CN111411144A - 一种用于血流感染病原诊断的血浆游离dna标志物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于血流感染病原诊断的血浆游离DNA标志物。本发明提供了一种血浆游离DNA的处理方法，包括如下步骤：从待测血浆游离DNA中选择大小为60‑140bp的片段，该方法可作为通过血浆游离DNA进行血流感染病原体检测的样本前处理方法。本发明对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、鲍曼不动杆菌感染的血浆样本中游离核酸分布范围进行了研究，确定了这5种细菌在血浆中的游离核酸片段分布。本发明对于提高血浆宏基因组检测中病原检测的灵敏度，指导设计PCR扩增产物片段长度范围，以提高PCR检测灵敏度具有重要意义。本发明为血浆游离DNA检测产品开发过程中的病原模拟样本制备提供依据。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于血流感染病原诊断的血浆游离DNA标志物。
背景技术
血浆游离DNA是一种游离于细胞外的DNA。目前认为血中的游离DNA来源与凋亡、坏死和细胞主动分泌DNA有关。正常生理情况下，凋亡和坏死细胞会很快被清除掉，因此健康人血中游离DNA浓度很低。在恶性肿瘤、器官移植或感染等情况下，游离核酸释放较多，不能被机体有效清除，因此血浆中游离核酸浓度会升高。
血流感染是各种病原微生物入侵血流引起的感染，包括细菌、病毒、真菌等。当发生血流感染时，病原体在血液中进行繁殖代谢或被白细胞吞噬，其细胞被破坏后会将胞内的DNA释放到血液中成为血浆游离DNA，因此血浆中会同时存在人源的游离DNA和病原体的游离DNA。对于人源游离DNA，目前已经有比较全面的研究，认为人源细胞在凋亡或坏死过程中，基因组DNA会与核小体缠绕，受核小体大小的影响，在血浆中呈现约166bp的DNA片段分布；对于病原体游离DNA，它们在血液中的释放和降解机制目前研究较少。
目前，国内外有多家公司开展通过血浆游离DNA进行血流感染病原体的检测。以美国Karius公司的Karius test为例，该方法通过宏基因组二代测序的方式对血浆中的全部游离DNA进行检测，检测后的数据与人源数据库进行比对。去除人源核酸序列，将剩余DNA序列与病原数据库对比，根据比对结果判断感染病原体类型，该方法可同时检测上千种病原体。但是，该方法在检测过程中会检测到大量的人源核酸序列，在信息分析过程中，这部分序列需要进行去除，属于“无效”序列，因此，在测序数据中会造成大量的数据浪费，并且大量的人源序列也会影响病原核酸的检测灵敏度。在实际使用中，检测性能较低并且检测成本偏高，大规模推广受限。
基于PCR技术的血浆游离DNA病原体检测。该方法通过设计病原体特异性引物序列及探针，对血浆样本提取后的游离DNA进行病原体检测，该方法具有操作简单，检测周期短等优势。但该方法在检测过程中常常会由于对扩增片段产物大小无相应指导设计方案，设计盲目性较高，在实际应用中需要对大量引物进行筛选确定。
发明内容
本发明针对血流感染常见的几种病原体类型，建立了其在血浆中的游离DNA片段大小特征，可作为血流感染诊断的特异性生物标志物，并且通过该特征，可指导现有检测产品进行进一步优化，提升检测性能。
第一方面，本发明要求保护一种血浆游离DNA的处理方法。
本发明所要求保护的血浆游离DNA的处理方法，可包括如下步骤：从待测血浆游离DNA中选择大小为60-140bp的片段。
进一步地，该方法可作为通过血浆游离DNA进行血流感染病原体检测的样本前处理方法。
进一步地，该方法可作为从血浆游离DNA中去除人源游离DNA的方法。
更进一步地，该方法可作为通过血浆游离DNA采用高通量测序技术进行血流感染病原体检测的样本前处理方法。
