-(2-(异丙基磺酰基)苯基)嘧啶-2，4-二胺(化合物5)及其药学上可接受的盐和溶剂化物。
化合物5的结构如下：
根据本发明，BTK抑制剂包括：依鲁替尼(Ibrutinib)、ICP-022、Acalabrutinib(ACP-196)、BGB3111、ONO/GS-4059、Spebrutinib(CC-292或AVL-292)、CNX-774、Olmutinib(HM61713，BI1482694)、M7583、HM71224、PCI-32765外消旋体(PCI-32765Racemate)、GDC-0853、ONO-4059、赞鲁替尼(Zanubrutinib)、RN486、PCI-32765、CGI-1746、QL47、LFM-A13、(±)-赞鲁替尼((±)-Zanubrutinib)、SNS-062、BMS-935177、Btk抑制剂2、Evobrutinib、依鲁替尼-生物素(Ibrutinib-biotin)、BMX-IN-1、GDC-0834和CB1763。其中，优选依鲁替尼(Ibrutinib)、和依鲁替尼-生物素(Ibrutinib-biotin)。根据本发明，BTK抑制剂例如依鲁替尼不仅在MYC/ERBB2扩增或高表达的食管癌中有抗肿瘤效果，而且对于存在EGFR表达的ESCC中也有很显著的抑制肿瘤细胞的效应。根据本发明，BTK抑制剂例如依鲁替尼可以显著的降低磷酸化-EGFR的蛋白表达，以及其下游的磷酸化-AKT的蛋白表达。
BTK抑制剂例如依鲁替尼与FAK抑制剂例如化合物5组合后能达到更为显著的降低磷酸化-AKT蛋白表达的效果。因此，根据本发明提供了一种BTK抑制剂例如依鲁替尼与FAK抑制剂例如化合物5的组合，其可能成为治疗EGFR表达的ESCC的新疗法。
在一些实施方式中，包含FAK抑制剂和BTK抑制剂的组合是药物组合物的形式。
在一些实施方式中，所述FAK抑制剂和BTK抑制剂各自呈单独的制剂形式存在于试剂盒中。
在一些实施方式中，所述FAK抑制剂和BTK抑制剂同时或先后施用。
在一些实施方式中，根据本发明的组合物包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在一些实施方式中，根据本发明的组合物呈片剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂、粉剂、锭剂、药囊、扁囊剂、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液、糖浆剂、气雾剂、软膏剂、乳膏剂和注射剂的形式。
根据本发明的第二方面，提供包含FAK抑制剂和BTK抑制剂的组合物或试剂盒在制备用于治疗疾病、包括食管癌(例如食管鳞状细胞癌(ESCC))的药物中的用途。
根据本发明的第三方面，提供一种治疗疾病、包括食管癌(例如食管鳞状细胞癌(ESCC))的方法，包括对有此需要的受试者施用治疗有效量的FAK抑制剂和BTK抑制剂。
附图说明
图1A.通过在GEPIA数据库(http：//gepia.cancer-pku.cn/)中分析TCGA数据库来源信息FAK基因在食管正常组织和食管癌组织中的表达差异。
图1B.通过GEPIA数据库(http：//gepia.cancer-pku.cn/)，Pearson检验方法分析TCGA数据库来源信息FAK基囚和EGFR基因在食管癌中的相关性。
图1C.提取新鲜复苏传代4代以内处于对数增殖期6株食管癌细胞系(TE-10、TE-1、YES-2、KYSE-520、KYSE-510、KYSE-150)的蛋白，通过蛋白免疫印迹法检测以下蛋白的基础蛋白水平表达情况：EGFR、磷酸化-EGFR(p-EGFR(Tyr1068))、FAK、磷酸化-FAK(p-FAK(Tyr397))、BTK、C-Myc、磷酸化-C-Myc(p-C-Myc)，β-微管蛋白(β-tubulin)作为内参蛋白。
图1D.不同浓度的化合物5对图1C所示不同食管癌细胞系的细胞毒作用，显示化合物5在不同食管癌细胞上的活性差别。
图1E.不同浓度的依鲁替尼对图1C所示不同食管癌细胞系的细胞毒作用，显示化合物5在不同食管癌细胞上的活性差别。
图2A.化合物5与依鲁替尼单药及组合对ESCC细胞系KYSE-150的细胞生长抑制作用。
图2B.化合物5与依鲁替尼单药及组合ESCC细胞系YSE-2的细胞生长抑制作用。
图2C.化合物5与依鲁替尼单药及组合ESCC细胞系KYSE-520的细胞生长抑制作用。
图2D.化合物5与依鲁替尼的组合显著地发挥协同的细胞周期停滞的作用。
图2E.化合物5与依鲁替尼的组合显著地发挥协同的细胞凋亡诱导的作用。
图3A.通过克隆形成实验检测化合物5联合依鲁替尼对食管癌细胞增殖抑制作用。
图3B.通过细胞迁移(Transwell)实验检测化合物5联合依鲁替尼对食管癌细胞迁移抑制作用。
图3C和图3D表示蛋白免疫印迹检测化合物5联合依鲁替尼对食管癌细胞相关通路蛋白的影响。
图4A表示化合物5与依鲁替尼单药及组合给药对体内肿瘤生长的影响，显示组合给药显著抑制体内肿瘤生长。
图4B表示化合物5与依鲁替尼单药及组合对小鼠体重的影响。
定义
除非在下文中另有定义，本文中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。提及本文中使用的技术意图指在本领域中通常所理解的技术，包括那些对本领域技术人员显而易见的技术的变化或等效技术的替换。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
如本文中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”及其在本文中的其它变体形式为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。
如本文中所使用，“FAK”指局部粘着斑激酶(focal adhesion Kinase)，“FAK抑制剂”是指对FAK具有抑制作用的药剂。在一些实施方案中，所述FAK抑制剂还对于其它一种或多种靶点(例如ALK和/或ROS1)具有抑制作用。
在本文中使用的术语“BTK抑制剂”是指抑制BTK酶活性的物质、或降解BTK酶的物质、或降低BTK酶水平的基因工具。
在本文中使用的术语“药学上可接受的盐”是指游离酸或游离碱的盐，通常通过将游离碱与合适的有机或无机酸反应或者通过将酸与合适的有机或无机碱反应而进行制备。该术语可以用于本发明中的任何化合物。代表性的盐包括：乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、依地酸钙盐、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、克拉维酸盐、柠檬酸盐、二盐酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯月桂硫酸盐(estolate)、乙磺酸盐(esylate)、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、谷氨酸盐、甘苯砷酸盐(glycollylarsanilate)、己基间苯二酚酸盐(hexylresorcinate)、哈胺盐(hydrabamine)、氢溴酸盐、盐酸盐、羟萘酸盐、碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲溴酸盐、甲硝酸盐、甲硫酸盐、马来酸单钾盐、粘酸盐(Mucate)、萘磺酸盐、硝酸盐、N-甲葡葡糖胺盐、草酸盐、巴莫酸盐(双羟萘酸盐)、棕榈酸盐、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、钾盐、水杨酸盐、钠盐、硬脂酸盐、次乙酸盐、琥珀酸盐、丹宁酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、对甲苯磺酸盐、三乙基碘盐(triethiodide)、三甲胺盐和戊酸盐。