KR102385733B1 - Maldi 질량분석용 수난용성 물질 시편의 제조 방법 및 이에 사용하기 위한 샘플 플레이트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 기재 및 상기 기재의 상부에 위치하는 복수의 돌기부를 포함하고, 상기 돌기부는 상부 가압시 힘을 받기 위한 평탄면을 구비하는 샘플 플레이트를 이용하여 균질한 수난용성 물질 시료의 두께가 균일한 시편을 제조하는 방법, 및 상기 시편에 대해 MALDI 질량 분석을 수행하여 수난용성 물질을 정량분석하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따라, 돌기부가 형성된 샘플 플레이트를 펠렛 컵과 함께 MALDI 질량분석용 수난용성 물질 시편의 제조에 이용하는 경우, 상기 돌기부 위에 시료가 담긴 펠렛 컵을 가압시킬 때 시료가 도입된 부분에 주로 압력이 가해지게 함으로써, 가압시에 펠렛 컵이 우그러져 시편의 에지가 뭉개지는 현상 및 샘플 플레이트로부터 시편이 떨어져 들뜨는 현상을 방지할 수 있고, 또한 샘플 플레이트가 휘는 것을 방지하여 재사용이 가능함에 따라 시편 제조의 재현성을 향상시킬 수 있다. 이에 따라, 균질하고 두께 편차가 작은 수난용성 물질 시편을 제조할 수 있고, 상기 시편으로부터 재현성있는 MALDI 스펙트럼을 획득할 수 있어 상용 MALDI-TOF MS 장비를 이용한 수난용성 물질의 정량분석이 가능하다.

Description

MALDI 질량분석용 수난용성 물질 시편의 제조 방법 및 이에 사용하기 위한 샘플 플레이트{METHOD OF MANUFACTURING SPECIMENS OF POORLY WATER-SOLUBLE MATERIALS FOR MALDI MASS SPECTROMETRY AND SAMPLE PLATE USED IN THE METHOD}

본 발명은 MALDI 질량분석에 사용되는 수난용성 물질 시편의 제조 방법 및 이에 사용되는 샘플 플레이트에 관한 것이다.

질량 스펙트럼을 통하여 정량적 정보를 얻기 위해서는 동일한 시료에 대하여 재현성있는 스펙트럼을 얻고 시료의 농도에 따른 선형 검정곡선(calibration curve)을 작성할 수 있어야 한다.

MALDI-TOF 질량분석법(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry, 이하에서 간략하게 “MALDI”로 언급함)은 불용성 물질을 분석할 수 있는 질량분석법이다. 그러나, MALDI는 시료와 매트릭스(matrix)의 혼합으로 만들어진 결정이 불균질하고 레이저 샷-투-샷(shot-to-shot) 변동성으로 인해 이온 시그널이 안정되지 못하고 스펙트럼 재현성이 떨어져 정확한 정량분석에 사용하기 어려운 기술로 알려져 있다. 최근에는 펩타이드 및 생물 단분자 물질에 대하여 MALDI 스펙트럼의 재현성을 확보한 경우가 보고되기도 하였으나, 합성 고분자의 정량법은 표준화되어 있지 않으며 상용 MALDI-TOF MS 장비를 활용하여 일정하게 효과적인 결과를 얻기는 어렵다.

본 발명자들은 MALDI 스펙트럼의 재현성을 높이기 위해 가용성 고분자 시료에 대하여 홀(hole)이 있는 마스크(mask)를 통한 전기분무(electrospray)에 의해 두께가 균일한 고분자 시편을 자체 제조한 바 있다(대한민국 출원 제10-2017-0130010호, 출원일: 2017.10.11, 출원인: 주식회사 엘지화학). 또한, 본 발명자들은 시편의 두께가 스펙트럼의 재현성에 영향을 미친다는 사실을 발견하고 제작한 두께 편차가 작은 농도별 고분자 시편을 이용하여 재현성있는 MALDI 스펙트럼을 얻은 후 내부 표준물질을 사용하여 선형 검정곡선을 작성하는 기술을 개발한 바 있다(대한민국 출원 제10-2017-0157161호, 출원일: 2017.11.23, 출원인: 주식회사 엘지화학). 상기 특허문헌들에 개시된 모든 내용은 본 명세서에서 참고문헌으로서 인용한다. 그러나, 이들 방법은 난용성 또는 불용성 물질에 대해서는 적용할 수 없었다.

이에, 본 발명자들은 난용성 또는 불용성 물질의 MALDI 질량 분석에 적합한 균질하고 두께 편차가 적은 시편을 제공하기 위해, 상용 샘플 플레이트 상에 수용성 재질의 펠렛 컵(pellet cup)을 이용하여 일정한 양의 시료(수난용성 물질과 매트릭스의 혼합물)을 제한된 면적에 일정한 압력으로 가압하는 방법으로 시편을 제조한 바 있다(대한민국 출원 제10-2018-0108097호, 출원일: 2018.09.11, 출원인: 주식회사 엘지화학). 상기 특허문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서에서 참고문헌으로서 인용한다.

그러나, 상기와 같은 시편 제조 방법에서는 상용 샘플 플레이트 위에서 직접 펠렛 컵을 가압함에 따라 샘플 플레이트의 휨, 시편 에지 부분의 뭉개짐, 샘플 플레이트에서 시편이 떨어져 들뜨는 현상 등이 발생하여 일정한 시편의 제조가 어려운 단점이 있다(도 1 참조). 또한, 샘플 플레이트가 휘는 경우 MALDI 질량 분석시 조사되는 레이저와 시편의 상대적 위치를 일정하게 유지하기 어렵고 전기장의 뒤틀림이 발생하여 스펙트럼의 재현성을 확보하기 어렵다.

