CN111432800B - 利奈唑胺制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于缓解和/或治疗慢性下背疼痛(CLBP)的包含利奈唑胺的可注射的热敏性水凝胶组合物。

Description

利奈唑胺制剂

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年11月16日提交的标题为“linezolid formulations(利奈唑胺制剂)”的美国专利申请号62/587,101的优先权；其内容通过引用整体并入本文。

发明领域

本发明提供了可用于慢性下背疼痛(chronic low back pain)治疗的利奈唑胺(linezolid)制剂、方法和生产。在本发明的一个方面，利奈唑胺制剂包含利奈唑胺II型混悬物、碘海醇和泊洛沙姆407，并且是可注射的。

发明背景

慢性下背疼痛(CLBP)在全球一般人群中很常见。观察到MRI的Modic改变(骨水肿)与非特异性LBP之间呈正相关，平均比值比(OR)为4.5。Jensen等综述指出在非特异性CLBP患者中，任何类型的Modic改变(例如I-III型)的患病率为46％，而在一般人群中为6％(Jensen等人,Eur.Spine J.2008,17:1407-1422)。

以椎骨水肿(或炎症)为特征的Modic改变很可能是由于盘组织的低度感染所致，其中盘/终板损伤和炎性刺激的持续存在形成诱因性条件。已表明非化脓性椎间盘内的痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes，P.acnes)是引起Modic改变(例如I型)和非特异性下背疼痛的一种病原体(Stirling等人Lancet,2001,357:2024-2025；Agarwal等人SpineJ.2010,10:S45-S46；Albert等人,Eur Spine J.,2013,22(4):690-696；Capoor等人,PLoSOne,2016,11(8):e0161676.doi:10.1371；和Capoor等人,PLos One,2017,12(4):e0174518.doi:10.1371)。盘细胞可对痤疮丙酸杆菌感染产生炎症应答(Dudli等人,EurSpine J.,2017,Sep 7.doi:10.1007/s00586-017-5291-4)。从与Modic改变和盘退变相关的患者分离的痤疮丙酸杆菌当接种到椎间盘里时，可诱发炎症反应、椎间盘退变和Modic改变(Chen等人,Biomed Res Int.2016:9612437.doi:10.1155/2016/9612437.Epub 2016Jan26；和Chen等人,Int Orthop.2016,40(6):1291-1298.；和Dudli等人,J Orthop Res.2016,34(8):1447-1455)。在动物中进行的研究还表明，盘中的痤疮丙酸杆菌感染可以诱发盘退变和Modic改变(Zamora等人,Orthop Traumatol Surg Res.,2017,103(5):795-799；Shan等人,Spine,2017,Apr 10.doi:10.1097/BRS.0000000000002192；和Shan等人,J BoneJoint Am.,2017,99(6):472-481)。与组织感染相关的痤疮丙酸杆菌菌株还表达透明质酸降解酶，其可以导致盘退变(Nazipi等人,Microorganisms.2017Sep 12；5(3).pii:E57.doi:10.3390/microorganisms5030057)。

据推测，来自口腔和皮肤的厌氧细菌(如痤疮丙酸杆菌)可以进入该盘。由于细胞因子和丙酸的产生，相邻骨中的局部炎症可能是继发效应，其中感染在该盘中，而Modic改变是在骨中表现出的“副作用”(Albert等人,Eur Spine J.,2013,22(4):690-696)。

抗生素疗法可有效治疗与Modic改变相关的CLBP。几项研究已表明，口服抗生素如阿莫西林-克拉维酸盐对慢性LBP患者的所有结果指标均具有临床上重要且统计学上显著(p<0.001)的改善(Albert等人,Br.J.Sports Med.2008,42(12):969-973；和Albert等人Eur Spine J.2013,22(4):697–707)。这些结果为细菌感染可能在具有Modic改变的CLBP中发挥作用的假设提供了支持。

尽管一些非手术治疗方法(包括盘内注射类固醇、抗TNF-α抗体和双膦酸盐)已经在一些未重复的临床研究中显示出一些减少Modic改变和CLBP的短期疗效，但这些方法都没有成功，并引起争议结果。在这种背景下，本领域需要解决治疗、缓和、预防和/或减轻发现与骨、关节、韧带和/或肌腱的疾病、状况或病症(尤其是与Modic改变或骨水肿相关的那些)同时发生的疼痛的方式。本发明提供了利奈唑胺制剂来满足该需求。利奈唑胺是一种抗生素，用于治疗对其他抗生素具有抗性的革兰氏阳性细菌引起的感染。对利奈唑胺有抗性的痤疮丙酸杆菌临床分离株(MIC>4μg/ml)尚无广泛报道。利奈唑胺制剂将利奈唑胺有效递送至患病的盘和椎骨，因此改善了Modic改变和CLBP的治疗功效。

发明内容

本发明提供了适合将利奈唑胺递送到受感染的脊椎部位的可注射制剂，其用于治疗、预防、改善和/或减轻与骨、关节、韧带或肌腱的临床状况同时发生的一种或多种类型的疼痛或表型表现。还提供了试剂盒、包装以及生产和使用它们的方法。

根据本发明，将利奈唑胺制剂制成混悬物，其响应于温暖的体温原位形成水凝胶。本发明的制剂是热敏性的和可注射的。

在一些实施方案中，本发明的制剂包含有效量的利奈唑胺。在一些方面，利奈唑胺是利奈唑胺II型，其被制备为制剂中的颗粒混悬物。可将利奈唑胺按最终制剂的重量或体积计以约1％至约20％、或优选约2.5％至约20％加载至递送运载体(即水凝胶)以形成混悬物。在一些实例中，混悬物制剂可以包含约25mg/ml、约30mg/ml、约35mg/ml、约40mg/ml、约45mg/ml、约50mg/ml、约55mg/ml、约60mg/ml、约65mg/ml、约70mg/ml、约75mg/ml、约80mg/ml、约85mg/ml、约90mg/ml、约95mg/ml、约100mg/ml、约150mg/ml、或约200mg/ml的利奈唑胺。

在一些实施方案中，本发明的利奈唑胺制剂包含泊洛沙姆作为递送运载体，其响应于温度升高而形成水凝胶。在某些方面，泊洛沙姆是泊洛沙姆407。本发明的利奈唑胺制剂可以包含泊洛沙姆407，其按制剂的重量计为约9.5％至约17％，或按制剂的重量计为约9.5％至约14.5％，或按制剂的重量计为约10.5％至约13.5％，或者在制剂中的浓度为约115mg/ml至约207mg/ml，或者在制剂中浓度为约130mg/ml至约165mg/ml。优选地，利奈唑胺制剂可以包含按制剂的重量计约10.8％至约12.8％或者在制剂中的浓度为约130mg/ml至156mg/ml的泊洛沙姆407。

在一些实施方案中，本发明的利奈唑胺制剂包含不透射线的染料。在一些方面，该物质是碘海醇。利奈唑胺制剂可以包含碘海醇，其按制剂的重量计为约14％至约59％，或按制剂的重量计为约约14％至约40％，或者在制剂中的浓度为约165mg/ml至约718mg/ml，或在制剂中的浓度为约200mg/ml至约450mg/ml。优选地，利奈唑胺制剂可以包含按制剂的重量计约17％至约30％或者在制剂中的浓度为约206mg/ml至364mg/ml的碘海醇。

在一个优选的实施方案中，利奈唑胺制剂包含按最终制剂的重量或体积计约2.5％至约20％的利奈唑胺II型和包含按制剂的重量计约10.8％至约12.8％的泊洛沙姆407和按制剂的重量计约17％至约30％的碘海醇的递送运载体(也称为稀释剂)。该制剂是利奈唑胺混悬物。利奈唑胺制剂是可注射的，并且具有约26℃至约36℃的溶胶-凝胶转变温度。

本发明的制剂可以在腰椎间盘和/或邻近的椎骨、韧带、肌肉、肌腱和关节中施加至有需要的受试者，并且该施加通过开放手术或通过注射或通过显微手术或经皮技术来进行。

在一些实施方案中，本发明提供了利奈唑胺制剂的生产和使用方法。在一些实例中，利奈唑胺制剂可以单独包装，包括一定剂量的利奈唑胺粉末以及包含具有优化浓度比的泊洛沙姆407和碘海醇的递送运载体溶液。可以通过在施用前混合利奈唑胺粉末和泊洛沙姆运载体来制备该混悬物。本发明中还提供了一种试剂盒，其包含本发明的组合物、运载体以及用于施用无菌可注射制剂的注射器和/或针。

附图简要说明

图1A描绘了微粉化后的利奈唑胺(II型)粒度分布。图1B是利奈唑胺II型在微粉化之前和之后的代表性图像。

图2是显示将针放置到相邻的盘中并注射0.1ml含碘海醇的制剂的图像。可以使用x射线或荧光检查成像观察注射的制剂的位置。

图3显示了在椎间盘内施用后从绵羊盘中回收的利奈唑胺的量。每个点显示基于3-4个盘的平均值和平均值的标准误差。

图4显示了与未经治疗的盘相比，从利奈唑胺治疗的盘中分离的细菌。

图5示出了利奈唑胺混悬物(PP353)通过预热的甘薯的可注射性(injectability)。

图6描述了利奈唑胺在施用PP353利奈唑胺混悬液的绵羊中的药代动力学。Y轴代表血浆利奈唑胺的浓度，单位为ng/ml。X轴表示时间，单位为小时。

发明详述

前面已经相当广泛地概述了本发明的特征和技术优点，以便可以更好地理解随后的本发明的详细描述。在下文中将描述本发明的附加特征和优点，其形成本发明权利要求的主题。本领域技术人员应该理解，所公开的概念和具体实施方案可以作为基础容易地用于修改或设计用于实施本发明的相同目的的其他结构。本领域技术人员还应该认识到，这种等同构造不脱离所附权利要求中所列的本发明的精神和范围。当结合附图考虑时，由以下描述将更好地理解被认为是本发明的特征(关于其组织和操作方法)的新颖特征，以及其他目的和优点。然而，应该清楚地理解，仅仅是为了说明和描述的目的提供每个附图，而其不旨在定义对本发明的限制。

本发明是基于人体研究中的发现：慢性下背疼痛(CLBP)通常与Modic改变和其中观察到细菌感染的盘突出相关。因此，开发了包含针对引起Modic改变和CLBP的细菌感染的抗生素的药物组合物和制剂。这些制剂和方法可用于治疗、预防、改善和/或减轻发现与骨、关节、韧带和/或肌腱的疾病、状况或病症同时发生的一种或多种类型的疼痛或表型表现，尤其是其中与由细菌感染引起的Modic改变或骨水肿有关。

疼痛的类型可以包括但不限于急性疼痛、亚急性疼痛、慢性或持续疼痛、局部疼痛、根性疼痛、牵涉性疼痛、躯体疼痛、放射性疼痛、神经病理性疼痛、炎性疼痛和混合性或非特定性来源的疼痛。疼痛可能存在于身体的各个部位，包括四肢、肌肉、皮肤、关节、深层组织或器官或脊椎(包括颈椎、胸椎、腰椎或骶椎)。

