CN111410669A - 制备d-核糖和碱基的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了制备D‑核糖和碱基(例如，嘌呤)的方法，所述方法包括以下水解步骤：将碱基核苷在无机酸的催化下水解，得到含有D‑核糖和碱基的水解产物。

Description

制备D-核糖和碱基的方法
技术领域
本发明属于医药和食品领域，具体涉及制备D-核糖和碱基(特别地，嘌呤)的方法。
背景技术
D-核糖是非常重要的戊醛糖，同时也是遗传物质RNA的主要组成部分，对生命的繁衍有着重要的作用。D-核糖存在醛糖和呋喃糖的化学互变异构体。化学立体结构如下所示：
Figure BDA0001935774520000011
D-核糖是所有细胞中的成分之一，与腺苷酸的形成和ATP的再生有密切关系，是生命代谢最基本的能量来源之一，在心脏和骨骼肌代谢中起关键作用，能够促进局部缺血、局部缺氧组织恢复。D-核糖可用于维生素B2(核黄素)、呋喃核糖、吡喃核糖及抗病毒、抗肿瘤、核甘类药物的制造，亦可用于运动保健产品及食品添加剂，具有广阔的应用前景。腺嘌呤主要用于参加DNA和RNA的合成，它具有刺激白细胞增生的作用，因此可用于多种原因引起的白细胞减少症等。
此发明之前的制备方法是以葡萄糖为原料，经过多步反应合成所得，具有反应步骤多、成本高等缺点。例如，US3970522公开了Sasajima等人利用枯草芽孢杆菌的转酮醇酶缺陷突变株，以发酵法用D-葡萄糖生产获得D-核糖。自此D-核糖的生产主要以发酵法为工业的生产方法。但是以发酵法生产D-核糖存在发酵菌株不稳定、产量低、发酵周期偏长等缺点，而且后处理提纯过程复杂繁琐，包括膜过滤去除菌丝体、蛋白质等杂质，再经过离子交换树脂除去杂质离子，再将离子交换收集液浓缩脱色，过冷结晶才能得到D-核糖。
中国专利CN101928304B中公开的D-核糖的制备方法如下所示。以鸟嘌呤核苷或者次黄嘌呤核苷为起始原料，在水中以超强固体酸S2O8 2-/TiO2为催化剂水解直接制备D-核糖。这个方法反应简单，但是超强固体酸S2O8 2-/TiO2成本较高，而且反应温度高达到90℃，制备的核糖会焦化。而且此方法不能用腺嘌呤核苷做起始原料来制备D-核糖，因为腺嘌呤核苷高温容易被氧化，水解产物腺嘌呤具有的独立的伯胺在高强酸下会和D-核糖反应，产生复杂的副产物。
Figure BDA0001935774520000021
中国专利CN103923083A中公开的腺嘌呤制备方法如下所示。以腺嘌呤核苷为起始原料，腺嘌呤核苷在醋酐中降解，得到乙酰腺嘌呤和四乙酰核糖，乙酰腺嘌呤再通过碱解、中和得到腺嘌呤。这个方法反应简单，但是当量醋酐被水解后成三废，三废处理成本较高。
Figure BDA0001935774520000022
中国专利CN101125854A中公开的腺嘌呤制备方法如下所示，以腺嘌呤核苷起始原料，腺嘌呤核苷在水中高温水解直接制备，这个方法反应简单，但是耗能较大，而且副产物D-核糖在高温下会焦化，间接导致成本高。
Figure BDA0001935774520000023
中国专利CN105802938A中公开的腺嘌呤和D-核糖的制备方法如下所示。以腺嘌呤核苷起始原料，腺嘌呤核苷在水中以水解酶为催化剂水解直接制备腺嘌呤和D-核糖。这个方法反应简单，但是水解酶成本较高，而且引入了新的蛋白杂质，对后续的药品合成影响不清楚。
Figure BDA0001935774520000024
发明内容
一方面，本发明提供了一种制备D-核糖和碱基(例如，嘌呤)的方法。在某些实施方式中，所述方法包括以下水解步骤：将碱基核苷在无机酸的催化下水解，得到含有D-核糖和碱基的水解产物。具体地，所述方法的工艺流程如下所示：