본 발명은 상기 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 MALDI 질량 분석용 수난용성 물질 시편을 제조시에 특정 구조의 샘플 플레이트를 이용함으로써, 가압 과정에서 시편이 뭉개지거나 들뜨는 현상을 방지할 수 있고 상기 플레이트 자체가 휘지 않아 재사용이 가능하여 두께가 균일한 시편 제조의 재현성을 높일 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 MALDI 질량 분석용 수난용성 물질 시편의 제조 방법에 사용되는 전용 샘플 플레이트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로부터 제조된 균일한 두께의 수난용성 물질 시편에 대해 재현성 있는 MALDI 스펙트럼을 얻고 이로부터 수난용성 물질을 정량 분석하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 측면에 따르면,

(S1) 기재 및 상기 기재의 상부에 위치하는 복수의 돌기부를 포함하고, 상기 돌기부는 상부 가압시 힘을 받기 위한 평탄면을 구비하는 샘플 플레이트를 준비하는 단계;

(S2) 수난용성 물질과 매트릭스를 혼합한 후 휘발성 용매를 투입하여 상기 휘발성 용매가 증발될 때까지 상기 수난용성 물질과 매트릭스를 분산시켜 수난용성 물질 시료를 수득하는 단계; 및

(S3) 상기 (S2) 단계에서 수득된 시료를 수용성 재질로 된 펠렛 컵의 홈에 채우고, 상기 펠렛 컵을 뒤집어 상기 샘플 플레이트의 돌기부 위에 상기 펠렛 컵의 홈이 위치하도록 올려놓고 상부에서 가압한 후, 상기 펠렛 컵을 물로 녹여 수난용성 물질 시편을 형성하는 단계를 포함하는, MALDI 질량분석용 수난용성 물질 시편의 제조 방법이 제공된다.

또한, 본 발명은 상기 MALDI 질량분석용 수난용성 물질 시편의 제조에 사용하기 위한 샘플 플레이트로서,

기재 및 상기 기재의 일면에 위치하는 복수의 돌기부를 포함하고, 상기 돌기부는 상부 가압시 힘을 받기 위한 평탄면을 구비하는 샘플 플레이트를 제공한다.

추가로, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 수난용성 물질 시편을 이용한 수난용성 물질의 정량분석방법으로서,

상기 수난용성 물질 시편에 대해 MALDI 질량 스펙트럼을 얻은 단계; 및

상기 스펙트럼의 피크 결과로부터 수난용성 물질 및 매트릭스의 시그날 강도 비율을 산출하고, 이를 수난용성 물질과 매트릭스의 중량 비율로 도시하여 정량 검정선을 작성하는 단계를 포함하는 수난용성 물질의 정량분석방법을 제공한다.

본 발명에 따라 돌기부가 형성된 샘플 플레이트를 펠렛 컵과 함께 MALDI 질량분석용 수난용성 물질 시편의 제조에 이용하는 경우, 상기 돌기부 위에 시료가 담긴 펠렛 컵을 가압시킬 때 시료가 도입된 부분에 주로 압력이 가해지게 함으로써, 가압시에 펠렛 컵이 우그러져 시편의 에지가 뭉개지는 현상 및 샘플 플레이트로부터 시편이 떨어져 들뜨는 현상을 방지할 수 있고, 또한 샘플 플레이트가 휘는 것을 방지하여 재사용이 가능함에 따라 시편 제조의 재현성을 향상시킬 수 있다.

이에 따라, 균질하고 두께 편차가 작은 수난용성 물질 시편을 제조할 수 있고, 상기 시편으로부터 재현성있는 MALDI 스펙트럼을 획득할 수 있어 상용 MALDI-TOF MS 장비를 이용한 수난용성 물질의 정량분석이 가능하다.

도 1a는 기존 기술에 따른 MALDI 질량분석용 수난용성 물질 시편의 제조 방법에서 상용 샘플 플레이트 상에 시료가 담긴 펠렛 컵을 뒤집어 가압시키는 과정을 나타낸 것이다.
도 1b는 기존 기술에서 사용된 상용 샘플 플레이트가 가압 과정 후에 휘어진 모습을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시양태에 따른 MALDI 질량분석용 수난용성 물질 시편의 제조 방법에서 돌기부를 구비한 샘플 플레이트 상에 시료가 담긴 펠렛 컵을 뒤집어 가압시키는 과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 3는 본 발명의 일 실시양태에 따른 MALDI 질량분석용 시편의 제조 방법에 사용된 전용 샘플 플레이트 및 덮개의 개략적인 구조를 예시한 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시양태에 따른 MALDI 질량분석용 시편의 제조 방법에서 수난용성 물질 시료를 수득하는 과정을 예시한 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시양태에 따른 MALDI 질량분석용 시편의 제조 방법에서 수난용성 물질 시편을 형성하는 과정을 예시한 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시양태에 따른 MALDI 질량분석용 시편의 제조 방법에 사용된 펠렛 컵의 제작 과정을 예시한 것이다.
도 7a 및 7b는 각각 실시예 3에서 제조된 시편을 Optical profiler로 측정한 시편의 이미지와, 각 시편의 중심을 지나는 x축 방향의 단면에 대한 두께를 플롯팅(plotting)하여 나타낸 두께 프로파일(profile)이다.
도 8은 본 발명의 실시예 1 내지 3에서 제조된 시편의 현미경 사진이다.
도 9a 및 9b는 각각 실시예 3에서 제조된 3개의 수난용성 물질 시편에서 얻은 안료(PR177)의 전체 MALDI 질량 스펙트럼, 및 m/z 444 부근의 확대 스펙트럼이다.
도 10은 도 9의 MALDI 질량 스펙트럼의 결과로부터, 분석물질(수난용성 물질로서 PR177) 및 매트릭스의 시그날 강도 비율을 분석물질과 매트릭스의 중량 비율로 도시하여 작성한 선형의 정량 검정선을 나타낸 것이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에서 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시형태로 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본원에 사용된 용어 “수난용성”은 물에 용해가 전혀 되지 않거나 용해가 어려운 것을 모두 포함하는 의미이다.

