CN111518915A - 用于局限性前列腺癌临床风险预测的标志物和试剂盒 - Google Patents
用于局限性前列腺癌临床风险预测的标志物和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物医学领域,具体而言,涉及一种用于局限性前列腺癌临床风险预测的标志物和试剂盒。所述试剂盒包含用于对血液类样本中细胞外囊泡的fcn1、il1b、lilrb3、mefv、ppt1、rassf2和serpina1基因对应的mRNA进行定量的引物和探针。本发明首次将基因表达谱组合应用于局限性前列腺癌的危险级别分级。提供了用于局限性前列腺癌诊断分级的试剂盒和标志物组,从而较好地通过非侵入的方式实现前列腺癌的分级诊断,提高诊断的灵敏度、特异度和准确性。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域,具体而言,涉及一种用于局限性前列腺癌临床风险预测的标志物和试剂盒。
背景技术
前列腺癌(prostate cancer, PCa)是男性最常见的实体恶性肿瘤之一,同时也是导致男性死亡的第五大肿瘤类型。目前全球每年有超过110万的新增病例,仅2019年约有45万人死于前列腺癌。前列腺特异性抗原(PSA)筛查是早期发现前列腺癌的最常用方法,但是若干项PSA筛查的随机临床试验中结果证实PSA的筛查导致了前列腺癌的过度诊断和过度治疗。
格里森评分(GS)是评价前列腺癌危险程度的一个重要指标,GS≤6时为低级别或低风险前列腺癌,仅需要密切随访而不需要采取任何治疗手段。GS≥7时为临床显著性前列腺癌,需要综合其他检查结果实施根治性手术或根治性放疗等治疗方案。但遗憾的是,临床上尚无有效判断前列腺癌恶性程度的分子标志物,仍然依靠前列腺穿刺活检进行病理检查。前列腺特异性抗原(Prostate specific antigen, PSA)作为目前诊断PCa最为公认、应用最为广泛的分子诊断标记物,在目前PCa的诊断方面起着极为重要的作用,但它在明显提高肿瘤诊断率的同时也有着很大的局限性。PSA是前列腺特异而非PCa特异,如前列腺炎、尿路感染、直肠指诊等因素都能导致PSA升高,在PSA的诊断灰区(4-10 ng/ml),前列腺穿刺阳性率仅为30%左右。更为重要的是,由于PSA筛查的广泛应用,导致了前列腺癌的过度诊断和过度治疗。因此,使用血清PSA检查导致了临床上大量的患者接受了不必要的穿刺活检,也检出了大量无需临床干预的低风险前列腺癌,增加了患者的痛苦也浪费了医疗资源。因此,临床上亟需寻找新型的分子标志物对PSA异常患者进行临床风险预测。
细胞外囊泡(EVs)是具有双脂质层的由细胞分泌,存在于细胞外的囊泡。细胞外囊泡内含有细胞来源的核酸、蛋白等分子信息,并能够轻易进入血液、尿液等体液中。由于双脂质层的结构存在,确保囊泡中的生物信息即使在循环系统中依然能够很好的保留。最近通过检测尿液细胞外囊泡中pca3和erg两个基因的表达量来预测血清总PSA在2-10ng/mL患者是否需要前列腺穿刺的方法学(EPI检测法)被美国FDA批准为创新方法。该方法不依赖于前列腺活检即可判断患者是低级别还是高级别的前列腺癌,但AUC在0.73左右,灵敏度和特异性都达不到临床要求。此外,现有技术检测样本是尿液中mRNA和lncRNA,前列腺是否按摩,收集尿液和保存时间对检测结果产生严重影响。
发明内容
本发明涉及一种试剂盒,其含有如下引物和探针:
所述引物和探针对受试者血液类样本中细胞外囊泡的所述待检测mRNA进行定量以用于局限性前列腺癌的风险评估、预后判断、治疗或者辅助治疗。
本发明的再一方面还涉及用于检测如下基因表达量的检测剂在制备用于局限性前列腺癌的风险评估、预后判断、治疗或者辅助治疗的试剂盒中的应用:
fcn1、il1b、lilrb3、mefv、ppt1、rassf2和serpina1;
所述表达量通过用所述检测剂对受试者血液类样本中细胞外囊泡的所述基因对应的mRNA进行定量以表征。
本发明的有益效果为:
(1)本发明首次将基因表达谱组合应用于局限性前列腺癌的危险级别分级。提供了用于局限性前列腺癌诊断分级的试剂盒和标志物组,从而较好地通过非侵入的方式实现前列腺癌的分级诊断,提高诊断的灵敏度、特异度和准确性,显著减少不必要的前列腺穿刺手术;
(2)该试剂盒和标志物组能够针对血清总PSA异常的疑似前列腺癌患者,适用范围不局限于欧美2-10ng/mL的范围;
(3)检测血清细胞外囊泡中多个基因的表达,有效减少血液中复杂成分对核酸造成的降解影响,从而确保样本处理过程不会影响基因检测的结果;
(4)诊断指标AUC可以超过0.96,远高于国外现有的基于尿液细胞外囊泡核酸的检测方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中晨尿细胞外囊泡RNA中ERG,PCA3和SPDEF表达水平检测结果;
图2为本发明一个实施例中血清细胞外囊泡RNA中fcn1和il1b表达水平检测结果;
