CN111465698B - 用于由来源于银胶菊植物的生物质生产糖的方法 - Google Patents
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Abstract
由来源于银胶菊(guayule)植物的生物质生产糖的方法，包括：在至少一种木质素降解真菌的存在下，对所述生物质进行生物预处理，获得包含糖的液相和第一固体残余物；在至少一种稀无机酸的存在下，对所述第一固体残余物进行水解，获得包含糖的第一水解产物和第二固体残余物；对所述第二固体残余物进行酶水解，获得包含糖的第二水解产物和第三固体残余物。由此获得的糖可以有利地用作在用于生产醇(例如乙醇，丁醇)、脂质、二醇(例如，1,3‑丙二醇、1,3‑丁二醇、1,4‑丁二醇、2,3‑丁二醇)的发酵过程中的碳源，或者在用于生产其它中间体或化学产品(例如糠醛)的化学合成过程中的碳源。所述醇和脂质又可以有利地用于生产生物燃料(例如生物柴油或“绿色柴油”)，其可以原样使用，或者与其它燃料混合用于运输，而所述二醇可以用于生产产品如生物‑丁二烯，其又可以用于制造橡胶(例如，聚丁二烯或其共聚物)。所述用途在生物精炼厂的情况下是特别重要的。
Description
描述
本发明涉及用于由来源于银胶菊植物(guayule plants)的生物质生产糖的方法。
更特别地，本发明涉及一种由来源于银胶菊植物的生物质生产糖的方法，包括：在至少一种木质素降解真菌的存在下，对所述生物质进行生物预处理，获得包含糖的液相和第一固体残余物；在至少一种稀无机酸(稀释的无机酸，diluted inorganic acid)的存在下，对所述第一固体残余物进行水解，获得包含糖的第一水解产物和第二固体残余物；对所述第二固体残余物进行酶水解，获得包含糖的第二水解产物和第三固体残余物。
由此获得的糖可以有利地用作在用于生产醇(例如乙醇，丁醇)、脂质、二醇(例如，1,3-丙二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、2,3-丁二醇)的发酵过程中的碳源，或者在用于生产其它中间体或化学产品(例如糠醛)的化学合成过程中的碳源。所述醇和脂质又可以有利地用于生产生物燃料(例如生物柴油或“绿色柴油”)，其可以原样使用，或者与其它燃料混合用于运输，而所述二醇可以用于生产产品如生物丁二烯，其又可以用于制造橡胶(例如，聚丁二烯或其共聚物)。所述用途在生物精炼厂的情况下是特别重要的。
天然橡胶是以含水乳液的形式(通常以术语胶乳表示)包含在数百种植物物种中的烃类聚合物(顺式-1,4-聚异戊二烯)。天然橡胶的主要来源是巴西橡胶树(Heveabrasiliensis)(一种原产于亚马逊的树)，并且南美仍然是整个十九世纪所需的有限数量胶乳的主要来源。目前，由于寄生虫和疾病，美洲种植园几乎被完全废弃并且天然橡胶的生产几乎完全集中在东南亚。
为了克服越来越多地受到疾病和寄生虫侵袭的生产缺陷，在二十世纪，人们开发了多种方法来生产合成橡胶，最终发现了齐格勒-纳塔催化剂，该催化剂可以使异丙烯以极高的区域和立体选择性进行聚合，获得了几乎与植物来源的产物没有区别的合成的顺式-1,4-聚异戊二烯。然而，天然橡胶从未被完全替代，因为其某些性能(主要是机械性能)实际上是其少量脂质和与其相关的蛋白质的含量的结果。因此，在2013年的橡胶总产量(27.5Mt)中，仍然包括了12Mt(43％)的天然橡胶。
但是，从巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)生产橡胶暗示了一些技术和伦理性的问题。实际上，破坏美洲种植园的相同疾病和寄生虫仍然有可能也影响东南亚的橡胶生产。此外，胶乳的收获需要大量的劳动并且是唯一有利可图的，因为这种劳动以极低的薪水支付。由于这些原因，正在研究天然橡胶的替代来源。在这些当中，银胶菊(Partheniumargentatum)无疑是最有前途的一种。
银胶菊(Parthenium argentatum)是起源于美国西南部(特别是德克萨斯州)和北墨西哥的半荒漠地区的多年生灌木。这种植物以胶乳(在水中的乳状分散液或混悬液)的形式，尤其是在枝和茎的皮中积累天然橡胶(主要包含弹性体顺式-1,4-聚异戊二烯)。天然橡胶的含量可能取决于多种环境、耕种和保存因素，并且因此为干燥植物总重量的5％至20％。
与从属于菊科(Asteraceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、桔梗科(Campanulaceae)、唇形科(Labiatae)和桑科(Moraceae)类的其它植物(如例如续随子(Euphorbialathyris)、灰白毛银胶菊子(Parthenium incanum)、金花矮灌木(Chrysothamnusnauseosus)、大果红雀珊瑚属(Pedilanthus macrocarpus)、桉叶藤(Cryptostegiagrandiflora)、叙利亚马利筋(Asclepias syriaca)、Asclepias speciosa、Asclepiassubulata、高茎一枝黄花(Solidago altissima)、狭叶一枝黄花(Solidago gramnifolia)、坚硬一枝黄花(Solidago rigida)、苣荬菜(Sonchus arvensis)、罗盘草属(Silphiumspp.)、苍白印度车前草(Cacalia atriplicifolia)、俄罗斯蒲公英(Taraxacum kok-saghyz)、山薄荷(Pycnanthemum incanum)、美国石蚕(Teucreum canadense)、美洲风铃草(Campanula americana)(简称为术语“银胶菊型”))提取天然橡胶一样，从银胶菊植物中提取天然橡胶代表着一种从巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)提取天然橡胶的重要替代方法，尤其是考虑到这些物种对攻击橡胶树属(大戟科)(Hevea)的病原体具有更大的抵抗力、较低的植物原料的进口成本以及在从这些植物中提取的橡胶中的引起I型胶乳过敏(或IgE-介导)的多种蛋白质污染物的较低含量(与源自橡胶树属(大戟科)的橡胶相比)。
