CN111418382B - 一种甘薯薯块无损接种黑斑病菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种甘薯薯块无损接种黑斑病菌的方法，具体为将完整无损的甘薯薯块置于病菌孢子悬浮液与接种载体的混合物中进行薯块接种，在密闭环境下进行接种管理。病菌孢子悬浮液的浓度不大于10⁶个孢子/mL，载体与病菌孢子悬浮液的体积比为6.5：1，接种时间不超过72h。该接种方式不破坏薯皮、与薯块实际生长及储藏时的条件极为相似，最大限度模拟了黑斑病毒侵染薯块的自然全过程。避免了针刺薯块接种造成的薯块伤口，规避了后期试验或鉴定过程中薯块容易腐烂及由腐烂造成的无法再进行试验及鉴定的问题，使研究薯块表皮对黑斑病的抗性成为可能，保证了感染黑斑病的薯块在试验过程中的完整性，使感病薯块能够有效进行后续试验，具有重要的应用价值。

Description

一种甘薯薯块无损接种黑斑病菌的方法

技术领域

本发明属于农业植保植物病原菌接种技术，具体涉及一种甘薯薯块无损接种黑斑病菌的方法。

背景技术

甘薯黑斑病在世界各甘薯产区均有发生，每年由该病造成的甘薯产量损失达到5％～10％，危害严重时造成损失能达到20％～50％，甚至更高。此外，病薯可产生甘薯黑疱霉酮(ipomeamarone)等呋喃萜类有毒物质，人和家畜食用可引起中毒，严重时会造成死亡。该病由甘薯长喙壳菌(Ceratocystis fimbriata Ellis et Halsted)侵染甘薯引起，且可通过种薯、种苗及土壤等多种途径传播，很难彻底根除。

目前生产上通过选育抗黑斑病甘薯品种，杀菌剂处理种薯种苗，高剪苗等手段综合控制甘薯黑斑病的发生。而这其中无论是评价不同甘薯品种薯块对甘薯黑斑病的抗性，还是筛选处理薯块防治黑斑病的药剂，或者研究甘薯黑斑病在薯块上的发生扩展规律，都需要在薯块上进行甘薯黑斑病菌的接种操作。

目前对甘薯薯块接种黑斑病菌只有一种针刺接种法，该方法需要使用接种针蘸孢子悬浮液针刺薯块或在薯块上打微孔注入孢子悬浮液，保湿培养促进接种部位发病。该方法能在甘薯的具体位置进行针刺注入孢子悬浮液，能够较为准确的确定黑斑的形状及半径，但是该方法存在明显的不足：(1)人为造成了薯块的伤口并深及真皮，在进行薯块的抗病鉴定时，不同品种薯块薯皮及皮下组织抵抗病菌侵入的作用无法评价；(2)人为造成薯块伤口进行接种的方法，与病菌在自然环境中通过接触薯块表皮、然后附着在薯块表面，进而侵入薯块的侵染过程不同。造成在筛选防治薯块黑斑病的杀菌剂，研究感病薯块及薯块出苗过程中病害发展时，无法完全模拟自然发病，对试验结果具有较大的干扰；(3)人为造成薯块伤口接种，在保湿或育苗过程中杂菌会通过伤口侵染薯块，造成薯块腐烂或大面积感染，干扰试验结果，甚至无法得到试验结果。所以，针刺法虽然能够保证甘薯薯块在针刺部位发生黑斑病，但完全无法模拟自然状态下的发病过程。

因此，为了能够最大限度模拟黑斑病菌侵染薯块的自然全过程，开展以带病薯块为材料的多方面试验工作，提高甘薯黑斑病的综合防控技术水平、建立一种针对甘薯薯块的无损且能够有效侵染的接种方法，是丞待解决的技术问题。

发明内容

针对上述问题，本发明提出了一种甘薯薯块无损接种黑斑病菌的方法，该方法创造性的将没有任何损伤的甘薯进行病菌接种，能够最大限度的模拟自然条件下甘薯黑斑病菌侵染薯块的过程，能够控制接种强度，进而控制甘薯薯块的发病程度，更能够满足后续试验的不同要求。

