CN113994787B - 一种测定药剂对甘薯薯块新鲜伤口保护作用的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药剂效果评价技术领域，具体涉及一种测定药剂对甘薯薯块新鲜伤口保护作用的方法。包括以下步骤：将完整无损的甘薯薯块先进行药剂处理，然后将薯块静置使薯块晾干；在薯块表面制造等距且大小均匀的多个深入真皮的伤口；对薯块无伤口部位用保鲜膜保护后，使用可侵染薯块新鲜伤口的病原菌孢子悬浮液向薯块伤口处喷雾接种，晾干后保湿培养；当空白对照薯块伤口内生长的菌丝覆盖范围开始超出伤口边缘时，对各处理薯块伤口发病情况进行统计，计算薯块表面伤口的发病率，完成测定。该方法与实际生产中药剂处理薯块的时机完全一致，最大限度的模拟了病菌侵染薯块伤口的自然过程。该方法填补了技术空白，具有重要的应用价值。

Description

一种测定药剂对甘薯薯块新鲜伤口保护作用的方法

技术领域

本发明属于药剂效果评价技术领域，具体涉及一种测定药剂对甘薯薯块新鲜伤口保护作用的方法。

背景技术

中国甘薯种植面积约670万hm²，年产量约1亿t，居世界首位。甘薯以块根作为主要的营养物质储藏载体，含水量高、组织柔嫩，容易在采收、运输、储藏过程中出现薯块损伤，其中伤皮现象最为普遍。薯皮对薯块有保护作用，一旦受损就容易造成病害侵染，从而引起薯块变质、腐烂，严重的可引起储藏期烂窖，损失巨大。

目前主要采取两种手段来降低因薯块损伤造成的收获后损耗，一种是通过改变环境条件或是利用外源激素等刺激薯块快速愈合伤口；另一种是施用药剂，防止受损部位被病菌侵染破坏，形成新的侵染源。在选择处理薯块的杀菌剂或保鲜剂时，需进行药剂的筛选试验选取效果理想的药剂种类加以推广应用。

现阶段普遍采用的药剂筛选方法是首先人工在无病薯块上随机制造擦伤伤口；然后与已经发病的薯块在水中混合放置一段时间或放入孢子悬浮液中接种；晾干后进行药剂处理，通过对薯块喷雾或浸薯块进行；储藏一段时间后对每个薯块的病情严重度进行主观分级，计算每个处理的病情指数后再进行防治效果计算。该方法采取的是先人为制造随机伤口，然后进行伤口的病原菌接种，最后进行药剂处理，虽然能够成功进行伤口接菌，但是存在明显的不足：(1)该方法中薯块伤口产生与药剂处理的时间顺序与实际生产不符。薯块收获时，有损伤且无法自然愈合的薯块会被捡出。完好的商品薯在入窖前或调运前会进行药剂保护处理，而薯块伤口基本上是在入窖和运输搬运过程中产生的。因此，由于该方法的试验步骤和实际应用中药剂使用和薯块伤口产生的顺序有出入，即先有病原菌侵染伤口，后进行药剂处理，不适合评价药剂是否有保护薯块伤口免遭病菌侵染的作用；(2)接菌的方式与自然传播不符。薯块伤口被病原菌侵染，特别是储藏期和运输期间，只需环境湿度较大，或有凝结水滴存在即可通过子囊孢子或其他孢子或菌丝完成。该方法的接菌方式是病薯和有伤口的健薯在水中混合放置或是放入孢子悬浮液中，在实际生产中是不会发生这类情况的。(3)评价发病严重度的方法是对整个薯块进行主观分级，受薯块本身影响较大，不够客观。每个薯块的形状均不相同，人为随机制造的伤口分布和大小也有差别，每个薯块的接种量也不好控制，病斑的扩大也会受薯块外形的影响，以上原因会导致发病严重度不同，对后期的药剂防治效果评价造成干扰。(4)发病调查以薯块为单位进行，每个薯块仅有一个数据，如果想增加样本量，提高评价精度，就需要增加薯块的使用量。甘薯薯块体积较大，增加薯块数量会造成接种病原菌、药剂处理、放置等环节操作难度增加，还会造成接种和药剂处理等环节薯块间有差异。所以，该方法虽然能够保证甘薯薯块接种，但无法模拟自然状态下的薯块受伤及病害侵染过程，不适合进行药剂对伤口保护作用的评价，难以提高样本数量，评价精度无法保证。

