CN111527391B

CN111527391B - Maldi质谱法用水不溶性物质的试验片的制备方法

Info

Publication number: CN111527391B
Application number: CN201980006839.7A
Authority: CN
Inventors: 裵龙珍; 林泳姬; 尹汝荣; 郑畴恩; 朴炳贤; 刘贤植
Original assignee: LG Chem Ltd
Current assignee: LG Chem Ltd
Priority date: 2018-09-11
Filing date: 2019-09-11
Publication date: 2023-05-02
Anticipated expiration: 2039-09-11
Also published as: JP2021508369A; EP3708996B1; US11282684B2; EP3708996A4; KR20200030010A; JP7031956B2; EP3708996A1; KR102385738B1; US20210090866A1; CN111527391A

Abstract

本发明涉及一种其中均匀的水不溶性物质的样品的厚度均匀的试验片的制备方法，并且涉及一种通过使用MALDI质谱法分析这种试验片来定量分析水不溶性物质的方法。具体地，所述试验片可以通过以下步骤制备：将挥发性溶剂加入到水不溶性物质与基质的混合物中；将通过混合水不溶性物质与基质的混合物直至所述溶剂蒸发而得到的样品放置在由水溶性物质制成的压片杯中，并且用均匀的压力压制所述样品；和用水溶解所述压片杯。

Description

MALDI质谱法用水不溶性物质的试验片的制备方法

技术领域

本申请要求于2018年9月11日提交的韩国专利申请No.10-2018-0108097和于2019年9月10日提交的韩国专利申请No.10-2019-0112140的优先权的权益，这两项专利申请的全部公开内容通过引用并入本说明书中。

本发明涉及一种用于MALDI质谱法的水不溶性物质的试样的制备方法和所述试样的定量分析方法，更具体地，涉及一种用于MALDI质谱法的具有小的厚度变化的水不溶性物质的均匀试样的制备方法，和使用所述试样用商业MALDI-TOF MS设备得到再现性的MALDI谱图的方法。

背景技术

为了通过质谱法得到定量信息，需要得到相同样品的再现性谱图，并且需要根据样品的浓度制备线性校准曲线。

MALDI-TOF质谱法(基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法，下文中简称为“MALDI”)是一种能够分析不溶性物质的质谱法。然而，已知MALDI难以用于精确的定量分析，因为通过混合样品与基质得到的晶体不均匀，并且由于激光的照射与照射之间的变化，离子信号不稳定，引起差的谱图再现性。近来，已经报道用于多肽和生物分子的MALDI谱图的再现性。然而，合成聚合物的定量方法尚未标准化，并且使用商业MALDI-TOF MS设备难以得到始终有效的结果。

本发明人通过使可溶性聚合物样品经具有孔的掩模电喷射来制备他们自己的具有均匀厚度的聚合物试样，以便提高MALDI谱图的再现性(由LG Chem Co.,Ltd.于2017年10月11日提交的韩国专利申请No.10-2017-0130010)。此外，本发明人发现试样的厚度影响谱图的再现性，并开发了一种由使用对于各个浓度具有小的厚度变化的聚合物样品得到的再现性的MALDI谱图使用内标物制备线性校准曲线的技术(由LG Chem Co.,Ltd.于2017年11月23日提交的韩国专利申请10-2017-0157161)。在上述专利文献中公开的全部内容通过引用并入本说明书中。然而，这些方法不适用于不溶性(或难溶性)物质。

在现有技术中，已经尝试使用研棒、研钵、球磨机等来确保样品的均匀性，以便确保不溶性物质的MALDI谱图的再现性。然而，由于依赖于技术的均匀性的变化大并且由于静电，难以处理样品。此外，有一种通过混合基质与不溶性物质然后将其压制来制备颗粒形式的试样的方法，这难以控制试样的厚度。

另外，CS技术(压缩样品技术)已知是一种制备不溶性物质的试样的方法。CS技术是一种通过在放置试样的板中钻孔、将样品插入到孔中并且在阻塞孔的一侧的情况下压制样品来制备试样的方法。然而，根据CS技术，由于板的孔，在试样中不均匀地形成电场，导致在孔的中心和边缘处得到的谱图中的不同的峰m/z。

