CN111485029A

CN111485029A - 用于检测包纳米虫的TaqMan探针定量检测方法及相应的试剂盒

Info

Publication number: CN111485029A
Application number: CN201910085475.8A
Authority: CN
Inventors: 唐伟; 束文圣; 杨荣; 束浩然; 黄斌; 蒋华
Original assignee: Guangdong Magigene Technology Co ltd
Current assignee: Guangdong Magigene Technology Co ltd
Priority date: 2019-01-29
Filing date: 2019-01-29
Publication date: 2020-08-04

Abstract

本发明公开了一种用于检测包纳米虫的TaqMan探针定量检测方法及相应的试剂盒。本发明巧妙的应用了特异性的基因检测区分包纳米虫与其它种属的菌种或虫种，通过综合判断，得出准确的菌属信息。本发明与现有的主流检测试剂盒相比，本发明用于检测包纳米虫的试剂盒具有灵敏度高、快捷方便、特异型好、判断严谨准确等优势，具有良好的应用前景和市场价值。

Description

用于检测包纳米虫的TaqMan探针定量检测方法及相应的试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种通过特异性基因对包纳米虫进行TaqMan探针定量检测的方法及相应的检测试剂盒。

背景技术

包纳米虫为世界动物卫生组织(OIE)规定的必报水生动物疫病之一，目前可分为四类，即牡蛎包纳米虫(Bonamia ostreae，Bona)、杀蛎包纳米虫(Bonamia exitiosa)、鲁道夫包纳米虫(Bonamia roughleyi)和成孢包纳米虫(Bonamia perspora)。其中，牡蛎包纳米虫是分布最为普遍，造成的危害也最为严重的。牡蛎包纳米虫是一种有核球形的专性寄生宿主血细胞的寄生虫，常寄生于牡蛎血液淋巴细胞内，感染后期在牡蛎结缔组织、内脏、消化道和性腺等组织器官也有寄生。

牡蛎感染包纳米虫后大部分表现正常，不显示临床症状，但生长速度放缓，机体瘦弱，肉质疏松，心肌肥大，套膜萎缩、溃疡。少部分牡蛎感染包纳米虫后表现为闭合肌萎缩褪色，出现灰白色小溃疡或穿孔性溃疡，血细胞破裂等症状。

包纳米虫病的发病与温度有关，温度低时感染包纳米虫也不发病，但当温度升高，包纳米虫就会爆发，牡蛎感染该病原一般终生携带。该病首先在欧洲被发现，随后流行于世界。包纳米虫可以通过宿主之间的共栖或接触直接感染，也能通过牡蛎的呼吸和食物传播。

感染包纳米虫后，目前没有有效的方法进行治疗，只能通过加强疫病监测与检疫，达到防控该病爆发的概率。国内外学者通过大量的研究，建立了一系列针对包纳米虫的检测方法，如组织病理解剖法、电镜观察法、雷氏液体巯基乙酸盐培养法、PCR检测法及LAMP法。但是前三类方法操作复杂、耗时长及检测灵敏度低，只能对发病明显的牡蛎进行诊断；PCR检测法虽然结果准确，但检测时间长、操作复杂、无法定量，很难在生产中进行推广应用；LAMP法虽然检测时间快但假阳性高，达不到精确检测的要求。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种用于检测包纳米虫的TaqMan探针定量检测方法，所述方法能够定量、快速、实时检测包纳米虫，使包纳米虫的检测更准确、灵敏、快速和安全。

具体地，上述方法包括如下步骤：

S1、收集样品；

S2、提取基因组DNA；

S3、利用TaqMan探针定量检测检测包纳米虫特异性基因18SrRNA基因；

S4、读取扩增Ct值；当所述包纳米虫特异性基因18SrRNA基因的Ct值小于35时，包纳米虫的检测结果为阳性；当所述包纳米虫特异性基因18SrRNA 基因的Ct值大于35时，包纳米虫的检测结果为阴性。

作为一种优选技术方案，所述步骤S2中还包括设计18SrRNA基因的检测引物和TaqMan探针的步骤。

作为一种优选技术方案，所述包纳米虫特异性基因18SrRNA基因的检测引物如SEQ ID NO:1～2所示；

SEQ ID NO:1(5'-GATTACGTCCCTGCCCTTTG-3')；

SEQ ID NO:2(5'-TCCACCTAATTCACCTCATTATTCAA-3')。

探针序列如SEQ ID NO:3所示；

SEQ ID NO:3(5'-FAM-CACACCGCCCGTCGCTTCTACC-BHQ1-3)。

作为一种优选技术方案，所述荧光定量PCR检测的反应体系为25μl，包括 2×TaqPCR Mix 12.5μl，total 10uM Primers Mix 1μl，TaqMan探针0.5μl，DNA input 2μl，H₂O 9μl。

