CN111481587B - 克鲁兹王莲的萃取物用于制备提升基因表现量及提升皮肤的保湿能力的组合物的用途 - Google Patents
克鲁兹王莲的萃取物用于制备提升基因表现量及提升皮肤的保湿能力的组合物的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及植物提取物领域，尤其涉及克鲁兹王莲的萃取物用于制备提升基因表现量及提升皮肤的保湿能力的组合物的用途。所述克鲁兹王莲的萃取物是以水、醇类、含水醇类或其组合作为一萃取溶剂对所述克鲁兹王莲进行萃取而制得。本发明提供一种鲁兹王莲的萃取物用于制备提升角蛋白基因及透明质酸合成酶2基因的表现量，及提升皮肤的保湿能力的组合物的用途。
Description
技术领域
本发明涉及植物提取物领域，尤其涉及克鲁兹王莲的萃取物用于制备提升基因表现量及提升皮肤的保湿能力的组合物的用途。
背景技术
皮肤是保护人类个体的最大屏障，它具有对抗水分散失、病原菌以及各种环境损害的功能。暴露于大量的紫外线(ultraviolet，UV)、游离辐射(ionizing radiation)、药物或异生物质(xenobiotics)会促使皮肤生成活性氧族(reactive oxygen species，ROS)以及自由基(free radicals)。当所累积的活性氧族以及自由基的数量超过细胞或组织本身的抗氧化能力时，便会形成氧化性压力(oxidative stress)。接着，活性氧族以及自由基会与细胞内的组成物(包括DNA、蛋白质以及脂质等)相反应，进而对皮肤产生非所欲的影响。
近年来，人类对于皮肤保湿(moisturizing)的需求与日俱增，然而，目前常见用来提升皮肤保湿能力的方式大多为利用涂抹于皮肤表面的化妆品、保养品，或口服宣称具有提升皮肤保湿效用的健康食品。然而，习知的化妆品、保养品及健康食品大多由化学成分所制成，长期使用不但对人体健康有害无益，且这些产品往往价格昂贵，并非为一般使用者所能负担。
为了解决上述问题，本领域的技术人员亟需研发出具有提升皮肤的保湿能力的新颖医药品、食品产品或保养品以造福有此需求的广大族群。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的为提供一种克鲁兹王莲(Victoria cruziana)的萃取物用于制备一提升角蛋白(keratin，KRT)基因及透明质酸合成酶2(hyaluronan synthase 2，HAS2)基因的表现量的组合物的用途，其中该克鲁兹王莲的萃取物是以水、醇类、含水醇类或其组合作为一萃取溶剂对该克鲁兹王莲进行萃取而制得。
本发明的另一目的为提供一种克鲁兹王莲的萃取物用于制备一提升皮肤的保湿能力的组合物的用途，其中该克鲁兹王莲的萃取物是以水、醇类、含水醇类或其组合作为一萃取溶剂对该克鲁兹王莲进行萃取而制得。
在本发明的一实施例中，该克鲁兹王莲与该萃取溶剂的体积比例介于1～5∶10～20。
在本发明的一实施例中，该KRT基因是KRT1基因、KRT10基因或KRT14基因。
在本发明的一实施例中，该克鲁兹王莲的萃取物的有效浓度为至少0.03125mg/mL。
在本发明的一实施例中，该克鲁兹王莲的萃取物为一克鲁兹王莲第1天开花的花萃取物。
在本发明的一实施例中，该组合物是一医药品、一食品产品或一保养品。
综上所述，本发明克鲁兹王莲的萃取物的功效在于：可通过提升角蛋白基因及透明质酸合成酶2基因的表现量，达到提升皮肤的保湿能力的功效。
以下将进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。
附图说明
图1是本发明克鲁兹王莲的萃取物的总多酚含量检测的数据图，其中“***”表示与比较组比较，p＜0.001；
图2是本发明克鲁兹王莲的萃取物在作用6小时的提升与皮肤细胞保湿相关的KRT1基因、KRT10基因、KRT14基因及HAS2基因表现上的功效的数据图，其中“*”表示与对照组比较，p＜0.05；“**”表示与对照组比较，p＜0.01；
图3是本发明克鲁兹王莲的萃取物在作用24小时的提升与皮肤细胞保湿相关的KRT1基因、KRT10基因、KRT14基因及HAS2基因表现上的功效的数据图，其中“*”表示与对照组比较，p＜0.05；“**”表示与对照组比较，p＜0.01；“***”表示与对照组比较，p＜0.001。
具体实施方式
定义