图3为本发明一个实施例中晨尿细胞外囊泡RNA中ERG,PCA3和SPDEF、血清细胞外囊泡RNA中fcn1和il1b的CV值比较;
图4为本发明一个实施例中尿样取样时间对检测仪器生成结果的影响;
图5为本发明一个实施例中血样取样时间对检测仪器生成结果的影响;
图6为本发明一个实施例中低级别前列腺癌和高级别前列腺癌患者7个基因拷贝数在血清中的差异;
图7为本发明一个实施例中通过FS评分模型预测84例低级别或高级别前列腺癌生成诊断ROC曲线。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考,其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上,对本领域技术人员而言,显而易见的是,可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如,作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中,来产生更进一步的实施方式。
因此,旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述,而非意在限制本发明更广阔的方面。
本发明涉及一种试剂盒,其含有如下引物和探针:
所述引物和探针对受试者血液类样本中细胞外囊泡的所述待检测mRNA进行定量以用于局限性前列腺癌的风险评估、预后判断、治疗或者辅助治疗。
在一些实施方式中,所述引物和/或所述探针是标记的。
在一些实施方式中,所述标记物选自放射性同位素、荧光团、发光物质、有色物质和酶。
在一些实施方式中,所述标记是荧光团。
在一些实施方式中,所述荧光团可选自荧光素类染料、罗丹明类染料以及菁染料。
在一些实施方式中,所述荧光素类染料包括标准荧光素及其衍生物,如异硫氰酸荧光素(FITC)、羟基荧光素(FAM)、四氯荧光素(TET)等。
在一些实施方式中,所述罗丹明类染料包括R101、四乙基罗丹明(RB200)和羧基四甲基罗丹明(TAMRA)等。
在一些实施方式中,所述菁染料主要选自两类,一类是噻唑橙(thiazole orange,TO)、噁唑橙(oxazole orange, YO)系列及其二聚体染料,另一类是多甲川系列菁染料。
在一些实施方式中,荧光团还可以选择下述染料:二苯乙烯、萘酰亚胺、香豆素类、吖啶类、芘类等。
荧光团通常标记在引物或探针序列的5'端,但通过改变修饰键(例如-OH或-NH键)也可以将其置于3'端。
在一些实施方式中,所述试剂盒中还含有用于指示所述待检测mRNA参考表达量的参考标准品。
参考标准品可以理解为阴性和阳性对照,例如可以为健康人的生物样品,也可以是已知的局限性前列腺癌进行危险度不同分级的患者的生物样品。例如采用EPI方法进行分级。
生物样品优选为血液类样本。
血液类样本在本发明中指一切包含细胞外囊泡的样本,例如全血,血清和血浆等,优选血清。
参考标准品还可以理解为进一步包括RNA测量标准化所需的样本和/或试剂。例如,RNA测量可通过一种或多种“持家”mRNA作为标准化的基准,这对于本领域技术人员是熟悉的。
本发明还涉及用于检测如下基因表达量的检测剂在制备用于局限性前列腺癌的风险评估、预后判断、治疗或者辅助治疗的试剂盒中的应用:
fcn1、il1b、lilrb3、mefv、ppt1、rassf2和serpina1;
所述表达量通过用所述检测剂对受试者血液类样本中细胞外囊泡的所述基因对应的mRNA进行定量以表征。
在一些实施方式中,所述检测剂为用于执行以下任一种方法的试剂:
聚合酶链反应、核酸杂交法、免疫学检测法和生物质谱法。
在一些实施方式中,所述检测剂为用于检测所述mRNA的引物和/或探针。
在一些实施方式中,所述检测剂为如上所述试剂盒中所定义的引物和探针。
在一些实施方式中,所述受试者为血清总PSA在4ng/mL~20ng/mL的疑似前列腺癌患者。
本发明还涉及一种局限性前列腺癌的风险评估、预后判断、治疗或者辅助治疗的方法,所述方法包括:
a)评价多种基因mRNA的表达情况,包括确定来自从受试者获得的血液类样本的fcn1、il1b、lilrb3、mefv、ppt1、rassf2和serpina1的mRNA的表达水平; b) 依据基因表达量,对受试者进行评估。
在一些实施方式中,评估方法具体为:每个基因copy数纳入模型并运算得到结果:Formula Score(FS):0.51×Copy(ppt1)+0.37×Copy(fcn1)+0.34×Copy(lilrb3)+0.34×Copy(mefv)+0.11×Copy(serpina1)+0.06×Copy(il1b)-0.18×Copy(rassf2);
根据cutoff判定:
FS≤100,检测样本没有前列腺穿刺术必要,建议每半年随访血清总PSA变化;
120<FS<510时,检测样本属于低级别前列腺癌,可根据患者意愿选择性进行前列腺穿刺术,若穿刺术结果为阴性,建议每三个月随访血清总PSA变化;