当酸性取代基存在时，例如-COOH，可以形成铵盐、吗啉盐、钠盐、钾盐、钡盐、钙盐等以供剂型使用。当碱性基团存在时(例如在柠檬苦素类化合物或1，1-二甲基双胍中)，例如氨基或碱性杂芳基如吡啶基，可形成酸性盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、三氟乙酸盐、三氯乙酸盐、乙酸盐、草酸盐、马来酸盐、丙酮酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、扁桃酸盐、苯甲酸盐、肉桂酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苦味酸盐等。
在本文中使用的术语“治疗”是指减轻、缓解或改善疾病或病症的症状，改善潜在的代谢引起的的症状，抑制疾病或症状，例如阻止疾病或病症的房展、缓解疾病或病症、引起疾病或病症的消退、缓解疾病或病症引起的病况、或阻止疾病或病症的症状。
在本文中使用的术语“溶剂化物”是本发明所涉及的化合物与溶剂分子的组合、物理结合、和/或溶剂合，例如二溶剂化物、单溶剂化物、半溶剂化物。本发明涉及的化合物可以以与例如水、甲醇、乙醇等药学上可接受溶剂形成溶剂化形式，其不显著影响化合物的药理学活性或毒性且这样可以作为药理学等价物起作用。
在本文中使用的术语“受试者”是指包括人类(例如，患者)和动物(例如，小鼠、大鼠、犬、猫、兔、鸡或猴等)。当受试者是人类患者时(通常体重按60kg来计算)时，除非另有说明，本发明所述的剂量可采用与实验动物的转换因子(例如，人用剂量＝小鼠剂量/12.3)进行换算得到(请参考Kin Tam.“Estimating the“First in human”dose-a revisit withparticular emphasis on oncology drugs，ADMET&DMPK 1(4)(2013)63-75)。本领域的普通技术人员能够根据一般常识，根据受试者的具体体重、疾病的种类和严重程度以及其它因素对所述剂量进行合理调整，这些调整的技术方案均落入本发明要求保护的技术方案的范围之内。
在本文中使用的术语“有效量”或“治疗有效量”是指施用的药物或化合物的足够量(例如，剂量)，其将在一定程度上减轻被治疗的疾病或病症的一种或多种症状。结果可以是缩小和/或减轻病症或疾病原因或任意其它期望的生物系统的改变。例如，用于治疗用途的“有效量”是提供以使疾病或病症的临床症状显著减轻、而不产生过度的毒副作用的化合物或药物(例如，本申请要求保护的药物组合物)的量。
在本文中使用的术语“剂量”是指每千克(kg)受试者体重的活性物质的重量(例如，毫克(mg))。
在本文中使用的术语“IC50”是指在测量这样的效应的试验中获得最大效应的50％抑制，例如FAK或BTK的抑制的特定测试化合物或药物的量、浓度或剂量。
在本文中使用的术语“室温”是指25℃±1℃。同时，若没有具体指明实验温度，均为室温。
在本文中使用的术语“约”是指该术语所修饰的数值的±10％，更优选为±5％，最优选为±2％，因此本领域的普通技术人员能够清楚地根据所修饰的数值确定术语“约”的范围。
在本文中使用的术语“依鲁替尼”是具有下述结构的化合物
药物组合物和试剂盒
本发明第一方面提供药物组合物，包含FAK抑制剂和BTK抑制剂。
在一些实施方式中，所述FAK抑制剂为式I的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物：
其中：
R1a和R1b独立地选自氢、C1-6烷基和C3-8环烷基；
R2a和R2b独立地选自氢、C1-6烷基和C3-8环烷基；
R3选自氢、C1-6烷基、C3-6环烷基和4-8元杂环基；
R4选自C1-4烷基和C3-6环烷基；
R5为卤素；
R6选自C1-4烷基和C3-6环烷基；并且
R7选自氢、C1-4烷基和C3-6环烷基；
条件是当R1a、R1b、R2a和R2b各自为氢时，则R3选自C3-6环烷基和4-8元杂环基。
在一些实施方式中，所述FAK抑制剂为式II的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物：
其中：
R1a和R1b独立地选自氢、C1-4烷基和C3-6环烷基；
R2a和R2b独立地选自氢、C1-4烷基和C3-6环烷基；并且
R3选自氢、C1-4烷基、C3-6环烷基和4-8元杂环基。
在一些实施方式中，所述FAK抑制剂为式III的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物：
其中：
R1a和R2a各自独立地选自C1-4烷基和C3-6环烷基；并且
所述化合物具有90％或更高的对映体过量。
在一些实施方式中，所述FAK抑制剂为式IV的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物：
其中：
R1a和R2a各自独立地选自C1-4烷基和C3-6环烷基；并且
所述化合物具有90％或更高的对映体过量。
在一些实施方式中，所述FAK抑制剂为式V的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物：
其中：
R1a和R2a各自独立地选自C1-4烷基和C3-6环烷基；并且
所述化合物具有90％或更高的对映体过量。
在一些实施方式中，所述FAK抑制剂为式VI的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物：
其中：
R1a和R2a各自独立地选自C1-4烷基和C3-6环烷基；并且
所述化合物具有90％或更高的对映体过量。
在一些实施方式中，FAK抑制剂为下表中的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物：
/>
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在一些实施方式中，所述FAK抑制剂是5-氯-N2-(2-异丙氧基-5-甲基-4-(1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)苯基)-N4-(2-(异丙基磺酰基)苯基)嘧啶-2，4-二胺(化合物5)或其药学上可接受的盐或溶剂合物。
在一些实施方式中，所述BTK抑制剂具选自：依鲁替尼(Ibrutinib)、ICP-022、Acalabrutinib(ACP-196)、BGB3111、ONO/GS-4059、Spebrutinib(CC-292或AVL-292)、CNX-774、Olmutinib(HM61713，BI1482694)、M7583、HM71224、PCI-32765外消旋体(PCI-32765Racemate)、GDC-0853、ONO-4059、赞鲁替尼(Zanubrutinib)、RN486、PCI-32765、CGI-1746、QL47、LFM-A13、(±)-赞鲁替尼((±)-Zanubrutinib)、SNS-062、BMS-935177、Btk抑制剂2、Evobrutinib、依鲁替尼-生物素(Ibrutinib-biotin)、BMX-IN-1、GDC-0834和CB1763。