定义为任何外在表现的表型表现无论是否被受试者感知或经历，可以包括但不限于任何类型的疼痛，通常是由于疼痛导致的夜间睡眠不安、Valsalva动作期间的疼痛、腰椎主动屈曲期间的疼痛、腰椎主动伸展期间的疼痛、正颅压缩试验、弹跳试验期间的疼痛、床上翻身困难、离开座椅困难、上楼梯困难、弯腰或跪下困难和长时间站立或走路困难。

与疼痛同时发生的骨、关节、韧带和/或肌腱的疾病、状况或病症包括但不限于：Modic改变、骨水肿、腰椎间盘突出症、肌腱炎、肌腱断裂、韧带炎症、韧带断裂、耻骨联合分离(symeysiolysis)、骨盆带综合症和Scheuermann病。

疼痛或表型表现可能是(1)由疾病、状况或病症引起，(2)与疾病、状况或病症同时发生，(3)存在于疾病、状况或病症部位或其附近，或(4)前述的任何组合。引起下背疼痛(LBP)的疾病的实例包括关节炎、弥漫性特发性骨肥厚(DISH或Forestier病)、坐骨神经痛、退行性盘疾病、腰椎管狭窄、腰椎滑脱(spondylolisthesis)、椎间盘突出症、脊柱侧凸(scoliosis)、神经根病、关节功能障碍、尾骨痛、子宫内膜异位症和骨质疏松症。

本发明涉及利奈唑胺组合物和制剂，其将有效量的利奈唑胺局部递送至(一个或多个)患病部位或紧邻需要治疗的(一个或多个)部位的区域。利奈唑胺配制在热敏性泊洛沙姆运载体中，形成响应于温度变化的可降解的凝胶。这些在室温下为水溶液的热敏性载体在体温下原位形成凝胶，并将所携带的利奈唑胺释放到(一个或多个)靶部位。制剂的凝胶化特性可以避免活性药物从注射部位泄漏，因此，增加了靶部位的活性药物的量。

I.利奈唑胺制剂

本发明的药物组合物和制剂包含利奈唑胺作为活性药物成分(API)与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂的组合，以治疗、预防、改善或减轻疼痛。本发明的利奈唑胺组合物和制剂可以任选地包含一种或多种另外的活性物质，例如治疗和/或预防性活性物质。在一些实例中，组合物可以包含至少另一种抗炎剂或另一种抗感染剂等。

特别地，利奈唑胺制剂可以用于将本文所述的抗生素组合物施用于(一个或多个)患病部位，以治疗、预防、改善或减轻下背疼痛并同时消除颈椎、胸椎、腰椎或骶椎的细菌感染。

本文所述的制剂可以通过药理学领域中已知的或以后开发的任何方法来制备。药剂的配制和/或生产中的一般考虑因素可以例如参见Remington:The Science andPractice of Pharmacy 21st ed.,Lippincott Williams&Wilkins,2005(其内容通过引用整体并入本文)。通常，这些制备方法包括使活性成分与赋形剂、稀释剂和/或一种或多种其他辅助成分结合的步骤，然后，如果必要和/或需要，将产品分开、成形和/或包装成期望的单剂量或多剂量单位。

根据本发明的药物制剂可以作为单一单位剂量和/或作为多个单一单位剂量批量制备、包装和/或批发。如本文所用，“单位剂量”是离散量的包含预定量的活性成分的药物组合物。活性成分的量通常等于施用于受试者的活性成分的剂量和/或这种剂量的方便分数，例如这种剂量的一半或三分之一。

本发明的利奈唑胺制剂可以包含在递送运载体中配制的治疗有效量的利奈唑胺，所述递送运载体包含热敏性泊洛沙姆水凝胶和非离子型造影剂碘海醇。包含泊洛沙姆和碘海醇的递送运载体在低于26℃时是水溶液，并且在较高的温度(例如，比较接近于体温的温度)下凝胶化。任选地，也可以向制剂添加一种或多种药学上可接受的赋形剂。在根据本发明的药物组合物中活性成分(即利奈唑胺)、药学上可接受的赋形剂和/或任何另外成分的相对量将根据所治疗的受试者的身份、大小和/或状况并还根据组合物的施用途径而变化。

该制剂可以是可注射的。可注射的药物组合物被配制成注射到受试者的解剖结构，包括但不限于椎间盘、椎间隙、关节内隙、韧带、肌腱、肌腱和骨的连接处、关节、硬膜外腔、椎间小关节、邻近骨水肿的部位或其他脊椎腔室。在一个优选的实施方案中，可注射的利奈唑胺制剂可用于将API递送到椎间盘和/或椎间盘间隙中。可注射制剂包含至少一种聚合物，其形成溶液但在体温下凝胶化。热敏性水凝胶将负载的抗生素携带到注射部位，其中抗生素有效抵抗感染。本发明的凝胶制剂可以在注射的地方保持足够长的时间，以使抗生素扩散到盘组织中，从而避免抗生素从注射区域泄漏。该特征在受损的盘中特别有益，在受损的盘中当注射针被抽出时，相当一部分的流体施用可能快速地从该盘中漏出。

在一些实施方案中，利奈唑胺组合物和制剂施用于人、人类患者或非人类受试者。例如，可以将制剂施用于患有下背疼痛的患者或有发生下背疼痛的风险的患者。在一些实施方案中，向其施用治疗组合物的受试者在骨、关节、韧带或肌腱处或附近遭受疼痛或有发生疼痛的风险。

活性成分-利奈唑胺

如背景技术中所述，慢性下背疼痛通常与腰椎间盘突出后的Modic改变密切相关。由于经常在突出的腰椎间盘的核组织中观察到厌氧细菌，因此用于治疗与Modic改变相关的疼痛的药物组合物可以包含至少一种抗生素作为杀死或抑制一种或多种目标细菌的活性成分。

活性剂的选择可以取决于从Modic盘中分离的细菌病原体。从Modic盘中最经常分离的细菌病原体是葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)和痤疮丙酸杆菌。抗生素耐药性在全世界不同的人群和地区中是变化的。为了具有稳健且广泛有效的治疗，优选覆盖痤疮丙酸杆菌和葡萄球菌属或者至少仅痤疮丙酸杆菌的常见耐药性。优选地，考虑到在与Modic相关的感染部位分离的病原体的耐药性谱，可以选择对来自任何感染部位的当前临床分离株有效的抗生素作为本发明的组合物和制剂的活性剂。

例如，本发明的药物制剂可以包含用于治疗葡萄球菌属和痤疮丙酸杆菌的活性剂，葡萄球菌属和痤疮丙酸杆菌是从Modic盘中最经常分离的细菌病原体。在一些方面，本发明的药物制剂可以包含至少一种抗生素，其用于治疗引起大多数所研究的感染的痤疮丙酸杆菌感染，约38％为Modic 1型患者。来自多个分别用于痤疮丙酸杆菌和葡萄球菌属的潜在抗菌治疗的现有治疗的证据识别了对至少一种病原体有效的几种抗生素。根据本发明，可以选择对痤疮丙酸杆菌和葡萄球菌都有效的抗生素作为本发明组合物和制剂的活性剂。在一些实施方案中，可以选择对痤疮丙酸杆菌和葡萄球菌都有效的抗生素的组合。

在一个优选的实施方案中，抗生素是利奈唑胺。利奈唑胺是第一种临床使用的抵抗导致疾病的大多数革兰氏阳性细菌(包括链球菌(streptococci)、耐万古霉素肠球菌(vancomycin-resistant enterococci，VRE)和耐甲氧西林金黃葡萄球菌(MRSA))的唑烷酮(Gaudin等人,Eur J Clin Microbiol Infect Dis.2013,32(2):195-198)。它已被成功地用于治疗患有心内膜炎和菌血症、骨髓炎、骨和关节感染和结核病的患者，并且它经常用于在其他疗法失败时治疗并发感染(Gautier等人,JM.J Biomater Appl.2012,26(7):811-828；Tsiolis等人,Surg Infect(Larchmt).2011,12(2):131-135)。长期使用(例如，超过2周)利奈唑胺可能导致严重的副作用((Falagas等人,Int.J Antimic Agents,2007,29(3):233-239)。利奈唑胺吸收良好，健康志愿者的生物利用度约为100％。利奈唑胺可以相对快速地渗透到组织中，以达到4mg/L的MIC。它还可以渗透到椎间盘和周围组织(Komatsu等人,Eur Spine J.2010,19(12):2149–2155)。较高的利奈唑胺成功率可能发生在AUC：MIC值为80-120并且当在整个给药间隔内，浓度维持高于该MIC(Dryden,J.Antimicrob.Chemother.2011,66(suppl 4):iv7-iv15的综述)。

根据本发明，选择利奈唑胺作为活性成分，并将其配制为将药学有效量的利奈唑胺递送至需要的受试者的靶部位。至少部分地基于目标细菌、施用方式和其他决定因素提供有效量的组合物。通常，有效量的组合物有效杀死或抑制目标细菌，并减少需要的受试者的疼痛或发生疼痛的风险。

在一些实施方案中，利奈唑胺的有效剂量水平高于目标细菌的最小抑制浓度(MIC)。目标细菌是厌氧细菌，如痤疮丙酸杆菌、丙酸棒状杆菌(Corynebacteriumpropinquum)或葡萄球菌属的那些。

通过在不同条件下使用有机溶剂重结晶，可以获得利奈唑胺的不同晶体修饰物(多晶型物)。可以选择利奈唑胺的几种多晶型物作为本发明制剂的活性成分。例如，利奈唑胺可以是利奈唑胺I型(例如，美国专利号6,444,813)，或II型(例如，美国专利号6,559,305)，或III型(例如，美国专利号7,718,799；美国专利公开号2007/0104785)或IV型(例如美国专利公开号2008/0319191)，或如PCT申请公开号WO2007/026369、WO2006/110155和WO2014/013498；和美国专利公开号2017/0008919中记载的其他晶型；这些文献中的每一个的内容通过引用整体并入本文。如美国专利号6,559,305中详细说明的，利奈唑胺((S)-N-[[3-[3-氟-4-(4-吗啉基)苯基]-2-氧代-5-唑烷基]甲基]乙酰胺)II型的特征可以在于粉末X射线衍射光谱，其具有以下峰：

如美国专利号6,559,305中所详细说明的，利奈唑胺((S)-N-[[3-[3-氟-4-(4-吗啉基)苯基]-2-氧代-5-唑烷基]甲基]乙酰胺)II型的特征还在于作为矿物油研磨物(mull)的红外(IR)光谱，具有以下峰：3364、1748、1675、1537、1517、1445、1410、1401、1358、1329、1287、1274、1253、1237、1221、1145、1130、1123、1116、1078、1066、1049、907、852和758cm^-1。

在一个实施方案中，选择利奈唑胺II型作为本发明制剂的活性成分。可以将利奈唑胺II型研磨成小颗粒，并在低温或室温下均匀分散在泊洛沙姆溶液中。分散的利奈唑胺II型颗粒在泊洛沙姆溶液中形成混悬物。

根据本发明，可将利奈唑胺颗粒灭菌以制备无菌可注射制剂。利奈唑胺可以通过本领域已知的任何方法(例如干热或蒸汽)灭菌。在一个优选的实施方案中，利奈唑胺颗粒可以通过γ辐照灭菌。