此后，为了克服这些缺点，已经尝试通过减小孔的尺寸并向样品中加入导电材料(例如，铁粉)来使电场的畸变最小化以克服这些缺点。然而，由于孔的尺寸越小，越难以将样品插入到孔中，因此，预期该方法在试样制备中降低再现性。并且不能总是确保样品与导电材料混合的均匀性。还没有开发出一种得到为不溶性物质提供再现性的MALDI谱图的试样的方法。

为了确保使用商业MALDI-TOF MS设备的不溶性物质的MALDI谱图的再现性，应当解决不溶性物质与基质的均匀混合以及制备厚度变化小的试样的问题。

发明内容

技术问题

本发明要解决的问题是提供一种其中水不溶性物质的样品均匀分布的厚度均匀的试样的制备方法，以便得到所述水不溶性物质的再现性的MALDI谱图。

本发明要解决的另一问题是得到具有均匀厚度的水不溶性物质的试样的再现性的MALDI谱图，并由此定量分析所述水不溶性物质。

技术方案

为了解决上述问题，本发明提供一种用于MALDI质谱法的水不溶性物质的试样的制备方法，包括以下步骤：

(S1)将水不溶性物质与基质混合，然后加入挥发性溶剂以分散所述水不溶性物质和所述基质，直至所述挥发性溶剂蒸发，由此得到水不溶性物质的样品；和

(S2)用所述样品填充由水溶性物质制成的压片杯的凹槽，将填充有所述样品的压片杯倒置并且压制，然后用水溶解所述压片杯以得到水不溶性物质的试样。

另外，本发明提供一种用通过上述制备方法制备的水不溶性物质的试样定量分析水不溶性物质的方法，包括以下步骤：

对于所述水不溶性物质的试样，得到MALDI质谱图；和

由所述MALDI质谱图的峰结果计算水不溶性物质与基质的信号强度比，并且根据水不溶性物质与基质的重量比将其绘制出来，从而制备定量校准线。

有益效果

在本发明中，可以通过制备具有均匀性和小的厚度变化的水不溶性物质的试样来得到再现性的MALDI谱图，从而能够使用商业MALDI-TOF MS设备定量分析水不溶性物质。

附图说明

图1示出了在根据本发明的一个实施方案的用于MALDI质谱法的试样的制备方法中得到水不溶性物质的均匀样品的过程；

图2示出了在根据本发明的一个实施方案的用于MALDI质谱法的试样的制备方法中由水不溶性物质的样品得到试样的过程；

图3示出了在根据本发明的一个实施方案的用于MALDI质谱法的试样的制备方法中使用KBr压片杯的制备过程；

图4示出了包括制备压片杯的试样制备过程；

图5是通过根据本发明的一个实施方案的用于MALDI质谱法的试样的制备方法得到的水不溶性物质的试样的显微图；

图6是根据本发明的实施例和比较例制备的水不溶性物质的试样的点与点之间的MALDI质谱图的再现性的评价结果；

图7是对于在根据本发明的一个实施方案的相同条件下制备的三个水不溶性物质的试样中的每一个得到的MALDI质谱图；

图8示出了由根据本发明的实施方案制备的水不溶性物质的试样得到的MALDI质谱图的结果，通过根据分析物与基质的重量比绘制分析物(水不溶性物质)与基质的信号强度比来制备的线性定量校准线。

具体实施方式

由于在本发明中可以进行各种修改和改变，因此，具体实施方案示于附图中并且将在详细说明中详细描述。然而，应当理解的是，本发明不意在局限于具体实施方案，而是包括落入本发明的精神和范围内的所有修改、等同物和替代物。在本发明的下面的描述中，如果确定会使本发明的主旨模糊，则将省略已知功能的详细描述。

如本文中所使用的，术语“水不溶性”意在包括不溶于水和难溶于水两者。

如本文中所使用的，术语“均匀性”或“均匀”指样品或试样中以一个比例被包含的组分彼此均匀分布的状态。

下文中，将详细描述本发明。

本发明的一个实施方案涉及一种其中水不溶性物质的样品均匀地分布以便得到所述水不溶性物质的再现性的MALDI谱图的均匀厚度的试样的制备方法，其中，所述制备方法包括以下步骤：(S1)得到水不溶性物质的样品；和(S2)通过使用压片杯由所述样品得到试样。

