CN111518780A - 脱辅基辣根过氧化物酶的制备方法 - Google Patents

脱辅基辣根过氧化物酶的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药和医学检验技术领域，尤其涉及脱辅基辣根过氧化物酶的制备方法。本发明提供的辣根过氧化物酶脱辅基的方法包括，采用在低温条件下用有机溶剂提取的方法对辣根过氧化物酶进行处理，制备脱辅基的辣根过氧化物酶，然后除去有机溶剂，通过透析、洗滤、浓缩等步骤，制成冻干样品的过程。经验证，该方法可以有效地去除辣根过氧化物酶中的铁卟啉辅基，应用于生产脱辅基的辣根过氧化物酶，脱辅基辣根过氧化物酶主要应用于生物行业和医学检测行业领域。

Description

脱辅基辣根过氧化物酶的制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药和医学检验技术领域，尤其涉及脱辅基辣根过氧化物酶的制备方法。
背景技术
辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)是临床检验试剂中的常用酶。该产品不但广泛用于多个生化检测项目，也广泛运用于免疫类(ELISA)试剂盒。过氧化物酶作为多个试剂盒显色体系的关键成分，对试剂盒的质量有重要影响。抗原或抗体与辣根过氧化物酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。
辣根过氧化物酶中的存在铁卟啉辅基，人体中由于各种原因，产生辣根过氧化物酶抗体，和辣根酶结合后能进行显色反应，显示出假阳性。脱辅基辣根过氧化物酶可以特异性的和这些抗体结合，能够有效地降低假阳性效果，提高检测准确率。
根据相似相溶原理，辅基易溶于有机溶剂，而蛋白溶于水，因此通常采用萃取后分离两相的方法脱去辅基，但目前的制备工艺收率不足，且经过制备后脱辅基辣根过氧化物酶的活性受到严重影响，因此，研发脱辅基辣根过氧化物酶的制备工艺对免疫检测行业有十分重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供脱辅基辣根过氧化物酶的制备方法，从而提高脱辅基辣根过氧化物酶的产率及活性。
本发明提供了脱辅基辣根过氧化物酶的制备方法，其包括：
将辣根过氧化物酶溶液与有机溶剂饱和水溶液混合后，萃取30min，然后分离水相后经浓缩、干燥获得脱辅基辣根过氧化物酶；
所述有机溶剂为正丁醇、甲乙酮或乙酸乙酯；
所述辣根过氧化物酶溶液的pH值为1.5～4。
本发明中，所述辣根过氧化物酶溶液和有机溶剂饱和水溶液的温度为0～15℃。
本发明中，所述辣根过氧化物酶溶液中辣根过氧化物酶的浓度为5～30mg/ml。
一些具体实施例中，所述辣根过氧化物酶溶液中辣根过氧化物酶的浓度为10mg/ml。
本发明中，所述有机溶剂饱和水溶液的制备方法包括：将有机溶剂与水等体积混合，充分搅拌后静置30min以上，分离上层液体为饱和水溶液。
本发明中，所述辣根过氧化物酶溶液与有机溶剂饱和水溶液混合的体积比为1：1。
本发明中，所述萃取的次数为1～5次。
本发明中，所述分离水相后与浓缩步骤之间，还包括去除有机溶剂的步骤；所述去除的方法为透析、膜包、中空纤维洗滤或者浓缩低压旋蒸法。
一些具体实施例中，所述脱辅基辣根过氧化物酶的制备方法为：
将正丁醇与等体积水混合，搅拌均匀后静置30min取上层正丁醇饱和水溶液，冷却至0～15℃；
将辣根过氧化物酶溶解于水至浓度为10mg/ml，调节pH值至1.8～3.0冷却至0～15℃；
将辣根过氧化物酶溶液与有机溶剂饱和水溶液以体积比为1：1混合后，萃取30min，萃取次数为2次，分离两次萃取的水相后，去除有机溶剂，经浓缩、干燥获得脱辅基辣根过氧化物酶。
一些具体实施例中，所述脱辅基辣根过氧化物酶的制备方法为：
将甲乙酮与等体积水混合，搅拌均匀后静置30min取上层甲乙酮饱和水溶液，冷却至0～15℃；
将辣根过氧化物酶溶解于水至浓度为10mg/ml，调节pH值至1.8～3.0冷却至0～15℃；