优选实施方案中，所述所述BTK抑制剂优选为依鲁替尼(Ibrutinib)或ICP-022。
在一些实施方式中，所述的药物组合物还包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在一些实施方式中，所述的药物组合物，为片剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂、粉剂、锭剂、药囊、扁囊剂、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液、糖浆剂、气雾剂、软膏剂、乳膏剂和注射剂的形式。
本发明所提供的试剂盒，包含FAK抑制剂和BTK抑制剂，所述FAK抑制剂优选为如上文所定义的FAK抑制剂和任选存在的药学上可接受的载体，所述BTK抑制剂优选如上文所定义的BTK抑制剂和任选存在的药学上可接受的载体。
优选实施方案中，所述FAK抑制剂是5-氯-N2-(2-异丙氧基-5-甲基-4-(1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)苯基)-N4-(2-(异内基磺酰基)苯基)嘧啶-2，4-二胺(化合物5)或其药学上可接受的盐或溶剂合物，所述BTK抑制剂是依鲁替尼(Ibrutinib)。
在一些实施方案中，所述FAK抑制剂和所述BTK抑制剂同时或先后施用。
治疗方法和用途
本发明另一方面，提供一种治疗疾病的方法，包括对有此需要的受试者施用治疗有效量的FAK抑制剂和/或BTK抑制剂，所述疾病选自癌症、慢性自体免疫性病症、炎性病症或增生性病症。
在一些实施方式中，所述FAK抑制剂优选为如上文所定义的FAK抑制剂和任选存在的药学上可接受的载体，所述BTK抑制剂优选如上文所定义的BTK抑制剂和任选存在的药学上可接受的载体。
在一些实施方式中，所述FAK抑制剂是5-氯-N2-(2-异丙氧基-5-甲基-4-(1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)苯基)-N4-(2-(异丙基磺酰基)苯基)嘧啶-2，4-二胺(化合物5)或其药学上可接受的盐或溶剂合物，并且所述BTK抑制剂为依鲁替尼(Ibrutinib)。
在一些实施方式中，所述疾病选自间变性大细胞淋巴瘤、非小细胞肺癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、炎性肌纤维母细胞瘤、间变性甲状腺癌、横纹肌肉瘤、乳腺癌、结直肠癌、食道癌(食管癌)、肾细胞癌、套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞白血病、携带17p缺失的慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞白血病、巨球蛋白血症、边缘带淋巴瘤、慢性移植物抗宿主病、FAK高表达实体瘤、系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿关节炎(RA)。
优选实施方案中，所述疾病选自食管癌，系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿关节炎(RA)。
优选实施方案中，所述疾病选自食管癌，所述食管癌优选为EGFR表达类型、HER2表达类型或myc扩增类型的食管鳞状细胞癌。
优选实施方案中，所述疾病选自EGFR表达类型的食管鳞状细胞癌。
优选实施方案中，所述疾病选自HER2表达类型的食管鳞状细胞癌。
优选实施方案中，所述疾病选自myc扩增类型的食管鳞状细胞癌。
在一些实施方式中，将所述FAK抑制剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物以约0.0025-5000mg/日的量给药，例如约0.005、0.05、0.5、5、10、20、30、40、50、100、120、150、200、250、300、350、400、450、480、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000mg/日的量给药。
在一些实施方式中，将所述FAK抑制剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物以每单位剂量约1ng/kg至约200mg/kg、约1μg/kg至约100mg/kg或者约1mg/kg至约50mg/kg的量给药，例如以每单位剂量约1μg/kg、约10μg/kg、约25μg/kg、约50μg/kg、约75μg/kg、约100μg/kg、约125μg/kg、约150μg/kg、约175μg/kg、约200μg kg、约225μg/kg、约250μg kg、约275μgkg、约300μg/kg、约325μg kg、约350μg/kg、约375μg/kg、约400μg/kg、约425μg/kg、约450μg/kg、约475μg/kg、约500μg/kg、约525μg kg、约550μg/kg、约575μg kg、约600μg/kg、约625μg/kg、约650μg/kg、约675μg/kg、约700μg/kg、约725μg/kg、约750μg/kg、约775μg/kg、约800μg/kg、约825μg/kg、约850μg/kg、约875μg/kg、约900μg/kg、约925μg/kg、约950μg/kg、约975μg/kg、约1mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约8mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg、约80mg/kg、约90mg/kg、约100mg/kg、约125mg/kg、约150mg/kg、约175mg/kg、约200mg/kg的量给药，并且每天给药一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)单位剂量。
在一些实施方式中，将所述BTK抑制剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物以约0.0025-5000mg/日的量给药0.005、0.05、0.5、5、10、20、30、40、50、100、120、150、200、250、300、350、400、450、480、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000mg/日的量给药。