第二方面，本发明要求保护一种通过血浆游离DNA进行血流感染病原体检测的样本前处理方法。
本发明所要求保护的通过血浆游离DNA进行血流感染病原体检测的样本前处理方法，可包括如下步骤：
(A1)从待测血浆中提取游离DNA，进行末端修复和加A，并连接接头，得到DNA文库；
(A2)从所述DNA文库中选择所述游离DNA片段大小为60-140bp的片段，得到测序文库，所述测序文库即为处理后样本。
所述方法为非疾病诊断治疗方法。
在本发明的具体实施例中，步骤(A2)中从所述DNA文库中选择的片段大小约为150-230bp(接头序列约为90bp，靶标游离DNA片段大小约为60-140bp)。
进一步地，利用所述方法制备得到的测序文库(处理后样本)适用于利用高通量测序技术检测血流感染病原体。
第三方面，本发明要求保护一种提高血浆游离DNA中病原体检出率的方法。
本发明所要求保护的提高血浆游离DNA中病原体检出率的方法(高通量测序法)，可包括如下步骤：
(A1)从待测血浆中提取游离DNA，进行末端修复和加A，并连接接头，得到DNA文库。
该步骤中，进行末端修复后，通过酶反应将核酸片段3’端进行补平，并且同时在3’端添加A碱基形成粘性末端。
该步骤中，在连接接头后，还可包括对连接产物进行磁珠(如XP磁珠)纯化的步骤，目的是去除残留的小片段接头序列。
(A2)从所述DNA文库中选择所述游离DNA片段大小为60-140bp的片段，得到测序文库。
该步骤中，在进行片段选择前还包括文库扩大的步骤。具体可通过进行PCR扩增实现，目的是放大文库信号，得到大量文库序列。
该步骤中，进行片段选择可通过磁珠纯化实现。在本发明的具体实施方式中，具体是通过如下实现的：扩大后的所述DNA文库中加入0.7倍体积的XP磁珠(吸附约230bp以上的片段)，放置于磁力架上，然后向上清(主要为小于230bp的片段)中加入1.2倍体积的XP磁珠(吸附大于150bp的片段)，此时磁珠吸附的片段主要为150-230bp之间的核酸(该核酸长度为添加测序接头后的长度，去除接头序列后，对应的插入片段大小约为60-140bp之间)。
(A3)对所述测序文库进行上机测序，从测序结果中获得所述待测血浆中病原体的检测结果。
该步骤中，去除测序数据中的人源序列，将剩余序列与病原体序列库进行比对，得到病原体比对结果。
所述方法为非疾病诊断治疗方法。如用于检测血制品是否合格，是否含有病原体或者被病原体感染。
在本发明的具体实施例中，步骤(A2)中从所述DNA文库中选择的片段大小约为150-230bp(接头序列约为90bp，靶标游离DNA片段大小约为60-140bp)。
第四方面，本发明要求保护一种通过血浆游离DNA检测血流感染病原体的系统。
本发明所要求保护的通过血浆游离DNA检测血流感染病原体的系统(适用于高通量测序法)，可包括
(B1)用于从血浆中提取游离DNA的试剂和/或仪器；
(B2)用于对游离DNA进行末端修复和加A，并连接接头，得到DNA文库的试剂和/或仪器；
(B3)能够从所述DNA文库中选择游离DNA片段大小为60-140bp的片段作为测序文库的试剂和/或仪器；
在本发明的具体实施例中，从所述DNA文库中选择的片段大小约为150-230bp(接头序列约为90bp，靶标游离DNA片段大小约为60-140bp)。
在本发明的具体实施例中，所述(B3)中的试剂具体为XP磁珠。
(B4)能够对所述测序文库进行上机测序，从测序结果中获得待测血浆中病原体的检测结果的装置。
进一步地，所述(B4)中，所述装置中设有结论输出模块。
所述结论输出模块用于按照如下输出结论：如果所述测序结果(即由目的片段组成的测序文库的测序结果，目的片段为连接有接头的靶标游离DNA片段，在本发明的具体实施方式中，接头序列约为90bp，靶标游离DNA片段大小约为60-140bp)中含有某种病原体的特异性序列信息，则所述待测血浆中含有或候选含有对应的病原体；如果所述测序结果中不含有某种病原体的特异性序列信息，则所述待测血浆中不含有或候选不含有对应的病原体。