然而，只有在还利用了构成植物的所有其它成分的情况下，从银胶菊生产天然橡胶才是有利可图的，所述其它成分主要是树脂(含量与橡胶相当)和木质纤维素成分，以及少量精油和蜡。特别地，在科学和专利文献中广泛描述的提取橡胶和树脂之后，包含木质素和多糖的木质纤维素残余物(蔗渣)必须经过糖化过程，所述糖化过程由多糖的水解组成[其因此转化为溶解在所获得的水解产物中的5-碳原子(C5)糖和6-碳原子(C6)糖]，留下含有木质素的固体残余物。由此获得的糖然后可以用于通过发酵的有机中间体的进料生产过程，而木质素可以用作燃料或以其它方式利用。
在现有技术中描述的糖化方法中，优选的糖化方法是允许获得尽可能完全水解的半纤维素和尽可能高浓度的具有5个碳原子(C5)的单体糖和具有6个碳原子(C6)的单体糖，同时将寡聚物的形成以及源自糖脱水和木质素部分解聚的反应副产物的形成减少到最小的那些方法，所述反应副产物如例如糠醛(F)、羟甲基糠醛(HMF)、酚化合物，其充当通常在随后的糖发酵过程中使用的微生物的生长抑制剂，从而决定了所述方法的效率和生产率的实质性降低。在能够实现这些结果的方法中，设想在高温下或用侵袭性化学物质(例如，用酸或碱)来对木质纤维素残余物(蔗渣)进行预处理的方法虽然是有效的，但是由于腐蚀植物、过度糖降解、处置有毒或残余物质(例如盐)等而可能引起问题。作为所述处理的一种替代方法，或者出于减少其侵袭性的目的，通过生物方法对木质纤维素残余物(蔗渣)进行预处理，如例如设想使用能够选择性降解木质素的真菌进行处理，由于反应条件温和、技术方案简单且不产生要处置的有毒物质，而可以考虑作为有效的替代方法。
例如，美国专利申请2016/0304830涉及一种通过处理包含植物材料的水溶液或混悬液(淤浆)来提高天然橡胶从植物材料(例如，来源于银胶菊植物的植物材料)的产率的方法，所述植物材料包含天然橡胶与嗜热真菌，即绵毛嗜热丝菌(Thermomyceslanuginosus)。所述专利申请还涉及一种用于木质纤维素生物质的糖化的方法，其包括以下步骤：a)提供包含木质纤维素植物材料的水溶液或混悬液(淤浆)；b)用有效量的绵毛嗜热丝菌或者其一种或多种衍生物接种所述水溶液或混悬液(淤浆)；c)将所述水溶液或混悬液(淤浆)与有效量的绵毛嗜热丝菌或者其一种或多种衍生物一起孵育；d)在孵育步骤之后，回收从所述水溶液或混悬液(淤浆)获得的可发酵糖。在孵育后获得的糖主要是具有5个碳原子(C5)的单体糖，如木糖(42.62％)和阿拉伯糖(5％)，而具有6个原子(C6)的单体糖以少量获得(葡萄糖5.91％)。
还已知的是，用木质素降解真菌对木质纤维素生物质进行预处理，所述木质素降解真菌诱发被称为“白腐菌”(WRF)的所谓白腐病。实际上，与较低选择性的“褐腐菌”不同，所述真菌能够选择性地水解木质素并且因此能够使生物质中所含有的多糖更易于可接近且更可用于后续水解，无论是化学/热类型还是酶促类型，因而能够提高具有5个碳原子(C5)的单体糖和具有6个原子(C6)的单体糖的最终产量。
例如，Taniguchi M.等人在以下文章中：“Evaluation of pretreatment withPleurotus Ostreatus for enzymatic hydrolysis of rice straw(用糙皮侧耳(Pleurotus Ostreatus)的预处理用于稻草的酶水解的评价)”，该文章发表在“Journal ofBioscience and Bioengineering(生物科学与生物工程杂志)”(2005)，第100卷第6期，第637-643页，描述了用白腐菌(WRF)糙皮侧耳(Pleurotus Ostreatus)对稻草进行预处理，然后对其进行酶水解。在孵育60天后，所述预处理导致木质素降解(等于41％)。然而，在所述预处理结束时，没有突显出具有5个碳原子(C5)的单体糖或具有6个原子(C6)的单体糖的产量。
Ma F.等人在以下文章中：“Combination of biological pretreatment withmild acid pretreatment for enzymatic hydrolysis and ethanol,production fromwater hyacinth(生物预处理与温和酸预处理的组合用于从水葫芦的酶水解和乙醇生产)”，该文章发表在“Bioresource Technology(生物资源技术)”(2010)，第101卷，第9600-9604页，描述了一种用于改善从水葫芦(具有特别低的木质素含量，等于约2.8％)获得的生物质的酶水解和生产乙醇的方法。为此，将所述生物质用白腐菌(WRF)紫衫木齿菌(Echinodontium taxodii)进行预处理，并在10天后用稀硫酸(0.25％v/v溶液)处理：将所获得的残余物进行酶水解，得到糖，随后将其用于酵母酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)进行发酵以生产乙醇。用白腐菌(WRF)紫衫木齿菌与稀硫酸进行预处理的组合具有协同作用，并且使糖的产率相对于仅用稀硫酸预处理获得的糖的产率提高了1.13-2.11倍。这对于随后的乙醇生产同样是有效的，其显示出比仅用稀硫酸预处理获得的乙醇的产率高1.34倍的产率。