在步骤(S1)中，混合水不溶性物质和基质，然后加入挥发性溶剂以分散水不溶性物质和基质，直至挥发性溶剂蒸发，得到水不溶性物质的样品。

图1详细示出了在根据本发明的一个实施方案的用于MALDI质谱法的试样的制备方法中得到水不溶性物质的均匀样品的过程。

参照图1，在本发明中，通过研钵和研棒将待分析的水不溶性物质和基质混合(a)，将挥发性溶剂加入到混合物中以溶解所述基质，并且所述水不溶性物质分散在得到的溶液中(b)，然后用刮刀搅拌分散体直至使用的全部挥发性溶剂蒸发(c和c')。由此，可以得到水不溶性物质的样品。

换言之，本发明的特征在于，除了现有技术中的使用研钵和研棒混合分析物(水不溶性物质)和基质以提高样品的均匀性的步骤(a)之外，还进行将基质溶解在挥发性溶剂中并将水不溶性物质分散在溶液中的步骤(b)和经由溶剂蒸发来均匀混合所述基质和所述水不溶性物质同时保持分散状态的步骤(c，c')。根据本发明的得到样品的过程，样品的均匀性得到改善，并且在样品中不产生静电，从而改善样品的操作性能。

根据本发明得到的样品中的各个成分的均匀分布程度可以根据由其制备的试样的MALDI谱图结果的误差范围来评价。可以评价为，误差范围越小，样品越均匀分布，即，均匀性。

在一个实施方案中，所述水不溶性物质包括：蒽醌颜料，如颜料红177(PR177，4,4'-二氨基[1,1'-联蒽]-9,9',10,10'-四酮)、铜酞菁颜料、苝颜料、二酮基吡咯并吡咯颜料、苯并咪唑酮颜料、异吲哚啉颜料或二噁嗪颜料，但是不限于此。

在一个实施方案中，与水不溶性物质混合的基质在水中具有低溶解度，并且可以是DCTB(反式-2-[3-(4-叔丁基苯基)-2-甲基-2-亚丙烯基]丙二腈)、DPF(α,β-二苯基富马腈)、α-氰基-4-羟基肉桂酸或蒽三酚(1,8,9-三羟基蒽)，但是不限于此。

对所述水不溶性物质和所述基质的含量没有特别地限制，但是它们可以以1:20至1:100，如以1:20的重量比混合。

在一个实施方案中，向水不溶性物质和基质中加入的挥发性溶剂可以是选自四氢呋喃(THF)、氯仿等中的一种或多种，但是不限于此。

在一个实施方案中，除了研钵和研棒之外，可以使用球磨机将基质与水不溶性物质混合。

接着，在步骤(S2)中，将上面得到的样品填充到由水溶性物质制成的压片杯的凹槽中，并且将压片杯倒置并压制，然后用水溶解压片杯以得到水不溶性物质的试样。

图2详细示出了在根据本发明的一个实施方案的用于MALDI质谱法的试样的制备方法中由水不溶性物质的样品得到试样的过程。

参照图2，在本发明中，制备由水溶性物质制成的压片杯，并将水不溶性物质的样品填充到其凹槽中(d)，将填充有所述样品的压片杯倒置(e)，进行压制(f)，将使用的压片杯溶解在水中(g)，并且进行附加的干燥(h)，从而得到水不溶性试样。在这种情况下，所述压制可以使用热压机在1巴至5巴的压力下进行10秒至20秒。

在本发明中，为了在预定区域上并且在样品之间以相同的压力压制根据上述过程得到的水不溶性物质的均匀样品，使用压片杯作为将相同量的样品限制在特定区域的工具。可以不受限制地使用压片杯，只要它是可以溶解在水中的水溶性物质即可。例如，可以使用由KBr、NaBr、MgBr₂、NaCl或它们的混合物制成的压片杯。

图3示出了在根据本发明的一个实施方案的用于MALDI质谱法的试样的制备方法中使用的KBr压片杯的制备过程。

参照图3，用于制备KBr压片杯的单元可以包括：平坦方形板6；具有居中圆孔的方形框架1，该方形框架1放置在板6上；圆形部件2、3和4，它们以此顺序放置在方形框架1的圆孔中；和圆形部件5，该圆形部件5放置在圆形部件4上，然后压制。