본원에 사용된 용어 “균질도” 또는 “균질성”은 시료 또는 시편 내에 일정 비율로 포함된 성분들이 서로 균일하게 분포되어 있는 상태를 의미한다.

이하, 본 발명에 대해 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 일 실시양태는 재현성있는 수난용성 물질의 MALDI 스펙트럼을 얻기 위해, 수난용성 물질 시료가 균질하게 분포되어 있는 균일한 두께의 시편을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (S1) 돌기부를 구비한 샘플 플레이트의 준비 단계; (S2) 수난용성 물질 시료를 수득하는 단계; 및 (S3) 상기 샘플 플레이트 위에 시료가 담긴 펠렛 컵을 가압하여 시편을 형성하는 단계를 포함하며, 이하에서는 도면을 참조하여 본 발명의 시편 제조방법을 단계별로 설명한다.

도 2는 본 발명의 일 실시양태에 따른 MALDI 질량분석용 수난용성 물질 시편의 제조 방법에서 돌기부를 구비한 샘플 플레이트 상에 시료가 담긴 펠렛 컵을 뒤집어 가압시키는 과정을 개략적으로 나타낸 것이다.

본 발명에 따른 시편 제조 방법의 단계 (S1)에서는 전용의 샘플 플레이트(10)를 준비한다.

도 2를 참조할 때, 본 발명의 시편 제조 방법에 사용되는 샘플 플레이트(10)는 기재(11) 및 상기 기재의 상부에 위치하는 돌기부(12)를 구비한다.

본 발명의 샘플 플레이트(10)에서 돌기부가 형성되는 기재(11)는 알루미늄, 스테인레스 스틸, 구리 또는 이들의 합금을 포함하는 재질로 이루어질 수 있다,

상기 기재의 두께는 2.0 내지 3.5 mm, 예컨대 2.2 내지 2.8 mm일 수 있으며, 상기 두께 범위를 만족할 때 상부 가압시 샘플 플레이트가 휘는 것을 방지할 수 있으며, 이로부터 재사용이 가능함에 따라 시편 제조의 재현성을 향상시킬 수 있다.

본 발명의 샘플 플레이트(10)에 구비된 돌기부(12)는 시편 제조시 샘플 플레이트 상에 시료가 담긴 펠렛 컵을 뒤집어 가압시킬 때 시료가 도입된 부분에 주로 압력이 가해지는 부분으로서, 일정한 높이 및 상부 가압시 힘을 받기 위한 평탄면을 구비한다.

상기 돌기부의 높이는 0.3 내지 0.7 mm, 예컨대 0.5mm일 수 있으며, 상기 높이 범위를 확보할 때 상부 가압시에 압력을 충분히 유지할 수 있고, 샘플 플레이트 자체는 압력을 덜 받게 할 수 있다.

상기 돌기부의 평탄면은 시료가 채워지는 펠렛 컵의 홈에 대응되도록 원형 형상일 수 있다. 또한, 돌기부의 직경은 펠렛 컵의 홈 크기에 따라 조절될 수 있으며, 예컨대 1.5 내지 3 mm, 상세하게는 1.8mm 또는 2mm의 직경을 가질 수 있다.

상기 돌기부의 평탄면에는 소수성 물질의 코팅층(13)이 형성될 수 있으며, 상기 소수성 코팅층(13)은 이후 단계에서 시편과 돌기부 사이에 물의 침투를 막아 시편의 들뜸 현상을 방지할 수 있다. 상기 소수성 물질의 예로는 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene), 폴리다이메틸실록산(polydimethylsiloxane), 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacylate), 파라핀(paraffine) 또는 이들의 혼합물이 포함될 수 있다.

또한, 상기 샘플 플레이트는 MALDI 분석시 전기장을 안정적으로 유지할 수 있는 덮개(30)를 추가로 구비할 수 있다. 상기 덮개는 MALDI 분석과정에서 전압을 인가할 때 상기 돌기부에 의해 발생할 수 있는 전기장의 뒤틀림(distortion)을 방지할 수 있다.

도 3은 본 발명에 따라 소수성 코팅층이 형성된 복수의 돌기부(12)가 구비된 샘플 플레이트(10) 및 덮개(30)의 개략적인 구조를 예시한 것이다.

상기 덮개는 앞서 설명한 기재(10)과 동일한 재질일 수 있으며, 복수의 홀이 형성되어 있고, 돌기부의 높이와 동일한 두께, 즉 0.3 내지 0.7 mm, 예컨대 0.5mm의 두께를 가질 수 있다.

상기한 바와 같은 본 발명의 전용 샘플 플레이트를 MALDI 질량 분석용 시편의 제조에 이용하는 경우, 상기 플레이트에 구비된 상기 돌기부 위에 시료가 담긴 펠렛 컵의 홈 부분을 맞추고 가압이 이루어짐에 따라, 펠렛 컵의 전체에 압력이 가해지지 않고 돌기부상에 압력이 가해지므로 펠렛 컵이 우그러져 시편의 에지가 뭉개지지 않는다. 또한, 돌기 표면부를 소수성 물질로 코팅함으로써 펠렛 컵을 물로 녹여내는 과정에서 시편과 돌기부 사이에 물의 침투를 막아 샘플 플레이트로부터 시편이 떨어져 들뜨는 현상을 방지할 수 있다.