Figure BDA0001935774520000031
其中，B代表碱基，例如腺嘌呤，鸟嘌呤，次黄嘌呤等。
本发明的发明人惊奇地发现，可以使用普通无机酸来催化水解步骤中的水解反应。在本发明以前，传统工艺中使用高温、水解酶、醋酐、固体超强酸等催化碱基核苷水解成核糖和碱基，这需要严苛的反应条件，不仅可能导致产物(核糖、碱基)发生副反应，而且生产成本高，还可能会产生工业废液造成环境污染。在本发明以前，没有关于使用无机酸催化碱基核糖的公开内容，也没有任何这样的技术启示。本发明的发明人意想不到的发现，使用无机酸能够解决上述传统工艺中的问题(例如解决D-核糖焦化问题，减少环境污染，解决水解酶和固体酸成本较高的问题等)，并且还能降低生产成本。
无机酸在本申请中是指无机化合物中的酸类，包括能解离出氢离子的无机化合物，例如由氢和一非金属元素或其基团组成的化合物。
在某些实施方式中，水解步骤中的所述无机酸在常温常压下为液体状态。在某些实施方式中，水解步骤中的所述无机酸选自以下组的一种或多种酸：磷酸、硫酸、盐酸、硝酸。在某些实施方式中，所述无机酸为浓酸。本发明中所述的浓酸为浓度较高的酸溶液，例如以大于约30％、大于约40％、大于约50％、大于约60％、大于约65％、大于约70％、大于约75％、大于约80％、大于约85％、大于约90％、大于约95％、大于约98％的浓度存在的酸。这里的百分比指的是在水中的重量/重量(w/w)％。本领域技术人员可以根据其专业知识判断某一浓度的酸是否为浓酸，例如36％盐酸、98％硫酸、63％浓硝酸等均属于浓酸。
在某些实施方式中，水解步骤中的所述无机酸不是固体酸。“固体酸”通常为在常温常压下为固体(例如粉末状、颗粒状等)的酸类，例如硅酸、对羟基苯磺酸等。在某些实施方式中，水解步骤中的所述无机酸不是固体超强酸。“固体超强酸”是指酸性超过100％硫酸的酸，100％硫酸的酸度函数(H0值)约为-11.93，通常把酸强度H0<-11.93的固体酸称为固体超强酸，例如吸附在金属氧化物或氢氧化物表面的硫酸根经高温燃烧制备得到的固体酸，如S2O8 2-/TiO2。
在某些实施方式中，水解步骤中的所述无机酸均为普通市售无机酸，例如酸度函数(H0值)在-1至-5.2的范围之内的无机酸，例如，酸度函数(H0值)为-1、-1.5、-2、-2.5、-3、-3.5、-4、-4.5、-5等。H0值用以描述高浓度强酸溶液的酸度。酸度函数H0基于强酸的酸度可通过一种与强酸反应的弱碱指示剂的质子化程度来表示，此指示剂的碱形式B不带电荷，它在酸中的形式为BH+。计算公式为：H0＝-lg[H+]＝-lgKBH+-lg{[BH+]/[B]}。KBH+是指示剂的共轭酸的电离常数，可用一般的测定平衡常数的方法测得，而[BH+]/[B]是指示剂的电离比率，可通过紫外-可见光光度法测定。H0标度可以看作是对pH标度的补充，H0和pH的结合可用来表述整个浓度范围的酸溶液(或碱溶液)的酸度。
在某些实施方式中，所述无机酸与所述碱基核苷的质量比为0.2～5:1，例如，0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1。
在某些实施方式中，所述水解步骤中的所述碱基核苷是通过发酵步骤得到的，所述发酵步骤包括：利用菌株对葡萄糖溶液进行发酵，得到含有所述碱基核苷的发酵产物。具体地，所述方法的工艺流程如下所示：
Figure BDA0001935774520000041
其中，B代表碱基，例如腺嘌呤，鸟嘌呤，次黄嘌呤等。