制备KBr压片杯的具体过程如下。

首先，将中心具有圆孔的框架1放置在板6上，并且将圆形部件2放置在框架1的圆孔中(步骤i)。在从KBr压片杯的制备到试样的制备的整个过程中使用板6。对板6的形状、尺寸和材料没有特别地限制，只要试样的整个制备过程可以容易地进行即可。随后，将圆形部件3放置在圆形部件2上(步骤ii)。此时，圆形部件2在中心处具有凸起部分，并且圆形部件3具有在中心处具有小圆孔的形状。随后，在圆形部件3的中心的孔中填充KBr(步骤iii)。圆形部件2的凸起部分及其尺寸和圆形部件3的中心的孔及其尺寸与后面描述的KBr压片杯的形状和尺寸相对应。当圆形部件3的中心的孔中填充KBr时，在其上放置圆形部件4(步骤iv)。圆形部件4具有在中心处的凸起部分。之后，将圆形部件5放置在圆形部件4上(步骤v)，然后进行压制(步骤vi)。此时，在圆形部件5的整个区域上施加相同的压力。由于圆形部件2、3和4以此顺序放入框架1的圆孔中，它们的尺寸必须精确地适合框架1的圆孔。在充分压制圆形部件5之后，移除圆形部件5和4，并且移除圆形部件2和框架1，仅将圆形部件3留在板6上。通过压制将KBr牢固地填充在圆形部件3的中心的孔中。最后，移除圆形部件3以完成KBr压片杯(步骤vii)。完成的压片杯通过圆形部件2的凸起部分在中心处成凹槽的形状。

在本发明中，对框架1的形状和尺寸没有特别地限制，但是优选地，所有的圆形部件2、3和4都插入到框架1的圆孔中，使得框架的厚度可以等于或大于圆形部件2、3和4的厚度之和。圆形部件5应当小于圆形部件4，以便于压制。对圆形部件1至5的材料没有特别地限制，例如，为不锈钢、铝等。

在一个实施方案中，可以使用热压机进行压制。例如，可以在1巴至5巴的压力下进行压制10秒至20秒。

对框架1的圆孔和圆形部件3的中心处的孔的尺寸没有特别地限制。

在一个实施方案中，所述压片杯可以具有圆形或多边形形状。

图4示意性地示出了包括制备压片杯的试样制备过程，该过程包括：将压片杯的材料如KBr放置在用于制备压片杯的单元中，对其压制以制备压片杯(见图3)；将水不溶性物质的样品装到得到的压片杯中；将压片杯倒置并将其安装在MALDI样品板上并压制；然后溶解压片杯。

这样，利用压片杯，不需要像通过传统CS技术(压缩样品技术)制备试样的情况那样在放置试样的板上钻孔，并且可以克服由于使用CS技术导致的电场不均匀所引起的缺点。换言之，本发明中使用的压片杯可以在样品被限制在其中的情况下以每单位体积相同的压力压制，从而使得可以制备均匀的试样。此外，通过仅将压片杯而不是与压片杯一起压制的样品溶解在水中，可以防止试样表面由于压制而损坏。

如上制备的本发明的水不溶性物质的试样的厚度可以为20μm以下，例如，为10μm以下。此外，当在多个点，例如，在三个或更多个点处测量试样的厚度以计算平均值的标准偏差时，厚度变化可以为30％以下。

这样，当使用具有小的厚度变化的水不溶性物质的试样用于MALDI质谱法时，可以得到再现性的MALDI谱图，从而能够定量分析水不溶性物质的样品。

因此，本发明提供一种利用使用压片杯制备的水不溶性物质的试样的MALDI质谱法定量分析水不溶性物质的方法。

具体地，所述分析方法包括以下步骤：得到使用压片杯制备的水不溶性物质的试样的MALDI质谱图；和由所述MALDI质谱图的峰结果计算水不溶性物质与基质的信号强度比，并根据水不溶性物质与基质的重量比将其绘制出来，从而制备定量校准线。

MALDI质谱图可以使用商业MALDI-TOF MS设备得到。此时，为了得到具有良好S/N比(信噪比)的谱图，MALDI谱图可以在用于试样的50至200个点中的数个点，例如，三个或更多个点，或五个或更多个点处得到，以确定平均值。