FS≥550,检测样本属于高级别前列腺癌,必须进行前列腺穿刺术,若穿刺术结果为阴性,建议进行重复穿刺。
其中,评估的步骤可以在计算机程序上进行。计算机程序可以包括信息接收模块和数据处理模块,所述信息接收模块用于接受多种基因mRNA的表达情况,所述数据处理模块通过如上所述方法处理数据并优选给出cutoff判定结论。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1本发明试剂盒使用方法
1. 从全血中分离血清样本,4℃下3000g离心15分钟,收集约500μL血清,放置于4℃不超过48小时;
2. 使用QIAGEN的exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit(货号77044),按照说明书将500μL血清中的细胞外囊泡RNA进行提取,并用20μLRNase-free水溶解血清囊泡来源的RNA;
3. 根据BIORAD数字PCR(QX100)配套的One-Step RT-ddPCR Advanced Kit forProbes(货号1864022)配方,配制ddPCR反应体系至20μL。
4. 将上一步骤的PCR反应液vortex振荡10秒钟,并进行微滴生成,每个样本生成4管微滴;
5. 在进行PCR反应前将微滴转移至96孔PCR反应板并热封反应板。设置PCR仪程序如下:
6. 微滴分析仪统计每个反应孔中荧光值对应的copy数:
1号孔基因(ppt1-FAM/serpina1-JOE);2号孔基因(fcn1-FAM/il1b-JOE);3号孔基因(lilrb3-FAM/mefv-JOE);4号孔基因(rassf2-FAM);
引物探针信息表如下:
7. 将上述分析仪输出的每个基因copy数纳入模型并运算得到结果:Formula Score(FS):0.51×Copy(ppt1)+0.37×Copy(fcn1)+0.34×Copy(lilrb3)+0.34×Copy(mefv)+0.11×Copy(serpina1)+0.06×Copy(il1b)-0.18×Copy(rassf2)。
8. 根据cutoff判定:
FS≤100,检测样本没有前列腺穿刺术必要,建议每半年随访血清总PSA变化;
120<FS<510时,检测样本属于低级别前列腺癌,可根据患者意愿选择性进行前列腺穿刺术,若穿刺术结果为阴性,建议每三个月随访血清总PSA变化;
FS≥550,检测样本属于高级别前列腺癌,必须进行前列腺穿刺术,若穿刺术结果为阴性,建议进行重复穿刺。
实施例2本发明模型与EPI检测方法(对比例)精密度的比较
每隔两天收集血清总PSA在4-10ng/mL同一患者晨尿与空腹全血,其中晨尿每次收集20mL,共收集三份,空腹全血每次收集2mL,共收集三份,确保每次的晨尿与全血一一对应。所有全血与晨尿均在4℃冰箱保存少于2小时内并提取其中的细胞外囊泡RNA。具体操作为,尿液细胞外囊泡及囊泡RNA的分离提取:用0.8微米的过滤器将20mL尿液进行过滤。过滤后的尿液在4℃离心机以3000g离心15分钟,上清再次在4℃离心机以10000g离心30分钟,上清再次在4℃超速离心机以100000g离心两小时,吸去上清,细胞外囊泡在离心管沉淀区,以1mLPBS溶解并重悬细胞外囊泡。随后以1mL尿液来源的细胞外囊泡作为总RNA提取起始样本,根据RNeasy Micro kit(货号74004)说明书指示操作,得到20μLRNA溶液。随后10μLRNA溶液根据TransPlex Whole Transcriptome Amplification Kit(货号3254563)说明书指示操作,得到20μL cDNA模板。对PCA3,ERG和SPDEF基因的检测使用AB7500荧光PCR仪,qPCR试剂为TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (货号4366072),PCA3上游引物:GCACATTTCCAGCCCCTTTA;下游引物:GGCATTTCTCCCAGGGATCT;探针:FAM-CACACAGGAAGCACAAAAGGAAGC-BHQ1,ERG上游引物:GCGTCCTCAGTTAGATCCTTATCAG;下游引物:CTGGCCACTGCCTGGATT,探针:FAM- CTTGGACCAACAAGTAGCCGCCTTGC-BHQ1,SPDEF上游引物:CCACCTGGACATCTGGAAG;下游引物:AATCGCCCCAGGTGAAGT,探针:FAM-CGGCCTGGATGAAAGAGCG-BHQ1,反应体系与反应程序如下,荧光PCR结果的CT值取三重复的平均值:
血清细胞外囊泡RNA的分离提取:2mL全血在4℃离心机以3000g离心15分钟。随后吸取0.5mL血清作为细胞外囊泡总RNA提取起始样本,其中fcn1上游引物:GGTACTGGGAGCCTTTGTCG;下游引物:CATCATTGTCTTGGTCTTTGGTG;探针:FAM-CCACAACAACAACTTCTTCTCCAC-BHQ1。il1b上游引物:GAAATGATGGCTTATTACAGTGGC;下游引物:GCTGTAGTGGTGGTCGGAGATT;探针:JOE- TGAGGATGACTTGTTCTTTGAAGC-BHQ1。ddPCR结果根据微滴分析仪(biorad QX100)统计每个反应孔中荧光通道对应的copy number。