在某些实施方式中，发酵步骤中的所述菌株为芽孢杆菌，或其他能产生碱基核苷的菌株，例如产氨短杆菌。在某些实施方式中，发酵步骤中的所述菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。在某些实施方式中，发酵步骤中的所述菌株为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。不受理论限制，但认为芽孢杆菌中的PRPP转酰胺酶、IMP脱氢酶、sAMP合成酶、sAMP裂解酶、和/或5’核苷酸酶等可以共同作用，将葡萄糖发酵成碱基核苷。任何具有这些功能性酶的芽孢杆菌都能适用于本发明。在某些实施方式中，发酵步骤中的所述菌株为野生型枯草芽孢杆菌。又例如，在某些实施方式中，发酵步骤中的所述菌株能够产生多种酶(例如PRPP转酰胺酶、IMP脱氢酶、sAMP合成酶、sAMP裂解酶、5’核苷酸酶等)，通过一种或多种酶的共同作用，从而把葡萄糖发酵为碱基核苷。
在某些实施方式中，发酵步骤中的所述菌株是枯草芽孢杆菌突变菌株。在某些实施方式中，所述枯草芽孢杆菌突变菌株具有一种或多种以下特征：黄嘌呤营养缺陷(例如IMP脱氢酶缺失)、GMP还原酶缺失、具有核苷酸生物合成中的反馈抑制的解除(例如具有抗8-杂氮黄嘌呤的性质)、腺嘌呤和腺苷脱氨酶失活或低活性、SAMP合成酶强活性、5’-核苷酸酶强活性、或者黄嘌呤鸟嘌呤双重营养缺陷。详细信息可参见，汪泽等，利用枯草芽孢杆菌黄嘌呤缺陷型B.Subtilis X产生腺苷的研究，华东理工大学硕士学位论文。在某些实施方式中，发酵步骤中的所述菌株是在野生型枯草芽孢杆菌的基础上诱变开发出的枯草芽孢杆菌突变株，所述枯草芽孢杆菌突变株与葡萄糖进行发酵时产生碱基核苷，而不会从葡萄糖直接发酵产生D-核糖。本领域技术人员可以根据本领域常规的技术手段来制备枯草芽孢杆菌突变株。例如，用X-射线或紫外线照射处理或用诱变剂处理野生型枯草芽孢杆菌，然后从所得的突变株中选择能与葡萄糖进行发酵产生碱基核苷的枯草芽孢杆菌突变株。再例如，也可以通过基因改造等手段将枯草芽孢杆菌中的腺苷代谢途径中的相关酶进行突变而获得。一个示例性的枯草芽孢杆菌突变株是Xn151(中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：CICC10082)，其为黄嘌呤、鸟嘌呤双重营养缺陷型、并且丧失腺嘌呤脱氨酶，但是能够发酵葡萄糖产生腺苷。本领域还公知多种能够将葡萄糖发酵成核糖核苷的枯草芽孢杆菌突变株，例如，请参见：刘玥等，枯草芽孢杆菌嘌呤合成途径的修饰对腺苷积累的影响，微生物学报，2014年06期；中国专利申请CN1724646A等。这些已知的能够将葡萄糖发酵成碱基核苷的枯草芽孢杆菌突变菌株都可以用于本发明。
在某些实施方式中，发酵步骤中的碱基核苷的产率较高，足以使得发酵步骤中获得的发酵产物不经浓缩即可进入水解步骤进行水解反应。在某些实施方式中，发酵步骤中碱基核苷的产率为50-80g/L，例如50g/L、55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、75g/L、80g/L等。本领域技术人员可以通过本领域公知的方法来测定碱基核苷的产率，例如，通过HPLC外标法测定。
在某些实施方式中，发酵步骤中所获得的碱基核苷为嘌呤核苷，例如，次黄嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、或其任意混合物等。在某些实施方式中，水解步骤中所获得的碱基为嘌呤，例如，次黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤、或其任意混合物等。在某些实施方式中，发酵步骤中所获得的碱基核苷为嘧啶核苷，例如，胞嘧啶核苷、胸腺嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、或其任意混合物等。