Isikhuemhen O.S.等人在以下文章中：“Biodegradation and Sugar Releasefrom Canola Plant Biomass by Selected White Rot Fungi(通过所选白腐菌从油菜植物生物质中进行的生物降解和糖释放)”，该文章发表在“Advances in BiologicalChemistry(生物化学进展)”(2014)，第4卷，第395-406页，描述了使用六种不同的白腐菌(WRF)用于预处理油菜植物。已经观察到，包括葡萄糖的单体糖与表多糖一起被释放到培养装置中：所获得的单体糖的量平均为2g-3g/100g生物质。
以申请人名义的国际专利申请WO 2016/062753涉及一种用于转化和利用银胶菊植物的每个部分的综合方法，依次包括以下步骤：
-利用机械处理将所述植物的茎与叶分离；
-处理叶以产生蜡和精油，以及包含纤维素、半纤维素和较小程度的盐、有机化合物和木质素的成分；
-从茎和枝中提取液相，从而形成第一固体木质残余物，表示为蔗渣；
-处理所述第一固体木质残余物以形成糖、纤维素、半纤维素和木质素。
上述综合方法被说成能够通过添加而进一步利用银胶菊植物生产胶乳、橡胶、树脂和蔗渣，以及生产可发酵糖：所述利用在设计用于生产除乙醇以外的有机中间体，例如用于生产1,3-丁二醇(在其双重催化脱水后可以将其转化为生物-丁二烯)的生物精炼厂的情况下是特别重要的。可发酵糖的生产通过两个阶段的糖化过程进行：在第一阶段，进行酸水解以将木质素转化为具有5个碳原子(C5)的单体糖，而在第二阶段，进行酶、化学或热化学水解，以获得具有6个原子(C6)的单体糖。没有提及对来源于银胶菊植物的生物质的任何生物预处理。
基于对从银胶菊植物中可获得的所有组分的利用的生物精炼厂将是更可持续的，更有可能将在提取主要组分(即胶乳、树脂和橡胶)后获得的残余木质纤维素生物质(即蔗渣)转化为具有五个碳原子(C5)的单体糖或转化为具有六个原子(C6)的单体糖(即第二代糖)。
已知的是，尽管使用具有6个原子(C6)的单体糖来生产有机化合物(例如，乙醇)不会构成问题，但是在具有5个碳原子(C5)的单体糖的情况下不能说是同样的。原因可以在以下事实中找到：具有5个碳原子(C5)的单体糖在代谢方面的效率低于具有6个碳原子(C6)的单体糖，因为它们遵循部分不同的分解代谢途径。具有6个碳原子(C6)的单体糖(如葡萄糖)根据糖酵解途径进行分解代谢，而具有5个碳原子(C5)的单体糖(如木糖)根据磷酸戊糖途径进入细胞代谢并且仅随后加入糖酵解途径的最后一部分：分解代谢途径的所述差异导致具有5个碳原子(C5)的单体糖被许多微生物消耗，其动力学明显比在具有6个碳原子(C6)的单体糖的消耗中观察到的动力学更慢。微生物即使存在，并且被用于微生物工业，但它们不能使用具有5个碳原子(C5)的单体糖。
因此，通常，在生物质的许多水解过程中获得的糖的混合物(其包括具有6个碳原子(C6)的单体糖和具有5个碳原子(C5)的单体糖二者)不构成用于许多发酵的合适进料，除了在酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)菌株的存在下进行的传统酒精发酵，这些菌株经过适当遗传修饰，用于生产乙醇的目的，并且对于进料质量具有相当高的耐受性。
因此，产生具有主要含量为具有5个碳原子(C5)的单体糖的水解产物构成了问题，特别是在设计用于生产除乙醇以外的有机中间体例如用于生产1,3-丁二醇(在其双重催化脱水后可以将其转化为生物-丁二烯)的生物精炼厂的情况下。
因此，申请人着手解决以下问题：增加从处理来源于银胶菊植物的生物质获得的糖的量，特别是具有6个碳原子(C6)的单体糖的量，以生产除乙醇以外的有机中间体。
申请人现在已经发现，通过以下方式可以增加从处理来源于银胶菊植物的生物质获得的糖的量，特别是具有6个碳原子(C6)的单体糖的量：在至少一种木质素降解真菌的存在下，对来源于银胶菊植物的生物质进行预处理，获得包含糖的液相和第一固体残余物；在至少一种稀无机酸的存在下，对所述第一固体残余物进行水解，获得包含糖的第一水解产物和第二固体残余物；对所述第二固体残余物进行酶水解，获得包含糖的第二水解产物和第三固体残余物。由此获得的糖可以有利地用作在用于生产醇(例如，乙醇，丁醇)、脂质、二醇(例如1,3-丙二醇，1,3-丁二醇，1,4-丁二醇，2,3-丁二醇)的发酵过程中的碳源，或在用于生产其它中间体或化学产品(例如糠醛)的化学合成过程中的碳源。所述醇和脂质又可以有利地用于生产生物燃料(例如，生物柴油或“绿色柴油”)，其可以原样使用或与其它燃料混合以进行运输，而所述二醇可以用于生产诸如生物-丁二烯的产品，其又可以用于制造橡胶(例如，聚丁二烯或其共聚物)。所述使用在生物精炼厂的情况下特别重要。
通过根据本发明的方法获得许多优点，如例如：
-利用至少一种木质素降解真菌，特别是利用选自白腐菌(WRF)的真菌进行生物预处理，允许具有6个碳原子(C6)的单体糖释放到培养基中，主要是葡萄糖，其从一些生物质组分通过所述木质素降解真菌直接转化为可溶性单体糖的代谢转化获得，特别地，葡萄糖可以以等于28g/100g蔗渣的量获得(如以下实施例中所述)；
-利用至少一种稀无机酸，特别是利用稀硫酸对第一固体残余物进行水解处理，允许获得生物质中所含有的半纤维素的几乎定量水解，主要产生具有5个碳原子(C5)的单体糖，更特别地，相对于其中没有对生物质进行生物预处理的情况，所述定量产率使用一半量的稀无机酸获得。
-第二固体残余物的酶水解允许仍然含有的纤维素被水解，主要获得具有6个碳原子(C6)的单体糖，特别是葡萄糖，所述产率高于其中没有对生物质进行生物预处理的情况；