따라서, 도 1에 나타낸 바와 같은 상용 샘플 플레이트 위에서 직접 펠렛 컵을 가압함에 따라 샘플 플레이트의 휨, 시편 에지 부분의 뭉개짐, 샘플 플레이트에서 시편이 떨어져 들뜨는 현상 등이 발생하여 일정한 시편의 제조가 어려운 단점을 극복할 수 있다. 또한, 샘플 플레이트가 휘는 현상을 방지함으로써, MALDI 질량 분석시 조사되는 레이저와 시편의 상대적 위치를 일정하게 유지할 수 있고, 전기장의 뒤틀림 현상을 방지하여 MALDI 질량 스펙트럼의 재현성을 확보하는데 기여할 수 있다.

본 발명에 따른 시료 제조 방법의 단계 (S2)에서는 수난용성 물질과 매트릭스를 혼합한 후 휘발성 용매를 투입하여 상기 휘발성 용매가 증발될 때까지 상기 수난용성 물질과 매트릭스를 분산시켜 수난용성 물질 시료를 수득한다.

도 4는 본 발명에 사용되는 시료의 수득 과정을 예시한 것이다. 도 4를 참조할 때, 막자(pestle)와 막자사발(mortar)을 이용해 분석대상인 수난용성 물질과 매트릭스를 혼합하고(a), 혼합물에 휘발성 용매를 투입하여 매트릭스를 녹이면서 이로부터 생성된 용액에 수불용성 물질을 분산시키고(b), 이어서 사용된 휘발성 용매가 모두 증발될 때까지 분산액을 스패툴라로 저어줌(c 및 c')으로써 수난용성 물질 시료를 수득할 수 있다.

본 발명에서는 막자와 막자사발을 이용해 분석물질(수난용성 물질)과 매트릭스를 혼합한 후(단계 a), 시료의 균질성을 높이기 위해 휘발성 용매를 사용하여 매트릭스를 녹이고 그 용액에 수난용성 물질을 분산시키고(단계 b), 분산 상태를 유지하면서 용매 증발을 통해 매트릭스와 수난용성 물질을 균질하게 혼합한다(단계 c 및 c'). 이러한 시료 수득 과정에 따르면, 시료의 균질도가 향상되고 시료에 정전기가 발생하지 않아 시료의 취급성이 좋아진다.

상기 수득된 시료에서 각 성분들이 균일하게 분포된 정도는 이로부터 제조된 시편의 MALDI 스펙트럼 결과의 오차 범위로부터 평가할 수 있으며, 상기 오차 범위가 작을수록 시료의 분포 균일성, 즉 균질도가 우수한 것으로 평가할 수 있다.

일 실시양태에서, 상기 수난용성 물질은 안트라퀴논계 안료, 예컨대 Pigment Red 177(PR177, 4,4'-diamino[1,1'-bianthracen]-9,9',10,10'-tetraone), 구리 프탈로시안계 안료, 페릴렌계 안료, 다이케토피롤로피롤계 안료, 벤즈이미다졸론계 안료, 아이소인돌린계 안료, 다이옥사진계 안료 등 일 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.

일 실시양태에서, 상기 수난용성 물질과 혼합되는 상기 매트릭스는 물에 대한 용해도가 낮은 물질로서 DCTB(trans-2-[3-(4-tert-butylphenyl)-2-methyl-2-propenylidene]malononitrile), DPF(α,β-diphenylfumaronitrile), α-시아노-4-하이드록시신남산(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid), 디트라놀(Dithranol, 1,8,9-trihydroxyanthracene) 등으로부터 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 수난용성 물질 및 상기 매트릭스의 함량은 특별히 제한되지는 않지만, 1:20 내지 1:100, 예컨대 1:20의 중량비로 혼합될 수 있다.

일 실시양태에서, 상기 수난용성 물질 및 상기 매트릭스에 투입되는 상기 휘발성 용매는 테트라하이드로푸란(THF), 클로로포름(chloroform) 등으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

일 실시양태에서, 수난용성 물질과 매트릭스의 혼합시 막자와 막자사발 이외에도, 볼 밀을 이용할 수 있다.

본 발명에 따른 시편 제조 방법의 단계 (S3)에서는 상기 (S2) 단계에서 수득된 시료를 수용성 재질로 된 펠렛 컵의 홈에 채우고, 상기 펠렛 컵을 뒤집어 상기 샘플 플레이트의 돌기부 위에 상기 펠렛 컵의 홈이 위치하도록 올려놓고 상부에서 가압한 후, 상기 펠렛 컵을 물로 녹여 수난용성 물질 시편을 형성한다.

도 5는 본 발명에 따른 전용 샘플 플레이트를 이용하여 시편을 형성하는 과정을 일예로 예시한 것이다.

도 5를 참조할 때, 수용성 재질의 펠렛 컵을 준비하여 이의 홈에 앞서 수득한 수난용성 물질 시료를 채우고(d), 뒤집은 펠렛 컵의 홈을 샘플 플레이트에 구비된 돌기부의 평탄면에 맞춰 위치시킨 후 가압한 다음(e), 사용된 펠렛 컵을 물로 녹이고(f), 질소(N₂) 블로윙 방식으로 건조시켜 시편을 형성하고(g), 샘플 플레이트에 덮개를 씌운다(h).

일 실시양태에서, 상기 가압은 핫 프레스(hot press)를 이용하여 1 내지 5 ton의 압력으로 10 내지 20 초 동안 수행할 수 있다.