在某些实施方式中，所述方法还包括对发酵产物或者水解产物进行纯化，例如，除去所述菌株。在某些实施方式中，所述除去所述菌株的步骤包括在加入无机酸之前从所述发酵产物中除去所述菌株，或在加入无机酸进行水解之后从所述水解产物中除去所述菌株。可以采用现有技术中的多种方法除去菌株，例如过滤。在某些实施方式中，所述除去所述菌株的步骤包括对所述发酵产物进行微滤，或者对所述水解产物进行微滤。在某些实施方式中，所述微滤通过使得发酵产物或水解产物经过微滤膜来实现。本发明中所述的微滤膜可以是市售的微滤膜，例如GE Healthcare Life Sciences公司、仕比纯公司、旭化成公司等公司生产的微滤中空纤维膜系列。在某些实施方式中，所述微滤膜的孔径为0.1μm～0.45μm，例如0.1μm、0.15μm、0.2μm、0.22μm、0.25μm、0.3μm、0.35μm、0.4μm、0.45μm或者以上任意两个数值范围之间的任意数值。根据用于发酵的菌株的尺寸，选择尽可能小的微滤膜孔径有助于大颗粒杂质的去除。
在某些实施方式中，将发酵步骤中的碱基核苷进行纯化之后，再进入水解步骤进行水解反应。优选地，在某些实施方式中，发酵步骤中的所述碱基核苷无需经过纯化即可进入水解步骤进行水解反应。在某些实施方式中，直接向发酵步骤得到的发酵产物中加入无机酸进行水解反应，从而得到水解产物。
在某些实施方式中，发酵步骤中的所述发酵的反应温度为30～40℃(例如，30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等)，反应时间为40-60小时(例如，42小时、45小时、48小时、50小时、52小时、55小时、56小时、57小时、58小时、59小时、60小时等)。
在某些实施方式中，水解步骤中的所述水解的反应温度为0～70℃(例如，10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃等)，反应时间为0.5～65小时(例如，5小时、10小时、15小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、45小时、50小时、55小时、60小时、65小时等)。
在某些实施方式中，本发明所述的方法进一步包括以下分离步骤：分离得到所述水解产物中的所述碱基和所述D-核糖。
在某些实施方式中，所述分离步骤包括将所述水解产物的温度降至-10～25℃以允许所述碱基的无机酸盐析晶。在某些实施方式中，所述碱基的无机酸盐的析晶时间为0～20小时(例如，5小时、10小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时等)。在某些实施方式中，本发明所述的方法进一步包括用水将分离的、析出的碱基无机酸盐晶体溶解，并用pH调节剂将碱基无机酸盐溶液调节至中性，冷却至-10～5℃(例如-5℃、-3℃、0℃、3℃、5℃等)，得到碱基。在某些实施方式中，所述pH调节剂包括氨水、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钾、碳酸钾、或碳酸氢钾。在某些实施方式中，所述碱基为次黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤、或其任意混合物等。