第五方面，本发明要求保护一种提高血浆游离DNA中病原体检出率的方法。
本发明所要求保护的提高血浆游离DNA中病原体检出率的方法，可包括如下步骤：
(C1)从待测血浆中提取游离DNA；
(C2)以所述游离DNA为模板，采用病原体特异性引物对进行PCR扩增；所述引物对扩增目的片段的大小为60-140bp；
(C3)根据PCR扩增结果获得所述待测血浆中病原体的检测结果。
所述方法为非疾病诊断治疗方法。如用于检测血制品是否合格，是否含有病原体或者被病原体感染。
第六方面，本发明要求保护前文第四方面所述系统在制备用于通过血浆游离DNA检测血流感染病原体的产品中的应用。
第七方面，本发明要求保护前文第四方面所述系统和记载有前文第三方面所述方法的可读性介质在制备用于通过血浆游离DNA检测血流感染病原体的产品中的应用。
第八方面，本发明要求保护用于对血浆游离DNA进行PCR扩增所用试剂和/或仪器，以及记载有前文第六方面所述方法的可读性介质在制备用于通过血浆游离DNA检测血流感染病原体的产品中的应用。
在上述各方面中，所述大小为60-140bp具体可是大小为64-132bp。
相应的，所述病原体可选自如下：大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌和/或鲍曼不动杆菌感染。
第九方面，本发明要求保护血浆中病原体游离DNA的分布特征在如下任一中的应用：
(D1)开发通过血浆游离DNA检测血流感染病原体的产品；
(D2)开发通过血浆游离DNA诊断感染性疾病的产品；
(D3)提升现有通过血浆游离DNA检测血流感染病原体的产品的性能；
(D4)制备血浆游离DNA中病原体模拟样本。
在本发明中，所述病原体可选自如下：大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌和/或鲍曼不动杆菌感染。相应的，血浆中所述病原体游离DNA的峰值分布范围为64-132bp。更加具体的，大肠埃希菌在血浆中的游离DNA分布峰值为89bp，肺炎克雷伯菌在血浆中的游离DNA分布峰值为132bp，金黄色葡萄球菌在血浆中的游离DNA分布峰值为64bp，鲍曼不动杆菌在血浆中的游离DNA分布峰值为112bp，屎肠球菌在血浆中的游离DNA分布峰值为118bp。
本发明基于宏基因组测序技术，对不同病原体感染患者血浆中游离DNA特征进行研究，建立了可用于血流感染诊断的特异性病原分子标志物。
(1)本发明对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、鲍曼不动杆菌感染的血浆样本中游离核酸分布范围进行了研究，确定了这5种细菌在血浆中的游离核酸片段分布。
(2)基于本发明发现的病原体游离核酸片段分布特征，可以通过片段选择技术对病原游离核酸进行特异性筛选，或对人源核酸进行特异性去除，以提高血浆宏基因组检测中病原检测的灵敏度。
(3)根据不同病原体在血浆中的游离DNA片段大小，可以指导设计PCR扩增产物片段长度范围，以提高PCR检测灵敏度。
(4)本发明还可以为血浆游离DNA检测产品开发过程中的病原模拟样本制备提供依据。
本发明的有益效果具体如下：
1、本发明在血浆中发现了病原体特异性分子标志物，并建立了该标志物的特征，可用于对血流感染患者的诊断，并且诊断时效性明显优于传统血培养方法，可在短时间内获得检测结果。