本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。
依据本发明，克鲁兹王莲(Victoria cruziana)别名为巴拉圭王莲或阿根廷王莲，为睡莲科(Nymphaeaceae)王莲属(Victoria)的水生植物，原产于南美热带地区。克鲁兹王莲具地下茎，根状茎直立块状，肥厚，具刺，具粗壮发达的侧根，质地软而脆，单叶互生。
依据本发明，克鲁兹王莲的花可具有不同的开花期(flowering stage)。较佳地，克鲁兹王莲的花是第1、2天开的花。更佳地，克鲁兹王莲的花是第1天开的花。
依据本发明，医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于非经肠地道(parenterally)或局部地(topically)投药的剂型，这包括，但不限于：注射品(injection)[例如，无菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、无菌的粉末(sterile powder)、外部制剂(external preparation)以及类似物。
依据本发明，医药品可进一步包含有一被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，该医药上可接受的载剂可包含一或多种选自于下列的试剂：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizingagent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorptiondelaying agent)、脂质体(liposome)以及类似物。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
依据本发明，该医药上可接受的载剂包含有一选自于由下列所构成的群组中的溶剂：水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline，PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)以及它们的组合。
依据本发明，该医药品可以一选自于由下列所构成的群组中的非经肠道途径(parenteral routes)来投药：皮下注射(subcutaneous injection)、表皮内注射(intraepidermal injection)、皮内注射(intradermal injection)以及病灶内注射(intralesional injection)。
依据本发明，医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于局部地施用于皮肤上的外部制剂(external preparation)，这包括，但不限于：乳剂(emulsion)、凝胶(gel)、软膏(ointment)、乳霜(cream)、贴片(patch)、擦剂(liniment)、粉末(powder)、气溶胶(aerosol)、喷雾(spray)、乳液(lotion)、乳浆(serum)、糊剂(paste)、泡沫(foam)、滴剂(drop)、悬浮液(suspension)、油膏(salve)以及绷带(bandage)。
依据本发明，该外部制剂是通过将本发明的医药品与一为熟习此项技艺者所详知的基底(base)相混合而被制备。
依据本发明，该基底可包含有一或多种选自于下列的添加剂(additives)：水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氢化合物(hydrocarbons)[诸如石油胶(petroleum，jelly)以及白凡士林(white petrolatum)]、蜡(wax)[诸如石蜡(paraffin)以及黄蜡(yellowwax)]、保存剂(preserving agents)、抗氧化剂(antioxidants)、界面活性剂(surfactants)、吸收增强剂(absorption enhancers)、安定剂(stabilizing agents)、胶凝剂(gelling agents)[诸如卡波普