本发明的碱基是以碱基无机酸盐的方式产生，然后将得到的碱基无机酸盐溶解，再提纯得到碱基。这种产生方式的好处之一是碱基无机酸盐(例如，嘌呤无机酸盐)直接在水中析晶得到，其他杂质保留在母液中，碱基盐法得到的碱基(例如，嘌呤)纯度高，减少了碱基(例如，嘌呤)的提纯步骤。
在某些实施方式中，所述分离步骤进一步包括在分离所述析晶出的碱基无机酸盐之后，用pH调节剂将剩余的所述水解产物的pH调节至中性以便于提纯D-核糖。在某些实施方式中，所述pH调节剂包括氨水、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钾、碳酸钾、或碳酸氢钾。
在某些实施方式中，所述分离步骤还包括以下浓缩步骤：浓缩所述D-核糖。在某些实施方式中，所述浓缩步骤包括除去所述pH中性的所述水解产物中的溶剂，以及任选地，在除去溶剂后获得的产物中加入有机溶剂溶解所述D-核糖。在某些实施方式中，所述有机溶剂包括乙醇、甲醇、或其混合溶剂。
另一方面，本发明还提供了根据本发明所述的方法制备得的D-核糖和碱基。在某些实施方式中，所述碱基为次黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤、或其任意混合物等。在某些实施方式中，所述D-核糖和碱基的收率均大于90％，例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％等。在某些实施方式中，根据本发明的方法制备得到的D-核糖和碱基的纯度大于90％，例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％等。
本发明所述的制备D-核糖和碱基(特别地，嘌呤)的方法与现有的制备方法相比具有以下优点：
1.本发明所述方法的一种实施方式中，使用普通无机酸水解发酵产物，与传统工艺中使用的高温、水解酶、固体超强酸相比，本发明的反应条件更温和，成本更低廉；
2.本发明所述方法的一种实施方式中，发酵步骤得到的发酵产物中的碱基核苷无需进一步纯化即可用于水解步骤进行水解反应，省去了传统工艺中复杂的纯化步骤，减少了操作次数，大大降低了成本；
3.本发明所述方法的一种实施方式中，使用葡萄糖做原料，与传统工艺中使用的碱基核苷相比，原料成本更低廉，在制备D-核糖的同时也制备了嘌呤(例如，腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤等)，嘌呤也具有较高的市场价值，间接导致了生产D-核糖的成本降低，有利于工业化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
一级种子培养：枯草芽孢杆菌突变株(中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：CICC10082)接一支活化斜面(25×200)于装有160mL培养基的1000mL三角瓶中，32℃,170rpm培养18小时，OD600(×25)在2.0-3.0之间。培养基：葡萄糖20，氯化钠2.5，蛋白胨10，酵母粉10，pH 7.0，120℃灭菌30min。
二级种子培养：其中，配料:冷凝水:底糖:接种量(体积比)＝7.1:0.7:0.2:0.02，初始条件为温度37℃、pH 7.0、罐压0.03mpa、风量0.5m3/h，转速300rpm。OD600净值20(稀释25倍)左右移种，种龄10-12h。培养基：葡萄糖24，蛋白胨12，酵母粉15，次黄嘌呤0.5，玉米浆10。