本发明建立的病原特异分子标志物为存在于血浆中的病原游离DNA，当发生血流感染时，患者血浆中同时存在人源细胞凋亡释放的游离DNA和感染病原体释放的游离DNA。根据本发明中建立的病原游离DNA特征(见实施例1)，针对不同病原体游离DNA在血浆中的片段大小分布，可以对特定分布范围内的游离DNA进行检测实现相应病原体的检测，可通过宏基因组二代测序的方法对血浆中特定大小的全部游离DNA进行检测，并通过生物信息学比对的方法鉴定其中所包含的病原核酸序列，实现对感染病原体的诊断。该方法可对上万种感染病原体进行同时检测。另外，对于疑似特定病原类型感染的患者，为尽快获得病原学证据，可参照本发明中建立的不同游离DNA在血浆中的片段分布峰值，设计相应扩增片段大小的引物以提高扩增成功率，通过PCR的方法进行诊断。对血浆中的游离DNA进行提取，采用特异性的病原引物进行PCR扩增或荧光PCR检测，根据检测结果快速判断是否存在相应病原体的感染，为血流感染快速诊断提供了依据。本发明利用血浆中的游离DNA进行分子诊断，避免了使用全血样本时存在的血红蛋白等干扰物质对分子检测的影响，同时，根据本发明建立的分子标志物特征，可实现对感染病原体的高效检测。
2、本发明对血浆中的病原分子标志物片段分布进行了研究，根据其片段分布的特异性，可以指导相关检测产品设计并提高检测性能。
本发明对血流感染常见的5种病原体在血浆游离DNA中的分布形态进行了研究(见实施例1)。其中，大肠埃希菌在血浆中的游离DNA分布峰值为89bp，分布中位数为116bp；肺炎克雷伯菌在血浆中的游离DNA分布峰值为132bp，分布中位数为166bp；金黄色葡萄球菌在血浆中的游离DNA分布峰值为64bp，分布中位数为103bp，鲍曼不动杆菌在血浆中的游离DNA分布峰值为112bp，分布中位数为128bp，屎肠球菌在血浆中的游离DNA分布峰值为118bp，分布中位数为134bp。与上述不同病原体相比，血浆中的人源游离DNA分布峰值为166bp，分布中位数为165bp，不同病原体与人源游离DNA相比，其峰值相差34-102bp，并且根据不同病原体游离DNA的峰值和中位数大小，可以判断5种病原体在血浆中的片段分布峰形均呈现拖尾式分布。根据其分布差异，可以筛选特定区间分布的游离DNA进行检测，以提高相应病原体的检测灵敏度。例如，对血浆中60-140bp的片段通过片段选择的方法进行富集检测，经过宏基因组二代测序后的结果进行病原体比对，可以有效提高大肠埃希菌核酸序列的检出(见实施例2)。因此，通过本发明建立的病原体游离DNA相关特性，可以指导设计高性能检测产品，提高感染病原体核酸的检出。
3、本发明建立了不同病原体感染后在血浆游离DNA中的分布形态，为产品开发中血浆模拟样本的制备提供了依据。
本发明建立了血流感染常见的5种病原体在血浆中的游离DNA分布，包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和屎肠球菌。不同病原体在血浆中的游离DNA分布主要集中在64-132bp之间，而血浆中人源游离DNA分布为166bp。
目前，随着分子生物学技术的发展，血浆游离DNA已经在诸多诊断及筛查领域有所应用。通过血浆游离DNA进行病原体诊断的产品也已经相继出现，但对于不同厂家的产品其宣称的检测性能具有一定的差异，很大原因在于目前对于病原体游离DNA的特征无相关研究，在进行产品性能评估过程中不同厂家未考虑病原体游离DNA在血浆中的真实分布，导致其宣称性能可能与实际应用不符。通过本发明建立的不同病原体的游离DNA分布，可以指导相关病原体检测产品的设计及性能评估，按照特定片段大小制备相应病原体的游离DNA，添加到血浆样本中制备模拟样本进行检测，对产品的检测性能进行评估，为产品性能的准确性提供支撑。
附图说明
图1为不同感染类型血浆样本中人源核酸分布。
图2为不同病原体核酸在血浆中分布峰值。
图3为不同病原体核酸在血浆中分布中位数。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的具体试剂及用到的核酸序列如表1和表2所示。
表1试剂名称及生产厂家
| 试剂名称 | 生产厂家 |
| 核酸纯化试剂 | 华大生物科技(武汉)有限公司 |
| T4 DNA Polymerase | Enzymatics |
