CN111418757B - 去环氧基催化活性多肽用于呕吐毒素解毒的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开去环氧基催化活性多肽用于呕吐毒素解毒的用途。本发明的多肽能够在缓和的条件下催化呕吐毒素与谷胱甘肽反应去除环氧基，并产生无毒无害的谷胱甘肽化衍生物，从而实现呕吐毒素的解毒和脱毒。该多肽在农业、食品、饲料和医药等领域具有广泛用途。

Description

去环氧基催化活性多肽用于呕吐毒素解毒的用途
技术领域
本发明涉及食品或饲料领域，具体涉及具有去环氧基催化活性的活性多肽用于呕吐毒素或含有该毒素的样品解毒或脱毒的用途。
背景技术
呕吐毒素主要由禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、粉红镰刀菌、雪腐镰刀菌等镰刀菌产生。另外，头孢菌属、漆班菌属、木霉属等的菌株也可产生该毒素。摄入此类毒素可引起采食量降低，严重时可引起例如呕吐，故又名呕吐毒素(vomitoxin，VT)。科研工作者已经探明呕吐毒素的环氧基是主要毒性来源基团。因此，分离出可高效去除呕吐毒素的环氧基的基因或酶，通过体外酶催化处理受毒素污染的谷物制品，将满足饲料工业、食品工业和医药产业对呕吐毒素的脱毒需求。遗憾的是，目前尚未报道有明确的基因或蛋白可通过去环氧基催化呕吐毒素进行解毒。
发明内容
鉴于现有技术存在的问题，发明人提供一种基于具有去环氧基催化活性的活性多肽进行呕吐毒素解毒的方法。至少部分地基于此完成了本发明，具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供具有去环氧基催化活性的多肽用于呕吐毒素解毒的用途，其中，所述活性多肽具有SEQ ID No:1所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述活性多肽能够使呕吐毒素中的环氧基与谷胱甘肽(GSH)催化反应生成谷胱甘肽化衍生物。
本发明的第二方面，提供活性多肽用于样品脱毒的用途，其中，所述活性多肽具有SEQ ID No:1所示的氨基酸序列，所述样品为呕吐毒素污染的样品。
在某些实施方案中，所述样品为食品、饲料或饮料。
在某些实施方案中，所述样品包含谷胱甘肽，或向所述样品加入谷胱甘肽。
在某些实施方案中，所述样品来源于镰刀菌属、头孢菌属、漆班菌属和木霉属的细菌侵染的植物。
在某些实施方案中，所述镰刀菌属细菌选自禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、粉红镰刀菌、黄色镰刀菌和雪腐镰刀菌。
本发明的第三方面，提供降低或减轻细胞毒性的方法，其包括将具有SEQ ID No:1所示氨基酸序列的多肽引入细胞或与细胞接触的步骤。优选地，在细胞内引入具有表达所述多肽的基因的步骤。
本发明的活性多肽能够有效地去除呕吐毒素中的环氧基团，从而消除或降低其毒性。活性多肽作为酶反应条件缓和，特别适合于食品或饲料工业。因此，具有巨大的潜在应用价值。
附图说明
图1活性多肽纯化后的SDS-PAGE分析图。
图2活性多肽的量对酶促反应的影响。(a)酶促反应底物呕吐毒素(DON)减少情况；(b)酶促反应生成物DON-GSH生成情况。
图3反应缓冲液pH值对酶促反应的影响。(a)酶促反应底物呕吐毒素(DON)减少情况；(b)酶促反应生成物DON-GSH生成情况。
图4反应温度对酶促反应的影响。(a)酶促反应底物呕吐毒素减少情况；(b)酶促反应生成物DON-GSH生成情况。
图5A为LC-HRMS(方法1)DON与GSH体外酶促反应的提取离子流谱图EIC。
图5B为LC-HRMS2(方法2)DON与GSH体外酶促反应获得的DON-GSH的高能碰撞解离产生的子离子质谱图。
图6呕吐毒素对细胞活力的影响。不同浓度梯度的DON(a)处理细胞48h后，测定OD450nm。
图7LC-HRMS(方法1)毒素处理转基因酵母提取的离子色谱图。
图8转基因毕赤酵母的DON耐受性结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。
本文中，术语“活性多肽”是指具有去环氧基酶催化活性的多肽，即将环氧基转化为其他基团或去除该基团的活性多肽。本文有时也称作“蛋白酶”。