在一些实施方式中，将所述BTK抑制剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物以每单位剂量约1ng/kg至约200mg/kg、约1μg/kg至约100mg/kg或者约1mg/kg至约50mg/kg的量给药，例如以每单位剂量约1μg/kg、约10μg/kg、约25μg/kg、约50μg/kg、约75μg/kg、约100μg/kg、约125μg/kg、约150μg/kg、约175μg/kg、约200μg kg、约225μg/kg、约250μg kg、约275μgkg、约300μg/kg、约325μg kg、约350μg/kg、约375μg/kg、约400μg/kg、约425μg/kg、约450μg/kg、约475μg/kg、约500μg/kg、约525μg kg、约550μg/kg、约575μg kg、约600μg/kg、约625μg/kg、约650μg/kg、约675μg/kg、约700μg/kg、约725μg/kg、约750μg/kg、约775μg/kg、约800μg/kg、约825μg/kg、约850μg/kg、约875μg/kg、约900μg/kg、约925μg/kg、约950μg/kg、约975μg/kg、约1mg/kg、约1.6mg/kg、约2mg/kg、约5mg/kg、约10 mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg、约80mg/kg、约90mg/kg、约100mg/kg、约125mg/kg、约150mg/kg、约175mg/kg、约200mg/kg的量给药，并且每天给药一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)单位剂量。
在一些实施方式中，所述FAK抑制剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物以约0.0025-1500mg/日的量给药。优选地，所述FAK抑制剂的每日给药量是1mg、5mg、10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、150mg、200mg、244mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、460mg、470mg、480mg、488mg、490mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg、850mg、900mg、950mg、1000mg，以及所述各量之间的范围，例如，1mg-1000mg、30mg-900mg、30mg-800mg、30mg-900mg、30mg-800mg、30mg-700mg、30mg-600mg、30mg-500mg、30mg-490mg、30mg-487mg等，且所述BTK抑制剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物以约0.0025-1000mg/的量给药。优选地，所述BTK抑制剂的每口给药量是10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、73mg、80mg、90mg、97.6mg、100mg、122mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、460mg、470mg、480mg、487mg、490mg、500mg，550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg、850mg、900mg、950mg、1000mg，以及所述各量之间的范围，例如，10mg-1000mg、20mg-950mg、30mg-900mg、50mg-650mg、60mg-600mg、70mg-450mg、73mg-400mg、73mg-550mg、73mg-522mg、97.6mg-600mg、97.6mg-600mg、97.6mg-700mg、97.6mg-800mg、97.6mg-950mg、122mg-500mg、122mg-600mg、122mg-700mg、122mg-800mg、97.6mg-900mg、73mg-1000mg等。
在一些实施方式中，将所述FAK抑制剂和/或所述BTK抑制剂一起、同时、顺序或交替给药。
在一些实施方式中，所述FAK抑制剂和BTK抑制剂先后施用的时间间隔可为约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约1小时、约2小时、约4小时、约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约72小时、约96小时、约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约8周、或约12周。
在一些实施方式中，可以根据需要，将所述呈药物组合物的形式(优选地，各自呈单独的剂量单元形式)的含有所述FAK抑制剂和BTK抑制剂的本发明的药物组合物，每天施用包括但不限于：1次、2次、3次、4次、5次或6次。
在一些实施方式中，可以根据需要，将所述呈药物组合物的形式(优选地，剂量单元形式)的含有所述FAK抑制剂和BTK抑制剂的本发明的药物组合物，每天施用包括但不限于：1次、2次、3次、4次、5次或6次。
在一些实施方式中，将所述FAK抑制剂和/或所述BTK抑制剂连续给药至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少21天、至少22天、至少23天、至少24天、至少25天、至少30天、至少35天、至少40天、至少45天或至少50天。
在一些实施方式中，将所述FAK抑制剂和/或所述BTK抑制剂给药一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)疗程，其中每个疗程持续至少1天、2天、3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少21天、至少22天、至少23天、至少24天、至少25天、至少30天、至少35天、至少40天、至少45天或至少50天；并且每两个疗程之间间隔0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天、两周、三周或四周。
在一些实施方式中，将所述FAK抑制剂和/或所述BTK抑制剂以相同(例如口服)或不同途径(例如分别以口服及肠胃外(如注射))给药。
在一些实施方式中，所述药物组合物可以通过下述方式施用：口服、口腔、吸入喷雾、舌下、直肠、透皮、阴道粘膜、透黏膜、局部给药，鼻或肠道给药；注射给药，如肌肉注射、皮下注射、髓内注射，以及鞘内、脑部直接给药、原位给药、皮下、腹腔内、静脉注射、关节内滑膜、胸骨、内、肝内、病灶内，颅内、腹腔、鼻腔、或眼内注射或其他药物递送方式。
本发明另一方面提供FAK抑制剂和BTK抑制剂在制备用于治疗疾病的药物组合物和/或试剂盒中的用途，其中所述疾病选自癌症、慢性自体免疫性病症、炎性病症或增生性病症。
在一些实施方式中，所述疾病选自间变性大细胞淋巴瘤、非小细胞肺癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、炎性肌纤维母细胞瘤、间变性甲状腺癌、横纹肌肉瘤、乳腺癌、结直肠癌、食道癌(食管癌)、肾细胞癌、套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞白血病、携带17p缺失的慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞白血病、巨球蛋白血症、边缘带淋巴瘤、慢性移植物抗宿主病、FAK高表达实体瘤、系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿关节炎(RA)。
优选实施方案中，所述疾病选自食管癌，系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿关节炎(RA)。