发酵罐发酵培养：其中，底料：冷凝水：底糖：种子(体积比)＝25：1.3：0.7：3，初始条件为温度37℃、pH保持7.0、罐压0.03mpa、风量0.5m3/h，代谢时间48-56h。培养基：葡萄糖20，酵母粉25，玉米浆11，磷酸二氢钾0.5，硫酸镁0.01，次黄嘌呤1.0，碳酸钙40。发酵过程中控制溶氧30-50％，pH 7.0；发酵罐残糖降到0.5-1.0开始补流加糖，整个发酵过程糖控制在0.5-0.8％(重量/体积)；流加物料：70％浓糖8L、泡敌300mL和25％氨水；代谢时间：48-56h。获得的发酵液次黄嘌呤核苷浓度为80g/L-120g/L。
实施例2
一级种子培养：枯草芽孢杆菌突变株(中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：CICC10082)接一支活化斜面(25×200)于160mL培养基的1000mL三角瓶中，32℃,170rpm培养18小时，OD600(×25)在2.0-3.0之间。培养基：葡萄糖20，氯化钠2.5，蛋白胨10，酵母粉10，pH 7.0，120℃灭菌30min。
二级种子培养：其中，配料:冷凝水:底糖:接种量(体积比)＝7.1:0.7:0.2:0.02，初始条件为温度37℃、pH 7.0、罐压0.03mpa、风量0.5m3/h，转速300rpm。OD600净值20(稀释25倍)左右移种，种龄10-12h。培养基：葡萄糖24，蛋白胨12，酵母粉15，腺嘌呤0.5，玉米浆10。
发酵罐发酵培养：其中，底料：冷凝水：底糖：种子(体积比)＝25：1.3：0.7：3，初始条件为温度37℃、pH保持7.0、罐压0.03mpa、风量0.5m3/h，代谢时间48-56h。培养基：葡萄糖20，酵母粉25，玉米浆11，磷酸二氢钾0.5，硫酸镁0.01，腺嘌呤0.60，碳酸钙40。发酵过程中控制溶氧30-50％，pH 7.0；发酵罐残糖降到0.5-1.0开始补流加糖，整个发酵过程糖控制在0.5-0.8％(重量/体积)；流加物料：70％浓糖8L、泡敌300mL和25％氨水；代谢时间：48-56h。获得的发酵液腺嘌呤核苷浓度为35g/L-50g/L。
实施例3
一级种子培养：枯草芽孢杆菌突变株(中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：CICC10082)接一支活化斜面(25×200)于160mL培养基的1000mL三角瓶中，32℃,170rpm培养18小时，OD600(×25)在2.0-3.0之间。培养基：葡萄糖20，氯化钠2.5，蛋白胨10，酵母粉10，pH 7.0，120℃灭菌30min。
二级种子培养：其中，配料:冷凝水:底糖:接种量(体积比)＝7.1:0.7:0.2:0.02，初始条件为温度37℃、pH 7.0、罐压0.03mpa、风量0.5m3/h，转速300rpm。OD600净值20(稀释25倍)左右移种，种龄10-12h。培养基：葡萄糖24，蛋白胨12，酵母粉15，鸟嘌呤0.5，玉米浆10。
发酵罐发酵培养：其中，底料：冷凝水：底糖：种子(体积比)＝25：1.3：0.7：3，初始条件为温度37℃、pH保持7.0、罐压0.03mpa、风量0.5m3/h，代谢时间48-56h。培养基：葡萄糖20，酵母粉25，玉米浆11，磷酸二氢钾0.5，硫酸镁0.01，鸟嘌呤0.60，碳酸钙40。发酵过程中控制溶氧30-50％，pH 7.0；发酵罐残糖降到0.5-1.0开始补流加糖，整个发酵过程糖控制在0.5-0.8％(重量/体积)；流加物料：70％浓糖8L、泡敌300mL和25％氨水；代谢时间：48-56h。获得的发酵液鸟嘌呤核苷浓度为50g/L-80g/L。
实施例4