-所述方法允许获得约50g/100g蔗渣(干重)的具有5个碳原子(C5)的单体糖和具有6个碳原子(C6)的单体糖的产率，所述产率明显高于在没有对蔗渣进行生物预处理的情况下获得的产率(其等于22g/100g蔗渣，(干重))(如以下实施例中所述)。
因此，本发明涉及一种用于从来源于银胶菊植物的生物质生产糖的方法，包括：
-在至少一种木质素分解真菌的存在下，对所述生物质进行生物预处理，获得包含糖的液相和第一固体残余物；
-在至少一种稀无机酸的存在下，对所述第一固体残余物进行水解，获得包含糖的第一水解产物和第二固体残余物；
-对所述第二固体残余物进行酶水解，获得包含糖的第二水解产物和第三固体残余物。
出于本说明书和所附权利要求书的目的，除非另有说明，否则数值范围的定义总是包括极限值。
出于本说明书和所附权利要求书的目的，术语“包括”还包括术语“基本上由...组成”或“由...组成”。
出于本说明书和所附权利要求书的目的，“银胶菊植物”通常意指上文列出银胶菊(Parthenium argentatum)物种和银胶菊类植物(guayule type plant)。
出于本说明书和所附权利要求书的目的，“具有5个碳原子(C5)的单体糖”意指戊糖糖类，或更简单地是戊糖，其是具有化学式为C5H10O5的包含五个碳原子的单糖。同样地，出于本说明书和所附权利要求的目的，“具有6个碳原子(C6)的单体糖”意指己糖糖类，或更简单地说是己糖，其是具有化学式C6H12O6的包含六个碳原子的单糖。
出于本说明书和所附权利要求书的目的，术语“来源于银胶菊植物的生物质”意指任何形式(例如，整个植物，植物的一部分，包括根、枝和/或茎、叶、任意皮，通过切碎、研磨等获得的植物碎片，通过压实植物碎片获得的团块和颗粒)，其中所述银胶菊植物用于通过化学和/或物理方法获得胶乳、橡胶、树脂、蔗渣、糖和植物本身中存在的其它组分的目的。
出于本说明书和所附权利要求书的目的，术语“蔗渣”意指源自对银胶菊植物可以进行的提取过程的植物材料的残余部分。蔗渣还可以包括一定量的典型地与植物的根相关且来源于栽培地的非植物材料(例如土壤，沙子等)。
出于本说明书和所附权利要求书的目的，术语“杂油液(油水混合物，miscella)”意指在分离蔗渣后获得的在其中进行提取过程的由胶乳、橡胶和/或树脂、水和/或有机溶剂组成的溶液、混悬液或乳液。
根据本发明的一个优选实施方案，所述来源于银胶菊植物的生物质是源自对所述银胶菊植物进行的提取过程的蔗渣。
为了获得蔗渣的目的，对银胶菊可以进行的提取过程在现有技术中是已知的。出于本发明的目的，优选地，所述蔗渣可以通过在以上报导的以申请人名义的国际专利申请WO 2016/062753中描述的方法获得，将该文献并入本文用于参考目的。
根据本发明的一个优选实施方案，所述至少一种木质素降解真菌可以例如选自属于菌株糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)、地中海嗜蓝孢孔菌(Formitiporiamediterranea)的白腐菌(WRF)。
根据本发明的一个特别优选实施方案，所述木质素降解真菌可以例如选自：糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)MUCL 29420、地中海嗜蓝孢孔菌(Formitiporiamediterranea)MUCL 45670，其获自BCCM(BE)比利时微生物协调中心、农用食品和环境真菌保藏中心MUCL(Belgian Coordinated Collection of Microorganism,Agro-food&Environmental fungal collection MUCL)。
出于本发明的目的，根据现有技术中已知的方法，在包含葡萄糖和各种营养物如例如氮、磷酸钾、镁、盐、维生素培养基的存在下，利用所述木质素降解真菌来制备接种物，所述培养基逐渐变为日益基本的培养基(即，含有越来越低浓度的容易被木质素降解真菌同化的大量营养素如例如碳、氮、磷)，持续从一个传代培养物到下一个传代培养物。随后，在无菌条件下操作，将如此得到的培养物的等分试样(5ml)转移到含有100g的软小麦仁的500ml烧瓶中，在搅拌下将其保持直至真菌菌丝体覆盖整个小麦仁。然后将烧瓶置于层流柜下，用于干燥所获得的物料的目的，然后将其精细研磨而获得被真菌污染的面粉，并用于生物质的预处理(如以下实施例中所述)。
根据本发明的一个优选实施方案，所述生物预处理可以在20℃至40℃范围内，优选在23℃至35℃范围内的温度下进行。
根据本发明的一个优选实施方案，所述生物预处理可以进行5天至25天范围内，优选10天至20天范围内的时间。
根据本发明的一个优选实施方案，所述生物预处理可以在4.5至7范围内，优选5至6.7范围内的pH下进行。
从所述生物质的生物预处理，获得包含固相(即第一固体残余物)和水相(即包含糖的液相)的混悬液。对所述混悬液进行过滤或离心以获得固相(即包含木质素、纤维素和木质素降解真菌(菌丝体)的细胞的第一固体残余物)和水相(即包含糖的液相)。
要指出的是，在所述液相中含有的糖，特别是具有6个碳原子(C6)的单体糖，更特别是葡萄糖，源自木质素降解真菌的代谢活性。
根据本发明的一个优选实施方案，所述稀无机酸可以例如选自硫酸、磷酸或其混合物。优选地，所述稀无机酸是稀硫酸，甚至更优选地其是2.5重量％的硫酸水溶液。
根据本发明的一个优选实施方案，在至少一种稀无机酸的存在下的所述水解可以进行30分钟至120分钟范围内，优选45分钟至90分钟范围内的时间。
根据本发明的一个优选实施方案，在至少一种稀无机酸的存在下的所述水解可以在110℃至160℃范围内，优选110℃至130℃范围内的温度下进行。
根据本发明的一个优选实施方案，在至少一种稀无机酸的存在下的所述水解可以在0.05至2范围内，优选在0.08至1.0范围内的pH下进行。