本发明是通过以下方案实现的

一种甘薯薯块无损接种黑斑病菌的方法，包括将完整无损的甘薯薯块置于甘薯的黑斑病致病菌孢子悬浮液与接种载体均匀混合形成的第一混合物中进行薯块接种，并在密闭环境下进行接种管理。

进一步地，所述的接种载体为蛭石、珍珠岩和水或者为细沙、珍珠岩和无菌水；所述黑斑病致病菌孢子悬浮液的浓度不大于10⁶个孢子/mL；所述第一混合物中接种载体与黑斑病致病菌孢子悬浮液的体积比为6.5：1。优选地，黑斑病致病菌孢子悬浮液的浓度可以为2.5×10⁵个孢子/mL、5×10⁵个孢子/mL、7.5×10⁵个孢子/mL、1×10⁶个孢子/mL等，根据接种需要对其浓度进行调节。

进一步地，接种载体位蛭石、珍珠岩和无菌水时，蛭石与珍珠岩的体积比为2～5：1，如2：1、3：1、4：1、5：1，蛭石及珍珠岩的干混物与无菌水的体积比为12：1；接种载体为细沙、珍珠岩及无菌水时，细沙与珍珠岩的体积比为3～5：1，如3：1、4：1、5：1，细沙及珍珠岩的干混物与无菌水的体积比为12：1。优选地，所述蛭石的平均粒径为1～3mm，珍珠岩的平均粒径为2～4mm，细沙的平均粒径为0.6～1mm。

进一步地，蛭石、细沙及珍珠岩在使用前进行清洗、干燥及灭菌处理。

进一步地，所述薯块接种的具体过程如下：每个薯块周围均包裹0.8～1.2cm厚的第一混合物；包裹后的薯块能够上下排放3～5层。

进一步地，所述密闭环境下管理的温度为20～30℃，时间为24～72h，如24h、36h、48h、60h、72h。

进一步地，密闭环境下管理的时间为48h。

进一步地，该方法包括以下步骤：

(1)选取薯块表皮干净，无创伤无大块附着物的新鲜甘薯，备用；

(2)采用清洗、干燥且杀菌后的蛭石或沙子与珍珠岩及无菌水均匀混合作为接种载体，备用；

(3)制备浓度不大于10⁶个孢子/mL的甘薯黑斑病致病菌孢子悬浮液，并与步骤(2)的接种载体进行均匀混合得到第一混合物；

(4)取步骤(1)中的薯块，每个薯块包裹0.8～1.2cm厚的第一混合物后置于容器中，上下排列3～5层；

(5)将步骤(4)放置薯块后的容器封闭，温度为20～30℃条件下接种24～72h，即完成无损接种。

进一步地，步骤(2)所述蛭石与珍珠岩的体积比为2～5：1，蛭石及珍珠岩混合物与无菌水的体积比为12：1；细沙与珍珠岩的体积比为3～5：1，细沙及珍珠岩混合物与无菌水的体积比为12：1。优选地，所述蛭石的平均粒径为1～3mm，珍珠岩的平均粒径为2～4mm，细沙的平均粒径为0.6～1mm。

进一步地，步骤(3)第一混合物中接种载体与甘薯黑斑病致病菌孢子悬浮液的体积比为6.5：1。

本发明还提供了一种具体的甘薯薯块无损接种黑斑病菌的方法，该方法包括以下步骤：

(1)接种用薯块准备：选取薯块表皮干净，无创伤无大块附着物的新鲜甘薯，无需清洗、直接备用；

(2)接种载体准备：取蛭石及珍珠岩分别进行清洗、干燥及杀菌处理，然后将蛭石与珍珠岩按照体积比为2：1进行混合，蛭石与珍珠岩的混合物再与无菌水按照12：1的体积比进行均匀混合得到第一混合物，备用；

或者取细沙与珍珠岩分别进行清洗、干燥及杀菌处理，然后将细沙与珍珠岩按照体积比为3：1进行混合，细沙与珍珠岩的混合物再与无菌水按照12：1的体积比进行均匀混合得到第一混合物，备用；