伴随(或组合给予的药物)药物可以与本发明的活性成分一起施用。在某些实施方案中，还施用抗炎药，如阿司匹林、布洛芬、酮洛芬、萘普生、cefacoxib、罗非昔布、帕瑞昔布、塞来昔布、伐地昔布和吲哚美辛。在某些实施方案中，还施用疼痛缓解药物，如对乙酰氨基酚、吗啡、羟考酮和可待因。伴随药物还可以包括非处方疼痛缓解贴剂、药物和/或软膏。

递送运载体-热敏性水凝胶

可以将本发明的活性成分(即利奈唑胺)掺入到递送运载体中，以施用于需要的受试者。递送运载体可以适用于注射。例如，递送运载体可以是水性溶液、低粘度溶液、混悬物或可逆热凝胶。运载体优选是可生物降解和生物相容的载体。如本文所用，术语“生物相容的”是指载体对组织和细胞无毒。如本文所用，术语“可生物降解的”和“生物可吸收的”可互换使用。本发明上下文中，生物降解或生物吸收是指在释放配制的治疗性活性成分后，在生物环境中通过活生物体的作用并且更特别是在生理pH和温度下，递送材料的降解、分解、消化或消失。具体反应包括但不限于化学或酶促降解。

根据本发明，在利奈唑胺递送中使用具有大约或低于生理温度的溶液-凝胶转变温度的热敏性水凝胶生物材料，尤其是可注射的热敏性水凝胶。包含利奈唑胺的水性混悬物在室温下形成，但是在体内注射后，能在体温下转变成非流动/硬质凝胶。经过数小时或数天，凝胶分解(即可生物降解的)。改变制剂中组分的浓度可允许性质的微调，如凝胶形成时的温度或凝胶的降解速率。

1.泊洛沙姆

热敏性水凝胶可以由合成聚合物、天然聚合物或其组合制成。在凝胶化之前，可以将药剂(例如利奈唑胺)和适当的载体在体外与聚合物溶液混合，并且在体内施用后，能原位形成载药水凝胶。

在一些实施方案中，热敏水凝胶可以由合成聚合物形成。合成聚合物可以包括但不限于聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)(PEO-PPO-PPO)三嵌段共聚物(也称为或/>)及其衍生物、基于聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAM)的共聚物及其衍生物、聚(有机膦腈)和聚(乙二醇)(PEG)/可生物降解的聚酯共聚物。

或/>是FDA批准的热敏性合成聚合物。泊洛沙姆是非离子三嵌段共聚物，由聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))的中心疏水链和侧翼为两个聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))的亲水链组成。生物相容的泊洛沙姆已广泛用于药物递送和组织工程。基于泊洛沙姆的水凝胶通过调节PEO和PPO的组成以及总分子量和浓度，在某些生理温度和pH下允许可逆凝胶化。已经用于药物递送的泊洛沙姆包括但不限于/>188(/>F-68、FLOCOR或RheothRx)、/>237(/>F87)、/>238(/>F-88)、/>F-98、/>124(/>L-44)、/> 184(L-64)、338(/>F-108)、/>401(/>L-121)和/>407(/>F-127)。一些所选的泊洛沙姆的物理化学特性和凝胶形成性质可以参见美国专利号5,702,717的表1；其内容通过引用整体并入本文。

407(也称为/>F-127、Kolliphor 407和SynperonicPE/F127)是嵌段共聚物中毒性最小的一种，并且已广泛用作药物递送系统。在纯度为20％(w/w)的浓度下，/>407在室温(～25℃)或低于室温在水性溶液中是液体，但在体温(37℃)下形成软凝胶。/> 407由按重量计约70％PEO(聚乙二醇)和30％PPO(聚环氧丙烷)组成的三嵌段共聚物，平均分子量为11500。与其他泊洛沙姆一样，/> 407表现出热可逆的凝胶化行为。/>407已用于递送许多药物、蛋白质和基因，如Gong等人所综述的(Curr.Med.Chem.2013,20,79-94；其内容通过引用整体并入本文)。

在一些实施方案中，热敏性水凝胶可以由天然聚合物形成，所述天然聚合物包括具有改进的热响应凝胶化行为的改性聚合物。可以用于形成热敏性水凝胶的天然聚合物包括但不限于壳聚糖和相关衍生物、甲基纤维素、藻酸盐、透明质酸、葡聚糖和木葡聚糖。

2.非离子型造影剂-碘海醇

虽然先前的研究表明泊洛沙姆包埋的抗生素(包括万古霉素和利奈唑胺)能用于受控和持续地释放抗生素以增加其抑制细菌增殖的有效性(Veyries等人,Int.J.Pharm.,1999,192(2):183-193；Veyries等人,Antimicrob Agents Chemother.,2000,44(4):1093-1096；Kalorewicz等人,Polim.Med,2011,41(4)3-15；和Lee等人,J Control Release,2004,96(1):1-7)，这些先前的研究都没有研究添加其他药剂的影响。例如，在注射和其他疼痛程序(例如椎间盘造影)期间，不透射线的造影剂常作为指引以确认针尖的放置。造影剂如碘海醇(商标名：Omnipaque)中的碘含量能阻断X射线的渗透，并使注射部位在荧光检查或X射线下可视。碘海醇是分子量为821.1的三碘化分子(46.3％的碘含量)。最常用的碘海醇试剂Omnipaque具有不同的碘浓度，例如，Omnipaque 140含有302mg碘海醇，相当于每mL 140mg有机碘；Omnipaque 180含有388mg碘海醇，相当于每mL 180mg有机碘；Omnipaque240含有518mg碘海醇，相当于每mL 240mg有机碘；Omnipaque 300含有647mg碘海醇，相当于每mL 300mg有机碘；以及Omnipaque 350含有755mg碘海醇，相当于每mL 350mg有机碘。

根据本发明，含泊洛沙姆的运载体可以进一步包含放射性造影剂如碘海醇以利于将利奈唑胺制剂施加至目标疾病部位，例如椎间盘。在本发明抗生素制剂中添加放射性照影剂将有助于临床从业者(如医生)看到所施用的产品，并使用荧光检查监测被施用的盘的状况。这种实时信息可以帮助从业者决定何时停止注射，此时盘充满并且开始泄漏。

在本发明中进行的实验表明，将碘海醇添加到利奈唑胺制剂中增加组合物的射线照相可视性，以监测其向患病部位的递送(例如，如图2所示)。还发现在递送运载体中碘海醇和泊洛沙姆407的浓度需要优化以实现本发明的热敏性水凝胶制剂的溶液到凝胶转变的目标温度范围(参见实施例5)。泊洛沙姆和碘海醇在水凝胶中的相互作用影响利奈唑胺制剂的转变温度。

在一些实施方案中，可以在添加利奈唑胺以形成利奈唑胺制剂(即利奈唑胺混悬物)之前，将包含泊洛沙姆407和碘海醇的递送运载体制备成单独的溶液。将泊洛沙姆和碘海醇的浓度优化到一定范围，以使溶液的凝胶化温度在体温或接近体温时达到最佳。

本发明还提供了用于药物递送的热敏性水凝胶。在一些实施方案中，运载体可以包含泊洛沙姆作为药学上可接受的生物可降解和生物相容的聚合物，其响应于温度升高而形成水凝胶。在一些方面，递送运载体包含泊洛沙姆407，其按递送运载体的重量计为约10％至约17％或按运载体的体积计浓度为约121mg/ml至约207mg/ml。优选地，其可以包含泊洛沙姆407，其按运载体的重量计为约11.5％至约13.5％或在运载体中的浓度为约140mg/ml至165mg/ml。在其他实施方案中，递送运载体还包含不透射线的染料。在一些方面，运载体包含碘海醇，其按运载体的重量计为约14.5％至约62.5％或在运载体中的浓度为约174mg/ml至约755mg/ml。优选地，递送运载体可以包含碘海醇，其按运载体的重量计为约18％至约35％，或在运载体中的浓度为约206mg/ml至425mg/ml。

本领域技术人员可以知道，除了形成本发明的利奈唑胺混悬物外，本文所述的递送运载体还能用于递送任何药物，例如来自β-内酰胺类抗生素种类的抗生素(例如青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类和单环内酰胺类)、唑烷酮类、氨基糖苷类、糖肽类、脂肽类和甘氨酰环素类。

根据本发明，泊洛沙姆水凝胶溶液可以在较低的温度下制备，包括以下步骤：(1)通过将碘海醇加入到包含氨丁三醇和EDTA钙二钠的溶液(pH为约8.0)中来制备冷的碘海醇溶液；和(2)将泊洛沙姆407粉末缓慢地加入到冷的碘海醇溶液中，并搅拌该溶液直至泊洛沙姆粉末完全溶解，其中分份添加泊洛沙姆粉末。泊洛沙姆-碘海醇溶液可以进行灭菌并包装到单独的小瓶中。

其他载体和赋形剂

本发明的利奈唑胺制剂可以进一步包含适合于所需特定剂型的一种或多种药学上可接受的赋形剂。用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于制备组合物的技术是本领域已知的(参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,A.R.Gennaro,Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006；其通过引用并入本文)。常规赋形剂介质的使用可以预期在本公开的范围内，除了任何常规赋形剂介质可能与物质或其衍生物不相容的情况，如通过产生任何不期望的生物效应或其他以有害的方式与药物组合物的任何其他(一种或多种)组分相互作用。

在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂可以是至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％纯。在一些实施方案中，赋形剂可以批准用于人类和兽医用途。在一些实施方案中，赋形剂可以被美国食品和药物管理局批准。在一些实施方案中，赋形剂可以是药品级的。在一些实施方案中，赋形剂可以符合美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药典的标准。

在一些实施方案中，本发明的制剂可以进一步包含螯合剂和缓冲剂。示例性螯合剂包括乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸一水合物、依地酸二钠、依地酸钙二钠、依地酸二钾、依地酸、富马酸、苹果酸、磷酸、依地酸钠、酒石酸和/或依地酸三钠。在一个实例中，该剂可以是EDTA的盐。

示例性缓冲剂包括但不限于柠檬酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、氯化铵、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙、葡萄糖酸钙、d-葡萄糖酸、甘油磷酸钙、乳酸钙、丙酸、乙酰丙酸钙、戊酸、磷酸氢钙、磷酸、磷酸三钙、氢氧化磷酸钙、乙酸钾、氯化钾、葡萄糖酸钾、钾混合物、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸钾混合物、乙酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、柠檬酸钠、乳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钠混合物、氨丁三醇、氢氧化镁、氢氧化铝、海藻酸、无热原水、等渗盐水、林格氏溶液、乙醇等，和/或它们的组合。在一个实施方案中，缓冲剂可以是氨丁三醇。

利奈唑胺制剂

本发明的利奈唑胺制剂包含负载有效量的利奈唑胺的热敏性泊洛沙姆水凝胶、对于泊洛沙姆溶液向凝胶转变而言是最佳的浓度的非离子型造影剂碘海醇、以及任选地一种或多种药学上可接受的赋形剂。

在一些实施方案中，利奈唑胺可以制备成在包含泊洛沙姆和碘海醇的递送运载体中的混悬物。在一个优选的实施方案中，API(即利奈唑胺)是利奈唑胺II型，将其研磨以形成小颗粒并通过γ辐照灭菌，并在泊洛沙姆-碘海醇运载体中形成混悬物。