作为一种优选技术方案，所述荧光定量PCR检测的反应条件为95℃变性 2min30s，94℃退火15s，60℃退火30s，采集荧光信号，40个循环。

本发明另一目的是提供一种用于检测包纳米虫的TaqMan探针定量检测试剂盒，包含所述的包纳米虫特异性基因18SrRNA基因的检测引物和TaqMan 引物探针。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明通过前期对包纳米虫和其他种属的虫种和菌种的大量研究数据中，挖掘出能够区分包纳米虫和其他种属的虫种和菌种特异性的孤儿基因，通过对特异性基因的检测，准确的判断出其他菌种或虫种阳性样品和环境样品中是否含有包纳米虫，具有前期大数据的挖掘和不同种属之间比对基础，选择的特异性基因具有物种和菌属的特异性。

(2)本发明中，通过对设计条件和实验条件的优化，选取针对于18SrRNA 基因检测扩增条件处于最优化的引物作为检测引物，提高引物扩增的效率，能够达到稳定、高效、高灵敏度和重现性的检测引物，实现微量样品的正确检出。

(3)本发明检测方法与市面上其他的检测方法相比，本发明的检测策略，能够直观的判断包纳米虫的感染和其他虫种或菌种感染，结果更加严谨和准确。

(4)本发明能够实现从10¹倍稀释到10⁵倍稀释的检测范围，灵敏度高，应用范围广，更高浓度的样品可以通过稀释折算同样被检测出来，检测结果稳定，具有很好的重现性。

(5)本发明检测方法能够应用于养殖水体样本或牡蛎样品等多方面来源样品筛查和检测，精准地判断出该养殖水体样品中是否含有包纳米虫，操作方便、快速、灵敏。本发明检测试剂盒能够应用于多种养殖样品的快速检验，无需额外进行微生物培养，使基因检验在养殖水体检测和日常民生中得到应用，具有灵敏度高、操作性强、快速、高效等优点。

附图说明

图1 18SrRNA基因检测引物标准曲线。

图2是实施例1中18SrRNA基因扩增曲线。

图3是实施例2中18SrRNA基因扩增曲线。

图4是实施例3中特异性实验18SrRNA基因的扩增曲线。

图5是实施例4中不同稀释倍数下包纳米虫阳性的18SrRNA基因的扩增曲线。

图6为实施例5中养殖基地样品1的18SrRNA基因的扩增曲线。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989) 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

本发明所用的以下试剂可通过常规途径购买得到。

表1

在一些实施方案中，使用扩增产物构建阳性标准品G质粒，并进行引物的扩增标准曲线检测和绘制，得到检测引物的扩增效率，本发明所提供的引物序列其扩增效率和置信程度均在最优化的水平。

在一些实施方案中，通过对不同的虫种或菌株检测特异性的基因，能够正确的区分出包纳米虫感染的样本和其他种属菌类以及虫种感染的样本，从而准确检测并判断出包纳米虫。

在一些实施方案中，通过对10个、100个、1000个、10000以及10⁵个阳性菌进行提取和检测，能够精确区分出包纳米虫和其他种属微生物，从而准确检测并判断出包纳米虫。并且能够保证低至10个阳性菌仍然能够准确检出，而更高滴度的微生物样品可以通过稀释至检测区间，同样可以准确检出。

在一些实施方案中，采集包括纯水、包纳米虫样品、养殖基地样品以及养殖水样，通过对特异性基因的检测，能够快速和准确的检验出样品中是否含有包纳米虫，方便快捷。

本领域技术人员应能理解，本方法中检测的基因和设计的特异性引物，同样可以通过相同检测对象的其他区段的设计达到相应的检测目的。

本发明所描述的用于检测包纳米虫TaqMan探针定量检测的方法及试剂盒可以广泛应用于牡蛎样本检测、养殖基地检测等多个检验检疫范畴，能够为牡蛎养殖、繁殖等提供方便、快捷、准确、高效的基于基因检测的监控产品。