(3)病菌孢子悬浮液准备：将病原菌(甘薯长喙壳菌Ceratocystis fimbriata)接种于PCA培养基上(或者在其他适宜该病原菌生长的培养基上培养均可)，在25℃条件下避光培养8～10天，然后用无菌水将分生孢子洗下，配置不同浓度的孢子悬浮液(血球计数法进行计数得到孢子液浓度)；

(4)用步骤(2)的其中一种接种载体(蛭石与珍珠岩或者细沙与珍珠岩)与步骤(3)配置的病菌孢子悬浮液按照6.5：1的体积比进行均匀混合，备用；

(5)薯块接种：取上端敞口的接种用容器，首先在容器底部铺1cm厚的第一混合物，然后将薯块整齐排列在第一混合物上，相邻薯块间均留有0.8～1.2cm的间隙；在排列后的薯块上均匀覆盖厚度为0.8～1.2cm的第一混合物、且相邻薯块的间隙之间均填充第一混合物；

然后重复上述操作，在上层继续排列薯块，排列后均匀覆盖第一混合物，依次向上排列薯块及均匀覆盖第一混合物，容器可放置3～5层薯块，最上层薯块需要被第一混合物所覆盖，厚度在2～3cm之间，然后封口密封；

(6)接种期间管理：将步骤(5)封口后的容器在温度为20～30℃的条件下接种48h；

(7)接种后处理：步骤(6)接种完成后，将薯块从接种容器内取出，注意轻拿轻放，避免破坏表皮。

如果薯块表面附着有较多的接种载体，将薯块在自然通风情况下晾干，拿起薯块轻轻抖落附着的接种载体，避免直接冲洗薯块，处理完成后即完成无损接种的全部操作。

与现有技术相比，本发明具有以下积极有益效果

现有技术中对于甘薯薯块的接种均是采用针刺法才能达到接种的效果，但是针刺法完全无法模拟甘薯的自然发病情况，而且针刺造成甘薯表皮伤害无法对其进行皮下组织的抗病性评价，在保湿或育苗过程中更易造成其腐烂及内部感染，无法再进行其他实验研究。且操作繁杂，需要逐个进行接种操作。

本发明则无需清洗甘薯，不破坏薯皮，不需要将薯块直接浸泡孢子悬浮液，该接种方式与薯块实际生长及储藏时的条件极为相似，最大限度的模拟了黑斑病毒侵染薯块的自然全过程。而且该方法还可以避免针刺薯块接种造成的薯块伤口，规避了后期试验或鉴定过程中薯块容易腐烂以及由于腐烂造成的无法再进行试验及鉴定的问题，所以该方法不仅使研究薯块表皮对抗黑斑病的抗性成为可能，而且最大程度上保证了感染黑斑病的薯块在试验过程中的完整性，使得该薯块能够有效进行后续多个试验，填补了技术空白，具有重要的应用价值；

本发明的接种方法可以使薯块在没有针刺的情况下稳定发病，还可以在接种过程中控制被接种薯块病斑的数量；

该方法操作简单，易于进行，无需对薯块进行清洗，也无需逐个进行针刺。

附图说明

图1为本发明对甘薯薯块进行无损接种甘薯黑斑病菌的过程图；

图中，A图为制备甘薯黑斑病菌分生孢子悬浮液所用的接菌平板；B图为制备好的一定浓度的甘薯黑斑病菌孢子悬浮液；C图为准备接种用的无外伤健康甘薯；D图为准备接种用的无外伤健康甘薯；E图为成功进行无损接种的薯块黑斑病的发病特征；F图为成功进行无损接种的薯块可以正常萌芽。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便于对本发明技术方案的理解，但并不用于对本发明保护范围的限制。