在一些实施方案中，本发明的制剂包含浓度范围按组合物(即利奈唑胺混悬物)的重量或体积计为约1％至50％的利奈唑胺。在一些方面，按组合物的重量或体积计，其可以负载约1％至约20％，或约2.5％至约20％或约2.5％至约10％，或约3.0％至约10％。在一个方面，利奈唑胺制剂可以包含按最终组合物(例如混悬物)重量计约2.5％、5％、7.5％、10％、12.5％、15％、17.5％或20％的利奈唑胺。利奈唑胺可以以约10mg/ml至约200mg/ml、或约20mg/ml至约200mg/ml、或约50mg/ml至约200mg/ml的浓度存在于制剂中。特别地，利奈唑胺可以以10mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml、50mg/ml、55mg/ml、60mg/ml、65mg/ml、70mg/ml、75mg/ml、80mg/ml、85mg/ml、90mg/ml、100mg/ml、150mg/ml或200mg/ml的浓度存在于制剂中。

在一些实施方案中，本发明的制剂包含泊洛沙姆作为药学上可接受的可生物降解和生物相容的聚合物，其响应于温度升高而形成水凝胶。在一些方面，泊洛沙姆是泊洛沙姆407。本发明的利奈唑胺制剂可以包含按制剂的重量计约9.5％至约17％或按制剂的重量计约9.5％至约14.5％或者在制剂中的浓度为约115mg/ml至约207mg/ml或浓度为约115mg/ml至约173mg/ml的泊洛沙姆407。优选地，利奈唑胺制剂可以包含按制剂的重量计约10.8％至约12.8％或者在制剂中的浓度为约130mg/ml至156mg/ml的泊洛沙姆407。

本发明的药物制剂进一步包含非离子型造影剂。举例来说，根据本发明的药物制剂每毫升制剂溶液可以包含约30mg至约600mg碘，优选每毫升制剂溶液包含约50mg至约300mg或约75mg至约200mg碘。

在某些方面，该剂是碘海醇。药物组合物可以包含按制剂的重量计约14％至约59％或者在制剂中的浓度为约165mg/ml至约718mg/ml的碘海醇。优选地，利奈唑胺制剂可以包含按制剂的重量计约17％至约30％或者在制剂中浓度为约206mg/ml至364mg/ml的碘海醇。

本领域技术人员已知的其他表面活性剂、溶剂或共溶剂也可以用于本发明范围内的一些实施方案。

在一些实施方案中，本发明的利奈唑胺制剂包含按制剂的重量计(w/w)约1％至约20％的利奈唑胺、按制剂的重量计(w/w)约9.5％至约17％的泊洛沙姆407、和按制剂的重量计(w/w)约14％至59％的碘海醇。在一个优选的实施方案中，利奈唑胺制剂包含约5％w/w的利奈唑胺、约11.8％w/w的泊洛沙姆和约27.2％w/w的碘海醇。在一些实例中，水性制剂可以在约26℃、或约27℃、或约28℃、或约30℃、或约31℃、或约32℃、或约33℃、或约34℃、或约35℃、或约36℃、或约37℃下凝胶化。在一个非限制性实例中，利奈唑胺制剂在约28℃下凝胶化。利奈唑胺可从硬凝胶中扩散。几天后，凝胶分解。改变制剂中组分(例如碘海醇和泊洛沙姆407)的浓度可允许微调凝胶的性质，如溶液至凝胶转变温度。

在一些实施方案中，所述制剂可以通过包括以下步骤的方法制备：(a)研磨利奈唑胺II型粉末以形成小的利奈唑胺颗粒；(b)制备步骤(a)的利奈唑胺颗粒单位，并对该制剂进行灭菌；(c)制备包含泊洛沙姆407和碘海醇的递送运载体；以及(d)将步骤(b)的所述利奈唑胺颗粒悬浮在步骤(c)的递送运载体中以形成稳定且均匀的混悬物。

可以在低温下将热凝胶泊洛沙姆溶解在适当体积的水性溶液中，并根据递送运载体的凝胶化特征优化泊洛沙姆和碘海醇的浓度。

可以使用干式空气喷射研磨或任何其他研磨方法研磨利奈唑胺、特别是利奈唑胺II型以形成小颗粒。得到的利奈唑胺粉末可以通过干热和/或γ辐照进一步灭菌。

在一些实施方案中，利奈唑胺颗粒和泊洛沙姆/碘海醇递送运载体可以单独制备和包装，例如，在两个单独的小瓶中。可以在施用前将两种制剂混合以形成利奈唑胺混悬物。在应用之前，将利奈唑胺粉末和运载体混合以形成均匀的混悬物。可以将抗生素混悬物放入注射器中并制备成具有预期的剂量体积。在一个实例中，可以在小瓶中提供约253mg利奈唑胺粉末，并且可以在另一个小瓶中制备约7ml的包含泊洛沙姆和碘海醇的递送运载体。可以以约3.8至约5.8ml或约4.6ml至约5.0ml的体积提供递送运载体。

可注射制剂可以例如通过细菌截留滤器过滤、通过辐照、通过蒸汽灭菌和/或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌，所述灭菌固体组合物在使用前可以溶解或分散在无菌水或其他无菌可注射介质中。

在一些实施方案中，可以使用针将本发明的热敏性水凝胶制剂施用于患病部位。热凝胶在室温下的水溶性特征和水性溶液的相对低粘度使得使用小孔针成为可能。这种可注射制剂可以用小尺寸针有效地施用于患者而不显示预凝胶化。

II.施用和给药

本发明的利奈唑胺组合物可以通过任何得到治疗有效结果的途径施用。在一个优选的实施方案中，该制剂适合用于注射。产生局部有效水平的利奈唑胺(高于目标细菌的MIC)的可注射施用具有有益的结果(例如，疼痛缓解)。

可注射施用将降低全身性副作用的水平，增加患者对给药方案的依从性并且在较小的抗生素剂量下增加在作用部位的功效。优点可以包括相对容易应用，用于在体内位点特异性作用的局部递送，降低给药频率而不损害治疗的有效性，增加剂量依从性等。

出于便于施用和剂量均匀性，根据本发明的药物组合物通常以剂量单位形式配制。然而，应该理解，本发明的药物组合物的施用将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。

根据本发明，可以以足以将总剂量为5mg至450mg的利奈唑胺递送至椎间盘的剂量水平施用药物制剂，以获得所需的治疗效果。在一些实施方案中，组合物可以递送约50mg至约200mg的利奈唑胺以获得所需的治疗效果。在一些实施方案中，总剂量为约10mg至约100mg的利奈唑胺，或约10mg至约200mg的利奈唑胺，或约20mg至约200mg、或约50mg至约200mg的利奈唑胺。在一些实例中，所述制剂可以递送总剂量为50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、110mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg或200mg的利奈唑胺。在一些实施方案中，基于受感染的盘确定剂量水平。例如，对于每个受感染的盘，剂量范围可以为5mg至450mg，例如，对于每个受感染的盘剂量为5mg，或者对于每个受感染的盘剂量为10mg，或者对于每个受感染的盘剂量为15mg，或者对于每个受感染的盘剂量为20mg，或者对于每个受感染的盘剂量为50mg，或者对于每个受感染的盘剂量为100mg，或者对于每个受感染的盘剂量为150mg，或者对于每个受感染的盘剂量为200mg，或者对于每个受感染的盘剂量为250mg，或者对于每个受感染的盘剂量为300mg，或者对于每个受感染的盘剂量为350mg，或者对于每个受感染的盘剂量为400mg，或者对于每个受感染的盘对于每个受感染的盘剂量为450mg。在一个优选的实施方案中，对于每个受感染的盘，利奈唑胺的有效量为约50mg至约200mg。

作为非限制性实例，本发明的利奈唑胺混悬物可以以约0.1ml至约4.0ml的体积范围施用，例如0.1ml、或0.3ml、或0.5ml、或1.0ml、或1.2ml、或1.5ml、或2.0ml、或2.5ml、或3.0ml、或3.5ml、或4.0ml、或4.5ml、或5.0ml，以达到预期的用于每个受感染的盘的利奈唑胺总剂量。

在一些实施方案中，使用单次施用(例如单次注射)将所需剂量的利奈唑胺递送至受感染的盘。在其他实施方案中，可以使用多次施用以获得期望的治疗效果。作为非限制性实例，在前一次给药之后2天或5天或10天或2周或3周或1个月施用第二次给药，可能第三次给药。

在一些实施方案中，本发明的制剂可以通过单次注射或者通过在多于一个部位的多次注射在骨、关节、韧带和肌腱处或其附近施用于需要的受试者。例如，利奈唑胺制剂可以从脊柱的同一侧或从脊柱的两侧注射到多个椎间盘中。在其他实例中，可以将本发明的制剂和组合物注射到椎间盘和椎间盘间隙中。

III.试剂盒、针和装置

根据本发明，还提供了包含本发明的利奈唑胺制剂的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒可以包含一个或多个剂量单位的利奈唑胺粉末；以及含有泊洛沙姆和碘海醇的水凝胶运载体，其中利奈唑胺粉末和水凝胶运载体可以混合形成利奈唑胺混悬物供使用。

预期将本领域已知的用于向细胞、器官和组织多次施用的方法和装置与本文公开的方法和组合物一起使用，作为本发明的实施方案。这些包括例如具有多个针的那些方法和装置、采用例如管腔或导管的混合装置以及利用热、电流或辐射驱动机构的装置。

可以使用施用装置根据本文教导的单次、多次或分次给药方案递送本发明的包含至少一种抗生素的药物组合物。根据本发明，这些多次施用装置可以用于递送在本文考虑的制剂中加载的单剂量、多剂量或分剂量的抗生素。

在一些实施方案中，Mckay等人已经描述了用于递送药剂的装置，并且例如在PCT专利公开号WO2006/118804中教导，其内容通过引用整体并入本文。根据Mckay，在每个针头上具有多个孔的多个针被并入到装置中以便于区域递送到组织，如脊椎盘的内部盘间隙。

使用针的注射器可以用于施用本发明的药物制剂。在一些情况下，针尖可以专用于特定的注射目的，例如脊椎注射。用于脊椎注射的注射器可以将针放置在脊椎的结构或间隙中。针可以具有来自Quincke babcock、Sprotte、Whitacre、Greene、Pitkin和Tuohy的任何类型的斜面。针的杆可以是直的或弯曲的，并且具有适合于将药物放置在脊椎中的特定位置的一定长度。例如，注射器和针可以如美国专利号5,628,734；6,500,153；7,367,961；和8,112,159中所公开的那样设计；其各自内容通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，用于施用本发明的药物制剂的注射器和针可以含有配置用于原位混合药物制剂组分的特殊结构。注射器可以包括一个、两个或更多个单独的腔室，药物制剂的组分分别储存在其中并刚好在注射之前混合。

定义

活性药物成分(API)：如本文所用，术语“活性药物成分(API)”是指具有生物活性的药剂。例如，一种物质在施用于生物体时对该生物体具有生物学作用，则该物质被认为具有生物活性。根据本发明，API是利奈唑胺。