本文中，术语“去环氧基催化活性”是指能够将呕吐毒素中的环氧基(优选在第12位碳、第13位碳上形成的环氧基)去除的活性或功能。具体催化过程如下所示：
实施例
一、本发明活性多肽的制备
1.材料与方法
大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α菌株、表达菌株BL21(DE3)、原核表达载体pET-28a(+)及质粒pMD19-T-ThFhb7由本实验室保存，其中质粒pMD19-T-ThFhb7含有来源于长穗偃麦草的去环氧基酶基因，其序列如SEQ ID No.2所示。
1.2实验方法
1.2.1通过下述方法构建重组表达载体pET28a-ThFhb7。
根据表达载体pET28a设计带有NcoI和BamHI酶切位点位点的引物，引物序列如下(下划线指示酶切位点)：
正向引物：5'-CCATGGCTAGAAATCCACCCATCGTCATCACC-3'
反向引物：5'-GGATCCTCTTCACCTCGGCATACTTGTC-3'
以质粒pMD19-T-ThFhb7为模版进行PCR扩增。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收目的片段；用NcoI和BamHI分别将目的片段及pET28a载体进行双酶切，胶回收后用T4连接酶连接；连接产物转化大肠杆菌DH5α，经菌落PCR和双酶切鉴定得到约900bp的目的基因和约5000bp的pET28a载体骨架。进一步进行测序验证，结果证明重组表达载体pET28a-ThFhb7序列和读码框正确。
1.2.2多肽诱导表达
将重组表达载体质粒pET28a-ThFhb7转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)感受态细胞；经PCR检测挑取转化平板上的阳性单克隆接种于含50μg/mL Kana的3mL LB培养液的试管中，37℃220r/min振摇过夜。次日接种于KanaLB培养液中振摇至菌体OD600为0.6～0.8。取出1mL培养物，室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃220r/min振摇4h，诱导融合蛋白表达。取出1ml培养物，10000r/min室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。剩余培养物4000r/min，离心10min，弃上清，用PBS重悬菌体沉淀；重悬液进行超声波破碎后，分别取上清液与沉淀液加入上样缓冲液重悬。
1.2.3多肽的纯化
利用Ni柱纯化和利用低压层析系统收集蛋白溶液，并加入透析袋中，使用50mMTris-HCl，0.30M NaCl，pH8.0进行透析过夜。
采用0.5mmol/LIPTG，在37℃条件下震荡4h，诱导蛋白表达，收集菌体并用PBS重悬，超声波破碎后收集上清，将上清液通过Ni柱和分子筛纯化。SDS-PAGE电泳检测结果表明，获得了可溶性蛋白形式的多肽，分子量大小约为33kDa，纯化蛋白条带单一，表明纯化效果较好(参见图1)。
二、多肽体外酶促反应体系建立
1.实验方法：
1.1试剂：0.5mg/mlDON：1mg呕吐毒素，加蒸馏水至2ml，过滤灭菌。
1.2体外酶促反应体系建立
通过对三种不同的影响酶促反应因素的梯度实验，建立ThFhb7多肽体外酶促反应体系的最适条件：
(1)反应酶量梯度：1μg、5μg、10μg、25μg、50μg；
(2)多种缓冲液设置pH值梯度：范围为3.0～10.0，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH＝3.0、4.0、5.0)，磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH＝6.0、7.0)，Tris-磷酸盐缓冲液(pH＝8.0、9.0、10.0)。
(3)反应温度梯度：4℃、12℃、15℃、20℃、25℃、30℃、37℃、45℃、50℃。
2.实验结果：
2.1酶量对酶促反应体系的影响
利用磷酸缓冲液PBS(pH＝7.0)，在25℃条件下，反应时间12h，分别在0h、0.5h、1h、3h、6h取样，进行LC-HRMS分析；通过LC-HRMS一级扫描的面积结果，得到随反应进行反应底物DON与反应生成GSH加合物这两种物质含量的变化情况，从而得到反应的最适酶量，参见图2。