| T4 PNK | Enzymatics |
| 10×T4 PNK buffer | Enzymatics |
| rTaq | TaKaRa |
| dATP(100mM) | Enzymatics |
| dNTP(25mM) | Enzymatics |
| ATP(100mM) | Thermo Fisher |
| T4 DNA Ligase | Enzymatics |
| 50％PEG 8000 | Rigaku |
| KaPa HiFi Ready Mix | Kapa biosystems |
表2接头序列和引物序列
实施例1、血浆中病原游离DNA片段大小的研究
细菌、病毒等微生物感染病人进入血液后，病原体会进行繁殖代谢或被白细胞吞噬，其细胞被破坏后会将胞内的DNA释放到血液中成为血浆游离DNA。因此，可以通过检测血浆中游离的微生物DNA片段鉴定微生物的种类。通过双端测序的方法可以对所检测到的病原体核酸序列在其参考基因组上进行定位，进而计算其DNA片段大小。本发明对血流感染患者血浆样本中的人源游离DNA和病原游离DNA进行分析，确定血浆中病原游离DNA片段大小。
1、根据临床诊断结果，选取不同病原体类型感染的阳性血浆样本，样本信息如下表3所示。并且选取健康人的血浆样本作为阴性对照样本进行分析。
表3不同病原体类型感染的阳性血浆样本信息
| 感染病原体中文名称 | 拉丁文名称 | 血浆样本例数 |
| 大肠埃希菌 | Escherichia coli | 6 |
| 肺炎克雷伯菌 | Klebsiella pneumoniae | 9 |
| 鲍曼不动杆菌 | Acinetobacter baumannii | 11 |
| 金黄色葡萄球菌 | Staphylococcus aureus | 8 |
| 屎肠球菌 | Enterococcus faecium | 8 |
2、取300μL血浆样本，按照血浆游离DNA提取试剂盒(华大生物科技(武汉)有限公司生产的核酸纯化试剂)操作说明进行血浆游离DNA提取。
3、DNA末端修复及加A
对步骤2提取得到的游离DNA进行DNA末端修复及加A。
DNA末端修复及加A反应体系如表4所示。
表4 DNA末端修复及加A反应体系
| 反应试剂 | 用量 |
| DNA | 43μL |
| 10×PNK Buffer | 5μL |
| 20:1的dATP(25mM)和dNTP(each1.25mM) | 1.2μL |
| T4 DNA Polymerase | 0.4μL |
| T4 PNK | 0.2μL |
| rTaq | 0.2μL |
| 反应体积 | 50μL |
反应条件：37℃，30min；65℃，15min；4℃hold。
4、接头连接反应
将步骤3所得产物连接接头。
接头连接反应体系如表5所示。
表5接头连接反应体系
反应条件：23℃，60min，4℃hold。
5、纯化
将步骤4所得连接产物用0.5倍体积(40μl)的AgencourtAMPure XP磁珠进行纯化，操作流程按照AMPure XP Beads纯化说明书进行，纯化产物回融至21μL用于后续反应。
6、文库扩大
将步骤5获得的纯化产物进行PCR扩增，放大文库信号，得到大量文库序列。
PCR反应体系如表6所示。
表6PCR反应体系
| 反应试剂 | 用量 |
| 纯化DNA | 21μL |
| Kapahifi ready mix | 25μL |
| Ad153-F(20μM) | 2μL |
| Ad153-R(20μM) | 2μL |
| 反应体积 | 50μL |
反应条件如下：98℃2min；12个循环(98℃15s，56℃15s，72℃30s)；72℃5min；4℃hold。
7、纯化