将辣根过氧化物酶溶液与有机溶剂饱和水溶液以体积比为1:1混合后，萃取30min，萃取次数为2次，分离两次萃取的水相后，去除有机溶剂，经浓缩、干燥获得脱辅基辣根过氧化物酶。
一些具体实施例中，所述脱辅基辣根过氧化物酶的制备方法为：
将乙酸乙酯与等体积水混合，搅拌均匀后静置30min取上层乙酸乙酯饱和水溶液，冷却至0～15℃；
将辣根过氧化物酶溶解于水至浓度为10mg/ml，调节pH值至1.8～3.0冷却至0～15℃；
将辣根过氧化物酶溶液与有机溶剂饱和水溶液以体积比为1:1混合后，萃取30min，萃取次数为2次，分离两次萃取的水相后，去除有机溶剂，经浓缩、干燥获得脱辅基辣根过氧化物酶。
本发明所述的制备方法制得的脱辅基辣根过氧化物酶。
本发明所述的制备方法制得的脱辅基辣根过氧化物酶在制备免疫学检测试剂中的应用。
本发明提供的辣根过氧化物酶脱辅基的方法包括，采用在低温条件下用有机溶剂提取的方法对辣根过氧化物酶进行处理，制备脱辅基的辣根过氧化物酶，然后除去有机溶剂，通过透析、洗滤、浓缩等步骤，制成冻干样品的过程。经验证，该方法可以有效地去除辣根过氧化物酶中的铁卟啉辅基，应用于生产脱辅基的辣根过氧化物酶，脱辅基辣根过氧化物酶主要应用于生物行业和医学检测行业领域。
具体实施方式
本发明提供了脱辅基辣根过氧化物酶的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
(1)前处理在常温条件下，200ml正丁醇和水等体积混合，用机械搅拌或磁力搅拌充分搅拌后静置30min以上。两相分离后，上层为正丁醇饱和水溶液，取上层正丁醇饱和水溶液进行0-15℃预冷。
(2)辣根过氧化物酶溶解称取1g辣根过氧化物酶按10mg/ml浓度溶解于过滤水中，并用盐酸调节PH至1.8-3.0后，进行预冷，预冷温度为0-15℃。
(3)提取预冷后的正丁醇饱和水溶液和辣根过氧化物酶溶液等体积混合，充分搅拌均匀后静置30min以上。分层后，用虹吸或者打开容器底部阀门的方式或采用离心机离心的方式进行两相分离。按步骤(3)重复操作。
(4)去除有正丁醇残留水相用透析的方式去除正丁醇(不限于膜包、中空纤维洗滤或者低压旋蒸法)，得目标产物。
(5)冻干冻干目标产物，保存，收率为85％。
实施例2
(1)前处理在常温条件下，甲乙酮和水等体积混合，用机械搅拌或磁力搅拌充分搅拌后静置30min以上。两相分离后，上层为甲乙酮饱和水溶液，取上层甲乙酮饱和水溶液进行0～15℃预冷。
(2)辣根过氧化物酶溶解辣根过氧化物酶称取辣根过氧化物酶按质量比10mg/ml浓度溶解于过滤水中，并用盐酸调节pH至1.8～3.0后，进行预冷，预冷温度为0-15℃。
(3)提取预冷后的甲乙酮饱和水溶液和辣根过氧化物酶溶液等体积混合，充分搅拌均匀后静置30min以上。分层后，用虹吸或者打开容器底部阀门的方式或采用离心机离心的方式进行两相分离。按步骤(3)重复操作。
(4)去除有正丁醇残留水相用透析的方式去除正丁醇(不限于膜包、中空纤维洗滤或者低压旋蒸法)，得目标产物。
(5)冻干冻干目标产物，保存。收率为80％。
实施例3
(1)前处理在常温条件下，乙酸乙酯和水等体积混合，用机械搅拌或磁力搅拌充分搅拌后静置30min以上。两相分离后，上层为正丁醇饱和水溶液，取上层乙酸乙酯饱和水溶液进行0-15℃预冷。
(2)辣根过氧化物酶溶解辣根过氧化物酶称取辣根过氧化物酶按质量比10mg/ml浓度溶解于过滤水中，并用盐酸调节pH值至1.8-3.0后，进行预冷，预冷温度为0-15℃。
(3)提取预冷后的乙酸乙酯饱和水溶液和辣根过氧化物酶溶液等体积混合，充分搅拌均匀后静置30min以上。分层后，用虹吸或者打开容器底部阀门的方式或采用离心机离心的方式进行两相分离。按步骤(3)重复操作。
(4)去除有正丁醇残留水相用透析的方式去除正丁醇(不限于膜包、中空纤维洗滤或者低压旋蒸法)，得目标产物。
(5)冻干冻干目标产物，保存。收率为70％。
效果验证
1、失活辣根酶活性检测结果
按照上述脱辅基辣根过氧化物酶制备后活性测定结果比较，配置母液1mg/ml，然后对母液进行稀释后检测发光值，其结果如下：
表1发光信号值