微结晶纤维素(microcrystalline cellulose)以及羧基甲基纤维素(carboxymethylcellulose)]、活性剂(active agents)、保湿剂(humectants)、气味吸收剂(odor absorbers)、香料(fragrances)、pH调整剂(pH adjusting agents)、螯合剂(chelating agents)、乳化剂(emulsifiers)、闭塞剂(occlusive agents)、软化剂(emollients)、增稠剂(thickeners)、助溶剂(solubilizing agents)、渗透增强剂(penetration enhancers)、抗刺激剂(anti-irritants)、着色剂(colorants)以及推进剂(propellants)等。有关这些添加剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
依据本发明，保养品可进一步包含有一被广泛地使用于保养品制造技术的可接受的佐剂(acceptable adjuvant)。例如，该可接受的佐剂可包含有一或多种选自于下列的试剂：溶剂、胶凝剂、活性剂、防腐剂、抗氧化剂、遮蔽剂(screening agent)、螯合剂、界面活性剂、染色试剂(coloring agent)、增稠剂(thickening agent)、填料(filler)、香料以及气味吸收剂。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
依据本发明，保养品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于护肤(skincare)或化妆(makeup)的形式，这包括，但不限于：水性溶液(aqueous solution)、水-醇溶液(aqueous-alcohol solution)或油性溶液(oily solution)、呈水包油型(oil-in-water type)、油包水型(water-in-oil type)或复合型的乳剂、凝胶、软膏、乳霜、面膜(mask)、贴片、贴布(pack)、擦剂、粉末、气溶胶、喷雾、乳液、乳浆、糊剂、泡沫、分散液、滴剂、慕斯(mousse)、防晒油(sunblock)、化妆水(tonic water)、粉底(foundation)、卸妆产品(makeup remover products)、肥皂(soap)以及其他身体清洁产品(body clearsingproducts)等。
依据本发明，保养品亦可与一或多种选自于下列的已知活性的外用剂(externaluse agents)一起合并使用：美白剂(whitening agents)[诸如维生素A酸(tretinoin)、儿茶素(catechin)、曲酸、熊果苷以及维生素C]、保湿剂、抗发炎剂(anti-inflammatoryagents)、杀菌剂(bactericides)、紫外线吸收剂(ultraviolet absorbers)、植物萃取物(plant extracts)[诸如芦荟萃取物(aloe extract)]、皮肤营养剂(skin nutrients)、麻醉剂(anesthetics)、抗痘剂(anti-acne agents)、止痒剂(antipruritics)、止痛剂(aralgesics)、抗皮肤炎剂(antidermatitis agents)、抗过角化剂(antihyperkeratolytic agents)、抗干皮肤剂(anti-dry skin agents)、抗汗剂(antipsoriatic agents)、抗老化剂(antiaging agents)、抗皱剂(antiwrinkle agents)、抗皮脂溢出剂(antiseborrheic agents)、伤口治疗剂(wound-healing agents)、皮质类固醇(corticosteroids)以及激素(hormones)。有关这些外用剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
依据本发明，食品产品可被当作食品添加物(food additive)，通过习知方法于原料制备时添加，或是于食品的制作过程中添加，而与任一种可食性材料配制成供人类与非人类动物摄食的食品产品。