将步骤6的产物，用1倍体积(50μl)的AgencourtAMPure XP磁珠进行纯化，操作流程按照AMPureXP Beads纯化说明书进行。
8、PCR纯化产物进行Qubit定量
按Qubit dsDNA HS Assay kit2.0Fluorometer说明书操作。
9、检测文库质量
用Agilent 2100Bioanalyzer检测文库产量，操作流程按照Agilent2100Bioanalyzer说明书进行。
10、上机测序
将质控合格的文库按照MGISEQ-2000平台PE100测序流程进行上机测序，详细流程参考相应试剂盒操作说明书。
11、信息分析
将测序得到的数据进行数据质控，对质控合格的数据按照实验中添加的唯一识别标签序列进行拆分，得到每个样本对应的测序数据。将每个样本的测序数据首先与人源序列数据库进行比对，其中人源序列库包括人类参考基因组(hg38)以及从炎黄基因组公共数据库官方网站下载的炎黄基因组序列两部分。去除人源序列后，将剩余序列通过Trimmomatic软件进行接头序列去除，去接头的序列与病原序列库进行比对，其中病原序列库包括细菌序列库、病毒序列库、真菌序列库及寄生虫序列库。比对参数包括病原比对序列数(MRN)，按照比对长度占比(maprate)>＝80％且碱基错配率(errorrate)<＝10％，统计比对结果中比对上每个病原微生物的序列数。
根据样本的临床诊断结果，将临床诊断为阳性的病原体在测序结果中进行筛选，根据双端测序中的序列匹配关系，得到待查序列在对应参考基因组上的位置，通过计算其碱基跨度，得到对应序列的长度。以同样的方法对样本中测到的人源核酸序列进行分析，得到对应样本中人源游离DNA的片段大小。
12、结果分析
a)根据步骤11中的分析方法，对不同病原体感染的血浆样本以及健康人血浆样本中人源DNA的片段分布进行统计(如图1)，发现不同病原体感染的血浆中人源DNA分布与健康人血浆中人源DNA分布基本一致，其片段峰值为166bp，片段中位数为165bp，基本呈正态分布，与之前相关文献报道一致。
b)根据感染病原体的不同，统计相同病原体在所有样本中的片段大小，并计算其峰值及中位数，并且与人源核酸大小进行对比，如表7，图2和图3所示；通过上述实施例对血流感染常见的5种病原体在血浆游离DNA中的分布形态进行研究，结果显示：大肠埃希菌在血浆中的游离DNA分布峰值为89bp，分布中位数为116bp；肺炎克雷伯菌在血浆中的游离DNA分布峰值为132bp，分布中位数为166bp；金黄色葡萄球菌在血浆中的游离DNA分布峰值为64bp，分布中位数为103bp；鲍曼不动杆菌在血浆中的游离DNA分布峰值为112bp，分布中位数为128bp；屎肠球菌在血浆中的游离DNA分布峰值为118bp，分布中位数为134bp。与上述不同病原体相比，血浆中的人源游离DNA分布峰值为166bp，分布中位数为165bp，不同病原体与人源游离DNA相比，其峰值相差34-102bp，可通过该分布差异进行病原体特异性检测，以提高检测灵敏度。
表7血浆中病原体及人源DNA片段分布
实施例2、应用本发明建立的血浆游离DNA标志物进行诊断的应用实例
1、选取5例临床血培养为大肠埃希菌阳性的血浆样本。
2、取300μL血浆样本，按照血浆游离DNA提取试剂盒操作说明进行血浆游离DNA提取，每个样本提取两份。
3、末端修复及加“A”，按照表8所示的反应体系进行。
表8末端修复及加“A”反应体系
| 反应试剂 | 用量 |
| DNA | 43μL |
| 10×PNK Buffer | 5μL |
| 20:1的dATP(25mM)和dNTP(each1.25mM) | 1.2μL |
| T4 DNA Polymerase | 0.4μL |
| T4 PNK | 0.2μL |
| rTaq | 0.2μL |
| 反应体积 | 50μL |
反应条件：37℃，30min；65℃，15min；4℃hold。
4、接头连接