추가로, 시편의 두께 편차를 줄이기 위해서, 홈이 없는 펠렛 컵을 만들어 앞서 제조된 시편 위에 덮고 일정 압력(예컨대, 3ton)을 약 20초 정도 가하는 2차 가압을 수행할 수 있다. 이 과정에서 사용된 펠렛 컵은 시편 제조시와 같이 물로 녹여내고 질소 블로윙으로 건조하여 물기를 제거한다.

또한, 제조한 시편은 시편 및 샘플 플레이트에 트랩(trap)되어 잔존할 수 있는 수분을 완전히 제거하기 위해, 고온에서의 추가 건조과정을 거칠 수 있다. 만약, 수분이 잔존하는 경우 MALDI 질량 분석시에 잔존 수분이 증발되면서 진공 상태를 유지하기 어려워 실험을 진행할 수 없다.

상기 추가 건조 과정은 약 100℃에서 10 내지 20분(예컨대, 15분) 동안 수행될 수 있다.

본 발명에서는 시편 제조 시에 위의 과정에 따라 수득한 균질한 수난용성 물질 시료를 일정량으로 일정 면적에 시료간 동일한 압력으로 가압하기 위해서, 같은 양의 시료를 일정한 면적에 국한시킬 수 있는 수단으로서 펠렛 컵을 이용한다. 상기 펠렛 컵은 물에 녹여지는 수용성 재질이면 제한 없이 사용될 수 있으며, 예컨대 KBr, NaBr, MgBr₂, NaCl 또는 이들이 혼합물로 이루어진 펠렛 컵을 사용할 수 있다.

도 6은 본 발명의 일 실시양태에 따른 MALDI 질량분석용 시편의 제조 방법에 사용된 KBr 펠렛 컵의 제작 과정을 예시한 것이다.

도 6을 참조할 때, KBr 펠렛 컵 제작 장치로서 평평한 사각형 플레이트(6), 플레이트(6) 위에 놓여지는 가운데 원형 구멍이 있는 사각 프레임(1), 사각 프레임(1)의 원형 구멍에 순서대로 놓여지는 원형 부재(2), (3) 및 (4)와, 원형 부재(4) 위에 놓여진 후 가압되는 원형 부재(5)를 사용할 수 있다. 구체적인 KBr 펠렛 컵의 제작 과정은 다음과 같다.

먼저, 플레이트(6) 위에 중앙에 원형 구멍이 있는 프레임(1)을 올려 놓고 프레임(1)의 원형 구멍에 원형 부재(2)를 넣는다(단계 i). 플레이트(6)는 KBr 펠렛 컵 제작부터 시편의 제작까지 전 공정이 이루어지는 판으로서, 형상, 치수 및 재질은 특별히 한정되지 않고, 시편 제작 전체 공정이 용이하게 이루어질 수 있는 것이면 된다. 이어서, 원형 부재(2) 위에 원형 부재(3)을 넣는다(단계 ii). 이 때, 원형 부재(2)는 중심에 볼록부를 갖고 원형 부재(3)은 중앙에 작은 원형 구멍이 뚫린 형태이다. 이어서, 원형 부재(3)의 중심 구멍에 KBr을 채운다(단계 iii). 원형 부재(2)의 볼록부 및 그 크기와 원형 부재(3) 중심의 구멍 및 그 크기는 추후 KBr 펠렛 컵의 형상 및 치수에 상응한다. 원형 부재(3)의 중심 구멍에 KBr이 다 채워지면 그 위에 원형 부재(4)를 올린다(단계 iv). 원형 부재(4)는 중심에 볼록부를 갖는다. 그 후, 원형 부재(4) 위에 원형 부재(5)를 올린 후(단계 v), 가압을 수행한다(단계 vi). 이 때, 원형 부재(5) 전체 면적에 걸쳐 동일한 압력을 적용한다. 상기 원형 부재(2), (3) 및 (4)는 프레임(1)의 원형 구멍 안에 순서대로 놓이므로, 프레임(1)의 원형 구멍에 정확히 맞는 크기여야 한다. 원형 부재(5)를 충분히 가압한 후, 원형 부재(5)와 (4)를 제거하고 원형 부재(2)와 프레임(1)을 제거하여 플레이트(6) 위에 원형 부재(3)만 남긴다. 원형 부재(3)의 중심 구멍에는 KBr이 가압에 의해 단단히 채워져 있다. 최종적으로, 원형 부재(3)을 제거하여 KBr 펠렛 컵을 완성한다(단계 vii). 완성된 펠렛 컵은 원형 부재(2)의 볼록부에 의해 중앙에 홈이 파진 형상이다.

본 발명에서 프레임(1)의 형상 및 치수는 특별히 한정되지 않으며, 단 프레임(1)의 원형 구멍에 원형 부재(2), (3) 및 (4)가 모두 들어가는 것이 바람직하므로, 프레임(1)의 두께는 원형 부재(2), (3) 및 (4)의 합한 두께와 같거나 그보다 두꺼울 수 있다. 원형 부재(5)는 원형 부재(4)의 크기보다 작아야 가압하기 쉽다. 상기 원형 부재(1) 내지 (5)의 재질은 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 스테인리스 스틸(stainless steel), 알루미늄(aluminium) 등을 사용할 수 있다.

일 실시양태에서, 상기 가압은 핫 프레스(hot press)를 이용하여 수행할 수 있다. 예컨대 상기 가압은 1 내지 5 ton의 압력으로 10 내지 20 초 동안 실시할 수 있다.

상기 프레임(1)의 원형 구멍 및 원형 부재(3) 중심의 구멍의 크기는 특별히 한정되지 않는다.

일 실시양태에서, 상기 펠렛 컵은 원형 또는 다각형의 형태를 가질 수도 있다.

