CN111471673A

CN111471673A - 一种固定化载体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111471673A
Application number: CN201911365487.2A
Authority: CN
Inventors: 张辉; 刘建宇; 肖琰; 赵明明
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2019-12-26
Filing date: 2019-12-26
Publication date: 2020-07-31

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，涉及一种固定化载体的及其制备方法和应用，具体涉及所述固定化载体在油污染水体的修复中的应用。所述的固定化载体采用PVA‑Na.Alg混合凝胶液进行二次交联方法的制备方法获得。所述的二次交联方法采用PVA‑Na.Alg混合凝胶液在五硼酸铵水溶液中进行一次交联，再在二次交联剂AlCl₃和FeCl₃的混合液中进行二次交联，然后再用固定剂固化，再进行增殖培养。通过二次交联的固定化方法，制备的固定化载体颗粒机械强度大、传质性好，通过扫描电子显微镜观察，微观结构均匀为微生物提供了良好的生活环境。该方法成本低，应用效果好。无论对细菌进行单株固定还是混合固定，采用二次交联方法制得固定化载体颗粒对油污染地表水的降解效果都比较好。

Description

一种固定化载体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，涉及一种固定化载体的及其制备方法和应用，具体涉及所述固定化载体在油污染水体的修复中的应用。

背景技术

随着现代工农业的高速发展，人们对油类及其制品的需求不断加大，各种途径所造成油类污染已经非常严重。据估计全世界每年约有 1000万吨石油及产品通过各种途径进入地下水、地表水及土壤中，给生态系统造成极大危害。就目前国内情况而言，日益增加的机动车船使用的燃料油的泄漏是造成内河及湖泊大面积、低浓度油污染的主要原因。油类污染物已成为地表水中超标的主要污染物之一。

传统微生物修复是利用游离菌降解作用消减污染物，但是该方法的缺陷逐渐显现，如：单位体积内有效降解菌浓度低、反应器启动慢、菌体易流失、与土著菌竞争处于弱势、抗病毒性侵害能力差、对激烈的水利条件变化敏感等。因此，亟需开发适合油污染地表水修复的新型实用的技术。微生物固定化技术是利用化学或物理方法将游离微生物定位于限定的空间区域内，并保持活性，且能反复使用的高效生物技术。该技术具有微生物密度高、反应速度快、耐毒害能力强等优点。目前，微生物固定化技术在废水方面应用非常广泛，但对于地表水污染的修复处于起步阶段。鉴于微生物固定化技术特点及在废水方面积累的经验，我们将其移植到地表水的修复，为污染地表水体修复技术开辟新方法。

传统的聚乙烯醇和海藻酸钠包埋固定方法存在较多的缺陷和不足如传质性能差、机械强度低、水溶膨胀性大等的，因此为了实现上述微生物固定化修复技术对油污染地表水的修复，本发明采用二次交联的包埋固定化方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种固定化载体，该固定化载体采用二次交联的包埋固定化微生物的制备方法，利用固定化微生物降解地表水中的油类污染物。采用PVA-Na.Alg混合凝胶液进行二次交联法所得固定化颗粒机械强度大、传质性好等，使固定化颗粒性能更优良。并将制得的固定化颗粒应用于油污染地表水的修复，结果表明：该方法制得的固定化颗粒对油污染地表水具有良好的修复效果。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种固定化载体的制备方法，采用PVA-Na.Alg混合凝胶液进行二次交联方法的制备方法获得。

所述的二次交联方法为采用PVA-Na.Alg混合凝胶液在一次交联剂五硼酸铵水溶液中进行一次交联，再在二次交联剂AlCl₃和FeCl₃的混合液中进行二次交联，然后再用固定剂固化，再进行增殖培养。

本发明所述的固定化载体通过如下方法制备：

(1)PVA-Na.Alg混合凝胶液；

(2)液体种子液与凝胶液混匀，定容；

(3)PVA-Na.Alg混合凝胶液在五硼酸铵水溶液中进行一次交联；

(4)在AlCl₃和1-3％FeCl₃混合液中进行二次交联；

(5)固定剂固化；

(6)增殖培养。

步骤(1)中所述的PVA-Na.Alg混合凝胶液包括聚乙烯醇、海藻酸钠、活性炭、酵母膏，以质量百分比计，各组分组成为：聚乙烯醇 10-12％，海藻酸钠0.3-1.0％，活性炭3-6％，酵母膏余量，其中，聚乙烯醇、海藻酸钠、活性炭、酵母膏的乳质量比为： (9-11):(1-0.1)；(1-5):(02-1.2)。

步骤(2)中，

所述的一次交联为液体种子液与PVA-Na.Alg混合凝胶液在五硼酸铵水溶液中进行。

所述的液体种子通过如下方法制备：

用接种环在菌株斜面培养基上接取2环菌苔，接入到液体种子培养基中，在摇床转速140rpm-145rpm、28℃-30℃条件下，培养18-20 小时，制得液体种子液；