发明内容

本发明为了能够客观评价药剂对甘薯薯块新鲜伤口的保护作用，有效减少甘薯薯块在储藏运输过程中的病害损失，建立了一种测定药剂对甘薯薯块新鲜伤口保护作用的方法。该方法先对甘薯薯块进行药剂处理，然后制造伤至真皮的伤口，采取微量喷雾的接种方法，能够最大限度的模拟自然条件下病菌侵染薯块伤口的过程；通过在同一薯块制造多个相同大小伤口及微量喷雾接种，使统计同一薯块的伤口发病率成为新的病情调查方法，且每个薯块可单独统计出发病率，使客观性和便捷性进一步提高。

本发明是通过以下方案实现的：

1.选择无明显损伤和畸形的甘薯薯块，洗净晾干备用。

2.进行药剂对薯块的处理，处理方式为浸薯块、喷淋薯块或熏蒸薯块。图1所示的即为药剂浸薯块。同时设空白对照组，空白对照组采用清水处理薯块并晾干。

3.将薯块静置一段时间，可根据所用药剂的作用原理调整静置时间，保证薯块充分晾干，施用无内吸作用的药剂后，静置时间不超过6小时。施用内吸性药剂后，静置时间不少于3小时。

4.采用等距多刀口的刮丝刀或其他工具，在药剂处理过的甘薯块一面制造切开真皮的伤口，伤口最好成排排列，各个伤口间距离在5～10mm，伤口深度在1mm左右，伤口直径为4mm～5mm，每个薯块伤口数5～20个。

5.选择可侵染薯块新鲜伤口的病原菌，根据需要配置不同浓度的孢子悬浮液或菌悬液，利用手持微量喷雾器(雾滴直径小于50微米，每分钟喷雾量小于500毫升)对薯块的伤口面喷雾。喷雾时，将同一重复的薯块排放在一起，伤口面向上，用保鲜膜将整个薯块覆盖固定，在伤口部位将保鲜膜开口，露出全部伤口，且利用保鲜膜伸展性将开口边缘贴合在伤口区域之外，喷雾对准薯块伤口面的斜上方，使雾滴飘落在伤口面，以喷湿伤口面而无明显流液现象为宜，即可停止接种。

6.接种后的薯块去掉保鲜膜静置通风，待薯块伤口面无明显湿痕后，立即进行避光保湿培养。培养温度为25℃～28℃，将薯块平放在容器中，伤口面朝上，不能堆叠，设保湿装置(如盛有水的小水杯，湿润的吸水纸等)，容器加盖或用薄膜覆盖，注意盖或薄膜不能接触薯块的伤口面。培养时间为7～15d。

7.达到培养时限(空白对照处理的伤口内菌丝覆盖范围开始超出伤口边缘)后，将薯块从容器中取出，对每个薯块的伤口数和发病伤口数计数。计算每个薯块的发病率，以及每重复和每处理的薯块发病率，根据发病率评价药剂对薯块伤口的保护作用。

与现有技术相比，本发明具有以下积极有益效果：

现有技术采取的是先制造擦伤伤口，水中与病薯混合或用孢子悬浮液浸泡接种，然后施药处理，最后通过对薯块整体发病分级进行主观评价的方法，该方法无法模拟甘薯薯块伤口被病菌侵染的自然发病情况；而且不能保证每个薯块的接种量一致；特别是由于施用药剂在接种后，施用药剂前病菌侵染伤口的情况受多种条件影响，伤口病菌侵染情况的不同又会影响施药后的效果，容易造成不同批次试验的结果不一致；薯块整体发病易受薯块本身形状、大小、伤口部位和形状的影响，容易造成不同批次间结果差异大；样本量不易扩大，整体样本数偏小。