稀释倍数 原酶对照 实施例1 实施例2 实施例3
100倍 836577849 466691 428260 470006
1万倍 208161768 5148 6429 6902
百万倍 8465579 63 70 72
结论：根据发光值显示，实施例1～3制得的辣根过氧化物酶的脱辅基效果明显，其中实施例1的脱除效果更显著。
2、RZ值检测结果
RZ值为紫外分光光度计在波长403nm处与波长275nm处吸收比值，母液按浓度2mg/ml配置结果如下：
表2 RZ值检测结果
Figure BDA0002524310620000051
Figure BDA0002524310620000061
为辅基的紫外吸收峰在403nm波长最高，蛋白的吸收峰在275nm波长最高，脱辅基前403nm处吸收峰是275nm处吸收峰的好几倍，脱辅基后，403处基本无吸收峰，用403/275的数值，来判断脱辅基效果。根据RZ值比较，实施例1～3技术路线对辣根过氧化物酶脱辅基效果明显，其中实施例1的脱除效果更显著。
3、通过ELISA检测TORCH项目同阳性消除效果：
采用实施例1制得的脱辅基辣根过氧化物酶对TORCH项目进行检测。
表3 CMV-IgM项目验证假阳性消除效果
Figure BDA0002524310620000062
Figure BDA0002524310620000071
表4 RV-IgM项目验证假阳性消除效果
Figure BDA0002524310620000072
表5 HSV-1-IgM项目验证假阳性消除效果
Figure BDA0002524310620000073
Figure BDA0002524310620000081
结果显示，根据上述结果可以看出，在加入脱辅基辣根过氧化物酶后，能有效消除TORCH五项中出现的多项同阳性。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.脱辅基辣根过氧化物酶的制备方法，其特征在于，包括：
将辣根过氧化物酶溶液与有机溶剂饱和水溶液混合后，萃取30min，然后分离水相后经浓缩、干燥获得脱辅基辣根过氧化物酶；
所述有机溶剂为正丁醇、甲乙酮或乙酸乙酯；
所述辣根过氧化物酶溶液的pH值为1.5～4。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述辣根过氧化物酶溶液和有机溶剂饱和水溶液的温度为0～15℃。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述辣根过氧化物酶溶液中辣根过氧化物酶的浓度为5～30mg/ml。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述辣根过氧化物酶溶液中辣根过氧化物酶的浓度为10mg/ml。
5.根据权利要求1～4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂饱和水溶液的制备方法包括：将有机溶剂与水等体积混合，充分搅拌后静置30min以上，收集上层液体。
6.根据权利要求1～5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述辣根过氧化物酶溶液与有机溶剂饱和水溶液混合的体积比为1：1。
7.根据权利要求1～6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述萃取的次数为1～5次。
8.根据权利要求1～7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述分离水相后与浓缩步骤之间，还包括去除有机溶剂的步骤；所述去除的方法为透析、膜包、中空纤维洗滤或者浓缩低压旋蒸法。
9.权利要求1～8任一项所述的制备方法制得的脱辅基辣根过氧化物酶。
10.权利要求1～8任一项所述的制备方法制得的脱辅基辣根过氧化物酶在制备免疫学检测试剂中的应用。
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