通过改变酶量的实验结果表明，酶量1～25μg时，在相同时间内，DON-GSH的生成量与酶的加入量成正相关。当酶量超过25μg时，DON-GSH生成量趋于平稳。因此选择25μg作为最适试验酶量。
2.2反应体系pH值对酶促反应体系的影响
酶促反应缓冲液pH值梯度实验结果如图3所示。图3表明，在缓冲液pH为6.0时，生成物DON-GSH的量达到最高值，同时反应底物DON的含量最低，因此适宜缓冲液pH值在5.0～7.0之间。
3.反应温度对酶促反应体系的影响
根据以上实验结果，在反应缓冲液pH为7.0，加入酶量25μg的条件下，设置温度条件分别为4℃、12℃、15℃、20℃、25℃、30℃、37℃、45℃、50℃，反应时间为24h；分别在0h、0.5h、1h、6h、12h、24h取样，进行LC-HRMS分析；通过LC-HRMS一级扫描的面积结果，得到随反应进行反应底物DON与反应生成GSH加合物这两种物质含量的变化情况，进而得到反应的最适温度。
通过设置不同反应温度实验的结果如图4所示。图4表明，20～25℃时，对酶促反应的影响差异性不显著，生成物含量均能达到最大值；在低于15℃时，DON-GSH的生成量随温度的降低而减少；在30～37℃时，DON-GSH的生成量与反应温度的增加呈反比，高于37℃后，LC-HRMS一级扫描检测不到生成物DON-GSH，说明蛋白酶已基本丧失活性。因此，在20～25℃条件下比较适合酶促反应的进行。
以上实验结果表明，蛋白酶进行体外酶促反应的最适宜条件为：在反应体系中，含有25μg ThFhb7纯化蛋白，加入适量反应底物后，用pH值为5.0～7.0的缓冲液补加至200μl，混合后于20～25℃条件下进行反应。
三、活性多肽催化呕吐毒素去环氧基反应
1.实验方法：
1.1体外酶促反应：
将DON(1mg)溶解于新鲜制备的GSH(30.7mg，100μmol)的PBS缓冲液中，并加入蛋白酶，于20℃水浴锅保温24h。
1.2LC-HRMS(/MS)分析
体外反应液通过0.22μm滤膜过滤后，转移到进样小瓶中准备进行LC-HRMS检测。
色谱法在反相XBridge C18，内径150×2.1mm，粒径3.5μm(Waters，Dublin，Ireland)上进行，柱温：35℃。流速为300μLmin-1，进样量3μL。流动相：A：0.1％乙酸水溶液，B：乙腈；洗脱梯度：0～0.2min，A＝90％；0.2～6min，A递减至10％；6～8min，A＝10％；8.1min，A递增至90％；8.1～10min，A＝90％。
(1)Full scan全扫描模式是在配备有电喷雾电离(ESI)源和UHPLC系统(Accela，赛默飞，美国加利福尼亚州圣何塞)的Thermo ScientificTMQExactiveTM上进行的。正离子模式的ESI接口采用以下设置进行：鞘气，40个任意单位；辅助气体，10个任意单位；毛细电压3.8kV；毛细管温度为350℃。将AGC target设置为2×e5。负离子模式的ESI接口设置为2.9kV；鞘气，4个任意单位；辅助气体，0个任意单位。质谱仪可在m/z 200～1000的范围内快速交替正负极扫描模式，该模式分辨力设置为70,000FWHM。
(2)Fullscan+ddms(一级全扫描+自动触发二级)模式的液相方法及色谱条件同上。该方法交替使用全扫描和MS2扫描，归一化碰撞能设置为20eV，产物离子扫描过程中分辨率设置为17500。
(3)PRM模式可用于量化样品中毒素及其衍生物的相对丰度。PRM模式筛选母离子后，在归一化碰撞能量(HCID)下诱导解离，随后在Orbitrap中进行子离子的碎片检测，其分辨力设置为17500。MS/MS中的采集速度设置为每秒3个光谱，并且采用归一化碰撞能，所施加的碰撞能量(15、30和45eV)取决于具体分析物。
LC-HRMS(/MS)分析使用Xcalibur 2.1.0(Thermo Fisher Scientific，美国加利福尼亚圣何塞)分析数据。采用所提出的生物转化产物的色谱峰形状，保留时间(±0.2分钟)和质量(±5ppm)对毒素及其衍生物的提取离子色谱图(EIC)进行了研究。根据二级图谱以及物质基本结构解析中性丢失，推测化学结构。