在一个实施方案中，表示当对同一试样上的三个或更多个点(点与点之间)进行测量时的结果的偏差的水不溶性物质的试样的MALDI质谱图的相对标准偏差(RSD)为40％以下，具体地为35％以下，例如为25％至35％或为25％至30％。此外，对在相同条件下制备的三个或更多个试样(样品与样品之间)测量的MALDI质谱图的结果的RSD为40％以下，具体地为30％以下，例如为20％至30％或为25％至30％。这种RSD范围证明了由根据本发明制备的试样得到的MALDI谱图的再现性，以确保厚度均匀性。

另外，利用再现性的MALDI谱图的结果制备的定量校准线，即，通过根据水不溶性物质与基质的重量比绘制水不溶性物质与基质的信号强度比而制备的定量校准线都是线性的(见图8)。由此，可以对水不溶性物质进行定量分析。

下文中，将详细描述本发明的实施例，以使本领域技术人员可以容易地实施本发明。然而，本发明可以以许多不同的形式实施，并且不应理解为局限于本文中阐述的实施例。

<实施例1>

步骤1：制备样品

使用由下面式表示的颜料红177(PR177，C₂₈H₁₆N₂O₄，精确质量为444.11)作为待分析的水不溶性物质，使用DCPB(反式-2-[3-(4-叔丁基苯基)-2-甲基-2-亚丙烯基]丙二腈)作为基质。如图2中所示，将水不溶性物质和基质在研钵&研棒中以1:20的重量比混合，并用研钵研磨。向其中加入作为挥发性溶剂的THF(2mL)用于分散混合物并连续混合。随后，在用刮刀搅拌的同时连续混合直至THF蒸发，得到具有均匀分布的水不溶性物质和基质的样品。

步骤2：制备试样

将在步骤1中制备的样品填充到如图4中所示制备的KBr压片杯的凹槽中。将填充有样品的KBr压片杯倒置并且安装在MALDI样品板上，然后对KBr压片杯施加5巴的压力20秒。随后，将KBr溶解在水中，制备厚度约为10μm的PR177试样。

图5示出了制备的试样的显微图，从中可以看出，样品没有表面损坏。

<比较例1>

步骤1：制备样品

通过仅将作为水不溶性物质的PR177和作为基质的DCPB以1:20的重量比在研钵&研棒中混合并用研钵研磨来制备样品。

步骤2：制备试样

以与实施例1的步骤2中相同的方式制备试样。

<比较例2>

步骤1：制备样品

以与实施例1的步骤1中相同的方式制备样品。

步骤2：制备试样

通过将在步骤1中得到的样品放置在MALDI样品板上而不使用KBr压片杯，然后简单地压制，来制备试样。

实验例1：点与点之间的再现性的评价

使用MALDI-TOF质谱仪(Ultraflextreme，Bruker Daltonics，德国)，得到对于根据实施例和比较例制备的各个PR177试样的五个点的MALDI质谱图。根据谱图结果，计算对于各个点的PR177离子(A⁺)的基峰与来自DCTB的离子中的具有最大强度的离子(M⁺)的基峰的强度比(A⁺/M⁺强度比)。对于根据比较例1制备的PR177试样的五个点中的每一个的强度比分别示于图6(a)中，对于根据比较例2制备的PR177试样的五个点中的每一个的强度比分别示于图6(b)中，对于根据实施例1制备的PR177试样的五个点中的每一个的强度比分别示于图6(c)中。

从图6(a)和图6(b)可以看出，对于在比较例1和比较例2中制备的试样的各个点的强度比(A⁺/M⁺强度比)明显偏离平均值(参见绿色箭头)。具体地，在以相同的方式制备样品之后不使用压片杯来制备试样的比较例2的情况下，即使在信号在特定位置上表现良好的条件下，当改变试样的位置时，也根本检测不到信号。认为这是由于试样的厚度的剧烈变化引起的激光与试样之间的位置关系的大的变化所导致。

另一方面，在通过根据实施例1的方法制备的试样的结果中，如图6(c)中所示，可以看出，对于各个点的强度比(A⁺/M⁺强度比)稍微偏离平均值(在实施例1中，强度比之间的RSD为30％以下)。