从所述第一固体残余物的水解，获得包含固相(即第二固体残余物)和水相(即第一水解产物)的混合物。对所述混合物进行过滤或离心以获得固相(即包含木质素和纤维素的第二固体残余物)和水相(即主要包含具有5个碳原子(C5)的单体糖的第一水解产物)。
要指出的是，在所述第一水解产物中含有的糖，特别是具有5个碳原子(C5)的单体糖，更特别是木糖，源自包含在所述第一固体残余物中的半纤维素的水解。
可以根据现有技术中已知的技术，例如，描述于专利US 5,628,830、US 5,916,780和US 6,090,595，使用商业酶，如例如Novozymes Bioenergy的CTec2、Celluclast1.5L(Novozymes)、Econase CE(Rohm Enzymes)、Spezyme(Genecor)、Novozym 188(Novozymes)(其可以单独使用或混合在一起使用)，来进行所述包含木质素和纤维素的第二固体残余物的酶水解。从所述第二固体残余物的酶水解，获得包含固相(即第三固体残余物)和水相(即第二水解产物)的混合物。对所述混合物进行过滤或离心以获得固相(即包含木质素和纤维素的第三固体残余物)和水相(即主要包含源自纤维素水解的具有6个碳原子(C6)的单体糖，特别是葡萄糖的第二水解产物)。
由此获得的糖可以有利地用作在用于生产醇(例如，乙醇，丁醇)、脂质、二醇(例如1,3-丙二醇，1,3-丁二醇，1,4-丁二醇，2,3-丁二醇)的发酵过程中的碳源，或在用于生产其它中间体或化学产品(例如糠醛)的化学合成过程中的碳源。所述醇和脂质又可以有利地用于生产生物燃料(例如，生物柴油或“绿色柴油”)，其可以原样使用或与其它燃料混合用于运输，而所述二醇可以用于生产诸如生物-丁二烯的产品，其又可以用于制造橡胶(例如，聚丁二烯或其共聚物)。所述使用在生物精炼厂的情况下特别重要。
木质素可以用作燃料，或用于制备复合材料(例如，在精细研磨后，木质素可以分散在适当的合成聚合物如例如聚乙烯、聚苯乙烯中)或用作生物填料(例如，在精细研磨后，木质素可分散在橡胶化合物中)。
可以通过现有技术中已知的技术，如例如高效液相色谱法(HPLC)或离子交换色谱法，来确定在水解后获得的糖的量。
现在将通过参考下面描述的图1的实施方案来更详细地举例说明本发明。
图1描绘了根据本发明的方法的一个实施方案。为此，例如通过机械处理，从银胶菊植物(1)中分离出枝、茎和叶(100)。例如，在碱性水溶液(图1中未显示)的存在下，对枝、茎和叶(100)进行提取，从而获得从其中提取胶乳(101)的第一杂油液和不含胶乳的第一蔗渣(图1中未显示)。例如，在极性溶剂体系(图1中未显示)的存在下，对所述不含胶乳的第一蔗渣进行提取，从而获得从其中提取树脂(103)的第二杂油液和不含胶乳且不含树脂的第二蔗渣(图1中未显示)。例如在非极性溶剂体系(图1中未显示)的存在下，对所述不含胶乳且不含树脂的第二蔗渣进行提取，从而获得从其中提取橡胶(102)的第三杂油液和不含胶乳、不含树脂且不含橡胶的第三蔗渣(110)。在至少一种木质素降解真菌的存在下，对蔗渣(110)进行生物预处理，所述木质素降解真菌选自属于菌株糙皮侧耳(Pleurotusostreatus)或地中海嗜蓝孢孔菌(Formitiporia mediterranea)的白腐菌(WRF)，获得包含具有6个碳原子(C6)的单体糖(特别是葡萄糖)的液相(111)和第一固体残余物(120)。在至少一种稀无机酸的存在下(例如，在稀硫酸的存在下)，对所述第一固体残余物(120)进行水解，获得主要包含具有5个碳原子(C5)的单体糖的第一水解产物(121)和第二固体残余物(130)。对所述第二固体残余物(130)进行酶水解，获得主要包含具有6个碳原子(C6)的单体糖(特别是葡萄糖)的第二水解产物(131)和第三固体残余物(140)(在图1中表示为木质素)。木质素(140)可以方便地用于制备复合材料或生物填料(400)。包含单体糖(111)、(121)和(131)的水解产物可以用于经由发酵来制备生物产品(300)(如例如生物-丁二醇)或生物燃料(如例如微生物油或乙醇)(300)，或用于经由化学合成来制备化学产品(200)(如例如糠醛)。
例如，在以上提及的以申请人名义的国际专利申请WO 2016/062753中，或者在以本申请人名义的意大利专利申请IT2015000082659中，可以找到关于从银胶菊植物获得所述多种类型的蔗渣，如用于获得胶乳、树脂、橡胶、精油的蔗渣的更多细节，将它们结合于此用于参考的目的。
在以下实施例中使用的来源于银胶菊植物的蔗渣含有：相对于蔗渣的总重量(干重)，18重量％的纤维素(葡聚糖)，11.6重量％的木聚糖，5.5重量％的阿拉伯聚糖，1.5重量％的半乳聚糖和31重量％的木质素。根据由美国NREL所定义的国际标准方法(A.Sluiter等人，NREL/TP-510-42618，2011年7月修订“Determination of StructuralCarbohydrates and Lignin in Biomass(生物质中的结构性碳水化合物和木质素的测定”)来确定来源于银胶菊植物的蔗渣的组成。
出于更好地理解本发明并将其付诸实践的目的，以下是本发明的一些例示性且非限制性实施例。
实施例1(比较)
来源于银胶菊植物的蔗渣的酶水解
将200g来源于银胶菊植物(银胶菊(Parthenium argentatum))的蔗渣用水洗涤，在60℃的烘箱中干燥一夜，并研磨(粒径<2mm)。