本发明采取先进行药剂处理，一定时间后在同一薯块上制造多个规则伤口，将薯块伤口外其他部位用保鲜膜保护后，使用相同浓度菌液或孢子悬浮液微量喷雾接种，统计薯块伤口发病率进行保护效果计算。该方法与实际生产中药剂处理薯块的时机完全一致，最大限度的模拟了病菌侵染薯块伤口的自然过程。该方法填补了技术空白，具有重要的应用价值。

而且该方法创新了人工制造伤口的形式，采取一个薯块上制造多个排列整齐的伤口，伤口大致一致，从而可以按照单一薯块的伤口感病数进行计算每块甘薯的伤口感染率，规避了因为薯块形状，伤口部位等造成的病害发展不一致现象，评价更加客观准确。

另外，微量喷雾接种可保证接种效率的同时，结合保鲜膜保护，避免大液量冲刷薯块表面破坏药剂对薯块的保护。

再者，将调查时间设置在空白对照处理的伤口内菌丝覆盖范围开始超出伤口边缘时，既可以清晰统计发病情况，又保证了发病充分，是调查方法的创新。

附图说明

图1为健康甘薯薯块准备及药剂处理薯块；

图2为制备甘薯黑斑病菌分生孢子悬浮液所用的接菌平板；

图3为在浸药后的薯块上切出的伤口；

图4为薯块伤口内黑斑病的发病特征；

图5为药剂处理薯块和清水对照(空白对照)薯块的发病情况对比图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便于对本发明技术方案的理解，但并不用于对本发明保护范围的限制。

1.所用实验材料

甘薯薯块：甘薯品种为商薯19。选择表皮光滑，没有明显损伤的甘薯薯块，大小保持均匀一致，放入薯窖中备用；

分生孢子悬浮液：以甘薯黑斑病菌为本次实例所用的病原菌。将引起甘薯黑斑病的病原菌(甘薯长喙壳菌Ceratocystis fimbriata)接种于PCA培养基上，如图2所示，在25℃避光培养8～10d，培养完成后用无菌水将分生孢子洗下，按要求配置各种浓度的分生孢子悬浮液(如用其他病原菌，需根据病原菌的特性进行孢子悬液或菌悬液的准备)。

2.人工制造薯块伤口的方法如下：

采用等距多刀口的刮丝刀在药剂处理过的甘薯块一面制造切开真皮的伤口，伤口成排排列，各个伤口间距离在5～10mm，伤口深度在1mm左右，伤口直径为4mm～5mm，每个薯块伤口数5～20个。如图3所示。

3.薯块的伤口接种方法如下：

将同一重复的薯块排放在一起，伤口面向上，薯块下可填充一些物品(如泡沫块、海绵等)，使同一排薯块呈现中间略高，两边依次降低的状态，用保鲜膜将此排薯块覆盖固定，在伤口面开口，使开口边缘贴合在伤口区域之外。根据需要配置不同浓度的孢子悬浮液，利用手持微量喷雾器对薯块的伤口面喷雾，喷雾对准薯块伤口面的斜上方，使雾滴飘落在伤口面，以喷湿伤口面而无明显流液现象为宜，即停止接种。

实施例1

按照上述的实验材料及接种方法，取75块相同的甘薯薯块分为5个处理，每个处理分3组，每组5块；各处理接种时使用的甘薯黑斑病菌孢子悬浮液浓度均为1×10⁵个孢子/mL；待薯块伤口面无明显湿痕后，将薯块平放在容器中，伤口面朝上，不堆叠，容器四周放湿润的吸水纸，容器用薄膜覆盖，薄膜不接触薯块的伤口面，放入25℃恒温箱保湿培养。