将步骤3所得产物连接接头。
接头连接反应体系如表9所示。
表9接头连接反应体系
注：表中Ad153为上述表2中Ad153上游序列和下游序列退火得到的双链结构。
反应条件：23℃，60min，4℃hold。
5、纯化：将步骤4所得连接产物用0.5倍体积(40μl)的AgencourtAMPure XP磁珠进行纯化，操作流程按照AMPure XP Beads纯化说明书进行，纯化产物回融至21μL用于后续反应。
6、文库PCR
将步骤5获得的纯化产物进行PCR扩增，放大文库信号，得到大量文库序列。
PCR反应体系如表10所示。
表10PCR反应体系
| 反应试剂 | 用量 |
| 纯化DNA | 21μL |
| Kapahifi ready mix | 25μL |
| AD153-F(20μM) | 2μL |
| AD153-R(20μM) | 2μL |
| 反应体积 | 50μL |
反应条件如下：98℃2min；12个循环(98℃15s，56℃15s，72℃30s)；72℃5min；4℃hold。
7、文库纯化
每例样本的两份样本分别按a)流程和b)流程进行操作
a)片段选择：向扩增后的文库中加入0.7倍体积的XP磁珠，充分混匀后，静置5min，将大约230bp以上的片段进行吸附，然后放置于磁力架上，待磁珠完全吸附到磁力架后，小心吸出上清至干净的EP管内，此时，上清中的核酸片段主要为小于230bp的片段，加入1.2倍体积的XP磁珠，继续将大于150bp的片段进行全部吸附，此时磁珠吸附的片段主要为150-230bp之间的核酸，该核酸长度为添加测序接头后的长度，去除接头序列后，对应的插入片段大小约为60-140bp之间，按照XP磁珠说明书进行操作，最终用23μL进行回融。
b)纯化：用1倍体积的AgencourtAMPure XP磁珠进行纯化，操作流程按照AMPureXP Beads纯化说明书进行，最终用23μL进行回融。
8、Qubit定量：按Qubit dsDNA HS Assay kit2.0Fluorometer说明书操作，对8)中得到的文库进行浓度测定。
9、检测文库质量：用Agilent 2100Bioanalyzer检测文库产量，操作流程按照Agilent 2100Bioanalyzer说明书进行。
10、上机测序：将质控合格的文库按照MGISEQ-2000平台测序流程进行上机测序，详细流程参考相应试剂盒操作说明书；
11、信息分析：将测序得到的数据进行数据质量控制，对质控合格的数据按照接头上的标签序列进行拆分，得到每个样本对应的测序数据。将测序数据中的人源序列进行去除，将剩余序列与病原序列库进行比对，按照设定的比对参数进行数据过滤，其中，比对参数包括比对序列数(MRN)、严格比对序列数(SMRN)、覆盖率、覆盖深度、相对丰度等，并对比对序列数和严格比对序列数利用有效数据进行归一化处理，得到标准化比对序列数(SDMRN)和标准化严格比对序列数(SDSMRN)。重要参数比对算法如下：
比对序列数(MRN)：按照比对长度占比(maprate)>＝80％且碱基错配率(errorrate)<＝10％，统计比对结果中比对上每个病原微生物的序列数。
严格比对序列数(SMRN)：在满足MRN条件的基础上，统计比对结果中同时满足maprate>＝90％，errorrate<＝4％(病毒碱基错配率满足viruserate<＝8％)，比对最优得分AS>＝30，序列比对频率read.freq＝1，且满足以下任一条件的序列数：
(1)次优比对得分XS/最优比对得分AS<0.8且比对质量值mapq>＝30；
(2)次优比对得分/最优比对得分>＝0.8且多比对结果(XA)输出的结果中比对上的病原和最优比对上的病原相同。
根据上述比对分析最终得到病原比对结果。
12、结果统计及对比：统计临床检测方法和通过标志物检测方法的时效性如表11所示。
