CN111450129A - 一种白刺果氯仿提取物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种白刺果氯仿提取物的应用,所述的白刺果氯仿提取物在制备预防/治疗结肠炎疾病药物中的应用。通过实验证明,经灌胃给药的途径,白刺果氯仿提取物对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠有显著的疗效。包括有效改善溃疡性结肠炎小鼠的一般状态、显著抑制DSS诱导的小鼠结肠变短、改善结肠组织病理学、降低髓过氧化物酶、显著减轻炎症反应、降低血清中促炎因子的表达,促进抑炎因子的生成,进而发挥抗炎作用。白刺果氯仿提取物具有治疗溃疡性结肠炎疾病的应用前景。

Description

一种白刺果氯仿提取物的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域,具体涉及一种白刺果氯仿提取物的应用。
背景技术
溃疡性结肠炎 (ulcerative colitis,UC) 是炎症性肠病 (inflammatory boweldisease,IBD) 的一个主要类型,是一种原因不明的慢性非特异性肠道炎症,可发生于任何年龄,病程迁延不愈,可反复发作,近年来,炎性肠病发病呈现全球蔓延的态势,表现为多地区发病率不断升高,以亚洲、中东和南美为甚。其临床表现为腹痛、腹泻及排粘液血便等,局限于结肠粘膜及粘膜下层,该病病程漫长,常反复发作,为胃肠道严重疾病之一。目前该病无确切的病因,仍没有治疗 UC 的特效药,因此被世界卫生组织列为现代难治病之一。
UC的致病因素以及发病机制尚不十分明确。目前认为该病发病机制较复杂,与诸多因素有关,如遗传因素、精神因素、免疫因素、感染因素、环境因素以及炎症介质等因素。目前用于治疗 UC 的常规药物主要是 5-氨基水杨酸、皮质类固醇、免疫抑制剂、抗生素及生物制剂等。治疗多以缓解症状为主,而且存在停药后易复发、耐药性增加或不良反应多等诸多问题。如柳氮磺胺吡啶的载体部分磺胺具有一定的毒性,15%~45%的患者服用后会出现明显的不良反应;糖皮质激素虽然具有较强的抗炎作用,但长期应用可导致机体出现糖、脂和蛋白质代谢紊乱,并且出现骨质疏松甚至股骨头坏死等并发症;有研究指出长时间服用免疫抑制剂可能会伴有感染、胰腺炎、头痛发热、肝损伤等不良反应,甚至引发肿瘤形成。抗生素药物口服易导致胃肠道刺激症状,静脉用药副作用大。因此,临床亟待新型抗 UC 的药物。
中医药是中华民族的瑰宝,中药也是国内治疗溃疡性结肠炎的特色。中药具有多系统、多环节、多靶点调控的特点,在预防和治疗复杂、慢性疾病方面具有独特优势。目前临床上用于治疗 UC 的中药材和中药处方较多,研究中药并从中寻找具备防治 UC 的天然药效成分及阐明其发挥作用的有关机制对于 UC 治疗具有重要意义。
白刺(Nitraria)是蒺藜科(zygophyllaceae)白刺属(Nitraria L.)多年生落叶灌木,该属植物是我国荒漠植被的重要种群之一,具有抗沙埋、抗干旱、耐盐碱、耐高温、耐严寒等特点,不仅能够起到维护生态环境、防风固沙、改良土壤的作用,而且其药用价值和食用价值也很高。白刺果实、叶子和茎含有丰富的多糖、维生素、氨基酸、各种微量元素和黄酮类化合物。它在食品、医药和保健等方面具备非常大的开发前景,具有很强的开发潜力。据《本草纲目》中记述,白刺“气味辛、寒、无毒,主治心绞痛、痛肿溃脓、止痛”有健脾胃、滋补强壮、调经活血、催乳之功效。现代医学研究认为,白刺“性味甘酸微咸温”,主治身体虚弱,气血两亏,月经不调,腰腹疼痛等症。白刺果素有“沙漠樱桃”的美称,经研究发现,白刺果实中富含多酚类、生物碱、黄酮类、氨基酸等生物活性成分,具有降血压,降血糖,降血脂,抗氧化等作用。但是关于白刺果氯仿提取物在溃疡性结肠炎应用未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种白刺果氯仿提取物的应用。
本发明的目的是这样实现的,所述的白刺果氯仿提取物在制备预防/治疗结肠炎疾病药物中的应用。
本发明通过生物学研究发现,白刺果氯仿提取物对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠有显著的疗效。包括有效改善溃疡性结肠炎小鼠的一般状态、显著抑制DSS诱导的小鼠结肠变短、改善结肠组织病理学、降低髓过氧化物酶、显著减轻炎症反应、降低血清中促炎因子的表达,促进抑炎因子的生成,进而发挥抗炎作用,提示其具有开发新的抗溃疡性结肠炎药物的前景。