所述菌株为可降油菌，优选为芽孢杆菌(Bacillus sp.)或微杆菌(Microbacterium sp.)或两者的组合。

所述的液体种子培养基的质量百分比为：1％葡萄糖，0.25％酵母膏，0.1％NH₄NO₃,0.02％MgSO₄·7H₂O,0.02％KCl,pH＝7.2-7.4。

所述的液体种子液的质量百分比为20-30％，凝胶液的质量百分比为70-80％。

步骤(3)中所述的一次交联为液体种子液与PVA-Na.Alg混合凝胶液在五硼酸铵水溶液中进行。

所述一次交联中，所述的液体种子液的质量百分比为20-30％；液体种子液与凝胶液按照一定比例，五硼酸铵的浓度为8-10％；温度为40-45℃，pH为6-7，交联时间为：20-24h。

步骤(4)所述的二次交联中，AlCl₃的质量百分浓度为：1-3％， FeCl3的质量百分浓度为：1-3％；交联时间为17-20h；

步骤(5)所述的固定剂为：Na₂SO₄，其质量百分浓度为：7-10％，固定时间：20-24h。

步骤(6)所述的增殖培养的培养基包含：

1-5％葡萄糖，0.2-0.5％酵母膏，0.1-0.5％NH₄NO₃,0.02％MgSO₄·7H₂O, 0.02％KCl,pH＝7.2-7.4。

增殖培养的条件：

在摇床中，转速140rpm-145rpm、28℃-30℃条件下，培养18-20 小时。

具体地，本发明所述的一种固定化载体的制备方法，包括如下步骤：

按照质量百分比称取10-12％的聚乙烯醇(PVA)、0.3-1.0％的海藻酸钠、3-6％的活性炭、酵母膏作为凝胶液，用自来水浸润20-24h，灭菌冷却。将20-30％的质量百分比液体种子液与凝胶液混匀，余量用水定容，在40℃和pH自然条件下，通过2-3mm的自制制粒器，按一定速度滴加8-10％的五硼酸铵水溶液中进行一次交联20-24h，用 1-3％的AlCl₃和1-3％FeCl₃混合液进行二次交联17-20h，然后再用固定剂7-10％Na₂SO₄加固20-24h，最后用无菌水浸泡24h，增殖培养备用。

本发明制备的固定化载体可以用于油污染地表水的修复。

具体地，将所述的固定化载体颗粒投加油污染地表水中。

本发明具有如下的优点：

1.通过二次交联的固定化方法，制备的固定化载体颗粒机械强度大、传质性好，通过扫描电子显微镜观察，微观结构均匀为微生物提供了良好的生活环境。

2.该方法成本低。采用聚乙烯醇和活性炭为载体，材料来源广，价格低廉，对生物不具有毒性。且固定化细胞颗粒的微环境有利于屏蔽土著菌、噬菌体和毒性物质对微生物体的恶性竞争、吞噬和毒害，使其在复杂环境条件下稳定地发挥高效能。

3.应用效果好。无论对细菌进行单株固定还是混合固定，采用二次交联方法制得固定化载体颗粒对油污染地表水的降解效果都比较好，而且混合菌的固定化载体颗粒的修复效果明显高于单株固定化颗粒。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1

(1)芽孢杆菌(Bacillus sp.)液体种子制备

用接种环在芽孢杆菌(Bacillus sp.)斜面培养基上接取2环菌苔，接入到液体种子培养基(质量百分比：1％葡萄糖，0.25％酵母膏， 0.1％NH₄NO₃,0.02％MgSO₄·7H₂O,0.02％KCl,pH＝7.2-7.4)中，在摇床转速140rpm-145rpm、28℃-30℃条件下，培养18-20小时，制得液体种子。

(2)凝胶液配制

按照总质量100g,称取10.5％聚乙烯醇(PVA)、0.5％海藻酸钠 (Na.Alg)、5％的活性炭、1％酵母膏，用45ml自来水润湿20小时。于111℃下湿热灭菌30min.