2.实验结果
图5A为LC-HRMS(方法1)DON与GSH体外酶促反应的提取离子流谱图EIC。如图5A所示，以负离子模式从LC-HRMS(Full scan模式)中得到DON的提取离子流谱图EIC，m/z355.13984(对应[M+CH3COO]-形式，Δ±5ppm)；正离子模式提取到DON-GSH加合物，m/z604.21707(对应于[M+H]+，Δ±5ppm)。
图5B为LC-HRMS2(方法2)DON与GSH体外酶促反应获得的DON-GSH的高能碰撞解离产生的子离子质谱图，[M+H]+(m/z 604.21707，Δ±5ppm)。通过对带正电([M+H]+)的离子进行靶向HRMS2分析，研究了DON-GSH环氧加合物的MS片段。DON-GSH的离子碎裂产生m/z299.0939的特征离子，对应于C14H19O5S+。该特征离子可归因于在C-6处侧链的裂解和除S以外GSH部分的损失。该片段还可以进一步裂解产生m/z281.08482(C14H17O4S+)，263.07425(C14H15O3S+)和231.10218(C14H15O3 +)。m/z 263.07425处的产物离子是HRMS2质谱图的基峰，该产物离子在m/z 299.0939的基础上脱去两分子H2O。
DON-GSH在甘氨酸损失之后，可得到碎片离子m/z 529.18503(C23H33O10N2S+)，也可得到损失脱水谷氨酸的碎片离子475.17466(C20H31O9N2S+)。损失了C-6处侧链的m/z574.20717(C24H36O11N3S+)离子碎片从其GSH部分损失脱水谷氨酸可得到m/z445.16389的特征离子(C19H29O8N2S+)；也可得到脱去谷氨酰胺的428.13733(C19H26O8NS+)。
产物离子为m/z 308.09108(C10H18O6N3S+，对应GSH的[M+H]+)。该碎片离子损失脱水谷氨酸得到m/z 179.04907(C5H11O3N2S+)；损失谷氨酰胺得到m/z162.02251(C5H9O3NS+)。此外，m/z130.05044(C5H8O3N+)、m/z145.06077(C5H9O3N2 +)的产物离子均与GSH相关。
3.实验结论
本发明的活性多肽在体外可以高效将呕吐毒素催化成谷胱甘肽加合物，并且由二级谱图可以知该加合物的形成破坏了在毒性中起主要作用的环氧环结构，可以大大降低毒素的毒性。
四、呕吐毒素GSH衍生物的细胞毒性试验
1.细胞培养
使用DMEM基础培养基，添加10％的胎牛血清和500μl的青霉素链霉素双抗，在37℃、5％CO2的恒温培养箱中培养胰腺癌细胞株(PATU8988)、人胚肾细胞293衍生株(293T)以及人正常食管上皮细胞(HEEC)，待细胞长至瓶壁80％～90％，每2～3d传代一次，用胰蛋白酶消化收集细胞并传代，根据细胞生长状态，选取对数生长期细胞进行实验。
2.CCK8法测定细胞毒性
Cell Counting Kit-8(简称CCK-8)试剂可简便而准确地分析细胞增殖和毒性。将处于对数生长期的3种细胞株分别接种于96孔板中，每孔100ul(约5×103个细胞)，在37℃、5％CO2的条件下常规培养24h，弃去培养基，并进行分组。每组均设3复孔观察，各组处理方式如下：空白组(即仅含培养基的调零孔)，对照组(含10％胎牛血清的DMEM培养基)，DON及其对应的酶促反应后产生的谷胱甘肽加合物均设定低、中、高三个浓度梯度。37℃培养48h后，每孔加入10ulCCK8液继续培养。2h后，小心吸弃孔内培养上清液，通过全波长多功能酶标仪在波长450nm处测出各孔OD值，并计算细胞存活率。
3.实验结果
以细胞浓度5×107L-1种板，CCK-8法酶标仪检测DON及其对应的经酶促反应产生的谷胱甘肽加合物作用48h后胰腺癌细胞株、人胚肾细胞293衍生株以及人正常食管上皮细胞的OD450值。每组均设3复孔观察，各组处理方式如下：空白组(即仅含培养基的调零孔)，对照组(含10％胎牛血清的DMEM培养基)，DON及其对应的酶促反应后产生的谷胱甘肽加合物根据文献结果设置相应浓度进行处理。结果如图6所示。