生物相容的：如本文所用，术语“生物相容的”意指与活细胞、组织、器官或系统相容，引起很小的损伤、毒性或被免疫系统排斥的风险或没有风险。

可生物降解的：如本文所用，术语“可生物降解的”意指能够通过活物的作用分解成无害产品。

制剂：如本文所用，“制剂”包括至少一种活性成分和递送剂。

水凝胶：如本文所用，术语“水凝胶”被视为聚合物链的水不溶的、交联的三维网络加上填充在聚合物链之间的空隙的水。交联促进水不溶性并提供所需的机械强度和物理完整性。水凝胶主要是水(水的质量分数远大于聚合物的质量分数)。水凝胶保持大量水的能力意味着聚合物链必须具有至少中等的亲水特性。

患者：如本文所用，术语“患者”是指可能寻求或需要治疗、要求治疗、正在接受治疗、将接受治疗的受试者，或针对特定疾病或状况受到经过培训的专业人员护理的受试者。

药物组合物：如本文所用，短语“药物组合物”是指改变疾病、病症和/或状况的病因的组合物。

药学上可接受的：如本文所用，短语“药学上可接受的”在本文中用于指在合理的医学判断范围内适合用于与人类和动物的组织接触而没有过多毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

药学上可接受的赋形剂：如本文所用，短语“药学上可接受的赋形剂”是指除本文所述的化合物之外的任何成分(例如，能够悬浮或溶解活性化合物的运载体)并且在患者体内具有基本上无毒和非炎性的性质。

部位：如本文所用，术语“部位”当涉及骨水肿或Modic改变而使用时，意指骨水肿或Modic改变的部位本身或围绕骨水肿的所有方向0.5-1英寸的环境。

分剂量：如本文所用，“分剂量”是将单个单位剂量或总治疗剂量分成两个或更多个剂量。

治疗有效量：如本文所用，术语“治疗有效量”是指待递送的药剂(例如，抗生素、药物、治疗剂、诊断剂、预防剂等)的量，其当被施用于患有或易患疾病、病症和/或状况的受试者时，足以治疗疾病、病症和/或状况，改善疾病、病症和/或状况的症状，诊断疾病、病症和/或状况，预防疾病、病症和/或状况和/或延迟疾病、病症和/或状况的发作。

治疗有效结果：如本文所用，“治疗有效结果”是指待递送的药剂(例如，抗生素、药物、治疗剂、诊断剂、预防剂等)的量，其当被施用于患有或易患疾病、病症和/或状况的受试者时，足以治疗疾病、病症和/或状况，改善疾病、病症和/或状况的症状，诊断疾病、病症和/或状况，预防疾病、病症和/或状况和/或延迟疾病、病症和/或状况的发作。

总治疗剂量：如本文所用，“总治疗剂量”是治疗期给予或处方的量。其可以作为单一单位剂量施用。

治疗：如本文所用，术语“治疗”是指部分或完全缓和、改善、提高、缓解特定疾病、病症和/或状况，延迟其发作，抑制其进展，降低其严重度和/或减少其一种或多种症状或特征的发生率。出于降低发生与疾病、病症和/或状况相关的病理风险的目的，治疗可以施用于没有表现出疾病、病症和/或状况的体征的受试者和/或施用于仅表现出疾病、病症和/或状况的早期体征的受试者。

运载体(vehicle)：如本文所用，术语“运载体”和“递送运载体”可互换使用，其是指可用于携带活性成分(例如本发明的API)并将其递送至指定部位的任何物质、化合物或其组合。

等同和范围

本领域技术人员将认识到或者能够使用不超过常规的实验确定根据本文所述的发明的具体实施方案的许多等同方案。本发明的范围不限于以上描述，而是如所附权利要求中所述。

在权利要求中，诸如“一个/种(a/an)”和“所述”的冠词可以表示一个/种或多于一个/种，除非相反地指出或另外从上下文中明显可见。如果组成员中的一个、多于一个或所有成员存在于、用于给定产品或方法或以其他方式与给定产品或方法相关，则认为在组中的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述是满足的，除非相反地指出或另外从上下文中明显可见。本发明包括如下实施方案，其中该组的恰好一个成员存在于、用于给定产品或方法，或以其他方式与给定产品或方法相关。本发明包括如下实施方案，其中多于一个或全部组成员存在于、用于给定产品或方法，或以其他方式与给定产品或方法相关。

还应注意，术语“包含”旨在是开放式的并且允许但不要求包括另外的要素或步骤。当在本文中使用术语“包含”时，因此也包括和公开了术语“由......组成”。

在给出范围的情况下，包括端点。此外，应理解，除非相反地指出或另外从上下文和本领域技术人员的理解中明显可见，否则表示为范围的值可以采用在本发明的不同实施方案中陈述的范围内的任何特定值或子范围，达到范围下限单位的十分之一，除非上下文另有明确规定。

另外，应该理解，落入现有技术内的本发明的任何特定实施方案可以明确地从任何一个或多个权利要求中排除。由于这些实施方案被认为是本领域技术人员已知的，因此即使在此未明确阐述排除，也可排除它们。本发明的组合物的任何特定实施方案(例如，任何抗生素、治疗或活性成分；任何生产方法；任何使用方法等)可以出于任何原因从任何一个或多个权利要求中排除，无论是否与现有技术的存在有关。

应当理解，已经使用的词语是描述性词语而不是限制性词语，并且可以在所附权利要求的范围内进行改变而不脱离本发明的更广泛方面的真实范围和精神。

虽然已经相对于几个所描述的实施方案以一定的长度和某些特定性描述了本发明，但是并不意图将本发明限制于任何这样的细节或实施方案或任何特定的实施方案，而是应当参考所附权利要求解释，以相对于现有技术提供对这些权利要求的尽可能广泛的解释，并因此有效地涵盖本发明的预期范围。

实施例

实施例1：金黄色葡萄球菌盘内感染的绵羊模型

已经开发了金黄色葡萄球菌盘内感染的绵羊模型来测试抗生素制剂的体内功效。雄性Charollais或Suffolk杂交绵羊在研究开始时约35-40kg，根据1986年动物(科学程序)法案的内政部指南(Home Office guidelines under the Animals(ScientificProcedures)Act 1986)饲养，并且适应至少7天，并且提供稻草垫料和水。向它们饲喂不添加抗生素的绵羊浓缩饲料，并提供额外的草料(干草/稻草)。

1.1金黃色葡萄球菌感染

细菌接种物(ATCC 29213)由2.5×10⁶CFU/ml的冷冻的甘油/磷酸盐缓冲盐水储备液通过稀释至2×10⁴CFU/ml制备。

1.2制备用于注射的制剂

使用18G 1英寸或1.5英寸的针将0.2ml金黄色葡萄球菌混悬物或测试制剂吸入到1ml注射器中。必要时可以来回拉动注射器以去除气泡。然后，该针用25G 4.69英寸的施用针替换，并装填(primed)，留下0.05ml或0.1ml的剂量。如果不立即使用，将装填的注射器留在冰箱中，但应在30分钟内使用。

在治疗模型中，对每只绵羊进行麻醉。作为麻醉的一部分，向动物给予推荐剂量的美洛昔康形式的镇痛药(肌内)。如果指定的兽医认为必要，可以重复给予这种镇痛药。对每只绵羊在L1/L2、L2/L3、L3/L4和L4/5处给予4次0.05ml(目标体积)盘内注射金黄色葡萄球菌接种物(1x10³细胞/盘)，每盘注射一次。

在第一次注射后约1小时或在另一选定时间，向每只绵羊第二次注射利奈唑胺制剂或对照制剂。先前成功注射细菌的每个盘被给予0.1ml(目标体积)盘内注射。施用抗生素和细菌之间的时间可以是数小时、数天、数周或数月。

1.3注射技术：治疗性给药

共定位给药(Co-localised dosing)

将一个20G 3.5英寸的脊椎穿刺针直接定位到每个盘的髓核的边缘中。在确认针的定位之后，将用给药溶液装填的第二25G 4.69英寸的针插入到第一针中，并将尖端置于髓核的中间。在确认第二针的定位之后，每个盘用细菌注射。然后将内部针取出。正好在1小时给药细菌后时间点之前，将用给药溶液装填的新的25G 4.69英寸的针插入到该20G 3.5英寸中并定位到髓核中间。第二次治疗是在第一次给药后1小时通过该针给药。

离散给药(Discreet dosing)

细菌感染：将一个20G 3.5英寸的脊椎穿刺针直接定位到每个盘的髓核的边缘中。在确认针的定位之后，将用给药溶液装填的第二25G 4.69英寸的针插入到第一针中，并将尖端置于髓核的中间。在确认第二针的定位之后，向每个盘注射细菌。然后将针取出。对动物重新定位以接近脊椎的另一侧。

制剂注射：将第二20G 3.5英寸的脊椎穿刺针直接放置到每个盘第一次注射的相对侧的髓核边缘中。刚好在施用时间点之前，将新的装填有给药溶液的25G 4.69英寸的针插入到该20G 3.5英寸并定位于髓核的中间。第二治疗是通过该针给药。

对于每次注射，对个体给药注射器称重并记录给药前后的重量，以计算施用的实际剂量。

对于每种制剂，缓慢给药，这需要30至60秒来递送，使用足够的力成功地逐剂递送，而使在注射器/针接头处没有任何给药溶液漏出。

使用数字x射线成像系统辅助注射并刚好在给药前后捕获图像记录。对动物进行连续监测，并在完全恢复后将其送回它们的畜栏。

1.4数字X射线成像

刚好在每次给药之前和给药之后立即对每只绵羊进行成像并捕获图像。记录顺序的细节。在给药后立即由有资格人员对每次IVD注射进行视觉评估。注射将被评分/记录为：

良好无泄漏：在盘内可见良好的离散剂量，在盘外无可见剂量。

最小泄漏：在盘内可见良好的离散剂量，在盘外可见最小的剂量。

中度泄漏：在盘内可见减少的剂量，在盘外可见明显的剂量。

严重泄漏：在盘内可见最小的剂量，在盘外明显可见大部分介质。

为了理想地确保研究中的科学稳健性，需要四个治疗的盘/组，至少三个/组。在完成对绵羊的注射后，将审核评分。如果总计小于理想的盘数被评为“良好无泄漏”或“最小泄漏”，则将考虑向该组添加额外的绵羊，直到最多2只绵羊。

1.5组织样品

在给药后设定的时间点，杀死绵羊。将注射的椎间盘切除，并从每个盘取出髓核。此外，对额外的未治疗的盘进行取样以提供对照组织。在对特定动物治疗过所有盘之后，小心地取出该盘，以确保对照和治疗过的样品之间没有污染。

1.6利奈唑胺提取

通过向预先称重的盘样品添加3ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)，从盘样品中提取利奈唑胺。使用Omni-Prep Bead Ruptor在4℃下将混合物均质化。再加入3.5ml PBS，将样品手工均质化，最后再加入3.5ml PBS，充分混合，得到总体积为10ml的PBS盘混合物。将这种含有利奈唑胺的盘匀浆的代表性等分试样用来自未治疗的盘的盘匀浆稀释，以确保样品在分析的校准范围内。通过用三体积的含有甲苯磺丁脲和拉贝洛尔作为内标(分别为50和25ng/ml)并用0.1ml甲酸酸化的乙腈进行蛋白质沉淀来提取样品。

涡旋混合并在4℃下离心后，在浅孔96孔板中将上清液与用0.1％甲酸酸化的乙腈：水(1:1v/v)混合。将板密封并摇动以确保在分析之前均匀。针对一系列基质匹配的校准和质量控制标准，使用Waters TQS质谱仪(条件见下文)，通过正电喷雾LC-MS/MS分析样品中的利奈唑胺。通过用利奈唑胺强化来自未治疗的盘的稀释的盘匀浆的等分试样，并如上所述提取，来制备标准品。