상기와 같은 펠렛 컵은 그 홈 안에 시료를 한정시킨 상태에서 단위 부피당 동일한 압력으로 가압을 수행할 수 있으므로 두께가 균일한 시편의 제조가 가능하다. 또한, 펠렛 컵과 함께 가압된 시료에 대해 펠렛 컵만을 물로 녹여냄으로써 시편 표면이 가압에 의해 손상되는 것을 방지할 수 있다.

본 발명에 따라 제조된 MALDI 질량 분석용 수난용성 물질 시편은 70 내지 100 ㎛, 예컨대 78 내지 95 ㎛(평균 86㎛)의 두께를 가질 수 있다.

또한, 복수의 시편을 위치에 따라 여러 지점, 예컨대 3개 이상의 지점에서 측정할 경우 평균 86㎛ 두께에 대해 ±10㎛의 편차를 나타내어, 두께 편차는 30% 이하, 예컨대 25% 이하일 수 있다.

상기 시편 두께 및 두께 편차는 는 당해 분야에서 통상적으로 이용되는 방법으로 측정될 수 있다. 예컨대, Optical profiler와 같은 3차원 표면분석기기를 사용하여 3개 이상의 시편에 대해 중심으로부터 반경 700㎛에서의 평균 두께와 편차를 계산함으로써 측정될 수 있다.

이와 같이, 본 발명에 따르면 전용 샘플 플레이트를 이용하여 수난용성 물질 시편을 제조하여 MALDI 질량 분석이 가능한 두께를 확보하면서 두께 편차를 최소화함으로써, 재현성 있는 MALDI 스펙트럼을 얻을 수 있으며, 이로부터 수난용성 물질 시료의 정량 분석이 가능하다.

따라서, 본 발명에서는 MALDI 질량 분석을 이용한 수난용성 물질의 정량 분석 방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 분석 방법은 본 발명의 전용 샘플 플레이트를 사용하여 제조된 수난용성 물질 시편에 대해 MALDI 질량 스펙트럼을 얻은 단계; 및 상기 스펙트럼의 피크 결과로부터 수난용성 물질 및 매트릭스의 시그날 강도 비율을 산출하고, 이를 수난용성 물질과 매트릭스의 중량 비율로 도시하여 정량 검정선을 작성하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 MALDI 질량 스펙트럼은 상용 MALDI-TOF MS 장비를 사용하여 시편에 레이저를 조사함으로써 얻을 수 있다.

한편, 상기 시편에 레이저 조사시 샷 수에 따라 스펙트럼의 양상이 다르게 나타날 수 있다. 즉, 시편의 두께에 따라 레이저가 조사되는 시편 표면의 면적이 달라지게 되며, 이러한 영향이 레이저에 의해 시편으로부터 생성된 증기인 플룸(plume)의 온도를 변화시켜 스펙트럼의 재현성 확보를 어렵게 할 수 있다.

본 발명에 따른 수난용성 물질 시편의 두께 범위가 70 내지 100 ㎛, 예컨대 78 내지 95 ㎛(평균 86㎛)인 점을 고려하여, 피크 위치(peak position) 변화 및 피크 강도비율(peak intensity ratio) 변화가 최소화된 MALDI 질량 스펙트럼 재현성을 확보하기 위해서는, 상기 시편에서 지점당 300샷에서 600샷의 스펙트럼을 획득하는 것이 유리하다.

일 실시양태에서, 상기 수난용성 물질 시편을 복수개로 준비하고 각 시편당 3곳 이상의 지점에서 각각 레이저 조사를 조사하여 획득한 300샷에서 600샷의 MALDI 질량 스펙트럼은 매트릭스 피크와 분석물질의 피크 상대 비율의 오차를 나타내는 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)가 40% 이하, 상세하게는 20% 내지 30%의 범위일 수 있다.

이는 본 발명에 따른 수난용성 물질 시편으로부터 얻은 MALDI 스펙트럼이 스팟-투-스팟(spot-to-spot) 및 샘플-투-샘플(sample-to-sample) 재현성이 있음을 입증하는 것이다.

또한, 재현성 있는 MALDI 스펙트럼의 결과를 이용하여 작성한 정량 검정선, 즉 수난용성 물질 및 매트릭스의 시그날 강도 비율을 수난용성 물질과 매트릭스의 중량 비율로 도시한 정량 검정선은 모두 선형으로 나타나며(도 9 참조), 이로부터 수난용성 물질의 정량 분석이 가능하다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명을 구체적인 실시예로 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

<실시예 1>

단계 1: 돌기부를 구비한 샘플 플레이트의 제조

도 3에 개략적으로 나타낸 바와 같이, 크기가 113.5mm×82mm인 스테인레스 스틸의 재질의 기재(두께: 2.3mm) 위에 복수의 돌기부(12)(직경: 1.8mm, 높이 0.5 mm)가 형성되고, 상기 돌기부의 표면이 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene, Teflon^®)로 코팅된 샘플 플레이트(10)(전체 두께: 2.8mm)를 제조하였다. 추가로, 상기 돌기부의 높이와 동일한 두께를 갖는 덮개(30)를 준비하였다.

단계 2: 시료의 제조

분석하고자 하는 수난용성 물질로서 하기 화학식으로 표현되는 Pigment Red 177(PR177, C₂₈H₁₆N₂O₄, Exact Mass 444.11)과 매트릭스로서 DCTB(trans-2-[3-(4-tert-butylphenyl)-2-methyl-2-propenylidene]malononitrile)를 사용하였다. 도 4에 예시한 바와 같이, 상기 수난용성 물질 및 매트릭스를 막자사발에 1:20의 중량비로 넣고 막자로 갈아주면서 혼합하였다. 여기에, 상기 혼합물을 분산시키기 위한 휘발성 용매로서 THF(2mL)를 투입하여 계속 혼합하였다. 이어서, THF가 증발될 때까지 스패튤라로 저어주면서 계속 혼합하여, 수난용성 물질 및 매트릭스가 균일하게 분포된 시료를 수득하였다.