实施例1检测引物扩增标准曲线及质粒灵敏度实验

1.微生物培养

使用LB培养基作为包纳米虫质粒的培养基，pH7.0～7.4的平板中生长良好。在平板上菌落直径为2mm，圆形，光滑，透明。选取处于生长旺盛的微生物样品进行后续的实验。

2.基因组DNA提取

按照Qiagen的QIAamp DNA Mini Kit说明书指示进行基因组DNA的提取。

3.扩增产物标准品质粒制作

使用源自包纳米虫提取的DNA，以18SrRNA基因的引物进行扩增，扩增产物经过加A处理后，使用T4连接酶连入T载体，并且通过转导感受态细胞后，质粒得到大规模扩增。18SrRNA基因的引物序列和TaqMan探针序列如SEQ ID NO:1～3所示，具体如表2。

表2

4.质粒的提取和标准曲线梯度的配置

分别涂板扩增18SrRNA基因对应的引物扩增产物的标准品克隆菌，收集单克隆的菌斑，并通过LB培养摇菌过夜扩增，最后得到5ml指数生长期的质粒阳性菌株，按照QIAGENPlasmid Midi Kit说明书指示进行质粒DNA的提取。提取后检测质粒DNA的浓度，并通过10倍稀释的方法，配置7个浓度梯度的标准品，浓度梯度分别为1fg/μL，1×10¹fg/μL，1×10²fg/μL，1×10³fg/μL，1×10⁴fg/μL， 1×10⁵fg/μL，1×10⁶fg/μL。

5.检测引物标准曲线绘制

按照TaKaRa Taq PCR Mix说明书指示进行浓度梯度标准曲线的q-PCR扩增，并且绘制对应的扩增曲线，得到引物的扩增效率。每一个q-PCR的反应设置3 个生物学重复及3个技术重复，q-PCR反应体系和扩增反应条件如表3所示，绘制的标准曲线如图1所示。

表3

6.结果分析

检测引物扩增标准曲线结果显示，18SrRNA基因对应的引物均为经过优化的引物设计和反应体系。其中线性的标准曲线可信度R²>0.990，证明引物设计和反应体系是最优状态。分析18SrRNA基因的扩增曲线的标准差和变异系数，以及7个浓度梯度下的扩增效率，均达到最优状态的要求，引物在该反应条件下能够满足检测要求，说明本方法质粒灵敏度高，且通过3个技术重复实验测得的CT值之间的变异系数小于5.0％，证明本方法重复性高。检测结果如表4及图2所示，图2为18SrRNA基因不同质粒浓度下的扩增曲线，扩增曲线从左到右的浓度依次为1×10⁶fg/μL，1×10⁵fg/μL，1×10⁴fg/μL，1×10³fg/μL，1×10²fg/μL， 1×10¹fg/μL，1×10⁰fg/μL。

表4

实施例2质粒重复性实验

1.微生物培养

同实施例1。

2.基因组DNA提取

同实施例1。

3.目标基因的q-PCR检测

按照TaKaRa Taq PCR Mix说明书指示进行样品的q-PCR扩增，并且得到引物对应的Ct值读数。本实验的q-PCR的反应设置2个浓度，分别为1×10⁶fg/μL 和1×10⁵fg/μL，每个浓度下分别设置4个生物学重复和5个技术重复，q-PCR反应体系和扩增反应条件如表5所示。

表5

4.结果分析

本实施例分析了18SrRNA基因的扩增曲线的相关性系数和可信度，以及2 个浓度下的扩增效率，均达到最优状态的要求，引物在该反应条件下能够满足检测要求。检测结果如表6及如图3所示，每个浓度条件设定4组，每组重复性测定5次，测定结果显示，变异系数均小于5％，证明本方法重复性好，稳定性高。

表6

实施例3阳性及阴性样品检测情况

1.微生物培养

同实施例1。

2.基因组DNA提取

同实施例1。

3.目标基因的q-PCR检测

按照TaKaRa Taq PCR Mix说明书指示进行样品的q-PCR扩增，并且得到引物对应的Ct值读数。q-PCR的反应设置3个生物学重复及3个技术重复，q-PCR 反应体系和扩增反应条件同实施例2。

4.结果分析

如表7和图4所示，引物的q-PCR扩增结果显示，包纳米虫呈现18SrRNA 基因的阳性结果，而其他虫种或菌属均显示阴性结果。因此，对于包纳米虫和其他虫种或菌属，进行18SrRNA基因的检测，能够较好的区分包纳米虫和其他虫种或菌属。综上所述，18SrRNA基因的对应引物和探针，能够满足包纳米虫的检测判断。