优选实施方案中，所述疾病选自食管癌，所述食管癌为EGFR表达类型、HER2表达类型或myc扩增类型的食管鳞状细胞癌。
具体实施方式
下而通过具体的实施例、对照例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例、对照例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
可以根据WO 2018/044767公开的实施例3制备本发明的化合物5。
实施例15-氯-N2-(2-异丙氧基-5-甲基-4-(1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)苯基)-N4-(2-(异丙基磺酰基)苯基)嘧啶-2，4-二胺(化合物5)的制备
步骤A：4-(5-氟-2-甲基-4-硝基苯基)-3，6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯的合成
将4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-3，6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(620mg，2mmo1)、Pd(dppf)Cl2(58mg，0.08mmo1)和K2CO3(828mg，6mmol)加入到1-溴-5-氟-2-甲基-4-硝基苯(470mg，2mmol)的DME-H2O(22mL，10∶1混合物)溶液中。氮气条件下将混合物在80℃下搅拌12小时。将反应物冷却至室温，并用乙酸乙酯萃取产物。减压除去溶剂，并将残余物通过硅胶色谱法用己烷/乙酸乙酯(9/1，v/v)纯化，得到步骤A的标题化合物(640mg，95％收率)，其为浅黄色油状物。
1H NMR(400(MHz，CDCl3)δppm 7.89(d，J＝7.5Hz，1H)，7.02(d，J＝11.5Hz，1H)，5.68(s，1H)，4.10-4.07(m，2H)，3.65(t，J＝5.6Hz，2H)，2.39-2.32(m，2H)，2.33(s，3H)，1.52(s，9H)。
步骤B：4-(5-异丙氧基-2-甲基-4-硝基苯基)-3，6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯的合成
向4-(5-氟-2-甲基-4-硝基苯基)-3，6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(640mg，1.9mmol)的20mL 2-丙醇溶液中加入Cs2CO3(1.862g，5.7mmol)。将混合物在60℃下搅拌过夜，并冷却至室温，然后减压蒸除大部分2-丙醇。加入水和乙酸乙酯萃取。合并有机层，用无水Na2SO4干燥，浓缩，并将粗产物用己烷/乙酸乙酯(8/2，v/v)通过硅胶色谱法纯化，得到步骤B的标题化合物(650mg，91％)，其为黄色油状物。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.63(s，1H)，6.79(s，1H)，5.62(s，1H)，4.65-4.62(m，1H)，4.10-4.07(m，2H)，3.64(t，J＝5.6Hz，2H)，2.36-2.34(m，2H)，2.25(s，3H)，1.52(s，9H)，1.39(d，J＝6.1Hz，6H)。
步骤C：4-(5-异丙氧基-2-甲基-4-硝基苯基)-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1，2，3，6-四氢吡啶的合成
向4-(5-异丙氧基-2-甲基-4-硝基苯基)-5，6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(217mg，0.576mmol)的二氯甲烷(5mL)溶液加入三氟乙酸(1mL)，并将反应混合物在室温下搅拌6小时。真空除去二氯甲烷和三氟乙酸，并加入100mL二氯甲烷，用饱和NaHCO3溶液洗涤。将水层用二氯甲烷再萃取两次(各100mL)。合并有机层，用盐水洗涤，用Na2SO4干燥并蒸发。将残余物溶于二氯甲烷(10mL)和四氢-4H-吡喃-4-酮(173mg，1.728mmol)，然后加入三乙酰氧基硼氢化钠(244mg，1.152mmol)和乙酸(69mg，1.152mmol)。将反应在室温下搅拌过夜。通过加水(80mL)淬灭反应，用二氯甲烷(3×100mL)萃取。合并有机层，用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，浓缩并通过硅胶柱色谱法用乙酸乙酯/甲醇(9/1，v/v)纯化，得到步骤C的标题化合物(170mg，82％，两步)，其为黄色油状物。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.63(s，1H)，6.83(s，1H)，5.62-5.59(m，1H)，4.58-4.56(m，1H)，4.11-4.01(m，2H)，3.43-3.28(m，4H)，2.78(t，J＝5.6Hz，2H)，2.60-2.56(m，1H)，2.40-2.36(m，2H)，2.23(s，3H)，1.86-1.82(m，2H)，1.69-1.65(m，2H)，1.35(d，J＝6.1Hz，6H)。
步骤D：2-异丙氧基-5-甲基-4-(1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)苯胺的合成
向4-(5-异丙氧基-2-甲基-4-硝基苯基)-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1，2，3，6-四氢吡啶(2.4g，6.66mmol)的30mL乙醇溶液中加入4mL10％HCl，然后加入铁粉(2.23g，40mmol)。将混合物在60℃下搅拌3小时。将反应物冷却至室温，滤除铁粉。减压除去乙醇，得到步骤D的标题化合物，其为浅黄色油状物(2.0g，91％收率)。MS m/z＝331[M+H]。
步骤E：5-氯-N2-(2-异丙氧基-5-甲基-4-(1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)苯基)-N4-(2-(异丙基磺酰基)苯基)嘧啶-2，4-二胺的合成
将2-异丙氧基-5-甲基-4-(1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)苯胺(330mg，1mmol)、2，5-二氯-N-(2-(异丙基磺酰基)苯基)嘧啶-4-胺(345mg，1mmol)、Xantphos(58mg，0.1mmol)、Pd(OAc)2(11mg，0.05mmol)和Cs2CO3(975mg，3mmol)溶解在无水THF(20mL)中。将N2鼓泡通过反应混合物5分钟，然后将反应容器密封并在微波辐射下加热至150℃，持续30分钟。过滤混合物，并减压浓缩滤液。浓缩后，将粗产物通过制备型HPLC(梯度为10％至60％乙腈水溶液)纯化，得到步骤E的标题化合物(125mg，20％收率)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.46(s，1H)，8.46(d，J＝8.3Hz，1H)，8.27(s，1H)，8.06(s，1H)，7.85(dd，J＝8.3，1.5Hz，1H)，7.66(t，J＝8.3Hz，1H)，7.59(s，1H)，7.37(t，J＝7.6Hz，1H)，6.73(s，1H)，5.57-5.50(m，1H)，4.58-4.54(m，1H)，3.96-3.87(m，2H)，3.47-3.43(m，1H)，3.31(t，J＝11.1Hz，2H)，3.17(d，J＝3.1Hz，2H)，2.70(t，J＝5.5Hz，2H)，2.29(t，J＝4.5Hz，2H)，2.07(s，3H)，1.78-1.74(m，2H)，1.49-1.45(m，2H)，1.23(d，J＝6.0Hz，6H)，1.16(d，J＝6.8Hz，6H)。