随后，在500ml烧瓶中，制备前述蔗渣在水中的10重量％混悬液(相对于该混悬液的总重量)，向其中加入酶共混物CTec2(Novozymes Bioenergy)(其量相对于所加载蔗渣(干重)为10重量％)和100ml的在pH 5的柠檬酸盐缓冲液的50mM储液：将全部物料在搅拌(150rpm)下在50℃留置72小时，获得包含固体残余物(其包含木质素和纤维素)和水解产物(其包含具有6个碳原子(C6)的糖)的混合物。在使全部物料冷却至室温(25℃)之后，通过过滤将包含木质素和纤维素的所述固体残余物与包含具有6个碳原子(C6)的单体糖的所述水解产物分离。
在通过真空蒸发(40mbar,40℃)进行浓缩之后，包含具有6个碳原子(C6)的单体糖的所述水解产物含有2.05g葡萄糖/100g加载的蔗渣(干重)。
使用装配有Carbopac PA 100柱的Dionex色谱系统，利用氢氧化钠梯度和乙酸钠作为抗衡离子，通过离子交换色谱法(HPAE-PAD)来确定糖含量。
实施例2(发明)
来源于银胶菊植物的蔗渣利用糙皮侧耳(Pleurotusostreatus)进行生物预处理
将200g来源于银胶菊植物(银胶菊(Parthenium argentatum))的蔗渣用水洗涤，在60℃的烘箱中干燥一夜，并研磨(粒径<2mm)。
将20g(干重)的前述蔗渣、1g/l的硝酸铵(NH4NO3)、1g/l的酵母提取物和400ml的在pH 5.5的磷酸盐缓冲液的0.1M储液加载到500ml玻璃反应器中，紧密地密封，该反应器设置有用于取样和供应气体的两个入口。将所获得的混合物在121℃的高压灭菌器中灭菌10分钟。在灭菌之后，加入1g的糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)接种物(被真菌污染的面粉，含有约106CFU/g)：将所获得的混悬液在搅拌下(250rpm)在室温(25℃)保持18天。在此期间，每2-3天，将纯氧气充入到生物反应器中(1ml/min)持续约60-90分钟，并在接种后的不同天数进行取样：分别为0、4、9、14和18。每个试验进行三次。
观察到，具有6个碳原子(C6)的单体糖(主要包括葡萄糖)根据钟形动力学在培养基(液相)中逐渐积累。最大葡萄糖积累值(对应于14培养天数)为28g葡萄糖/100g加载的蔗渣(干重)。糖含量如实施例1中所述确定。
所获得的包含木质素、纤维素和木质素降解真菌(菌丝体)糙皮侧耳(Pleurotusostreatus)的细胞的第一固体残余物通过过滤从混悬液分离，并且通过以上提及的由NREL所定义的国际标准方法进行分析。所述分析证实，在所获得的固体残余物中含有的纤维素的量仅稍微低于在生物预处理期间加载的蔗渣中含有的纤维素的量(2％降低)：考虑到所获得的葡萄糖的量高于理论上从初始生物质中所含有的纤维素可获得的葡萄糖的量(参见实施例1)，可以推断，培养基中所含有的葡萄糖起源于木质素降解真菌糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)的代谢活性。
实施例3(发明)
来源于银胶菊植物的蔗渣利用地中海嗜蓝孢孔菌(Fomitiporiamediterranea)进
行生物预处理
将200g来源于银胶菊植物(银胶菊(Parthenium argentatum))的蔗渣用水洗涤，在60℃的烘箱中干燥一夜，并研磨(粒径<2mm)。
将20g(干重)的前述来源于银胶菊植物的蔗渣、1g/l的(NH4NO3)、1g/l的酵母提取物和400ml的在pH 5.5的磷酸盐缓冲液的0.1M储液加载到500ml玻璃反应器中，紧密地密封，该反应器设置有用于取样和供应气体的两个入口。将所获得的混合物在121℃的高压灭菌器中灭菌10分钟。在灭菌之后，加入1g的地中海嗜蓝孢孔菌(Fomitiporiamediterranea)接种物(被真菌污染的面粉，含有约106CFU/g)：将所获得的混悬液在搅拌下(250rpm)在室温(25℃)保持18天。在此期间，每2-3天，将纯氧气充入到生物反应器中(1ml/min)持续约60-90分钟，并在接种后的不同天数进行取样：分别为0、4、9、14和18。每个试验进行三次。
观察到，具有6个碳原子(C6)的单体糖(包括葡萄糖)根据钟形动力学在培养基(液相)中逐渐积累。最大葡萄糖积累值(对应于14培养天数)为14g葡萄糖/100g加载的蔗渣(干重)。糖含量如实施例1中所述确定。
所获得的包含木质素、纤维素和木质素降解真菌(菌丝体)地中海嗜蓝孢孔菌(Fomitiporia mediterranea)的细胞的第一固体残余物通过过滤从混悬液分离，并且通过以上提及的由NREL所定义的国际标准方法进行分析。所述分析证实，在所获得的固体残余物中含有的纤维素的量仅稍微低于在生物预处理期间加载的蔗渣中含有的纤维素的量(1.5％降低)。可以推断，培养基中所含有的葡萄糖起源于木质素降解真菌地中海嗜蓝孢孔菌(Fomitiporia mediterranea)的代谢活性。
实施例4(比较)
在来源于银胶菊植物的蔗渣利用糙皮侧耳(Pleurotusostreatus)进行生物预处
理之后获得的第一固体残余物的酶水解
将在利用糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)进行生物预处理之后(实施例2)获得的第一固体残余物用水洗涤，在60℃的烘箱中干燥一夜并且最后进行酶水解。
随后，在500ml烧瓶中，制备所述第一固体残余物在水中的5重量％混悬液(相对于该混悬液的总重量)，向其中加入酶共混物CTec2(Novozymes Bioenergy)(其量为相对于所加载的第一固体残余物(干重)的10重量％)和100ml的在pH 5的柠檬酸盐缓冲液的50mM储液：将全部物料在搅拌下(150rpm)在50℃留置72小时，获得包含固体残余物(其包含木质素和纤维素)和水解产物(其包含具有6个碳原子(C6)的单体糖)的混合物。在使全部物料冷却至室温(25℃)之后，通过过滤将包含木质素和纤维素的所述固体残余物与包含具有6个碳原子(C6)的单体糖的所述水解产物分离。