表1：实验条件

/>

使用软件6.4版中的Phoenix WinNonL，使用每只动物的四个盘的平均动物数据、非房室分析和均匀加权、标称时间点和施用于这些盘的利奈唑胺的实际量，进行药代动力学分析。如果认为剂量小于标称剂量，例如观察到重大泄漏，则将数据点从药代动力学分析中排除。

1.7从绵羊盘提取和计数金黄色葡萄球菌

将每个盘的核置于含有2mL无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)或6mL塑料Sterilinbijoux的7mL塑料Precellys珠磨器管中。在Precellys 24BB珠磨器中以6500rpm的速度以其可达到的程度对每个盘的核进行两次均质化，持续45秒，每个均质化步骤之间有30秒的休息时间。取出样品(大约100μL)，并在无菌PBS中连续稀释10倍，然后通过铺展或Miles和Misra方法(https://en.wikipedia.org/wiki/Miles_and_Misra_method)涂到甘露醇盐琼脂(MSA；Thermo Scientific CM0085)上。将MSA板在37℃下在环境空气中孵育约16小时，并测定金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)的活菌计数。

实施例2：评估利奈唑胺在制剂制备中的稳定性的方法

使用超高效液相色谱(UPLC)测定制剂制备中利奈唑胺的量和稳定性。使用MassLynx软件在配备有二极管阵列检测器和单四极杆质谱仪的Waters Acquity系统上进行分析。该方法的详细信息在表2中列出。

表2：用于测定利奈唑胺的UPLC

实施例3：分析制剂制备中碘海醇的量的方法

使用HPLC来估算制剂制备中碘海醇的纯度和量。所用方法的详细信息在表3中列出。

表3：用于测定碘海醇的HPLC

实施例4：利奈唑胺混悬物制备

4.1.利奈唑胺II型和III型的空气喷射研磨

为了评价开发具有50和200mg/mL的利奈唑胺载量的利奈唑胺混悬物的能力，评估了制剂的短期物理稳定性，包括粒径、多分散性和均质性。然后加入不同浓度的泊洛沙姆407，并评价混悬物的溶胶-凝胶转变温度和注射能力(injectability)/可注射性(syringeability)。

选择利奈唑胺的不同晶型，并测试它们悬浮的可行性。利奈唑胺的两种晶体修饰物(多晶型物)：II型(FII)和III型(FIII)获自Symed labs Ltd(印度)。使用LaboMill喷射磨机(F.P.S.Food and Pharma Systems s.r.l，意大利)，以7bar的注射线压力和4bar的研磨线喷射研磨各大约1g的FII和FIII。通过激光衍射(Sympatec GmbH,Helos Disperse)分析原料和空气喷射研磨的材料的粒度分布。将每个样品5mg放入干粉分散器(RODOS/M)中。在将每个样品以2％的光学浓度运行5秒钟之前进行参考测量。使用透镜R1(0.18-0.35μm)和R2(0.25/0.45-87.5μm)在3巴的压力下获得结果(表4)。使用HELOS传感器收集数据，并使用Windox5软件进行分析。

表4：原始和喷射研磨的FII和FIII的粒度分布

两种形式的利奈唑胺的研磨后X₉₀粒度分布是相似的。

4.2.研磨的利奈唑胺II型和III型的混悬物

每种形式称量50mg，然后加入1mL泊洛沙姆运载体。通过手动摇动使颗粒重悬一分钟。II型空气喷射研磨的颗粒均匀分散。III型的颗粒形成块并且不均匀地分布。该观察表明，利奈唑胺II型优于III型，因为它具有改善的悬浮性能。

4.3.利奈唑胺II型的放大研磨和粒度分布

将利奈唑胺II型(Symed，印度)以0.5kg的规模进行空气喷射研磨，以提供用于制剂开发的微粉化利奈唑胺II型。使用表5中所示的以下方法实现微粉化。

表5：利奈唑胺II型微粉化

如图1所示分析粒径。

4.4.API(活性药物成分)：利奈唑胺II型的灭菌

可以通过干热灭菌或γ辐照来实现研磨粉的灭菌。使用含有200mg研磨的利奈唑胺II型的玻璃瓶进行灭菌可行性研究。

干热

如表6所示，将含有200mg微粉化的利奈唑胺或spordex片(AF0558：Steris LifeSciences，UK)的小瓶在120℃至160℃下孵育2至50小时。在每个温度时间点评估利奈唑胺II型粉末的外观和化学稳定性(实施例2的方法)。孢子片在30-35℃下培养7天并记录生长情况。

表6：通过干热对API进行灭菌

在孵育1天后观察到，储存在2-8℃的Sporedex片可用作细菌生长的阳性对照。

测试的所有干热条件均对孢子片进行了灭菌，表明达到了>10⁶的生物负荷降低。除了在140℃下进行8小时处理外，将利奈唑胺粉末加热至高于120℃引起从粉末到粘稠黄色液体的物理变化，以及存在的利奈唑胺的百分比显著降低。在高于或等于130℃的温度下处理的不稳定性表明，在120℃或120℃左右进行干热灭菌可能是可行的，但在规模化工艺中存在技术挑战，因为较小的温度波动可能导致温度升高和不稳定性。使用相对较低的温度长时间灭菌需要大量验证，并且不符合标准药典对干热灭菌的建议。

γ辐照

将含有200mg微粉化的利奈唑胺的小瓶装满空气或在氮气中，在环境温度下或在寒冷条件下用冰包装进行15KGy或25KGyγ辐照。在辐照后在时间零时以及在25℃或40℃下储存28天后评估外观和化学稳定性(实施例2的方法)以评估长期稳定性(表7)。

表7：通过γ辐照对API进行灭菌

*外观：P＝白色粉末。稳定性估计值是二份重复的平均值。T＝0以及在25℃或40℃下储存28天。

在任何条件下辐照后，均未观察到粉末物理外观或颜色的总体变化。辐照后28天时的化学稳定性良好且在预期范围内。没有迹象表明粉末必须在氮气下进行瓶装或样品必须在辐射过程中冷却。

γ辐照似乎提供了在药典指南之内的一种稳健的灭菌方法。数据还表明，γ辐照不影响利奈唑胺的稳定性。γ辐照是对瓶装的研磨的利奈唑胺II型粉末进行灭菌的优选方法。

实施例5：递送运载体的优化：基于泊洛沙姆的凝胶运载体

5.1泊洛沙姆水凝胶制备

按照一般程序制备用于利奈唑胺注射液的泊洛沙姆运载体。使用改良本领域中描述的方法的冷方法形成泊洛沙姆水凝胶(Schmolka,Journal of Biomedical MaterialsResearch,1972,Vol 6(6):571-582)。首先在水中配制氨丁三醇pH缓冲液、螯合剂EDTA钙二钠和不透射线的碘海醇，然后加入泊洛沙姆407。将混合物置于冷状态，直到泊洛沙姆水合成澄清溶液。该注射用运载体是按重量比重量进行配制的。重复该过程以优化条件，直到定义了合适的制剂。使用重量和体积设定最终注射利奈唑胺混悬物中氨丁三醇、EDTA和碘海醇的目标浓度和范围。

5.2.添加碘海醇的泊洛沙姆水凝胶的溶胶-凝胶温度

在一项研究中，采用由碘海醇提供的不同浓度的碘：V150、V170和V190以及相同浓度的氨丁三醇和CaNa₂EDTA开始制备三种运载体。将每种运载体分成两部分，并分别以12％w/w或12.5％w/w的浓度添加泊洛沙姆407。12％和12.5％w/w的泊洛沙姆运载体的体积略有不同，因此其密度也略有不同。评估了评估碘(碘海醇)和泊洛沙姆浓度影响的6种制剂的溶胶凝胶。通过将样品以2℃的间隔从室温升温至40℃并倒转瓶评估的样品流变性能对样品进行分类：液体(L)-在重力方向上快速移动时，粘稠液体(VL)和VVL-在重力方向上向下缓慢移动时，以及作为凝胶(G)-保留在小瓶底部时。后者被分类为溶液-凝胶转变温度(表8)。

表8：溶胶-凝胶制剂中的泊洛沙姆和碘海醇性能

/>

L＝液体；G＝凝胶；VL＝粘稠液体，VVL＝非常粘稠的液体

重量克分子渗透浓度(Osmolarity)随碘海醇和泊洛沙姆含量的增加而增加。随着碘海醇浓度的增加，密度也增加了。但是，对于同一运载体，12％w/w和12.5％w/w泊洛沙姆的密度是相似的(表8)。

采用150mg I/ml或170mg I/ml的起始浓度和12.5％w/w的泊洛沙姆407，达到了运载体的目标溶液凝胶化温度，为32-34℃。然而，采用190mg I/ml，采用12.0％w/w泊洛沙姆407的运载体在36℃下凝胶化，而采用12.5％w/w泊洛沙姆407则在28℃下凝胶化，表明在具有190mg I/ml的运载体中，最佳的泊洛沙姆407浓度将在12.0％至12.5％w/w之间。

5.3利奈唑胺泊洛沙姆制剂开发

在即将施用之前，将如实施例4所述制备的利奈唑胺微粉化粉末与泊洛沙姆溶液混合。注射时利奈唑胺的目标最终浓度设定为50mg/ml。50mg/ml利奈唑胺浓度可通过将～200mg利奈唑胺粉末重悬于约3.8ml泊洛沙姆运载体中以使最终体积为约4.0ml而获得。其他量的利奈唑胺和泊洛沙姆运载体可以达到相同的浓度，例如100mg利奈唑胺与1.9ml泊洛沙姆运载体。

5.4制剂制备程序

进行另一项研究以测试将API(利奈唑胺)添加到泊洛沙姆运载体中的情况。按照下面所述的生产方法制备300g泊洛沙姆运载体(表9)。

表9：含碘海醇的溶液的制备

步骤A：生产300克含碘海醇的溶液的方法：

1.记录500mL烧杯的皮重，并向烧杯中加入150g水；

2.将所需质量的氨丁三醇、EDTA钙二钠和碘海醇(表9)分配到烧杯中，并记录加入的每种组分的质量；

3.混合混合物直至所有固体完全溶解，并且任选地，如果没有足够的水来溶解固体，则添加更多的水以帮助溶解；

4.称量烧杯，然后使用5M HCl将pH调节至8.0。如果pH已经接近pH8.0，则可能有必要制备不太浓的HCl溶液。

5.通过记录烧杯的重量来记录用于调节pH的酸的量；

6.加入剩余的水，使产品总重量为300g；

7.记录外观并重复二次测量密度；和

8.通过用赋形剂的实际值(％w/w)乘以密度值(g/mL)来计算凝胶制剂的％w/v；

按照生产泊洛沙姆凝胶的方法，如表10所示，将300g运载体分成三部分，并添加泊洛沙姆407。

表10：泊洛沙姆溶液的制备

步骤B：生产泊洛沙姆-碘海醇溶液的方法：

1.将每种凝胶所需质量的运载体(来自步骤A)称量到150ml烧杯中(表10)，并将三个烧杯放入冰箱中至少1小时以冷却；

2.在环境温度下，使用顶置式搅拌器向冷运载体中缓慢添加所需量的泊洛沙姆407，直到混合物是均匀的；并记录外观；

3.将烧杯放在冰箱中过夜；

4.第二天检查是否已形成澄清的溶液，并使用刮刀或类似工具小心混合以确保溶液是均匀的；

5.使用铝比重瓶测量密度；记录外观并将全部样品存放在冰箱中，直到需要测试；和

6.通过用赋形剂的实际值(％w/w)乘以密度值(g/mL)来计算凝胶制剂的％w/v。

首先，使用凝胶1、凝胶2和凝胶3各2X5ml样品进行溶胶-凝胶转变测试。如果溶胶-凝胶温度在目标温度30-34℃之间，则添加空气喷射研磨的GMP利奈唑胺粉末以生成含有50mg/ml利奈唑胺的溶液，并再次如下测试溶胶-凝胶温度。