将所得的化合物5制备为其甲磺酸盐的形式供以下实施例中使用。即，在实施例2-6中提及的化合物5是以化合物5的甲磺酸盐形式使用的。
实施例2本发明所使用的一般实验方法
(1)通过CCK-8测定和集落形成测定确定细胞活力和生长抑制。
根据制造商的说明，使用Cell Counting Kit-8(Dojindo，Japan)测定细胞活力。简而言之，在单一药物或药物组合的存在下，将细胞以3000至4000个细胞/孔接种在96孔板中72小时。72小时后，加入CCK-8试剂(10μL/孔)并在37℃下孵育1-2小时，在450nm处获得吸光度读数。通过使用用于Windows的GraphPad Prism版本6.0.0(GraphPad Software，SanDiego，California USA)计算IC50值。
通过菌落形成实验检测生长抑制。将ESCC细胞以约500个细胞/孔接种在6孔板中，然后每3-4大用含有不同的抑制剂或DMSO的新鲜培养基替换。在第12天用结晶紫(V5265，Sigma，St Louis，MO，USA)染色细胞。用PBS洗涤两次后，用1％多聚甲醛固定细胞，并在室温下温育15分钟。然后，用PBS洗涤细胞再两次，并在室温下用0.5％结晶紫染色15分钟。
(2)通过细胞迁移(Transwell)试验检测迁移能力
将ESCC细胞悬浮于不含FBS的培养基中，所述培养基中含有化合物5，依鲁替尼或两者(200μl细胞悬液，1×105个细胞/ml)。将培养基被吸入Transwell的小室内(PC膜，孔径为8.0μm，Corning，NY，USA)，然后将该小室放置到含有750ul 50％FBS培养基的12孔板中。培养24-30小时后，将小室取出，吸去小室内的培养基并用棉签擦去内室多余的细胞，将小室放置多聚甲醛固定15分钟，并在室温下用0.5％结晶紫染色15分钟。细胞迁移活性被描述为穿出小室的相对细胞数。
(3)通过流式细胞术检测PI染色的细胞周期分析
对于细胞周期分析，将ESCC细胞以4x105个细胞每孔铺于6孔板中，并分别加入DMSO、化合物5、依鲁替尼或两者。处理24小时后，将细胞收集，并加入到70％乙醇中在4℃下固定过夜，并然后根据凯基周期试剂盒说明书进行碘化丙锭溶液(KeyGenBiotech，Nanjing，China)染色。用ACEA NovoCyteTM流式细胞仪(ACEA Biosciences Inc.China)分析DNA含量。
(4)通过流式细胞术检测细胞凋亡
对于细胞凋亡实验检测，将ESCC细胞以1x105个细胞每孔铺于12孔板中，并分别加入DMSO、化合物5、依鲁替尼或两者。处理48小时后，收集细胞，并用PBS洗涤2次。根据北京四正柏生物技术有限公司的Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书进行细胞染色：将试剂盒配有的4x结合缓冲液用蒸馏水稀释成1x，每个样品加入100μL的1x结合缓冲液重悬细胞，避光下加入5μL Annexin V-FITC用于培养5min，加入10μL Propidiom Iodide以及400μL的1x结合缓冲液混匀。室温避光在1h内上机检测，检测使用ACEA NovoCyte TM流式细胞仪(ACEA Biosciences Inc.China)。
(5)用于机理探索的蛋白免疫印迹分析。
在用DMSO，化合物5，依鲁替尼或两种药物处理细胞，24小时后收集细胞并用预冷却的PBS洗涤一次。使用含有1％蛋白酶抑制剂(PMSF)、1％磷酸激酶抑制剂的1x细胞裂解缓冲液置于冰上裂解细胞30分钟，12000rpm 4℃离心15分钟，收集上清蛋白裂解液。通过BCA蛋白质浓度检测试剂盒测量蛋白质浓度。使用8-12％SDS-PAGE电泳分离细胞蛋白裂解物(20-50μg)。将分离的蛋白质转移到PVDF膜上。在室温下用5％BSA缓冲液将PVDF膜封闭30分钟至1小时，然后在4℃摇床上与含有一抗的1x TBST一起温育过夜。洗脱多余的一抗，1xTBST洗涤膜3次，每次5-10分钟。使用含有辣根过氧化物酶标记的二抗稀释液室温下孵育蛋白条带膜1小时。洗涤，1x TBST洗膜3次，每次5-10分钟。使用ECL化学发光超敏比色试剂盒和化学发光成像系统进行信号产生和检测。本实验中使用的一抗包括：EGFR，(CST，Cat.4267S)；磷酸化EGFR(p-EGFR(Tyr1068))，(CST，Cat.3777T)；FAK，(CST，Cat.3285S)；磷酸化FAK(p-FAK(Tyr397))，(CST，Cat.8556T)；AKT，(CST，Cat.4685S)；磷酸化p-AKT(Ser473)，(CST，Cat.9271S)；ERK，(CST，Cat.4695S)；磷酸化ERK(p-ERK(Thr202/Tyr204))，(CST，Cat.4370T)；磷酸化MEK(p-MEK(Ser217/221))，(CST，Cat.9121S)；BTK，(Immunoway，Cat.YM1294)；C-Myc，(CST，Cat.5605)；磷酸化C-Myc，(CST，Cat.13748)；细胞周期蛋白B1(CST，Cat.12231S)，细胞周期蛋白D1(CST，Cat.2978S)，GAPDH(ABGENT，Cat.AM1020B)。在该实验中使用的第二抗体包括：山羊抗兔二抗(Senta，Cat.Sc-2004)和山羊抗小鼠二抗(Senta，Cat.Sc-2005)。
(6)建立ESCC细胞系KYSE-150异种移植瘤模型以评估体内协同抗肿瘤效果。
实验动物
所用动物为BALB/c Nude小鼠，4-6周龄，雌性。动物体重14-16±20％g。实验动物由北京维通利华实验动物技术有限公司提供(Vital River Laboratories，VRL，许可证号：SCXK(J)2016-0011)。动物合格证号：11400700325794
饲养条件
实验动物饲养在中山大学北校区动物实验大楼SPF级别实验室。实验动物的操作和管理均严格遵守中山大学实验动物使用和管理指导原则，所有动物实验均在中山大学实验动物使用和伦理委员会的指导下进行。每笼7只小鼠。每个鼠笼均佩挂有标记研究题目、实验组别、种属、性别和实验编号的身份卡片。动物用小鼠耳标标记。每日温度范围：20-24℃。每日湿度范围：40％-70％。光照：12小时昼夜交替。自由地进食和饮用纯净水。
体内实验