附图说明
图1为白刺果氯仿提取物对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠体重变化趋势曲线示意图;
图2为白刺果氯仿提取物对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠DAI评分结果曲线示意;
图3为白刺果氯仿提取物对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠取材代表性图片示意图;
图4为白刺果氯仿提取物对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠长度差异的条形图;
图5为白刺果氯仿提取物对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠H&E染色图;
图6为白刺果氯仿提取物对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中髓过氧化酶(MPO)的影响示意图;
图7为白刺果氯仿提取物对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠血清炎症因子水平的影响;
其中,A为TNF-α;B为IL-1β
Control为对照组;DSS为模型组;DSS+5-ASA为5-氨基水杨酸阳性药物组(500 mg/kg);High为白刺果氯仿提取物高剂量组(500 mg/kg);Low为白刺果氯仿提取物低剂量组(250mg/kg),n=10;Note: ##P﹤0.05 vs 对照组;**P﹤0.05 vs 模型组。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明,但不以任何方式对本发明加以限制,基于本发明教导所作的任何变换或替换,均属于本发明的保护范围。
本发明所述的白刺果氯仿提取物在制备预防/治疗结肠炎疾病药物中的应用。
所述的白刺果氯仿提取物在制备预防/治疗溃疡性结肠炎疾病药物中的应用。
所述的白刺果氯仿提取物的剂量为每日2~3次,每次1000~3000mg。
所述的白刺果氯仿提取物的剂量为每日3次,每次1500mg。
所述的白刺果氯仿提取物是经过以下制备方法制备得到,包括前处理、提取、萃取和后处理步骤,具体包括:
A、前处理:将干燥的白刺果植物的果实部分经干燥粉碎过筛得到物料a;物料a中加入物料a质量3~5倍的石油醚进行脱脂脱色素后得到物料b;
B、提取:物料b中加入体积百分浓度92~97%乙醇溶液回流提取2~4次,合并提取液,减压浓缩得到浸膏c;
C、萃取:将浸膏c中加入浸膏c体积2~3倍的水混悬分散后得到物料d,物料d用等体积的氯仿、乙酸乙酯和正丁醇分别萃取2~4次,回收溶剂,得到氯仿萃取物f、乙酸乙酯萃取物g、正丁醇萃取物h和水相部分i;
D、后处理:将氯仿萃取物f经减压浓缩得到目标物白刺果氯仿提取物。
A步骤中所述的粉碎过筛是粉碎过10~50目筛。
B步骤中所述的回流提取的温度为75~85℃。
B步骤中所述的乙醇溶液得加入量为物料b体积的4~6倍。
本发明所述的白刺果提取物为活性成分的药物组合物为所述的药物组合物是在所述的白刺果提取物中加入其他活性成分形成的药物组合物。
本发明所述的白刺果提取物的制剂为所述的白刺果提取物中加入药学上可接受的辅料制备成口服剂或注射剂。
下面以具体实施案例对本发明做进一步说明:
实施例1
白刺果氯仿提取物的制备:
(1)将干燥的白刺果植物的果实部分干燥后粉碎成粉末, 取冻干粉碎后的白刺果500g,先用石油醚脱脂、脱色素,之后用95%乙醇加热回流提取3次(提取温度为80℃,料液比为1:5,提取时间分别为2h、1.5h、1h),合并提取液,减压浓缩得浸膏。
(2)将(1)中制备得到的浸膏,用水混悬分散,用等体积的氯仿、乙酸乙酯和正丁醇分别萃取3次,回收溶剂,得到氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水相部分。
(3)将(2)中得到的氯仿萃取物减压浓缩,用于后续的实验。
实施例2
白刺果氯仿提取物对UC小鼠模型的药效观察
1.试验方法
1.1小鼠适应性饲养1周
1.2分组和建立模型
取健康18-22 g C57BL/6雄性小鼠50只,随机分为5组,每组10只,分别为正常组、模型组、5-氨基水杨酸阳性药物组、白刺果氯仿提取物高剂量组、白刺果氯仿提取物低剂量组。除正常组外,其余各组饮用3% DSS,7天后换成正常水,给药组连续 10天灌胃给药。