1.将200mg研磨的利奈唑胺分配到两个去皮重的透明8mL小瓶中；

2.向每个小瓶中添加3.8mL上面制备的凝胶1、凝胶2或凝胶3；和

3.剧烈摇动小瓶以使API(利奈唑胺)悬浮，并记录外观。

表11：利奈唑胺泊洛沙姆制剂

用含32.743％(w/w)碘海醇的溶液制得的12.5％w/w泊洛沙姆凝胶为50mg/ml利奈唑胺混悬物提供了目标溶胶-凝胶温度(34℃)。

实施例6：泊洛沙姆递送运载体的制备

以中等规模制备包含12.5％w/w泊洛沙姆407和32.7％w/w碘海醇的递送运载体(如实施例5中测试的)，然后以更大的规模制备以测试制剂的公差和长期稳定性。这些额外的批次提供了可重复性的证据。

表12：材料

生产用于注射的400g泊洛沙姆运载体的方法包括以下步骤：

1.记录600mL烧杯的皮重；并向烧杯中加入200g水；

2.将所需质量的氨丁三醇、EDTA钙二钠和碘海醇(表12)分配到烧杯中；并记录加入的每种组分的质量；

3.混合混合物直至所有固体完全溶解，并在必要时添加更多的水以帮助溶解；

4.称量烧杯，然后使用5M HCl将pH调节至8.0；

5.加入剩余的水，以使产品总重量为400g；

6.记录外观并重复二次测量密度；

7.通过乘以赋形剂的实际值(％w/w)计算凝胶制剂的％w/v；

8.称取175g碘海醇溶液(上面的步骤6)到250mL烧杯中，并将烧杯放在冰箱中至少1小时以冷却；

9.在环境温度下，使用顶置式搅拌器向冷的碘海醇溶液缓慢加入25g泊洛沙姆407(BASF Kolliphor 407：批号：WPNK538B(R/003191))，直到混合物是均匀的；

10.将烧杯放在冰箱中过夜；第二天检查是否已形成澄清溶液，并使用刮刀或类似工具小心地混合，以确保溶液是均匀的；

11.使用铝比重瓶对30mL样品测量密度；记录外观并将全部样品存放在冰箱中，直到需要测试；和

12.通过用赋形剂的实际值(％w/w)乘以密度值(g/mL)来计算凝胶制剂的％w/v。

通过使用Watson-Marlow蠕动泵过滤对泊洛沙姆溶液进行灭菌。使泊洛沙姆溶液通过Sartopore 2、0.4μm过滤器(部件号5441307H4G)过滤。在过滤前后评估泊洛沙姆和碘海醇的量以及凝胶的溶胶-凝胶温度，以确定碘海醇是否被过滤器截留或凝胶的性能是否因过滤而改变(表13)。

表13：过滤前后凝胶的测定结果

过滤前和过滤后的结果表明，可以使用蠕动泵过滤凝胶，并且凝胶的组成及其性能不会因过滤而改变。过滤前和过滤后的含量测定结果差异在测定公差和规格范围内。过滤是凝胶灭菌的优选方法。

然后将利奈唑胺装载到凝胶中并测试溶胶-凝胶温度。结果示于表14，表明以中等规模制备的混悬物保持所需的溶胶-凝胶温度。

表14：利奈唑胺混悬物的溶胶-凝胶温度

实施例7：利奈唑胺制剂的体内药代动力学和功效

进行初步研究以测试按照本文描述的生产方法制备的利奈唑胺混悬物的体内药代动力学和功效。

按照实施例2-5中描述的生产方法制备含有16.6％(w/w)泊洛沙姆的递送运载体，其含有50mg/ml利奈唑胺混悬物。如实施例1所述，将0.1ml这种利奈唑胺混悬物注入绵羊盘。如图2所示，在制剂中使用碘海醇可以允许被注射的制剂可视化。测量椎间盘内施用后利奈唑胺的药代动力学。图3显示了以每个盘5mg利奈唑胺的剂量注射后从绵羊盘回收的利奈唑胺的量。

如图4所示的测试的利奈唑胺混悬物的功效表明，利奈唑胺混悬物的施用使每个盘的平均细菌负荷减少了>3log(P＝0.009)。治疗组中超过60％的盘是无菌的。具有细菌残留的那些具有显著减少的负荷。

实施例8：利奈唑胺制剂的注射能力

为了确保混悬物不会阻塞针或者太粘稠而无法通过注射器，使用比预期人类施用所需(4.69英寸)更长的细孔25G针评价混悬物的注射能力。配制单独的水凝胶或利奈唑胺混悬物，并用该制剂装填1ml鲁尔锁(luer lock)注射器。定位针，并通过该针将凝胶或混悬物注射出去。结果记录如下：l＝不可能注射；没有流动；或2＝可以注射；逐滴流动；或3＝注射：中等；连续流动。得分为2或3的凝胶和混悬物在规格范围内。

实施例9：利奈唑胺混悬物制剂的放大制备

进一步地，以更大的规模并且在现行生产质量管理规范(cGMP)标准下生产本文中优化的在泊洛沙姆-碘海醇递送溶液中的利奈唑胺混悬物。该制剂是无菌的并且准备好供临床应用。

9.1利奈唑胺II型(API)的微粉化和瓶装

为了减小利奈唑胺II型的尺寸以使其在配制中形成混悬物并通过施用针，通过空气喷射研磨对利奈唑胺II型进行微粉化。使用LaboMill喷射磨机(F.P.S.Food and PharmaSystems，意大利)以60g/min至160g/min的进料速度，2至4巴的研磨压力和2至4巴的文丘里压力在氮气下对利奈唑胺II型大晶体(约1-2千克)进行微粉化。通过激光衍射(SympatecGmbH,Helos Disperse)分析原料和空气喷射研磨的材料的粒度分布。收集并分析未研磨的粉末(R1)和研磨的粉末(R4)的尺寸分布数据。空气喷射研磨将粒径从D10 4至6μm(D10，样品质量的10％由直径小于此范围的颗粒组成)和D90 40至50μm(D90，样品质量的90％由直径小于此范围的颗粒组成)的粒径分布减小至D10 0.4至0.50μm和D90 4至5μm。微粉化的利奈唑胺II型的规格设定为D10 0.2至1.0μm、D90 3至10μm。在1kg至1.5kg的规模下，微粉化提供收率为87％至89％的在规格内的利奈唑胺II型粉末。

通过手工将微粉化的利奈唑胺II型粉末以每小瓶253mg±2mg填充到10ml的Schott I型管状透明玻璃小瓶中，并用West 4023/50灰色溴丁基弹性体塞子封闭，该塞子是涂覆在产品接触表面并盖有铝密封件的约608g微粉化的利奈唑胺II型填充约2400个小瓶(中间体药物产品：PP353-A)。

9.2利奈唑胺(FII)的灭菌

在环境温度下通过以～23.5±10％kGy使用钴60源的γ辐照对～2400个小瓶进行灭菌。辐照的利奈唑胺II型小瓶标记为PP353-A。根据药物无菌性要求(EP 2.6.1)测试辐照的利奈唑胺II型粉末的无菌性。

通过在35-39℃下孵育同时振摇(±200rpm)直到产物溶解，将20小瓶(20x 253mg利奈唑胺)的内容物溶解在2500ml无菌水中。将200ml利奈唑胺溶液通过预先用流体D(包括1.0g动物组织的胃消化物、1ml聚山梨酯80、1000ml纯化水，pH：7.1±0.2)润湿的DuraporeSteritest装置过滤。每个膜用100ml流体D洗涤5次。一个罐中填充有100ml TSB+1％吐温+0.07％卵磷脂(包括17.0g酪蛋白胰消化物、3.0g大豆木瓜蛋白酶消化物、5.0g氯化钠、2.5g磷酸氢二钾、2.5g一水葡萄糖、10ml聚山梨酯80、0.7g卵磷脂、1000ml纯化水，pH7.3±0.2)并在20-25℃下孵育14天。另一个罐中填充有100ml FTM(流体巯基乙醇酸酯)+1％吐温+0.07％卵磷脂(包括0.5g l-胱氨酸、0.75g颗粒琼脂、2.5g氯化钠、5.5g/5.0g一水/无水葡萄糖、5.0g酵母提取物、15.0g酪蛋白胰消化物、0.5g巯基乙醇酸钠或0.3ml巯基乙醇酸、1.0ml新鲜制备的刃天青钠溶液、10ml聚山梨酯80、0.7g卵磷脂、1000ml纯化水，pH7.1±0.2)，并在30-35℃下孵育14天。所有溶液均使用经过验证的方法进行灭菌。孵育14天后，样品中无生长，表明PP353-A样品是无菌的。

9.3稀释剂(递送运载体)的规模放大制备

以18.4L(～22kg)的规模进行递送溶液(泊洛沙姆407-碘海醇溶液)的配制，然后通过无菌填充到10mL Schott I型透明玻璃小瓶中进行灭菌，目标填充重量为8.40g(相当于7mL标称填充体积)。制备多达2400个小瓶的制剂，并称为中间体药物产品PP353-B。

表15：递送运载体溶液(PP353-B)的配方

按照以下步骤制备22kg递送溶液制剂(PP353-B)：

1.在20升容器中向11,500g预冷的(5℃)WFI中加入22.257g氨丁三醇，并搅拌直至氨丁三醇溶解；

2.加入1.839g EDTA钙二钠并搅拌直至其溶解，随后加入6,303g碘海醇并搅拌直至溶解；

3.(任选的)用1M盐酸将溶液的pH值调节至约pH8.0(可接受的范围为pH7.80-pH8.20)；

4.加入额外的预冷的WFI至净重为18,750g；

5.在搅拌下以大约100g的份数缓慢地加入2,750g泊洛沙姆407；并在进一步添加之前使任何团聚的泊洛沙姆分解并分散；和

6.加入额外的预冷的WFI至22,000g的最终目标重量，相当于标称的18.4L，并搅拌，直到泊洛沙姆溶解。

由于泊洛沙姆溶解较快并且在较低的温度下具有较低的粘度，因此将制剂冷却。最终的PP353-B泊洛沙姆溶液在15℃时的密度为1.196g/mL。

通过两次过滤对冷却的PP353-B产品进行灭菌。使用蠕动泵使溶液(PP353-B)流动首先通过Sartopore 2XLG Midicap过滤器流入8-手套通用填充隔离器，然后再通过第二个顺序连接的Sartopore 2XLG Midicap过滤器。通过泵和过滤器使溶液冷却以降低粘度。将无菌的PP353-B保持在15℃的隔离器内10L容器中。设置该温度控制以限定小瓶的密度和重量填充。使用Masterflex泵，将无菌溶液以每小瓶7.0mL(8.4g)的无菌溶液包装到10ml的Schott I型管状透明玻璃小瓶中，并用West 4023/50灰色溴丁基弹性体塞子密封，该塞子是涂覆在产品接触表面并盖有铝密封件的22kg溶液(PP353-B)填充约2400个小瓶。