依据本发明，食品产品的种类包括但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermented foods)、烘培产品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食补充品(dietary supplements)。
实施例1.克鲁兹王莲的萃取物的制备
首先，将未开花、第1天开花或第2天开花的克鲁兹王莲(来自于台南市白河区莲合国休闲莲园)的花进行均质，接而以水、醇类、含水醇类或其组合作为萃取溶剂对均质后的克鲁兹王莲进行萃取0.5～3小时，其中萃取的温度介于50℃至100℃，萃取溶剂与克鲁兹王莲的体积比介于10～20∶1～5。接着，将所得到的产物冷却至室温，以400网目(mesh)的滤网对产物过滤而得到一滤液，然后于45～70℃下对滤液进行减压浓缩而得到一浓缩产物。之后，以5μm孔径的滤心对浓缩产物进行过滤，得到本发明克鲁兹王莲的萃取物。
实施例2.克鲁兹王莲的萃取物的总多酚含量检测
首先，制备标准溶液及绘制标准曲线，将10mg的没食子酸(gallic acid)(SigmaG7384)溶于水中并添加10mL的体积至量瓶中，然后储存于-20℃作为储备溶液。之后，将储备溶液稀释10倍至100μg/mL的浓度，未使用完的液体可储存于-20℃。接着，于玻璃试管中分别配制0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL及100μg/mL的没食子酸标准溶液，配制方式显示于表1。
表1
之后，添加500μL的佛萧酚试剂(Folin-Ciocalteu’s phenol reagent)(Merck1.09001.0100)、混合均匀并静置3分钟，接而添加400μL的7.5％碳酸钠(sodiumcarbonate)(Sigma 31432，溶于水中)、混合均匀并反应30分钟。接着，经由涡旋(vortex)确保无气泡后取200μL的标准溶液于750nm下测量吸光值，并绘制标准曲线。
另外，将实施例1所得到的第1天开花的克鲁兹王莲的萃取物作为实验组1，第2天开花的克鲁兹王莲的萃取物作为实验组2，未开花的克鲁兹王莲的萃取物作为比较组。将实验组1、实验组2及比较组分别以水予以稀释并取100μL的体积至玻璃试管中，每组样品需三重复。之后，添加500μL的佛萧酚试剂、混合均匀并静置3分钟，接而添加400μL的7.5％碳酸钠、混合均匀并反应30分钟～1小时。接着，经由涡旋确保无气泡后取200μL的各组反应溶液于750nm下测量吸光值，然后以内差法算出浓度后再回乘稀释倍数以取得原萃取物浓度。本实施例的结果显示于图1。
图1是本发明克鲁兹王莲的萃取物的总多酚含量检测的数据图。由图1可见，与比较组相较之下，实验组1及实验组2的总多酚含量有显著的提升，其中与比较组相较之下，实验组1的总多酚含量提升7.1倍。本实施例的结果显示，本发明克鲁兹王莲的萃取物会大量释出总多酚。由于第1天开花的克鲁兹王莲的萃取物的总多酚含量最高，因此以第1天开花的克鲁兹王莲的萃取物拿来进行后续实验。
实施例3.克鲁兹王莲的萃取物在提升皮肤的保湿能力上的效用评估
本实施例通过探讨克鲁兹王莲的萃取物可否通过调控与皮肤细胞保湿相关的基因表现来达到提升皮肤的保湿能力的功效。
于角质细胞专用的无血清培养基(Keratinocyte-SFM；购自Thermo，产品编号：17005042)中培养人类表皮角质细胞(HPEK-50；购自CELLnTEC)于6-孔盘，2mL培养基的细胞浓度为1.5×105细胞/孔。
之后，将细胞分成3组，其中包括1个对照组及2个实验组(亦即实验组1与2)。将第1天开花的克鲁兹王莲的萃取物以培养基稀释为具有0.0625mg/mL及0.03125mg/mL浓度的稀释液，继而分别将0.0625mg/mL稀释液添加至实验组1的细胞中，及将0.03125mg/mL稀释液添加至实验组2的细胞中，至于对照组的细胞则添加培养基。接着，于培养箱中培养各组细胞6小时，接而收取各组细胞培养物并拿来进行基因表现分析。
在本实施例中，用来分析与皮肤细胞保湿相关的基因包括角蛋白1(keratin 1，KRT1)基因、角蛋白10(keratin 10，KRT10)基因、角蛋白14(keratin 14，KRT14)基因及透明质酸合成酶2(hyaluronan synthase 2，HAS2)基因。以RNA萃取套组(Geneaid)对上面所得到的各组细胞培养物进行RNA的萃取。对由此所得到的各组RNA取2,000ng并以