如上所述，根据本发明，与仅使用研钵和研棒进行简单混合以得到样品的比较例1，和在试样的制备中未使用压片杯的比较例2相比，在使用压片杯由当混合水不溶性物质与基质时通过使用挥发性溶剂以提高混合物的分散性而制备的样品制备试样的情况下，试样的均匀性提高，并且实现高的MALDI质谱图的点与点之间的再现性。

实验例2：样品与样品之间的再现性的评价

根据实施例在相同的条件下制备三个试样。对于每个试样得到的MALDI质谱图示于图7(a)、图7(b)和图7(c)中。

由图7可以确认三个试样中的强度图案的再现性和峰的峰位置。此外，PR177离子(A⁺)的基峰与来自DCTB的离子中的具有最大强度的离子(M⁺)的基峰的强度比(A⁺/M⁺强度比)为25％。因此，根据本发明制备的试样的MALDI质谱图也具有高的样品与样品之间的再现性。

实验例3：定量校准曲线的评价

使用图7的质谱图的峰计算分析物(水不溶性物质)与基质的信号强度比，并且根据分析物与基质的重量比绘制所述比例，以制作定量校准曲线。结果示于图8中。

具体地，图8示出了使用对应于m/z 332(a)和m/z 250(b)的基质峰创建的线性定量校准线(R²＝0.99以上)。

尽管已经参照本发明的特定实施例具体示出和描述了本发明，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些具体描述仅是优选的实施例，并且本发明的范围不限于此。因此，本发明的范围旨在由所附权利要求书及其等同物限定。

Claims

1.一种用于MALDI质谱法的水不溶性物质的试样的制备方法，包括以下步骤：

步骤S1，将水不溶性物质与基质混合，然后加入挥发性溶剂以分散所述水不溶性物质和所述基质，搅拌直至所述挥发性溶剂蒸发，由此得到水不溶性物质的样品；和

步骤S2，用所述样品填充由水溶性物质制成的压片杯的凹槽，将填充有所述样品的压片杯倒置并且以每单位体积相同的压力压制，然后用水溶解所述压片杯以得到水不溶性物质的试样。

2.根据权利要求1所述的用于MALDI质谱法的水不溶性物质的试样的制备方法，其中，所述水不溶性物质包括：蒽醌颜料、铜酞菁颜料、苝颜料、二酮基吡咯并吡咯颜料、苯并咪唑酮颜料、异吲哚啉颜料、二噁嗪颜料或它们的混合物。

3.根据权利要求2所述的用于MALDI质谱法的水不溶性物质的试样的制备方法，其中，所述水不溶性蒽醌颜料是颜料红177(PR177，4,4'-二氨基[1,1'-联蒽]-9,9',10,10'-四酮)。

4.根据权利要求1所述的用于MALDI质谱法的水不溶性物质的试样的制备方法，其中，与所述水不溶性物质混合的所述基质包括：DCTB(反式-2-[3-(4-叔丁基苯基)-2-甲基-2-亚丙烯基]丙二腈)、DPF(α,β-二苯基富马腈)、α-氰基-4-羟基肉桂酸、蒽三酚(1,8,9-三羟基蒽)或它们的混合物。

5.根据权利要求1所述的用于MALDI质谱法的水不溶性物质的试样的制备方法，其中，向所述水不溶性物质和所述基质中加入的所述挥发性溶剂包括四氢呋喃(THF)、氯仿或它们的混合物。

6.根据权利要求1所述的用于MALDI质谱法的水不溶性物质的试样的制备方法，其中，所述压片杯由KBr、NaBr、MgBr₂、NaCl或它们的混合物组成。

7.一种用通过根据权利要求1所述的制备方法制备的水不溶性物质的试样定量分析水不溶性物质的方法，包括以下步骤：

对于所述水不溶性物质的试样，得到MALDI质谱图；和

8.根据权利要求7所述的定量分析水不溶性物质的方法，其中，在所述试样的不同点处测得的MALDI质谱图的相对标准偏差RSD为40％以下。

9.根据权利要求7所述的定量分析水不溶性物质的方法，其中，通过应用在相同条件下制备的多个试样测得的MALDI质谱图的相对标准偏差RSD为40％以下。