在通过真空蒸发(40mbar,40℃)进行浓缩之后，包含具有6个碳原子(C6)的单体糖的所述水解产物含有2.8g葡萄糖/100g加载的蔗渣(干重)。因此该结果表明，真菌糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)的木质素降解活性(实施例2)仅导致所加载蔗渣的部分分解，其可接近性相对于蔗渣本身(实施例1)增加了，但仍然保持为不完全。
实施例5(比较)
在来源于银胶菊植物的蔗渣利用地中海嗜蓝孢孔菌(Fomitiporia
mediterranea)进行生物预处理之后获得的第一固体残余物的酶水解
将利用地中海嗜蓝孢孔菌(Fomitiporia mediterranea)进行生物预处理之后(实施例3)获得的第一固体残余物用水洗涤，在60℃的烘箱中干燥一夜并且最后进行酶水解。
随后，在500ml烧瓶中，制备所述第一固体残余物在水中的5重量％混悬液(相对于该混悬液的总重量)，向其中加入酶共混物CTec2(Novozymes Bioenergy)(其量为相对于所加载的第一固体残余物(干重)的10重量％)和100ml的在pH 5的柠檬酸盐缓冲液的50mM储液：将全部物料在搅拌下(150rpm)在50℃留置72小时，获得包含固体残余物(其包含木质素和纤维素)和水解产物(其包含具有6个碳原子(C6)的单体糖)的混合物。在使全部物料冷却至室温(25℃)之后，通过过滤将包含木质素和纤维素的所述固体残余物与包含具有6个碳原子(C6)的单体糖的所述水解产物分离。
在通过真空蒸发(40mbar,40℃)进行浓缩之后，包含具有6个碳原子(C6)的单体糖的所述水解产物含有3.0g葡萄糖/100g加载的蔗渣(干重)。因此该结果表明，真菌地中海嗜蓝孢孔菌(Fomitiporia mediterranea)的木质素降解活性(实施例3)仅导致所加载蔗渣的部分分解，其可接近性相对于蔗渣本身(实施例1)增加了，但仍然保持为不完全。
实施例6(比较)
来源于银胶菊植物的蔗渣利用稀硫酸(5重量％水溶液)进行水解
将200g来源于银胶菊植物(银胶菊(Parthenium argentatum))的蔗渣用水洗涤，在60℃的烘箱中干燥一夜，并研磨(粒径<2mm)。
随后，将2g的前述蔗渣和20ml的5重量％硫酸水溶液加载到具有气密性密封的100ml玻璃瓶中，获得pH等于0.1的混悬液：将该瓶放入在121℃的高压蒸气灭菌器中持续1小时，获得包含固体残余物(其包含木质素和纤维素)和水解产物(其主要包含具有5个碳原子(C5)的单体糖和较少量的具有6个碳原子(C6)的单体糖)的混合物。在使全部物料冷却至室温(25℃)之后，通过过滤将包含木质素和纤维素的所述固体残余物与主要包含具有5个碳原子(C5)的单体糖和较少量的具有6个碳原子(C6)的单体糖的所述水解产物分离。
在通过真空蒸发(40mbar,40℃)进行浓缩之后，主要包含具有5个碳原子(C5)的单体糖和较少量的具有6个碳原子(C6)的单体糖的所述水解产物含有3.5g葡萄糖/100g加载的蔗渣(干重)和8.2g木糖/100g加载的蔗渣(干重)。
实施例7(发明)
在来源于银胶菊植物的蔗渣利用糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)进行生物预处
理之后获得的第一固体残余物利用稀硫酸(2.5重量％水溶液)的水解
将在利用糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)进行生物预处理(实施例2)之后获得的第一固体残余物用水洗涤，在60℃的烘箱中干燥一夜并且最后进行酶水解。
随后，将2g的前述蔗渣和20ml的2.5重量％硫酸水溶液加载到具有气密性密封的100ml玻璃瓶，获得pH等于0.3的混悬液：将该瓶放入在121℃的高压蒸气灭菌器中持续1小时，获得包含第二固体残余物(其包含木质素和纤维素)和第一水解产物(其主要包含具有5个碳原子(C5)的单体糖和较少量的具有6个碳原子(C6)的单体糖)的混合物。在使全部物料冷却至室温(25℃)之后，通过过滤将包含木质素和纤维素的所述第二固体残余物与主要包含具有5个碳原子(C5)的单体糖和较少量的具有6个碳原子(C6)的单体糖的所述第一水解产物分离。
在通过真空蒸发(40mbar,40℃)进行浓缩之后，主要包含具有5个碳原子(C5)的单体糖和较少量的具有6个碳原子(C6)的单体糖的所述第一水解产物含有3.8g葡萄糖/100g加载的蔗渣(干重)和6.4g木糖/100g加载的蔗渣(干重)。因此，获得与实施例6(比较)中获得的那些产率类似的产率，但使用更稀的硫酸(2.5重量％水溶液代替5重量％)。
实施例8(比较)
在利用稀硫酸(5重量％水溶液)进行水解之后，从来源于银胶菊植物的蔗渣获得
的固体残余物的酶水解
将在利用5重量％硫酸水溶液进行水解之后(实施例6)获得的固体残余物用水洗涤，在60℃的烘箱中干燥一夜并且最后进行酶水解。
随后，在500ml烧瓶中，制备所述固体残余物在水中的5重量％混悬液(相对于该混悬液的总重量)，向其中加入酶共混物CTec2(Novozymes Bioenergy)(其量相对于所加载的固体残余物(干重)为10重量％)和100ml的在pH 5的柠檬酸盐缓冲液的50mM储液：将全部物料在搅拌下(150rpm)在50℃留置72小时，获得包含固体残余物(其包含木质素和纤维素)和水解产物(其主要包含具有6个碳原子(C6)的单体糖和较少量的具有5个碳原子(C5)的单体糖)的混合物。在使全部物料冷却至室温(25℃)之后，通过过滤将包含木质素和纤维素的所述固体残余物与主要包含具有6个碳原子(C6)的单体糖和较少量的具有5个碳原子(C5)的单体糖的所述水解产物分离。