从结果中可以看到,同一名患者每两天收集的晨尿细胞外囊泡RNA中ERG,PCA3和SPDEF表达水平有显著差异(图1),从而造成变异系数(Coefficient of Variation,简写为CV)过大(图3),分别为7.70%,10.20%和7.97%。而同一名患者每两天收集的血清细胞外囊泡RNA中fcn1和il1b拷贝数,并没有显著差异(图2),因此CV分别是1.05%和1.89%(图3),说明检测结果更为稳定。
取样时间对检测仪器生成结果的影响:对住院患者晨尿及对应空腹全血(早上6点)、午饭前尿样及对应全血(中午11点)、晚饭后尿样及对应全血(晚上19点)对应的尿细胞外囊泡RNA,以及血清细胞外囊泡RNA中相应的基因检测显示,ERG和SPDEF在早上6点和晚上19点的尿样中表达量高于中午11点,并且晚上19点高于早上6点(CT值越大代表相应基因的相对表达量越低),而PCA3在早上6点的表达量最低,到晚上19点相对高于其他两个时间段(图4)。同比,血清细胞外囊泡RNA中fcn1和il1b在不同时间节点检测的拷贝数并没有显著差异,其中fcn1的拷贝数在987至1044之间,il1b的拷贝数在641至672之间(图5)。
比较低级别前列腺癌和高级别前列腺癌患者7个基因拷贝数在血清中的差异:经过前列腺穿刺术确诊为前列腺癌的患者中,明确格里森评分的样本(GS=6为低级别前列腺癌,GS≥7为高级别前列腺癌)进行FS中7个基因的拷贝数检测结果(图6)。
实施例3表征数据以及效果数据
对入组临床样本的前瞻性预测与随访:84例,血清总PSA在4-20ng/mL范围内。在前瞻性预测后的12月进行随访,最终入组的84例样本有56例在一年后并未确诊为前列腺癌;有11例GS=6,即低级别前列腺癌;有17例GS≥7,即高级别前列腺癌。总计有33.3%的患者确诊为前列腺癌,与真实世界多项大样本量临床研究结果相匹配(血清总PSA在4-20ng/mL范围内诊断为前列腺癌的患者约40%)。通过FS评分模型预测56例无需进行前列腺穿刺术的患者,其中53例在一年后并未确诊,同时漏诊3例(2例低级别前列腺癌,1例高级别前列腺癌)。通过FS评分模型预测28例低级别或高级别前列腺癌生成诊断ROC曲线如图7所示,该FS模型具有100%的特异性鉴别低级别与高级别前列腺癌的诊断效能:
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 上海晟燃生物科技有限公司
<120> 用于局限性前列腺癌临床风险预测的标志物和试剂盒
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Claims (10)
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述引物和/或所述探针是标记的。
3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述标记是荧光团。
4.根据权利要求1~3任一项所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中还含有用于指示所述待检测mRNA参考表达量的参考标准品。
5.检测剂在制备用于局限性前列腺癌的风险评估、预后判断、治疗或者辅助治疗的试剂盒中的应用,其特征在于,所述检测剂用于检测如下基因表达量:
fcn1、il1b、lilrb3、mefv、ppt1、rassf2和serpina1;
所述表达量通过用所述检测剂对受试者血液类样本中细胞外囊泡的所述基因对应的mRNA进行定量以表征。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述检测剂为用于执行以下任一种方法的试剂:
聚合酶链反应、核酸杂交法、免疫学检测法和生物质谱法。
7.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述检测剂为用于检测所述mRNA的引物和/或探针。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述检测剂为权利要求1~3任一项中所定义的引物和探针。
9.根据权利要求5~8任一项所述的应用,其特征在于,所述血液类样本为血清或血浆。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,所述受试者为血清总PSA在4ng/mL~20ng/mL的疑似局限性前列腺癌患者。
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