从接种开始日计算，分别在培养7d、10d、12d、14d、16d后进行薯块伤口发病情况调查，结果见表1。

表1接种后不同培养时间下甘薯薯块的发病情况

注：同列数据后不同小写字母表示在0.05水平差异显著，不同大写字母表示在0.01水平差异显著。

根据表1的试验结果，培养7d时，薯块伤口的发病率为9.87％，可以观察到伤口开始有菌斑出现。培养10d时，薯块伤口的发病率达到58.87％，伤口组织变色，伤口上出现明显菌斑。培养12d时，薯块伤口的发病率达到68.93％，伤口组织变色，菌斑明显。培养14d时，薯块伤口的发病率达到87.80％，部分伤口内生长的菌斑已经扩展出伤口范围，如图4所示。培养16d时，薯块伤口的发病率达到95.90％，伤口内生长的菌斑已经覆盖非伤口区域，并连接成片，对统计病斑发病造成了影响。因此，为了能够准确的判断伤口是否发病，对甘薯黑斑病的防治效果应选择在25℃培养14d(伤口内菌丝覆盖范围开始超出伤口边缘)时调查发病结果。

实施例2

按照上述的试验材料及接种方法，取60块相同的甘薯薯块分为4个处理，每个处理分3组，每组5块；4个处理分别使用浓度为1×10³个孢子/mL、1×10⁴个孢子/mL、1×10⁵个孢子/mL、1×10⁶个孢子/mL的甘薯黑斑病菌分生孢子悬浮液进行喷雾接种，方法同实施例1。

从接种开始日计算，在培养14d后进行薯块伤口发病情况调查，结果见表2。

表2不同接种强度下接种薯块的发病情况

注：同列数据后不同小写字母表示在0.05水平差异显著，不同大写字母表示在0.01水平差异显著。

根据表2可得，采用的孢子悬浮液浓度分别为1×10³个孢子/mL、1×10⁴个孢子/mL、1×10⁵个孢子/mL、1×10⁶个孢子/mL的四个处理，伤口的平均发病率分别为38.96％、54.46％、73.24％、76.84％，孢子悬浮液浓度为1×10⁵个孢子/mL和1×10⁶个孢子/mL两个处理的伤口平均发病率之间差异不显著，但显著高于其他处理。因此，采用该方法对薯块进行接种时，孢子悬浮液的合适浓度应为1×10⁵个孢子/mL～1×10⁶个孢子/mL。

实施例3

为了验证生物制剂四霉素抑制甘薯黑斑病的发生，对甘薯薯块新鲜伤口的保护作用，进行该试验，试验材料准备同上。试验共设7个处理：分别是0.3％四霉素水剂有效成分用量2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L、10mg/L；36％甲基硫菌灵悬浮剂500mg/L；另设空白对照(浸薯块时不使用药剂，而使用清水)。每个处理分3组，每组5块甘薯。药液配置好后，将薯块在药液中浸1小时，然后将薯块室温放置12小时，接着在薯块一面人工制造伤口，随后进行甘薯长喙壳菌接种，接种方法同前，采用的孢子悬浮液浓度为1×10⁵个孢子/mL。

接种完成，待薯块伤口面没有明显湿痕后，人工气候箱25℃培养，待空白对照处理薯块的伤口内菌丝覆盖范围开始超出伤口边缘时(14d)调查薯块伤口发病情况，结果见表3。

表3四霉素防止甘薯黑斑病侵染薯块伤口的试验结果

注：同列数据后不同小写字母表示在0.05水平差异显著，不同大写字母表示在0.01水平差异显著。

根据表3可知，培养14d后，空白对照的薯块伤口发病率达到了76.05％，伤口发病率符合预期。

各药剂处理的薯块伤口发病率有一定减少，体现出一定防治效果。0.3％四霉素水剂有效成分用量2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L、10mg/L防治效果分别为26.06％、32.81％、36.36％、39.39％、43.90％，36％甲基硫菌灵悬浮剂有效成分用量500mg/L的防治效果是20.04％。0.3％四霉素水剂有效成分用量4mg/L、6mg/L、8mg/L、10mg/L的防治效果显著高于对照药剂的防治效果，但整体防效不高。这与生产实际中黑斑病菌最易侵染薯块新鲜伤口是一致的。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。