化合物5由江苏亚盛医药开发有限公司(Ascentage Pharma Group Corp.Ltd.)提供。化合物5溶于20％PG(丙二醇)/80％NaH2PO4缓冲液，并根据实验方案稀释到最终浓度100mg/ml，终溶液为澄清的溶液。化合物5灌胃给药，给药剂量为100mg/kg，给药体积为200μl。给药制剂每3天配制一次，不使用时4℃储存。给药制剂的配制和使用均在无菌条件下进行。依鲁替尼(依鲁替尼)(纯度99％)购自江苏艾康生物医药研发有限公司(南京)。依鲁替尼腹腔注射给药，给药剂量为25mg/kg，给药体积为200μl(0.2mL/鼠)。依鲁替尼药物用20％PEG 400(聚乙二醇400)/5％EL/PBS配置为混悬溶液，4℃超声将药物溶解成淡乳白色液体。给药制剂每3天配制一次，4℃储存。给药制剂的配制和使用均在无菌条件下进行。
模型构建
在40只免疫缺陷小鼠右侧腋窝皮下注射混悬于100μl PBS中5×106个KYSE-150细胞以建立异种移植瘤模型。接种约一周，28只小鼠发展成移植肿瘤。当肿瘤达到合适的大小(50-100mm3)，根据动物肿瘤体积按随机区组法进行随机分组，各组肿瘤体积差异应小于均值的10％，最终确定分组每组7只，并于分组当日开始给药(即d1)。实验设计见表1
表1.实验设计
通过细胞接种法建立人肿瘤免疫缺陷小鼠皮下异种移植瘤模型：收集对数生长期的肿瘤细胞，计数后重悬于1×PBS，调整细胞悬液浓度至5×107/mL。用1mL注射器(4号针头)在免疫缺陷小鼠右侧背部皮下接种肿瘤细胞，5×106/0.1mL/鼠。所有动物实验操作严格遵守中山大学和苏州亚盛药业有限公司实验动物使用和管理规范。相关参数的计算参考中国NMPA《细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则》。
实验期间每周测定两次动物体重和肿瘤大小。定期观察肿瘤生长情况，待肿瘤生长至平均体积50-100mm3时根据肿瘤大小和小鼠体重随机分组给药。每天观察动物的状态以及有无死亡等情况发生。常规监测包括了肿瘤生长及给药对动物正常行为的影响，具体内容有实验动物的活动性、摄食和饮水情况、体重增加或降低情况、眼睛、被毛及其它异常情况。实验过程中观察到的死亡和临床症状均记录在原始数据中。整个给药、小鼠体重及肿瘤体积的测量操作均在超净工作台中进行。根据实验方案要求，当肿瘤的长径大于20mm，则到达实验终点，对小鼠进行安乐死处理。收集肿瘤组织，称重并拍照记录。
肿瘤体积(Tumor volume，TV)的计算公式为：TV＝a×b2/2。其中a、b分别代表肿瘤测量长和宽。相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)计算公式为：RTV＝Vt/V1。其中V1为分组给药时的肿瘤体积，Vt为给药后某天测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式分别为：相对肿瘤增殖率T/C(％)＝(TRTV/CRTV)×100％，TRTV为治疗组RTV，CRTV为溶媒对照组RTV；肿瘤缓解率(％)为治疗后荷瘤小鼠出现SD(疾病稳定)、PR(肿瘤部分消退)及CR(肿瘤完全消退)的数目除以本组小鼠总数×100％。
动物体重变化(Change of body weight，％)＝(测量体重-分组时体重)/分组时体重×100％。
疗效评价标准：根据中国NMPA《细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则》(2006年11月)，T/C(％)值≤40％并经统计学分析p＜0.05为有效。若小鼠的体重下降超过20％或药物相关的死亡数超过20％，则认为该药物剂量具有严重毒性。
协同性分析采用以下公式：协同因子＝((A/C)×(B/C))/(AB/C)；A＝A药单药组的RTV值；B＝B药单药组的RTV值；C＝溶媒对照组的RTV值，AB＝＝AB联合用药组的RTV值(Clarke R.Issues in experimental design and endpoint analysis in the study ofexperimental cytotoxic agents in vivo in breast cancer and other models[J].Breast Cancer Research&Treatment，1997，46(2-3)：255-278)。若协同因子＞1，则具有协同作用；若协同因子＝1，则具有相加作用；若协同囚子＜1，则具有拮抗作用。
实施例3食管鳞状细胞癌细胞株中EGFR表达相对于FAK表达的关系以及化合物5和依鲁替尼单药对食管鳞状细胞癌细胞株的影响
(1)实验方法如实施例2第(1)、(5)部分所述。通过在GEPIA数据库(http：//gepia.cancer-pku.cn/)中分析TCGA数据库来源信息FAK基因在食管正常组织和食管癌组织中的表达差异，并通过Pearson检验方法分析TCGA数据库来源信息FAK基因和EGFR基因在食管癌中的相关性。蛋白免疫印迹法检测6株食管癌细胞株(TE-10、TE-1、YES-2、KYSE-520、KYSE-510、KYSE-150)以下蛋白的基础蛋白水平表达情况：EGFR、磷酸化-EGFR(p-EGFRTyr1068)、FAK、磷酸化-FAK(p-FAKTyr397)、BTK、C-Myc、磷酸化-C-Myc(p-C-Myc)，其中β-tubulin作为内参蛋白。在CCK-8实验中测定化合物5和依鲁替尼单药对6株食管癌细胞株(TE-10、TE-1、YES-2、KYSE-520、KYSE-510、KYSE-150)增殖抑制作用(IC50值)。
(2)实验结果
如图1A所示，在TCGA的数据中，FAK在食管癌中的表达高于正常食管组织，图1B显示FAK与EGFR的表达具有正相关性。图1D、E显示化合物5与BTK抑制剂依鲁替尼对ESCC肿瘤细胞均有较好的增殖抑制作用。
具体地，在图1C中，EGFR在六株食管癌细胞中均有表达，其中以KYSE-520表达最强，而磷酸化-EGFR(p-EGFR Tyr1068)在KYSE-520、KYSE-150、YES-2和TE-10中表达较强。FAK在TE-10、TE-1和KYSE-520中表达较强，磷酸化-FAK(p-FAK Tyr397)在TE-10和KYSE-510中表达较强，BTK在六株食管癌细胞中表达均较强，C-Myc在TE-1、YES-2、KYSE-520、KYSE-510中表达较强，磷酸化-C-Myc在TE-1和KYSE-510有表达。在图1D中，YES-2和KYSE-520对化合物5更敏感，其对抑制增殖的IC50分别为0.956和0.825μM，而在TE-10、TE-1、KYSE-510和KYSE-150的抑制增殖的IC50分别为2.597、2.212、2.268和2.309μM；在图1E中，依鲁替尼单药对YES-2和KYSE-520细胞的抑制增殖的IC50最小，分别为0.177和0.245μM，在KYSE-150和TE-10细胞中的IC50分别为1.225和3.006μM。而在EGFR蛋白表达较低的TE-1、KYSE-510的抑制增殖的IC50分别为9.876和4.422μM。
(3)小结
由此可见，FAK和EGFR在食管癌中高表达且呈正相关性，在体外实验中，化合物5对ESCC细胞株均有较好的增殖抑制作用，依鲁替尼对EGFR高表达的ESCC细胞株显示出更强的增殖抑制作用。
实施例4化合物5与依鲁替尼的联合用药体外对食管鳞状细胞癌细胞株增殖、周期阻滞和细胞凋亡的影响。
(1)实验方法如实施例2第(1)、(3)、(4)部分所述。在CCK-8实验中测定化合物5和依鲁替尼单药以及两药联合在下述三株食管鳞状细胞癌细胞株(KYSE-150、YES-2、KYSE-520)的细胞存活率(％)。细胞周期实验和凋亡检测实验分别测定化合物5和依鲁替尼单药以及两药联合作用对下述三株食管鳞状细胞癌细胞株(KYSE-150、YES-2、KYSE-520)的细胞周期分布改变和凋亡诱导发生情况的影响。