2. 实验标本采集处理和结果判定方法
2.1疾病活动指数 (DAI)
在实验期间,每天观察小鼠的状态。此外,每天称量小鼠的重量,观察小鼠粪样的松软度以及便血情况。根据以上指标,得出小鼠DAI评分,并用于判定小鼠UC的严重程度。DAI评分=(体重下降分数+大便性状分数+便血分数)/3。DAI的具体评分标准如表1。
Figure 41287DEST_PATH_IMAGE001
2.2 血液样本采集及处理
实验结束当天,小鼠采取乙醚麻醉,眼球采血于肝素钠抗凝管中,离心吸取上清,置于4°C保存备用。ELISA测定血清炎症因子(TNF-α,IL-1β) :按照试剂盒说明书进行。(1)实验开始前,从冰箱中取出试剂盒放置室温,待试剂完全溶解,然后按照试剂盒说明书把所有浓缩液稀释为工作液,待用。(2)标准曲线的绘制:将标准品管离心,并按照说明书进行稀释。取7个 1.5ml EP管并从2开始标号,最后一个标为0管,每管加300ul样品稀释液。从1号管吸取300ul加到2号管,充分混匀,再从2号管吸取300ul混合液加到3号管,依次类推,至到7号管停止,0号管不加作为空白对照管。(3)加样:向酶标板的各孔中分别加入100ul的标准品和样品,室温25℃孵育2.5h,并轻轻振摇。(4)弃掉孔中的液体,用洗涤液洗4次,每次加入300ul洗涤液,最后一次洗完结束后,在滤纸上轻轻拍打残留液体,使孔保持干净。(5)每孔中加入100ul检测抗体,轻轻振摇,室温孵育1h。弃掉孔中液体,洗板(重复步骤 4)。(6)每孔中加入100ul HRP-链霉亲和液,室温孵育1h。弃掉孔中液体,洗板(重复步骤4)。(7)每孔中加入100ul显色液,注意避光操作,室温孵育30min。(8) 每孔中加入50ul反应终止液,立即在450nm波长下测各孔样品吸光度值并记录。(9)结果计算:所得样品OD值减去空白对照管OD值极为修正OD值。以标准品的浓度为X轴,以各浓度标准品对应的OD值为Y轴作图,得到标准曲线。将每个样品的OD值代入上述所得曲线方程中,即得到相应的蛋白浓度。
2.3结肠组织采集及处理
2.3.1小鼠结肠长度
实验结束当天,用颈椎脱臼法处死小鼠,立即解剖,取小鼠结肠(肛管至盲肠部),测量长度并记录。
2.3.2 HE染色
实验结束当天,用颈椎脱臼法处死小鼠,立即解剖,取部分小鼠结肠置于4%多聚甲醛固定24h,用蒸馏水冲洗10min。取出组织进行脱水、透明、浸蜡和石蜡包埋切片。取石蜡包埋的组织切片,厚度为 5μm,常规脱蜡;苏木精液染色5min;流水稍洗去苏木精液1-3s;1%盐酸乙醇1-3s;稍水洗10-30s;蒸馏水稍洗1-2s;0.5%伊红液染色1-3min;蒸馏水稍洗1-2s;80%乙醇稍洗1-2s;95%乙醇(Ⅰ)2-3s;95%乙醇(Ⅱ)3-5s;无水乙醇5-10min;石炭酸二甲苯5-10min;二甲苯(Ⅰ)2min;中性树脂封片。
2.3.3 小鼠结肠组织MPO含量
实验结束当天,用颈椎脱臼法处死小鼠,立即解剖,取小鼠结肠,-80°C冻存结肠组织以备用。准确称定组织重量,以试剂盒配备的试剂二为匀浆介质,按重量体积比为1:9加入匀浆介质制备成10%的组织匀浆,无需离心。严格按照试剂盒说明书操作,在460nm处,测吸光度值。按以下公式计算MPO活力(U/g组织湿重)=(测定管OD值-对照管OD值)/11.3×取样量(g)。
3. 试验结果
3.1 白刺果氯仿提取物对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠体重变化及DAI指数的影响
从图1 的结果显示,与正常组相比,模型组小鼠显示出更低的体重,第四天起其下降趋势明显,给药组体重虽然也呈下降趋势,但下降趋势不明显,表明白刺果氯仿提取物可以抑制DSS诱导的小鼠体重下降,与模型组相比,具有显著性差异。
由图2 的结果显示,与正常组相比,模型组小鼠在第3天开始有轻微腹泻,从第4天开始,体重明显下降,同时伴有毛发蓬松、懒动等行为,其 DAI 评分显著升高,且有显著性差异,与模型组比较,白刺果氯仿提取物治疗组在第3天症状开始减轻,饮食、活动逐渐增加,给药第7天后,DAI 评分均显著降低,说明白刺果氯仿提取物可以有效降低UC小鼠DAI评分。
3.2 白刺果氯仿提取物对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠长度的影响
由图3和图4我们可看出,与正常组相比,模型组结肠明显缩短,然而给予药物的小鼠,结肠缩短现象被明显抑制,且白刺果氯仿提取物的抑制效果优于阳性药对照组,具有显著性差异。结果表明白刺果氯仿提取物可显著增加DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的结肠长度。