在通过真空蒸发(40mbar,40℃)进行浓缩之后，包含具有5个碳原子(C5)的单体糖和主要是具有6个碳原子(C6)的单体糖的所述第二水解产物含有6.0g葡萄糖/100g加载的蔗渣(干重)和0.7g木糖/100g加载的蔗渣(干重)。
实施例9(发明)
在利用糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)进行生物预处理和利用稀硫酸(2.5重
量％水溶液)进行水解之后，从来源于银胶菊植物的蔗渣获得的第二固体残余物的酶水解
将在利用2.5重量％硫酸水溶液进行处理之后(实施例7)获得的第二固体残余物用水洗涤，在60℃的烘箱中干燥一夜，并且最后进行酶水解。
随后，在500ml烧瓶中，制备所述固体残余物在水中的5重量％混悬液(相对于该混悬液的总重量)，向其中加入酶共混物CTec2(Novozymes Bioenergy)(其量相对于所加载的固体残余物(干重)为10重量％)和100ml的在pH 5的柠檬酸盐缓冲液的50mM储液：将全部物料在搅拌下(150rpm)在50℃留置72小时，获得包含固体残余物(其包含木质素和纤维素)和第二水解产物(其主要包含具有6个碳原子(C6)的单体糖和较少量的具有5个碳原子(C5)的单体糖)的混合物。在使全部物料冷却至室温(25℃)之后，通过过滤将包含木质素和纤维素的所述第三固体残余物与主要包含具有6个碳原子(C6)的单体糖和较少量的具有5个碳原子(C5)的单体糖的所述第二水解产物分离。
在通过真空蒸发(40mbar,40℃)进行浓缩之后，主要包含具有6个碳原子(C6)的单体糖和较少量的具有5个碳原子(C5)的单体糖的所述第二水解产物含有6.4g葡萄糖/100g加载的蔗渣(干重)和0.7g木糖/100g加载的蔗渣(干重)。因此，获得与实施例7(比较)中获得的那些产率类似的产率，但使用稀的硫酸(2.5重量％水溶液代替5重量％)。
根据以上所提供的实施例，可以推断出当根据依照具有生物预处理的本发明的目标方法的糖化过程(实施例2、实施例7和实施例9)和根据依照没有生物预处理的现有技术的糖化处理(实施例6和实施例8)进行操作时所获得的具有5个碳原子(C5)的单体糖的量和具有6个碳原子(C6)的单体糖的量。如可以观察到的，如果进行了在至少一种木质素降解真菌的存在下的生物预处理，一组单体糖，其包括源自半纤维素降解的具有5个碳原子(C5)的单体糖(例如木糖、阿拉伯糖和半乳糖)和源自纤维素降解或直接由木质素降解真菌产生的具有6个碳原子(C6)的单体糖(特别是葡萄糖)二者，对应于49.6g/100g加载的蔗渣(干重)，其中38.2g/100g加载的蔗渣(干重)包括葡萄糖。在没有进行生物预处理的情形中，该组单体糖，其包括源自半纤维素降解的具有5个碳原子(C5)的单体糖(例如木糖、阿拉伯糖和半乳糖)和具有6个碳原子(C6)的单体糖(特别是葡萄糖)二者，对应于22.6g/100g加载的蔗渣(干重)，其中9.5g/100g加载的蔗渣(干重)包含葡萄糖。
Claims (10)
1.一种用于由来源于银胶菊植物的生物质生产糖的方法，包括：
-在至少一种木质素降解真菌的存在下，对所述生物质进行生物预处理，获得包含糖的液相和第一固体残余物，其中所述至少一种木质素降解真菌选自属于菌株糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)的白腐菌(WRF)；
-在至少一种稀无机酸的存在下，对所述第一固体残余物进行水解，获得包含糖的第一水解产物和第二固体残余物；
-对所述第二固体残余物进行酶水解，获得包含糖的第二水解产物和第三固体残余物。
2.根据权利要求1所述的用于由来源于银胶菊植物的生物质生产糖的方法，其中所述来源于银胶菊植物的生物质是由对所述银胶菊植物进行的提取过程所产生的蔗渣。
3.根据权利要求1或2所述的用于由来源于银胶菊植物的生物质生产糖的方法，其中所述至少一种木质素降解真菌是糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)MUCL 29420。
4.根据权利要求1或2所述的用于由来源于银胶菊植物的生物质生产糖的方法，其中在以下条件下进行所述生物预处理：
-在20℃至40℃范围内的温度下；和/或
-持续5天至25天范围内的时间；和/或
-在4.5至7范围内的pH下。
5.根据权利要求4所述的用于由来源于银胶菊植物的生物质生产糖的方法，其中在以下条件下进行所述生物预处理：
-在23℃至35℃范围内的温度下；和/或
-持续10天至20天范围内的时间；和/或
-在5至6.7范围内的pH下。
6.根据权利要求1或2所述的用于由来源于银胶菊植物的生物质生产糖的方法，其中所述稀无机酸选自硫酸、磷酸或其混合物。
7.根据权利要求6所述的用于由来源于银胶菊植物的生物质生产糖的方法，其中所述稀无机酸是稀硫酸。
8.根据权利要求7所述的用于由来源于银胶菊植物的生物质生产糖的方法，其中所述稀无机酸是2.5重量％的硫酸水溶液。
9.根据权利要求1或2所述的用于由来源于银胶菊植物的生物质生产糖的方法，其中在以下条件下进行在至少一种稀无机酸的存在下的所述水解：
-持续30分钟至120分钟范围内的时间；和/或
-在110℃至160℃范围内的温度下；和/或
-在0.05至2范围内的pH下。
10.根据权利要求9所述的用于由来源于银胶菊植物的生物质生产糖的方法，其中在以下条件下进行在至少一种稀无机酸的存在下的所述水解：
-持续45分钟至90分钟范围内的时间；和/或
-在110℃至130℃范围内的温度下；和/或
-在0.08至1范围内的pH下。
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