由图6的结果可知，采用相应浓度的DON处理48h后，胰腺癌细胞株、人胚肾细胞293衍生株以及人正常食管上皮细胞活力均急剧下降，说明DON对细胞均具有较大毒性，而经反应后产生的相应衍生物，在对应相同的浓度下细胞活力与空白对照基本一致，说明DON相应的谷胱甘肽加合物对细胞基本没有毒性作用。
五、表达活性多肽的宿主细胞及其功能研究
1.酵母表达质粒pPICZαA-ThFhb7的构建
来源于长穗偃麦草的去氧基酶基因cDNA长度为865bp(SEQ ID No.:2)，且序列不含Bsp119I和XbaI酶切位点，设计引物序列为：
F：5'-ATTATTCGAAAGAAATCCACCCATCGTCATCACC-3'
R：5'-TTGTTCTAGACTACTTCACCTCGGCATACTTGTC-3'
下划线部分为限制性内切酶位点。该cDNA全基因序列通过PCR获得。PCR产物纯化后，用Bsp119I、XbaI双酶切，同时酶切表达载体pPICZαA，分别回收载体大片段和目的基因片段，再将回收的片段用T4DNA连接酶连接，转化到大肠杆菌DH5α中，经菌落PCR鉴定后，将阳性单克隆菌液测序进行验证。
2.毕赤酵母的转化
首先利用Sac I将重组质粒线性化，将1ml单链DNA样品煮沸5分钟，然后在冰上快速冷却。保持冰上。离心酵母感受态，并用移液管除去LiCl。按顺序添加240μl50％聚乙二醇、36微升1M LiCl、25μl2 mg/ml单链DNA、50μl无菌水中的质粒DNA(5～10μg)。剧烈涡旋每个试管，直到细胞沉淀完全混合(约1分钟)。将试管在30℃孵育30分钟。在42℃的水浴中热冲击20～25分钟。离心细胞以沉淀。将沉淀重悬于1ml的YPD中，并在30℃振荡孵育。1小时和4小时后，在含有适当浓度ZeocinTM的YPD平板上接种25至100μl。将平板在30℃下孵育2～3天。
挑选10个单菌落富集培养，提取酵母染色体DNA，PCR检测阳性重组菌。通常采用pPICZαA通用引物进行PCR鉴定，若以酵母表达载体pPICZαA为模板，则可以扩增出588bp左右的目的片段；若以pPICZαA-ThFhb7为模版，则将扩增出目的条带+588bp大小的目的片段。
3.酶的表达与毒素处理
将筛选到的阳性酵母单菌落(X33/pPICZαA-ThFhb7)与阴性酵母单菌落(X33/pPICZαA)分别接种于25ml的BMGY培养基，28℃～30℃培养至OD600为2～6。室温离心弃去上清，收集细胞，用BMMY液体培养基重悬细胞至OD600＝1左右，转移至500ml的锥形瓶中，28℃～30℃培养，每24h向其中加入甲醇至终浓度为0.5％以保持诱导表达。在诱导48h后，分装菌液5ml到15ml离心管中，并向其中加入呕吐毒素至终浓度为25μg/ml，继续诱导48h～72h，收集菌体，用于LC-HRMS分析。
同时在阳性酵母单菌落(X33/pPICZαA-ThFhb7)与阴性酵母单菌落(X33/pPICZαA)诱导蛋白表达48h后，添加培养基将其稀释为1、1/5和1/20的培养物(初始OD＝0.01)，在含有浓度为400μmDON与不含DON的YPDA固体培养基上培养5天，观察其生长情况。比较过表达活性多肽和空白载体的转基因酵母对DON的耐受性。
4.LC-HRMS
将分装的样品离心弃去上清。置于液氮中速冻，加入少许石英砂，用塑料研磨棒研磨后，加入预冷的1.3ml 75％的甲醇水(含有0.1％甲酸)。震荡10s，室温下超声30min，取上清后转移至一新的离心管中。真空浓缩至干粉状。进样前用100μL20％乙腈重悬，通过0.22μm滤膜过滤后，转移到进样小瓶中进行LC-HRMS检测。检测方法与前述相同。
5.实验结果
5.1LC-HRMS结果
LC-HRMS结果如图7所示。以LC-HRMS(Full scan)正离子模式从DON处理表达活性多肽的酵母中检测到DON-GSH加合物，m/z 604.21730(对应于[M+H]+，Δ±5ppm)。
LC-HRMS检测结果表明：将去环氧基酶基因转移至毕赤酵母中，可以高效将呕吐毒素催化成谷胱甘肽加合物。转基因酵母提高了耐毒素的能力，证明ThFhb7可以以呕吐毒素为底物并将其催化成相应的GSH加合物，从而起到体内解毒作用。
5.2转基因酵母DON耐受性实验结果