III反转录酶(Invitrogen)将萃取出的RNA反转录为cDNA。接着，以cDNA作为模版，并且使用用来扩增目标基因的引物对，包括KRT1、KRT10、KRT14、HAS2及TBP(作为内部对照组)，它们的核苷酸序列显示于下表2，在StepOne Plus实时PCR系统(ABI)中利用KAPACYBR FAST qPCR套组(2x)(KAPA Biosystems)来进行定量实时PCR，以对目标基因进行扩增及定量。PCR产物的熔化曲线是在定量实时PCR反应期间进行确认。
表2
目标基因的相对表现量是推导自方程式
并利用TBP基因(作为内部对照组)及基准基因的循环阈值及通过标准偏差来计算相对倍数变化，其中ΔCt＝Ct目标基因/基准基因-CtTBP，ΔΔCt＝ΔCt目标基因-ΔCt基准基因，
以对照组的目标基因表现量作为1的比较基准。各组之间的统计学显著差异是通过单尾史徒登氏t-检定来决定。本实施例的结果显示于图2。
图2是本发明克鲁兹王莲的萃取物在作用6小时之时提升与皮肤细胞保湿相关的KRT1基因、KRT10基因、KRT14基因及HAS2基因表现上的功效的数据图。由图2可见，无论是KRT1基因、KRT10基因、KRT14基因或HAS2基因，与对照组相较之下，实验组1的基因相对表现量有显著的提升。就KRT14基因及HAS2基因而言，与对照组相较之下，实验组2的基因相对表现量有显著的提升。本实施例的结果显示，本发明克鲁兹王莲的萃取物可通过提升KRT1基因、KRT10基因及KRT14基因的表现量来维持角质细胞排列，使皮肤角质组织完整，防止肌肤水分散失。另一方面，本发明克鲁兹王莲的萃取物可通过提升HAS2基因的表现量来促进内生性玻尿酸生成，透过吸附水分支撑肌肤，维持肌肤弹性及光泽。
另外，本发明利用浓度为0.03125mg/mL的克鲁兹王莲的萃取物来探讨其可否提升KRT1基因、KRT10基因及KRT14基因的表现量，实验流程同上所述，不同之处在于，萃取物添加至实验组细胞之后的作用时间是以24小时来取代6小时。本实施例的结果显示于图3。
图3是本发明克鲁兹王莲的萃取物在作用24小时之时提升与皮肤细胞保湿相关的KRT1基因、KRT10基因、KRT14基因及HAS2基因表现上的功效的数据图。由图3可见，无论是KRT1基因、KRT10基因或KRT14基因，与对照组相较之下，实验组的基因相对表现量皆有显著的提升。本实施例的结果显示，本发明克鲁兹王莲的萃取物在24小时均可通过提升KRT1基因、KRT10基因及KRT14基因的表现量来维持角质细胞排列，使皮肤角质组织完整，防止肌肤水分散失。
综上所述，本发明克鲁兹王莲的萃取物可通过提升角蛋白基因(包括KRT1基因、KRT10基因及KRT14基因)及透明质酸合成酶2(HAS2)基因的表现量，透过维持肌肤细胞排列及维持肌肤水分恒定，提升玻尿酸生成，整体提升角质细胞保湿基因表现，达到提升皮肤的保湿能力的功效。
以上所述仅为举例性，而非为限制性者。任何未脱离本发明的精神与范畴，而对其进行的等效修改或变更，均应包含于后附的申请专利范围中。
Claims (3)
1.一种克鲁兹王莲(Victoria cruziana)的萃取物用于制备一提升角蛋白(keratin,KRT)基因及透明质酸合成酶2(hyaluronan synthase 2,HAS2)基因的表现量的组合物的用途，其中所述克鲁兹王莲的萃取物是以水、醇类、含水醇类或其组合作为一萃取溶剂对克鲁兹王莲第1天开花的花进行萃取而制得，所述克鲁兹王莲第1天开花的花与所述萃取溶剂的体积比例介于1～5：10～20，所述克鲁兹王莲的萃取物的有效浓度为至少0.03125mg/mL。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述KRT基因是KRT1基因、KRT10基因或KRT14基因。
3.一种克鲁兹王莲的萃取物用于制备一提升皮肤的保湿能力的组合物的用途，其中所述克鲁兹王莲的萃取物是以水、醇类、含水醇类或其组合作为一萃取溶剂对克鲁兹王莲第1天开花的花进行萃取而制得，所述克鲁兹王莲第1天开花的花与所述萃取溶剂的体积比例介于1～5：10～20，所述克鲁兹王莲的萃取物的有效浓度为至少0.03125mg/mL。
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