表11临床检测方法(血培养)和本发明通过标志物检测方法(宏基因组检测a流程和b流程)
统计5例样本不同纯化条件下大肠埃希菌检测结果，如表12所示。
表12 5例样本不同纯化条件下大肠埃希菌检测结果
13、总结：由本实施例测试结果显示，通过本发明中建立的病原血浆游离DNA标志物进行感染病原体的诊断，比传统血培养方法检测周期提高3倍；根据本发明建立的病原标志物特征，经过片段筛选后的样本，与常规的宏基因组检测法相比，大肠埃希菌的检出明显提升，说明本发明中发现的血浆病原核酸标志物有助于提升血浆病原检测效率。
Claims (10)
1.一种血浆游离DNA的处理方法，包括如下步骤：从待测血浆游离DNA中选择大小为60-140bp的片段。
2.一种通过血浆游离DNA进行血流感染病原体检测的样本前处理方法，包括如下步骤：
(A1)从待测血浆中提取游离DNA，进行末端修复和加A，并连接接头，得到DNA文库；
(A2)从所述DNA文库中选择所述游离DNA片段大小为60-140bp的片段，得到测序文库，所述测序文库即为处理后样本。
3.一种提高血浆游离DNA中病原体检出率的方法，包括如下步骤：
(A1)从待测血浆中提取游离DNA，进行末端修复和加A，并连接接头，得到DNA文库；
(A2)从所述DNA文库中选择所述游离DNA片段大小为60-140bp的片段，得到测序文库；
(A3)对所述测序文库进行上机测序，从测序结果中获得所述待测血浆中病原体的检测结果。
4.一种通过血浆游离DNA检测血流感染病原体的系统，包括
(B1)用于从血浆中提取游离DNA的试剂和/或仪器；
(B2)用于对游离DNA进行末端修复和加A，并连接接头，得到DNA文库的试剂和/或仪器；
(B3)能够从所述DNA文库中选择游离DNA片段大小为60-140bp的片段作为测序文库的试剂和/或仪器；
(B4)能够对所述测序文库进行上机测序，从测序结果中获得待测血浆中病原体的检测结果的装置。
5.根据权利要求4所述的系统，其特征在于：所述(B4)中，所述装置中设有结论输出模块；
所述结论输出模块用于按照如下输出结论：如果所述测序结果中含有某种病原体的特异性序列信息，则所述待测血浆中含有或候选含有对应的病原体；如果所述测序结果中不含有某种病原体的特异性序列信息，则所述待测血浆中不含有或候选不含有对应的病原体。
6.一种提高血浆游离DNA中病原体检出率的方法，包括如下步骤：
(C1)从待测血浆中提取游离DNA；
(C2)以所述游离DNA为模板，采用病原体特异性引物对进行PCR扩增；所述引物对扩增目的片段的大小为60-140bp；
(C3)根据PCR扩增结果获得所述待测血浆中病原体的检测结果。
7.权利要求4或5所述系统在制备用于通过血浆游离DNA检测血流感染病原体的产品中的应用。
8.权利要求4或5所述系统和记载有权利要求3所述方法的可读性介质在制备用于通过血浆游离DNA检测血流感染病原体的产品中的应用；或
用于对血浆游离DNA进行PCR扩增所用试剂和/或仪器与记载有权利要求6所述方法的可读性介质在制备用于通过血浆游离DNA检测血流感染病原体的产品中的应用。
9.根据权利要求1-8中任一所述的方法或系统或应用，其特征在于：所述大小为60-140bp是大小为64-132bp；和/或
所述病原体选自如下：大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌和/或鲍曼不动杆菌感染。
10.血浆中病原体游离DNA的分布特征在如下任一中的应用：
(D1)开发通过血浆游离DNA检测血流感染病原体的产品；
(D2)开发通过血浆游离DNA诊断感染性疾病的产品；
(D3)提升现有通过血浆游离DNA检测血流感染病原体的产品的性能；
(D4)制备血浆游离DNA中病原体模拟样本。
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