3.3 白刺果氯仿提取物对DSS诱导的结肠炎小鼠结肠病理组织分析的影响
由图5的H&E染色结果显示,正常组小鼠的组织切片显示正常组织学;而DSS诱导的模型组小鼠表现出典型的症状,包括结肠组织结构完整性被严重破坏,粘膜层细胞坏死脱落,炎症程度、炎症深度、炎症浸润面积等增加,腺体结构部分甚至完全消失;而白刺果氯仿提取物治疗组显著减弱了所有这些组织学变化,主要表现为结肠组织粘膜层、粘膜下层结构基本完整,且腺体结构部分保留,浸润的炎症细胞明显减少。结果表明白刺果氯仿提取物可有效改善溃疡性结肠炎小鼠结肠的病理变化情况。
3.4 白刺果氯仿提取物对DSS诱导的结肠炎小鼠结肠组织MPO的影响
由图6的结果显示,与正常组小鼠相比,DSS诱导的UC增强了MPO活性,白刺果氯仿提取物处理后可显著降低MPO的活性,且具有显著性差异。表明白刺果氯仿提取物可显著改善溃疡性结肠炎小鼠结肠的生物标志物的增加,意味着白刺果氯仿提取物可有效改善溃疡性结肠炎。
3.5 白刺果氯仿提取物对DSS诱导的结肠炎小鼠血清炎性因子的影响
由图7的结果显示,与正常组相比,模型组小鼠TNF-α、IL-1β水平均显著升高,且具有显著性差异,而白刺果氯仿提取物治疗组和5-氨基水杨酸阳性药物组可显著抑制TNF-α、IL-1β等炎性因子的水平,且白刺果氯仿提取物高剂量组的抑制效果优于阳性对照组,具有显著性差异。结果表明白刺果氯仿提取物可有效抑制由DSS介导的促炎因子的分泌。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出:对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种白刺果氯仿提取物的应用,其特征在于所述的白刺果氯仿提取物在制备预防/治疗结肠炎疾病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的白刺果氯仿提取物的应用,其特征在于所述的白刺果氯仿提取物在制备预防/治疗溃疡性结肠炎疾病药物中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的白刺果氯仿提取物的应用,其特征在于所述的白刺果氯仿提取物的剂量为每日2~3次,每次1000~3000mg。
4.根据权利要求3所述的白刺果氯仿提取物的应用,其特征在于所述的白刺果氯仿提取物的剂量为每日3次,每次1500mg。
5.根据权利要求1所述的白刺果氯仿提取物的应用,其特征在于所述的白刺果氯仿提取物是经过以下制备方法制备得到,包括前处理、提取、萃取和后处理步骤,具体包括:
A、前处理:将干燥的白刺果植物的果实部分经干燥粉碎过筛得到物料a;物料a中加入物料a质量3~5倍的石油醚进行脱脂脱色素后得到物料b;
B、提取:物料b中加入体积百分浓度92~97%乙醇溶液回流提取2~4次,合并提取液,减压浓缩得到浸膏c;
C、萃取:将浸膏c中加入浸膏c体积2~3倍的水混悬分散后得到物料d,物料d用等体积的氯仿、乙酸乙酯和正丁醇分别萃取2~4次,回收溶剂,得到氯仿萃取物f、乙酸乙酯萃取物g、正丁醇萃取物h和水相部分i;
D、后处理:将氯仿萃取物f经减压浓缩得到目标物白刺果氯仿提取物。
6.根据权利要求5所述的白刺果氯仿提取物的应用,其特征在于A步骤中所述的粉碎过筛是粉碎过10~50目筛。
7.根据权利要求5所述的白刺果氯仿提取物的应用,其特征在于B步骤中所述的回流提取的温度为75~85℃。
8.根据权利要求5所述的白刺果氯仿提取物的应用,其特征在于B步骤中所述的乙醇溶液得加入量为物料b体积的4~6倍。
9.一种以权利要求1~8任一所述的白刺果提取物为活性成分的药物组合物,其特征在于所述的药物组合物是在所述的白刺果提取物中加入其他活性成分形成的药物组合物。
10.一种权利要求1~8任一所述的白刺果提取物的制剂,其特征在于所述的白刺果提取物中加入药学上可接受的辅料制备成口服剂或注射剂。
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Title
申红枝: "西伯利亚白刺成熟果生物碱含量测定的初步研究 ", 《北方药学》 *
蔺伟等: "《大自然的守望者》", 31 December 2013, 《北京理工大学出版社》 *

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