단계 3: 시편의 제조

도 5에 예시한 바와 같이, 상기 단계 2에서 제조된 시료를 KBr 펠렛 컵의 홈에 채웠다. 시료가 채워진 KBr 펠렛 컵을 뒤집어 상기 단계 1에서 준비한 샘플 플레이트의 돌기부 위에 장착한 후, 상기 KBr 펠렛 컵에 2ton의 압력을 20초 동안 가하였다. 이어서, KBr을 물로 녹인 후 N₂ 블로윙(blowing)으로 건조시켜 PR177 시편을 제조하였다.

상기 시편이 형성된 샘플 플레이트 위에 스테인레스 스틸 재질의 덮개를 씌워 전기장을 일정하게 유지하였다.

<실시예 2>

실시예 1과 동일한 과정을 수행한 후, 시편 위에 홈이 없는 KBr 펠렛 컵을 덮고 3ton의 압력을 20초 동안 가하는 2차 가압을 추가로 수행하고 상기 KBr을 물로 녹이고 N₂ 블로윙(blowing)으로 건조하였다.

<실시예3>

실시예 2와 동일한 과정을 수행한 후, 시편을 오븐(oven)에 넣고 100℃에서 15분 동안 추가 건조를 수행하였다.

<비교예 1>

단계 1: 시료의 제조

실시예 1의 단계 2와 동일한 과정으로 시료를 제조하였다.

단계 2: 시편의 제조

실시예 1의 단계 3과 동일한 과정을 수행하되, 두께 0.3mm인 일회용 샘플 플레이트(ASTA)를 구입하여 시편 제조에 사용하였다.

그 결과, 도 1b에서 볼 수 있는 바와 같이, 가압 과정 후에 상기 일회용 샘플 플레이트(ASTA)가 휘어졌다.

실험예 1: 시편의 두께 및 두께 편차 측정

시편의 두께 및 두께 편차를 확인하기 위해, 실시예 1 내지 3에서 제조된 시편을 Optical profiler로 분석하였다.

도 7a는 실시예 3에서 제조된 시편을 Optical profiler로 측정한 시편의 이미지로서, 시편의 두께가 유사한 것으로 보인다.

도 7b는 실시예 3에서 제조된 시편의 중심을 지나는 x축 방향의 단면에 대한 두께를 플롯팅(plotting)하여 나타낸 두께 프로파일(profile)로서, 3개의 시편에 대해 중심으로부터 반경 700㎛에 대한 평균 두께와 편차를 계산한 결과, 86±9 ㎛로 확인되었다.

실험예 1: 시편의 균질도 평가

실시예 1 내지 3에서 제조된 시편의 균질도를 확인하기 위해 현미경(배율 x90)으로 관찰하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에서, (a)는 실시예 1의 1차 가압 후 시편, (b)는 실시예 2의 1차 가압 및 2차 가압 후 시편, 및 (c)는 실시예 3의 1차, 2차 가압 및 오븐에서의 추가 건조 후 시편의 현미경 사진으로, 3개의 시편 모두 균질하게 제조된 것을 확인할 수 있다.

표면 상태를 살펴볼 때, 도 8(a)에서는 1차 가압된 시편의 표면에 금이 가있는 것을 볼 수 있으며, 이는 1차 가압시에 펠렛 컵이 깨지면서 발생된 것으로 예상된다. 도 8(b)에서는 시편에 2차 가압을 수행하여 1차 가압시 발생된 금이 사라졌으므로, 2차 가압으로 시편 내 두께 편차를 감소시키고 표면을 보다 매끄럽게 하는 효과가 있음을 확인할 수 있다. 도 8(c)에서는 균질도 및 표면 상태에서는 큰 차이가 없으나 전체적으로 시편의 색상이 연해진 것을 확인할 수 있으며, 이는 시편에 잔류하는 수분이 증발한 결과로서 MALDI 질량 분석시에 수득된 스펙트럼의 재현성을 증가시킬 것으로 예상된다.

실험예 2 : MALDI 스펙트럼의 재현성 평가

실시예 3의 공정으로 3개의 시편을 제조하고, 각 시편에 대해서 MALDI-TOF 질량분석기(UltrafleXtreme, Bruker Daltonics, Germany)를 사용하여 10개 지점(spot)에 레이저를 조사하여 각각 300샷에서 600샷에 해당하는 스펙트럼들을 얻고, 이를 평균하여 도 9a 및 9b에 나타내었다.

도 9a 및 9b는 안료(PR177)의 시편 1 내지 3에 대한 전체 MALDI 질량 스펙트럼, 및 m/z 444 부근의 확대 스펙트럼이다.

도 9로부터, 3개의 시편에 얻은 스펙트럼의 피크 강도 패턴(peak intensity pattern) 및 피크 위치(peak position)가 유사함을 확인할 수 있다. 또한, 매트릭스 피크(m/z 332)에 대한 분석물질(PR177) 피크의 상대 비율을 측정하여 오차(RSD)를 구한 결과는 ±12%로서, 스팟-투-스팟(spot-to-spot) 및 샘플-투-샘플(sample-to-sample) 재현성이 있음을 확인하였다.

실험예 3 : MALDI 스펙트럼의 정량 가능성 평가

도 9의 질량 스펙트럼 피크를 이용하여 분석물질(PR177) 및 매트릭스의 시그날 강도 비율을 산출하고, 이를 분석물질과 매트릭스의 중량 비율로 도시하여 정량 검정선을 작성하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다.