根据EP 2.6.1中所述的要求测试PP353-B的无菌性。在两个Steritest罐之间分配20个PP353-B小瓶，并过滤。每个罐用约300ml的流体A(0.1％蛋白胨水)洗涤。Steritest罐填充有100ml TSB或FTM培养基，并孵育14天。培养物中无生长指示PP353-B的无菌性。

9.4稀释剂的流变特性

根据下面描述的溶胶-凝胶法，重复三次评估PP353-B溶液的转变温度：

1.准备含有去离子水的夹套式容器，并将该容器连接到循环水浴上；

2.将水浴温度设置为22℃，并使用已校准的温度计或热探针测量夹套式容器中的温度；

3.当夹套式容器中的水在22℃且稳定(±0.5℃持续至少5分钟)时，将样品放入夹套式容器中；

4.使样品静置15至20分钟以平衡至22℃；

5.从夹套式容器中取出小瓶，然后立即倒转以评估液体-凝胶行为；并立即根据其视觉流变特性对样品进行分类：1)在重力方向上快速移动时为液体；2)在其重力方向上向下缓慢移动时为粘稠液体；和3)保留在小瓶底部时为凝胶；

6.(任选的)重悬样品，并在样品尚未凝胶化时尽可能快地转移回到夹套式容器中；并使水浴温度升高2℃；

7.记录液体-凝胶行为；

8.一旦夹套式容器中的水的温度稳定(±0.5℃)持续5分钟，则使样品再静置15分钟以平衡至相同温度；和

9.重复上述步骤(5)、(6)、(7)和(8)，直到温度达到40℃。

PP353-B溶液的所有三个测试小瓶的溶胶-凝胶转变温度均为28℃。

9.5利奈唑胺II型混悬物制剂的制备

使用根据上述步骤(9.1和9.2)制备的含有微粉化的无菌利奈唑胺粉(API)的小瓶(即PP353-A)来制备利奈唑胺混悬物。每个小瓶含有253mg API。使用含有根据上述方法(9.3和9.4)制备的无菌溶液的小瓶(即PP353-B)作为稀释剂。每个小瓶含有7mL PP353-B稀释剂。

为了制备利奈唑胺混悬物，将约4.8mL的PP353-B溶液转移到PP353-A的小瓶中。通过摇动混合该小瓶，直到观察不到固体粉末为止(约1-1.5分钟)。小心进行该过程以避免升高小瓶温度。一个重构小瓶的最终体积约为5mL。在稀释剂中的最终利奈唑胺混悬物标记为药物产品PP353。

根据9.4节中所述的溶胶-凝胶方法重复三次评估PP353混悬物的溶胶-凝胶转变温度。

所有三个测试小瓶(PP353)的溶胶-凝胶转变温度均为28℃。注意到泊洛沙姆水凝胶和利奈唑胺混悬物制剂的较小规模的非GMP产品具有较高的溶胶-凝胶转变温度，为32℃至36℃(实施例5和6)，而大规模制备的凝胶和利奈唑胺混悬物GMP产品具有较低的溶胶凝胶转变温度，为28℃。结果表明基于泊洛沙姆的水凝胶溶液和利奈唑胺混悬物具有宽范围的溶胶-凝胶转变温度，为至少约28℃至约36℃。

实施例10.利奈唑胺制剂混悬物(PP353)的注射能力

对由该GMP规模制剂(PP353)制成的利奈唑胺混悬物进一步测试注射能力，以评估该制剂通过注射针以能够施用。在这项研究中，使用双针技术和加温的甘薯作为患者肉的替代物来测试混悬物(PP353)的注射能力。

将甘薯在水浴中加热至37℃。将5英寸(127mm)18French G针置于甘薯中。该针代表引导针，其将在使用荧光检查的图像引导下定位在患者体内，从而使针尖邻近待注射的盘。然后将另一根7英寸(178mm)22French G针通过引导针插入，直到末端从该5英寸引导针伸出。该针代表将被插入到待注射的盘中的施用针。在甘薯中将两根针加温至37℃。将填充有室温下的利奈唑胺混悬物(来自PP353)的1mL注射器连接到施用针上。然后将混悬物通过温热的针注入，观察到混悬物以凝胶而非滴液的形式从针头挤出(图5)。该实验证明，可以通过温热的施用针注射具有较低的溶胶-凝胶转变温度的利奈唑胺混悬物(即PP353，为28℃)，并且在此过程中，它在针内从液体转变为凝胶。

该观察结果表明，从临床上看，注射预制成的水凝胶很可能将施用局部化在施用部位，并使从注射部位例如患者的脊椎间盘的任何溢出物最小化。

实施例11.PP353利奈唑胺混悬物的全身药理学特性

为了测量PP353产品的全身药理学特性，按照实施例1的1.3节中描述的注射方法，用利奈唑胺混悬物(PP353)通过椎间盘注射给药于绵羊(n＝27，每个实验组3只)。在整个注射过程中均拍摄了X射线图像，以识别目标椎间盘以辅助注射程序并作为成功给药的标尺。将PP353利奈唑胺制剂(含有5mg利奈唑胺的0.1ml混悬物)注射到绵羊的两个盘中。将相同体积的泊洛沙姆-碘海醇递送运载体(即PP353-B)(0.1ml)给药于对照组中的绵羊。在给药后0分钟(在施用测试材料之前)、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、16小时、30小时和48小时采集血液样品。

处理所有血液样品，并按照GLP(非临床实验室研究的良好实验室规范)规定，使用LC-MS/MS测量和测定血浆提取物中利奈唑胺的浓度。如图6所示，血浆中利奈唑胺的浓度表现出与先前用实验制剂产品(例如，实施例4-7)观察到的相似的模式。向绵羊盘施用小注射体积(例如0.1ml)的混悬物可以使潜在的贮库效应最小化。

总之，这些观察结果提供了具有相对较低凝胶化温度(例如28℃)的制剂在体内的注射能力以及利奈唑胺从制剂释放到周围组织和血液中的证据。

Claims (26)

1.一种可注射的药物制剂，其包含：

(a)1％至20％的利奈唑胺II型，该浓度按所述制剂的重量计，

(b)包含10.8％至12.8％的泊洛沙姆407和14％至59％的碘海醇的热敏性水凝胶，上述浓度均按所述制剂的重量计，和任选地

(c)至少一种药学上可接受的赋形剂，

其中利奈唑胺II型在所述热敏性水凝胶中形成混悬物。

2.权利要求1所述的可注射的药物制剂，其中碘海醇按所述制剂的重量计以17％至30％的量存在。

3.权利要求1所述的可注射的药物制剂，其中所述混悬物在26℃至38℃的温度下凝胶化。

4.权利要求3所述的可注射的药物制剂，其中所述混悬物在32℃至36℃的温度下凝胶化。

5.权利要求3所述的可注射的药物制剂，其中所述混悬物在26℃至32℃的温度下凝胶化。

6.一种可注射的药物制剂，按所述制剂的重量计，其包含2.5至20％的利奈唑胺II型、17％至30％的碘海醇和10.8％至12.8％的泊洛沙姆407。

7.权利要求1-6中任一项所述的可注射的药物制剂，其中所述可注射的药物制剂被制备用于施用于邻近骨水肿的部位、韧带、骨、关节、肌腱或肌腱和骨的连接处。

8.权利要求7所述的可注射的药物制剂，其中，所述骨、关节、韧带或肌腱是与脊椎相关的骨、关节、韧带或肌腱。

9.权利要求8所述的可注射的药物制剂，其中，与脊椎相关的骨、关节、韧带或肌腱与颈椎、胸椎、腰椎或骶椎相关。

10.权利要求7所述的可注射的药物制剂，其中，所述关节是关节内隙或椎间盘。

11.权利要求10所述的可注射的药物制剂，其中，所述关节内隙是椎间隙。

12.一种可注射的药物制剂，其包含：

(a)1％至20％的利奈唑胺II型粉末，该浓度按所述制剂的重量计，

(b)包含10.8％至12.8％的泊洛沙姆407和14％至59％的碘海醇的热敏性水凝胶，上述浓度均按所述制剂的重量计，以及任选地

(c)至少一种赋形剂，

其中所述药物制剂通过包含以下步骤的方法制备：

(i)将利奈唑胺II型研磨成规定的粉末，

(ii)制备步骤(i)的利奈唑胺粉末单位，并对制剂进行灭菌，

(iii)制备包含泊洛沙姆407和碘海醇的热敏性水凝胶并对其进行灭菌，以及

(iv)将步骤(ii)的所述利奈唑胺粉末悬浮在步骤(iii)的热敏性水凝胶中。

13.权利要求12所述的可注射的药物制剂，其中通过γ辐照对所述利奈唑胺粉末进行灭菌。

14.权利要求13所述的可注射的药物制剂，其中步骤(iii)和(iv)在比步骤(i)和(ii)更低的温度下进行。

15.权利要求1-14中任一项所述的可注射的药物制剂在制备药物中的用途。

16.权利要求1-14中任一项所述的可注射的药物制剂在制备用于治疗或预防受试者的下背疼痛的药物中的用途，所述用途包括施用所述可注射的药物制剂。

17.权利要求16所述的用途，其中所述疼痛是急性疼痛、亚急性疼痛、慢性疼痛、局部疼痛、根性疼痛或牵涉性疼痛。

18.权利要求17所述的用途，所述局部疼痛是腰椎或颈椎疼痛。

19.权利要求17所述的用途，其中所述疼痛是与Modic改变或骨水肿相关的腰椎或颈椎疼痛。

20.权利要求19所述的用途，其中所述受试者疑似患有或患有细菌感染。

21.权利要求17所述的用途，其中所述可注射的药物制剂被注射到椎间盘、关节内隙、韧带、肌腱、肌腱和骨的连接处或邻近骨水肿的部位。

22.权利要求21所述的用途，其中所述关节内隙是椎间隙。

23.权利要求21所述的用途，其中所述可注射的药物制剂被注射到Modic改变或骨水肿的部位或邻近该部位。

24.权利要求1-14中任一项所述的可注射的药物制剂在制备用于同时缓解或改善受试者的疼痛并消除所述受试者的颈椎、胸椎、腰椎或骶椎中的细菌感染的药物中的用途，所述用途包括通过注射将所述可注射的药物制剂施用于受感染的椎骨中、附近或周围的区域。

25.一种用于制备可注射的药物制剂的试剂盒，包括：

(a)利奈唑胺II型粉末，其量按所述可注射药物制剂的重量计为1％至20％，和

(b)包含10.8％至12.8％的量的泊洛沙姆407和14％至59％的量的碘海醇的热敏性水凝胶，上述浓度均按所述可注射的药物制剂的重量计。

26.权利要求25所述的试剂盒，还包括注射器和用于注射的针。