在有/无DON的YPDA培养基上比较了过表达ThFhb7和空白载体的转基因酵母的生长活力。在酵母培养基上添加一系列稀释度分别为1、1/5和1/20倍的酵母诱导蛋白表达的培养物(初始OD＝0.01)，并在30℃下生长5天，观察其生长情况。结果如图8所示，发现过表达ThFhb7的转基因酵母在含DON培养基上的生长活力显著高于空白载体的转基因酵母。
在转基因酵母的DON耐受性实验中，发现在含有浓度为400μm DON的YPDA培养基上，含有ThFhb7的转基因酵母的生长活力明显高于转空白载体的转基因酵母，进一步说明ThFhb7能在酵母体内表达，并能催化谷胱甘肽与DON反应，进行解毒，从而提高酵母对DON的耐受能力。
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。
序列表
<110> 山东农业大学
<120> 去环氧基催化活性多肽用于呕吐毒素解毒的用途
<130> BH2000029-1
<141> 2020-03-05
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 281
<212> PRT
<213> Elytrigia ponticum
<400> 1
Met Ala Thr Ser Ala Ser Thr Ser Thr Pro Ile Ile Pro Thr Ala Ile
1 5 10 15
Ala Gly Ala Pro Pro Val Ala Gly Thr Cys Cys Ala Val Ala Pro Thr
20 25 30
Leu Ser Ala Leu Ala Leu Ala Pro Leu Ala Val Pro Thr Thr Thr Thr
35 40 45
Thr Val Leu Met Pro Ala Ile Ser Ser Val Ala Ala Ser Leu Ala Val
50 55 60
Pro Ala Cys Ala Leu Pro Ala Ala Gly Ser Ala Pro Ala Thr Leu Pro
65 70 75 80
Ile Ile His Ala Pro Ala Thr Ala Ser Leu Val Gly Ala Ser Pro Ala
85 90 95
Ile Ala Ala Thr Leu Gly Ala Thr Thr Pro Ala Ser Gly Ala Gly Ala
100 105 110
Leu Pro Pro Pro Gly Leu Leu Ala Thr Ala Val Gly Ala Ala Met Pro
115 120 125
Gly Leu Leu Ile Pro Leu Ser Gly Ile Ala Ala Ser Pro Gly Leu Ala
130 135 140
Ala Thr Ala Ala Pro Ala Ser Ala Val Ala Ala Ala Pro Thr Ala His
145 150 155 160
Val Gly Leu Met Val His Gly Leu Pro Leu Ala Pro Ala Thr Ala Ala
165 170 175
Val Thr Leu Ala Gly Pro Val Ala Ala Ala Gly Leu Ser Ser Thr Ala
180 185 190
Ala Leu Gly Met Val Gly Gly Ala Ala Ala Leu Met Met Gly Ser Leu
195 200 205
Ala Ala Met Leu Gly Ala Leu Ala Ala Leu Pro Ala Leu Ala Ala Ser
210 215 220
Gly Pro Pro Leu Leu Gly Gly Ala Ala Thr Thr Ala Ala Met Ile Val
225 230 235 240
Gly Gly Thr Leu Ala Met Met Ala Ala Thr Leu Pro Val Ser Gly Thr
245 250 255
Gly Gly Ala Ala Ala Cys His Gly Ala Ile Pro Gly Gly Leu His Ala
260 265 270
Ala Leu Ala Leu Thr Ala Gly Val Leu
275 280
<210> 36
<211> 846
<212> DNA