1.所用实验材料

甘薯薯块：甘薯品种为商薯19。选择表皮光滑，没有明显损伤的甘薯薯块，大小尽量保持均匀一致，放入薯窖中备用；

接种载体：将蛭石和珍珠岩清洗并干燥灭菌后按照2:1体积混匀；然后在接种薯块前，按照每600cm³干燥的接种载体需先加水50ml，混匀得到；

分生孢子悬浮液：将病原菌(甘薯长喙壳菌Ceratocystis fimbriata)接种于PCA培养基上，在25℃避光培养8～10天，培养完成后用无菌水将分生孢子洗下，配置浓度为2.5×10⁵个孢子/mL、5×10⁵个孢子/mL、7.5×10⁵个孢子/mL和1×10⁶个孢子/mL四个浓度的孢子悬浮液；

将四种不同浓度的孢子悬浮液各取100ml分别与650ml的接种载体混合，得到四种不同孢子悬浮液的第一混合物；每种不同的浓度均配置出多份备用。

2.接种方法具体如下：

准备长、宽、高为45cm×15cm×30cm的带盖容器，在容器底部铺上1cm厚的第一混合物，将薯块从薯窖内取出，再一次进行检查，把外观完好且大小均匀的薯块均匀排列在第一混合物上，相邻薯块间留有1cm的间隙，一层薯块摆好后，在其上面覆盖1cm后的第一混合物、间隙中也填充第一混合物；

随后向上进行第二层薯块排列，薯块排列后在其上面均匀覆盖厚度为1cm的第一混合物(间隙也填充)；随后向上进行第三层薯块排列，薯块排列后在其上面均匀覆盖厚度为1cm的第一混合物(1cm间隙也填充)；随后向上进行第四层薯块排列，薯块排列后在其上面均匀覆盖厚度为2～3cm的第一混合物(1cm间隙也填充)。

覆盖完成后密封，在20～30℃条件下接种相应时间即可。

实施例1

按照上述的实验材料及接种方法，取90块相同的甘薯薯块分为3组，每组30块；3组接种时使用的孢子悬浮液浓度均为1×10⁶个孢子/mL；最后在20～30℃条件下接种的时间分别为24h、48h、72h；

每组接种完成后，取出晾干，均采用每10块一组为一个重复、放入25℃恒温箱保湿培养。从接种开始日计算，均在6天后进行薯块病斑数调查，结果见表1。

表1不同接种时间下甘薯薯块的发病

注：同列数据后不同小写字母表示在0.05水平差异显著，不同大写字母表示在0.01水平差异显著。

根据表1的试验结果，种时间分别为24h、48h、72h，薯块的平均病斑数分别为23.5个、47个、46.6个。因此，三个时间段均能够达到接种的效果，接种48h时可以达到突出的效果。

实施例2

按照上述的实验材料及接种方法，取120块相同的甘薯薯块分为4组，每组30块；每个组采用的孢子液浓度分别为2.5×10⁵个孢子/mL、5×10⁵个孢子/mL、7.5×10⁵个孢子/mL、1×10⁶个孢子/mL；最后在20～30℃条件下接种的时间均为48h；

每组接种完成后，均采用每10块一组为一个重复、放入25℃恒温箱保湿培养。从接种开始日计算，6天后进行薯块病斑数调查，结果见表2。

表2不同接种强度下接种薯块的发病

注：同列数据后不同小写字母表示在0.05水平差异显著，不同大写字母表示在0.01水平差异显著。

根据表2可得，采用的孢子悬浮液浓度分别为2.5×10⁵个孢子/mL、5×10⁵个孢子/mL、7.5×10⁵个孢子/mL、1×10⁶个孢子/mL的四个处理，薯块平均病斑数分别为3.7个、21.3个、25.7个、32.8个，各处理间差异极显著。

所以，该方法能够很好的在甘薯薯块无损的条件下对其成功接种，而且还能够根据对于孢子悬浮液浓度的调整获得发病程度合适的薯块。具有很好的应用前景及效果。

实施例3

按照上述的实验材料及接种方法，取540块相同的甘薯薯块分为6组，每组90块；每个组采用的孢子悬浮液浓度为7.5×10⁵个孢子/mL；最后在20～30℃条件下接种的时间均为48h；