구체적으로, 도 10는 m/z 332에 해당하는 매트릭스 피크를 이용하여 작성한 정량 검정선으로 선형을 나타내고 있다(R² = 0.99 이상).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (17)

1. (S1) 기재 및 상기 기재의 상부에 위치하는 복수의 돌기부를 포함하고, 상기 돌기부는 상부 가압시 힘을 받기 위한 평탄면을 구비하는 샘플 플레이트를 준비하는 단계;
   (S2) 수난용성 물질과 매트릭스를 혼합한 후 휘발성 용매를 투입하여 상기 휘발성 용매가 증발될 때까지 상기 수난용성 물질과 매트릭스를 분산시켜 수난용성 물질 시료를 수득하는 단계; 및
   (S3) 상기 (S2) 단계에서 수득된 시료를 수용성 재질로 된 펠렛 컵의 홈에 채우고, 상기 펠렛 컵을 뒤집어 상기 샘플 플레이트의 돌기부 위에 상기 펠렛 컵의 홈이 위치하도록 올려놓고 상부에서 가압한 후, 상기 펠렛 컵을 물로 녹여 수난용성 물질 시편을 형성하는 단계를 포함하는, MALDI 질량분석용 수난용성 물질 시편의 제조 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 돌기부는 직경이 1.5 내지 3 mm이고 높이가 0.3 내지 0.7 mm의 형태를 갖는, MALDI 질량분석용 수난용성 물질 시편의 제조 방법
3. 제2항에 있어서, 상기 돌기부는 직경이 1.8mm이고 높이가 0.5mm의 형태를 갖는, MALDI 질량분석용 수난용성 물질 시편의 제조 방법
   
4. 제1항에 있어서, 상기 펠렛 컵은 홈의 직경이 1.5 내지 3 mm이고 홈의 깊이가 0.3 내지 0.7 mm가 되도록 제작된 것인, MALDI 질량분석용 수난용성 물질 시편의 제조 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 돌기부의 평탄면은 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene), 폴리다이메틸실록산(polydimethylsiloxane), 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacylate), 파라핀(paraffine) 또는 이들의 혼합물을 포함하는 소수성 물질로 코팅된 것인, MALDI 질량분석용 수난용성 물질 시편의 제조 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 기재는 알루미늄, 스테인레스 스틸, 구리 또는 이들의 합금을 포함하는 재질로 이루어진 것인, MALDI 질량분석용 수난용성 물질 시편의 제조 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 (S3) 단계 이후에 시편이 형성된 샘플 플레이트를 상기 돌기부와 같은 높이를 갖는 덮개로 씌워 전기장을 유지하는 단계를 추가로 포함하는, MALDI 질량분석용 수난용성 물질 시편의 제조 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 수난용성 물질이 안트라퀴논 안료, 구리 프탈로시안계 안료, 페릴렌계 안료, 다이케토피롤로피롤계 안료, 벤즈이미다졸론계 안료, 아이소인돌린계 안료, 다이옥사진계 안료 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것인, MALDI 질량분석용 수난용성 물질 시편의 제조 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 매트릭스는 DCTB(trans-2-[3-(4-tert-butylphenyl)-2-methyl-2-propenylidene]malononitrile), DPF(α,β-diphenylfumaronitrile), α-시아노-4-하이드록시신남산(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid), 디트라놀(Dithranol, 1,8,9-trihydroxyanthracene) 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것인, MALDI 질량분석용 수난용성 물질 시편의 제조 방법.
10. 제1항에 있어서, 상기 수난용성 물질 및 상기 매트릭스에 투입되는 상기 휘발성 용매는 테트라하이드로푸란(THF), 클로로포름(chloroform) 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것인, MALDI 질량분석용 수난용성 물질 시편의 제조 방법.
11. 제1항에 있어서, 상기 펠렛 컵은 KBr, NaBr, MgBr₂, NaCl 또는 이들의 혼합물로 이루어진 것인, MALDI 질량분석용 수난용성 물질 시편의 제조 방법.
12. 제1항에 따른 MALDI 질량분석용 수난용성 물질 시편의 제조에 사용하기 위한 샘플 플레이트로서,
    기재 및 상기 기재의 일면에 위치하는 복수의 돌기부를 포함하고, 상기 돌기부는 상부 가압시 힘을 받기 위한 평탄면을 구비하는 샘플 플레이트.
13. 제1항에 따른 방법으로 제조된 수난용성 물질 시편을 이용한 수난용성 물질의 정량분석방법으로서,
    상기 수난용성 물질 시편에 대해 MALDI 질량 스펙트럼을 얻은 단계; 및
    상기 스펙트럼의 피크 결과로부터 수난용성 물질 및 매트릭스의 시그날 강도 비율을 산출하고, 이를 수난용성 물질과 매트릭스의 중량 비율로 도시하여 정량 검정선을 작성하는 단계를 포함하는 수난용성 물질의 정량분석방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 시편의 서로 다른 지점에서 측정된 MALDI 질량 스펙트럼의 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)가 40% 이하인, 수난용성 물질의 정량분석방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 시편의 서로 다른 지점에서 측정된 MALDI 질량 스펙트럼의 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)가 20% 내지 30%인, 수난용성 물질의 정량분석방법.
16. 제13항에 있어서, 상기 시편을 동일 조건하에서 제조된 복수개로 적용하여 측정된 MALDI-TOF 질량 스펙트럼의 RSD가 40% 이하인, 수난용성 물질의 정량분석방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 시편을 동일 조건하에서 제조된 복수개로 적용하여 측정된 MALDI-TOF 질량 스펙트럼의 RSD가 20% 내지 30%인, 수난용성 물질의 정량분석방법.

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