Claims (8)

1.一种测定药剂对甘薯薯块新鲜伤口保护作用的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将完整无损的甘薯薯块先进行药剂处理，然后将薯块静置使薯块晾干，同时设空白对照组，空白对照组采用清水处理薯块并晾干；

（2）在薯块表面制造等距且大小均匀的多个深入真皮的伤口；具体为在药剂处理过的甘薯块一面制造切开真皮的伤口，伤口成排排列，各个伤口间距离在5～10 mm，伤口深度在1 mm，伤口直径为4mm～5mm，每个薯块伤口数5～20个；

（3）对薯块无伤口部位用保鲜膜保护后，使用可侵染薯块新鲜伤口的病原菌孢子悬浮液向薯块伤口处喷雾接种，晾干后去掉保鲜膜保湿培养；

（4）当空白对照组的薯块伤口内生长的菌丝覆盖范围开始超出伤口边缘时，对各处理薯块伤口发病情况进行统计，计算薯块表面伤口的发病率，完成测定；

对单个薯块的伤口发病数和单个薯块伤口总数计数，计算单个薯块的发病率，以及每个重复和每个处理的薯块平均发病率，根据发病率评价药剂对薯块伤口的保护效果；

单个薯块发病率（%）=（单个薯块伤口发病数/单个薯块伤口总数）×100%；

保护效果（%）=（空白对照处理平均发病率-药剂处理平均发病率）/空白对照处理平均发病率×100%。

2.根据权利要求1所述的测定药剂对甘薯薯块新鲜伤口保护作用的方法，其特征在于，所述的药剂处理方式为浸薯块、喷淋薯块或熏蒸薯块。

3.根据权利要求2所述的测定药剂对甘薯薯块新鲜伤口保护作用的方法，其特征在于，所述药剂为采用0.3%四霉素水剂制备而成，有效成分用量为4 mg/L、6 mg/L、8 mg/L、10mg/L。

4.根据权利要求1所述的测定药剂对甘薯薯块新鲜伤口保护作用的方法，其特征在于，步骤（1）中，施用无内吸作用的药剂后，静置时间不超过6小时；施用内吸性药剂后，静置时间不少于3小时。

5.根据权利要求1所述的测定药剂对甘薯薯块新鲜伤口保护作用的方法，其特征在于，所述病原菌为引起甘薯黑斑病的病原菌甘薯长喙壳菌Ceratocystis fimbriata，孢子悬浮液浓度为1×10⁵个孢子/mL～1×10⁶个孢子/mL。

6.根据权利要求1所述的测定药剂对甘薯薯块新鲜伤口保护作用的方法，其特征在于，步骤（3）中利用手持微量喷雾器对薯块的伤口面喷雾，手持微量喷雾器的雾滴直径小于50微米，每分钟喷雾量小于500毫升。

7.根据权利要求6所述的测定药剂对甘薯薯块新鲜伤口保护作用的方法，其特征在于，喷雾时，将同一重复的薯块排放在一起，伤口面向上，用保鲜膜将整个重复的薯块覆盖固定，在伤口部位将保鲜膜开口，露出全部伤口，且利用保鲜膜将开口边缘贴合在伤口区域之外，喷雾对准薯块伤口面的斜上方，使雾滴飘落在伤口面，以喷湿伤口面而无明显流液现象为准，即停止接种。

8.根据权利要求1所述的测定药剂对甘薯薯块新鲜伤口保护作用的方法，其特征在于，步骤（3）的保湿培养在避光条件下进行，培养温度为25℃～28℃，培养时间为7～15d，保湿培养时，将薯块平放在容器中，伤口面朝上，薯块不堆叠，容器加盖或用薄膜覆盖，盖或薄膜不接触薯块的伤口面。

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