表7

实施例4阳性样品的灵敏度

1.样本收集和处理

分别收集健康牡蛎样本和包纳米虫阳性样品，其中包纳米虫阳性样品按照 10¹倍、10²倍、10³倍、10⁴倍以及10⁵倍分别进行梯度稀释，按照Qiagen的QIAamp DNA Mini Kit说明书指示进行基因组DNA的提取。

2.基因组DNA提取

同实施例1。

3.目标基因的q-PCR检测

同实施例2。

4.结果分析

如表8和图5-6所示，3种样品的18SrRNA基因引物的q-PCR扩增结果显示，从10¹倍、10²倍、10³倍、10⁴倍以及10⁵倍稀释样本的范围内，包纳米虫呈现18SrRNA基因的阳性结果。因此，通过进行18SrRNA基因的检测，能够较好的达到达到从10¹倍至10⁵倍稀释的范围内包纳米虫的检出。同时，从样本稀释10¹倍至10⁵倍的范围内，可以通过18SrRNA基因的检测，较好的完成包纳米虫的检测，检测范围可以跨度至样本稀释10¹倍至10⁵倍，更高的菌株浓度也可以通过稀释的方法稀释至最佳检测范围内，能够达到预期的检测要求。

表8

实施例5环境样品的检测

1.环境样品收集和基因组DNA的提取

分别收集纯水样本、包纳米虫样品、养殖基地样品以及养殖水样多份，按照Qiagen的QIAamp DNA Mini Kit说明书指示进行基因组DNA的提取。

2.目标基因的q-PCR检测

同实施例2。

3.结果分析

如表9所示，引物的q-PCR扩增结果显示，除了纯水样本、健康牡蛎样本和一个珠海斗门阳性样品、一个湛江赤坎阳性样品以及养殖海水样品样本外，其他样品均检出18SrRNA基因，证明相应的样品来源中含有包纳米虫。最终判断为包纳米虫阳性的准则为，18SrRNA基因检测得到Ct值小于35个循环。如果 18SrRNA基因均检测得到Ct值大于35个循环，则判断为包纳米虫阴性未检出。

表9

以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东美格基因科技有限公司

<120> 用于检测包纳米虫的TaqMan探针定量检测方法及相应的试剂盒

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 18SrRNA正向引物(Artificial Sequence)

<400> 1

gattacgtcc ctgccctttg 20

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 18SrRNA反向引物(Artificial Sequence)

<400> 2

tccacctaat tcacctcatt attcaa 26

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 18SrRNA探针(Artificial Sequence)

<400> 3

ccacaccgccc gtcgcttcta cc 22

Claims

1.用于检测包纳米虫的TaqMan探针定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、收集样品；

S2、提取基因组DNA；

S4、读取扩增Ct值；当所述包纳米虫特异性基因18SrRNA基因的Ct值小于35时，包纳米虫的检测结果为阳性；当所述包纳米虫特异性基因18SrRNA基因的Ct值大于35时，包纳米虫的检测结果为阴性。

2.根据权利要求1所述的用于检测包纳米虫的TaqMan探针定量检测方法，其特征在于，所述步骤S2中还包括设计18SrRNA基因的检测引物和TaqMan探针的步骤。

3.根据权利要求1所述的用于检测包纳米虫的TaqMan探针定量检测方法，其特征在于，所述包纳米虫特异性基因18SrRNA基因的检测引物如SEQ ID NO:1~2所示，TaqMan探针序列如SEQ ID NO:3所示。

4.根据权利要求1所述的用于检测包纳米虫的TaqMan探针定量检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR检测的反应体系为25μl，包括2×Taq PCR Mix 12.5μl，total 10 uMPrimers Mix 1μl，TaqMan探针 0.5μl，DNA input 2μl，H₂O 9μl。

5.根据权利要求1所述的用于检测包纳米虫的TaqMan探针定量检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR检测的反应条件为95℃ 变性2min30s，94℃退火15s，60℃退火30s，采集荧光信号，40个循环。

6.一种用于检测包纳米虫的TaqMan探针定量检测试剂盒，其特征在于，包含所述的包纳米虫特异性基因18SrRNA基因的检测引物和TaqMan探针。