接种完成后，将薯块晾干，轻轻抖掉薯块表皮上多余的接种载体，分重复进行药剂浸薯处理(每组均为：30块甘薯为一个重复，重复3次)，浸薯时间10min。

6组药剂浸薯具体为：一个空白对照(不进行药剂处理，采用清水)，其他5组具体为SY01有效成分用量分别为250mg/kg、333mg/kg、500mg/kg，异菌脲有效成分用量475mg/kg，甲基硫菌灵有效成分用量为500mg/kg。

浸薯完成后，将薯块晾干后排入育苗基质，移入人工气候室保持30～35℃直至出苗，出苗后移入日光温室生长。每当成苗数达到一定规模时，进行一次拔苗调查，调查总苗数和病苗数，病苗的判定标准为薯苗茎基部，特别是白色茎段部分有黑褐色、黑绿色的圆形、椭圆形或梭型病斑，病斑呈中心稍凹陷，部分会在病斑上生成子囊壳。

在第一次调查时，每组重复挖出10块甘薯调查薯块的完好情况，薯块除感染黑斑病外，薯型完好，没有缩水、腐烂和杂菌生长，能够正常出苗的视为完好薯块，结果见表3。

表3出苗调查及薯块情况调查

注：同列数据后不同小写字母表示在0.05水平差异显著，不同大写字母表示在0.01水平差异显著。

根据表3可知，所有薯块均成功接种甘薯黑斑病菌，薯块发病率均为100％。薯块黑斑病发生后，引起了薯苗的严重发病，清水对照的薯苗发病率达到了59.65％。

通过本方法进行黑斑病菌接种的薯块，由于没有破坏薯块表皮，所有调查薯块完好率达到100％，能正常萌发，完全具备了进行带菌育苗的条件。通过对药剂处理薯块的效果调查看到，药剂SY01有较明显的防治效果，有效成分用量为250mg/kg、333mg/kg、500mg/kg时，防治效果分别为33.46％、40.48％、41.28％，显著高于异菌脲和甲基硫菌灵的防治效果。本试验最高防治效果的处理发病率也达到了35.02％。因此，该方法能够对完整无损的甘薯薯块进行高效接种，而且100％发病，能够正常萌发，完全具备了进行带菌育苗的条件。操作简单不繁琐，与甘薯的自然感染环境高度相似，具有很好的实际应用效果。

Claims (3)

1.甘薯薯块无损接种黑斑病菌的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)选取薯块表皮干净，无创伤无大块附着物的新鲜甘薯，备用；

(2)采用清洗、干燥且杀菌后的蛭石或细沙与珍珠岩及无菌水均匀混合作为接种载体，备用；所述蛭石与珍珠岩的体积比为2～5：1，蛭石及珍珠岩的干混物与无菌水的体积比为12：1；细沙与珍珠岩的体积比为3～5：1，细沙及珍珠岩的干混物与无菌水的体积比为12：1；

(3)制备浓度不大于10⁶个孢子/mL的黑斑病致病菌孢子悬浮液，并与步骤(2)的接种载体进行均匀混合得到第一混合物；第一混合物中接种载体与黑斑病致病菌孢子悬浮液的体积比为6.5：1；

(4)取步骤(1)中的薯块，每个薯块包裹第一混合物后置于容器中；

(5)将步骤(4)放置薯块后的容器封闭，温度为20～30℃条件下接种24～72h；

(6) 将薯块从接种容器内取出，注意轻拿轻放，避免破坏表皮，如果薯块表面附着有较多的第一混合物，将薯块在自然通风情况下晾干，拿起薯块轻轻抖落附着的第一混合物，避免直接冲洗薯块，处理完成后即完成无损接种的全部操作。

2.根据权利要求1所述的甘薯薯块无损接种黑斑病菌的方法，其特征在于，所述薯块接种的具体过程如下：每个薯块周围均包裹0.8～1.2cm厚的第一混合物；包裹后的薯块能够上下排放3～5层。

3.根据权利要求1所述的甘薯薯块无损接种黑斑病菌的方法，其特征在于，密闭环境下管理的时间为48小时。

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