(2)实验结果
如图2A、B、C所示，在三株食管癌细胞株(KYSE-150、YES-2、KYSE-520)中，化合物5与依鲁替尼联合用药，对肿瘤细胞的增殖抑制作用增强，细胞阻滞在G1/G0期比例增加(图2D)，细胞凋亡比例增加(图2E)。
具体地，在图2A的KYSE-150细胞中，1μM的化合物5联合1μM依鲁替尼作用于细胞72小时后比各自单药对细胞增殖的抑制作用进一步增强，差异具有统计学意义(****，p＜0.0001；单因素方差分析)。在图2B的YES-2细胞中，0.5μM的化合物5联合0.25μM依鲁替尼作用于细胞72小时后比各自单药对细胞增殖的抑制作用进一步增强，差异具有统计学意义(****，p＜0.0001；单因素方差分析)。在图2C的KYSE-520细胞中，1μM的化合物5联合0.5μM依鲁替尼作用于细胞72小时后比各自单药对细胞增殖的抑制作用进一步增强，差异具有统计学意义(****，p＜0.0001；单因素方差分析)。在图2D的细胞周期实验中，KYSE-150、YES-2和KYSE-520细胞在上述对应的药物浓度作用24小时后检测显示联合用药组使细胞阻滞在G1/G0期的比例较单药组要明显上调。在图2E细胞凋亡检测实验中，KYSE-150、YES-2和KYSE-520细胞在上述对应的药物浓度作用48小时后检测显示联合用药组比单药组能诱导更显著的细胞凋亡发生，差异具有统计学意义(**，p＜0.01；***，p＜0.001；****，p＜0.0001；单因素方差分析)。
(3)小结
由此可见，在体外实验中，化合物5联合依鲁替尼对ESCC细胞株有更强的增殖抑制作用、细胞周期阻滞以及诱导更显著的细胞凋广发生。
实施例5化合物5与依鲁替尼的联合用药对食管鳞状细胞癌细胞株克隆形成、细胞迁移的影响及机制探索。
(1)实验方法如实施例2第(1)、(2)、(5)部分所述。通过平板克隆形成实验测定化合物5和依鲁替尼单药以及两药联合在下述两株食管鳞状细胞癌细胞株(YES-2、KYSE-150)的细胞克隆形成能力。通过细胞迁移Transwell实验检测化合物5和依鲁替尼单药以及两药联合在下述两株食管鳞状细胞癌细胞株(YES-2、KYSE-150)的细胞迁移能力。通过蛋白免疫印迹方法测定相关信号通路蛋白的改变情况。
(2)实验结果
如图3A所示，在KYSE-150细胞中，1μM的化合物5或1μM依鲁替尼作用下，在YES-2细胞中，0.5μM的化合物5或0.25μM依鲁替尼作用下都能产生较强的抑制细胞克隆形成，但是化合物5联合依鲁替尼后能产生更为显著的克隆形成抑制作用，联合组在连续培养12大后几乎没有细胞克隆形成。如图3B所示，在KYSE-150细胞中，1μM的化合物5和1μM依鲁替尼作用下，在YES-2细胞中，0.5μM的化合物5和0.25μM依鲁替尼作用下都能产生一定的抑制细胞迁移，但化合物5联合依鲁替尼后能产生更为显著的细胞迁移抑制作用。如图3C、D所示，通过蛋白免疫印迹实验分析，在KYES-150细胞中，1μM的化合物5和1μM依鲁替尼作用下，在KYSE-520细胞中，1μM的化合物5和0.5μM依鲁替尼作用下，结果显示化合物5单药可以显著下降磷酸化-FAK(p-FAK Tyr397)和磷酸化-AKT(p-AKT Ser397)的蛋白表达水平，依鲁替尼单药可以显著下降磷酸化EGFR(p-EGFR Tyr1068)、磷酸化MEK(p-MEK，Ser217/221)、磷酸化ERK(p-ERK，Thr202/Tyr204)、细胞周期蛋白B1和细胞周期蛋白D1的蛋白表达水平，但是化合物5和依鲁替尼联合用药后能比单药产生更显著的降低磷酸化-AKT(p-AKT Ser397)、MEK(p-MEK，Ser217/221)、磷酸化ERK(p-ERK，Thr202/Tyr204)和细胞周期蛋白D1的蛋白表达水平的作用。
(3)小结
由此可见，化合物5和依鲁替尼的联合用药能较单药产生更强的细胞克隆抑制作用和细胞迁移抑制作用。化合物5和依鲁替尼联合用药后能更显著的降低磷酸化-AKT、磷酸化-MEK和磷酸化-ERK的蛋白表达水平。
实施例6化合物5、依鲁替尼以及化合物5与依鲁替尼联合用药对人源食管鳞状细胞癌KYSE-150细胞系小鼠异种移植瘤模型的影响
(1)实验方法如实施例2第(6)部分所述。本实验在来源于人食管鳞状细胞癌KYSE-150细胞系的异种移植模型中评价了化合物5和依鲁替尼单药以及联合治疗作用。简言之，当平均肿瘤体积达到约90mm3时，开始分组给药。化合物5给药剂量为100mg/kg，p.o.，依鲁替尼给药剂量为25mg/kg，i.p.，均为qd给药，连续给药5天后，停药2天，再继续给药5天。另外设置了化合物5与依鲁替尼的联合用药组(依鲁替尼25mg/kg，i.p.，qd+化合物5100mg/kg，p.o.，qd)。
(2)实验结果
如图4A所示，化合物5单药及依鲁替尼单药对KYSE-150人食管鳞癌模型有肿瘤生长抑制作用。给药后12天(末次给药)化合物5组与依鲁替尼组的T/C值(％)分别为49.8％(*p＜0.05，与溶媒对照比较)和48.6％(*p＜0.05，与溶媒对照比较)。化合物5与依鲁替尼单药组均出现1/7PR和1/7SD，缓解率为29％。化合物5与依鲁替尼联合用药则显著加强药效，给药后12天T/C值(％)达到24.9％并具有统计学显著差异(**p＜0.01，与溶媒对照比较；*p＜0.05，与APG-2449单药组比较；p＜0.05，与依鲁替尼单药组比较)。联合用药组出现5/7PR和2/7SD，缓解率100％(图4A和表2)。协同评分0.97，提示无明显协同作用。停药后，随着时间的延长，联合用药组与化合物5与依鲁替尼单药相比优势更趋明显。在第18天，化合物5组T/C值为55.8％(p＜0.05，与溶媒对照比较)。1/7动物保持PR(缓解率14％)。依鲁替尼组的T/C值为70.2％(p＞0.05，与溶媒对照比较)，无动物保持PR或SD。化合物5与依鲁替尼联合用药的T/C值保持为24.9％(***p＜0.001，与溶媒对照组比较；**p＜0.01与依鲁替尼单药组比较)。2/7动物保持PR，1/7动物保持SD，缓解率为43％。协同评分＞1，提示协同作用(图4A和表2)。如图4B所示，各给药组未见显著的体重变化，动物状态良好。
表2.化合物5、依鲁替尼、以及化合物5与依鲁替尼联合用药在人KYSE-150小鼠异种移植瘤模型中的抗肿瘤作用
(3)小结
在人食管鳞癌KYSE-150异种移植瘤模型中，化合物5与依鲁替尼联合用药无明显副作用，联合用药的抗肿瘤作用明显优于化合物5或依鲁替尼单药。因此，化合物5与依鲁替尼联合用药可能在临床为食管鳞状细胞癌患者带来获益。
Claims (2)
1.FAK抑制剂和BTK抑制剂在制备用于治疗食管癌的药物组合物和/或试剂盒中的用途，所述FAK抑制剂是5-氯-N2-(2-异丙氧基-5-甲基-4-(1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)苯基)-N4-(2-(异丙基磺酰基)苯基)嘧啶-2,4-二胺或其药学上可接受的盐和任选存在的药学上可接受的载体，所述BTK抑制剂是依鲁替尼和任选存在的药学上可接受的载体。
2.根据权利要求1中所述的用途，其中所述食管癌为EGFR表达类型、HER2表达类型或myc扩增类型的食管鳞状细胞癌。
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