(3)交联剂配制

按照总质量300g,称取8％五硼酸铵，溶于水中，调节pH为5，制得一次交联剂；

按照总质量300g，称取2％的AlCl₃和1％FeCl₃，溶于水中，调节 pH＝3，制得二次交联剂。

(4)加固剂配制

按照总质量300g,称取9％硫酸钠配制水溶液，pH自然。

(5)二次交联固定化载体制备

按照20％的质量百分比称取20ml的芽孢杆菌(Bacillus sp.)种子液，与100g凝胶液混合，迅速搅拌3分钟，将上述混合液通过2.5mm 的自制玻璃制粒器，以一定的速度滴加到连续搅拌的一次交联剂中，待呈球形颗粒后在室温下静置17-20h,更换二次联剂静置7-9h后换加 10％的Na₂SO₄固化剂，静置24h，用无菌水洗涤并浸泡24h,将固定化颗粒接入增殖培养基(1.25％葡萄糖，0.25％酵母膏，0.1％NH₄NO₃, 0.02％MgSO₄·7H₂O,0.02％KCl,pH＝7.2-7.4)中，摇床转速140rpm、28℃ 条件下，培养24h,然后更换增殖培养基重复2次，制得芽孢杆菌 (Bacillus sp.)固定化载体产品。

(6)机械强度和传质性

按照上述步骤制备得到的固定化载体机械强度为24.4Kg/cm²。固定化颗粒的传质性能通过观察不同断面的颜色，选择数量、粒径相同的固定化颗粒，分别放入等量的红墨水中，30min后取出球中心几乎全部变红。

(7)油污染地表水修复效果

将10％的固定化颗粒投加油污染地表水中，初始油浓度为 14.2mg/L,COD为118.4mg/L，在摇床转速140r/min，温度28℃条件下，120h油的去除率为80.1％,COD的去除率为79.4％；48h油的去除率为38.3％,COD的去除率为59.4％。

实施例2

基本操作与实施例1相同，不同之处在于：

将微杆菌(Microbacterium sp.)进行二次交联，制得固定化微杆菌(Microbacterium sp.)载体。

采用的凝胶液配比为：聚乙烯醇(PVA)10％、海藻酸钠(Na.Alg) 0.4％、活性炭3％，1％酵母膏，余量为水。

一次交联剂为7％的五硼酸铵水溶液，pH＝4.5。

制备得到的固定化载体机械强度为22.5Kg/cm²，传质性能好。

将10％的固定化颗粒投加到油污染地表水中，在摇床转速 140r/min，温度28℃条件下48h对油的去除率达到75.5％，对COD 的去除率为70.4％；48h油的去除率为33.4％,COD的去除率为49.8％。。

实施例3

与实施例1不同之处在于，将芽孢杆菌和微杆菌两株细菌混合固定。

混合菌种子液制备：分别用接种环在斜面培养基上接取2环菌苔，接入到液体种子培养基中，在摇床转速140rpm-145rpm、28℃-30℃ 条件下，培养18-20小时，将培养液混合，制得混合菌种子液。

将制得的混合菌10％的固定化颗粒投加到油污染地表水中，固定化颗粒在摇床转速140r/min，温度28℃条件下，48h对油的去除率达到84.3％，对COD的去除率为77.4％。混合菌的固定化颗粒的效果明显高于单一菌种的固定化颗粒。

Claims

1.一种固定化载体，其特征在于，采用PVA-Na.Alg混合凝胶液进行二次交联方法的制备方法获得。

2.如权利要求1所述的固定化载体，其特征在于，所述的二次交联方法为采用PVA-Na.Alg混合凝胶液在一次交联剂五硼酸铵水溶液中进行一次交联，再在二次交联剂AlCl₃和FeCl₃的混合液中进行二次交联，然后再用固定剂固化，再进行增殖培养。

3.一种制备权利要求1或2所述的固定化载体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)PVA-Na.Alg混合凝胶液；

(2)液体种子液与凝胶液混匀，定容；

(3)PVA-Na.Alg混合凝胶液在五硼酸铵水溶液中进行一次交联；

(4)在AlCl₃和1-3％FeCl₃混合液中进行二次交联；

(5)固定剂固化；

(6)增殖培养。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的PVA-Na.Alg混合凝胶液包括聚乙烯醇、海藻酸钠、活性炭、酵母膏，以质量百分比计，各组分组成为：聚乙烯醇10-12％，海藻酸钠0.3-1.0％，活性炭3-6％，酵母膏余量。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中聚乙烯醇、海藻酸钠、活性炭、酵母膏的乳质量比为：(9-11):(1-0.1)；(1-5):(02-1.2)。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)或(3)中，液体种子液与PVA-Na.Alg混合凝胶液在五硼酸铵水溶液中进行，所述液体种子液的菌株为为可降油菌，优选为芽孢杆菌(Bacillus sp.)或微杆菌(Microbacterium sp.)或两者的组合。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的二次交联中，AlCl₃的质量百分浓度为：1-3％，FeCl3的质量百分浓度为：1-3％。

8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述的固定剂为：Na₂SO₄。

9.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(6)所述的增殖培养的培养基包含：1-5％葡萄糖，0.2-0.5％酵母膏，0.1-0.5％NH4NO3,0.02％MgSO4·7H2O,0.02％KCl,pH＝7.2-7.4。

10.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(6)所述的增殖培养的条件为：转速140rpm-145rpm、28℃-30℃条件下，培养18-20小时。