<213> Tinopyrum_ponticum
<400> 36
atggccacct ccgcctccac ctccacccca atcatcttct acgacatagc ccagcggccc 60
cccgtcgcag aaacatgctg cgccgtcaac ccttggaaat ccagactggc cctcaacttc 120
aaggccgtcc cctacacaac cacctgggtg aagatgccag acatcagcag cgtccgcgcc 180
agcctcaacg tgccagcgtg tcgcaagttc gccgacggct ccgacttcaa caccctgccc 240
atcatccacg accccgcgac cgactccctc gtcggcgact cctttgacat cgccgcctac 300
ctgcagcgca cgtatcccgc ctcgggcgcc ggcgacctct tcccccccca gaagctcgac 360
tacgcagtcg gcagggacat gccgcagctg ctcatcccgc tgtccgagat tcgcgcatca 420
ccagagctcg cagactacgc ccgcttcaac agcaacgttg acgcagcctt taccgcgcac 480
gtgggcctca tggtccacgg acttcccttg gatcctgcca ccgccgacgt gaccaaggcc 540
gagtttgtgc ggcgcgcggg gctctcatcg tgggacgact tggaaatggt tggcgaggcg 600
cgcgacaaga tgatgcagtc cctccgaaac atgctggggg acctggctgc cttgtttcgg 660
aaagatgcga gcgggccgtt cctgttgggg cagagggcca cgtatgcgga catgattgtc 720
ggtggctggt tgcgcatgat gcgggcgacg ttgccggtga gtgagtggca ggaggcgaga 780
gcctgccacg gagctatctt tgggcagctg catgatgcgc tggacaagta tgccgaggtg 840
aagtag 846

Claims (7)

1.去环氧基催化活性多肽在用于制备呕吐毒素解毒产品中的用途，其特征在于，所述活性多肽为SEQ ID No:1所示的氨基酸序列，所述活性多肽使呕吐毒素中的环氧基与谷胱甘肽催化反应生成谷胱甘肽化衍生物。
2. 去环氧基催化活性多肽用于样品脱毒的用途，其特征在于，所述活性多肽为SEQ IDNo:1所示的氨基酸序列，所述样品为呕吐毒素污染的样品，所述样品为食品、饲料或饮料，所述样品包含谷胱甘肽，或向所述样品加入谷胱甘肽，所述活性多肽使呕吐毒素中的环氧基与谷胱甘肽催化反应生成谷胱甘肽化衍生物。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述样品来源于镰刀菌属、头孢菌属、漆斑菌属和木霉属的真菌侵染的植物。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述镰刀菌属真菌选自禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、粉红镰刀菌、黄色镰刀菌和雪腐镰刀菌。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述用途为食品或饲料加工领域中的用途。
6.一种降低或减轻细胞毒性的非治疗目的的方法，其特征在于，其包括将SEQ ID No:1所示氨基酸序列的多肽引入细胞或与细胞接触的步骤，所述细胞包括胰腺癌细胞株PATU8988、人胚肾细胞293衍生株293T和人正常食管上皮细胞HEEC。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，进一步包括在所述细胞内引入具有表达所述多肽的基因的步骤。
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