将实施例2得到的发酵液1000ml(腺嘌呤核苷浓度35g/L)，加入36％盐酸70ml，在60℃下保温23小时。反应液过微滤膜，过膜后液体冷却到0℃，保温10h，过滤得到腺嘌呤盐酸盐。腺嘌呤盐酸盐加入200ml水，氢氧化钠溶液调节反应液到中性，浑浊液冷却到0℃，保温10h，抽滤得到腺嘌呤湿固体，烘干得到腺嘌呤17.12g，收率96.72％，纯度99.1％。过滤掉腺嘌呤盐酸盐后的母液浓缩掉水，加入乙醇混合均匀，再一次浓缩，浓缩至无溶剂，反复三次。然后加入乙醇溶解，过滤掉不溶物，浓缩掉大量乙醇，剩余乙醇溶液-10℃结晶，晶体50℃真空烘干获得D-核糖18.09g，收率91.97％，纯度99.5％。
实施例5
将实施例2得到的发酵液1000ml(腺嘌呤核苷浓度40g/L)，加入浓硫酸60ml，在40℃下保温48小时。反应液过微滤膜，过膜后液体冷却到0℃，保温10h，过滤得到腺嘌呤硫酸盐。腺嘌呤硫酸盐加入200ml水，氢氧化钠溶液调节反应液到中性，浑浊液冷却到0℃，保温10h，抽滤得到腺嘌呤湿固体，烘干得到腺嘌呤19.13g，收率94.56％，纯度99.6％。过滤掉腺嘌呤硫酸盐后的母液浓缩掉水，加入乙醇混合均匀，再一次浓缩，浓缩至无溶剂，反复三次。然后加入乙醇溶解，过滤掉不溶物，浓缩掉大量乙醇，剩余乙醇溶液-10℃结晶，晶体50℃真空烘干获得D-核糖20.78g，收率92.48％，纯度99.2％。
实施例6
将实施例2得到的1000ml发酵液(腺嘌呤核苷浓度50g/L)过微滤膜，膜滤出液加入36％盐酸60ml，在20℃下保温65小时。液体冷却到-5℃，保温10h，过滤得到腺嘌呤盐酸盐。腺嘌呤盐酸盐加入200ml水，氢氧化钠溶液调节反应液到中性，浑浊液冷却到0℃，保温12h，抽滤得到腺嘌呤湿固体，烘干得到腺嘌呤25.12g，收率99.36％，纯度99.3％。过滤掉腺嘌呤盐酸盐后的母液浓缩浓缩掉水，加入乙醇混合均匀，再一次浓缩，浓缩至无溶剂，反复三次。然后加入乙醇溶解，过滤掉不溶物，浓缩掉大量乙醇，剩余乙醇溶液-15℃结晶，晶体50℃真空烘干获得D-核糖26.90g，收率95.76％，纯度99.8％。
实施例7
将实施例3得到的1000ml发酵液(鸟嘌呤核苷浓度60g/L)过微滤膜，膜滤出液加入36％盐酸20ml，在60℃下保温24小时。液体冷却到-5℃，保温10h，过滤得到鸟嘌呤盐酸盐。鸟嘌呤盐酸盐加入300ml水，氢氧化钠溶液调节反应液到中性，浑浊液冷却到0℃，保温12h，抽滤得到鸟嘌呤湿固体，烘干得到鸟嘌呤31.2g，收率97.5％，纯度99.1％。过滤掉鸟嘌呤盐酸盐后的母液浓缩浓缩掉水，加入乙醇混合均匀，再一次浓缩，浓缩至无溶剂，反复三次。然后加入乙醇溶解，过滤掉不溶物，浓缩掉大量乙醇，剩余乙醇溶液-15℃结晶，晶体50℃真空烘干获得D-核糖30.3g，收率95.3％，纯度99.2％。
实施例8
将实施例1得到的1000ml发酵液(次黄嘌呤核苷浓度80g/L)过微滤膜，膜滤出液加入36％盐酸15ml，在70℃下保温24小时。液体冷却到-5℃，保温10h，过滤得到次黄嘌呤盐酸盐。次黄嘌呤盐酸盐加入400ml水，氢氧化钾溶液调节反应液到中性，浑浊液冷却到0℃，保温12h，抽滤得到次黄嘌呤湿固体，烘干得到次黄嘌呤39.4g，收率97.1％，纯度99.3％。过滤掉次黄嘌呤盐酸盐后的母液浓缩浓缩掉水，加入甲醇混合均匀，再一次浓缩，浓缩至无溶剂，反复三次。然后加入甲醇溶解，过滤掉不溶物，浓缩掉大量甲醇，剩余甲醇溶液-15℃结晶，晶体50℃真空烘干获得D-核糖42.18g，收率94.2％，纯度99.1％。
实施例9
取市场上购买成品腺苷(购自通辽梅花生物科技有限公司)80g，加入1000ml水，配制腺苷浓度80g/L，再加入36％盐酸96ml，在60℃下保温20小时。停止加热反应，液体冷却到0℃，保温10h，过滤得到腺嘌呤盐酸盐。腺嘌呤盐酸盐加入200ml水，氢氧化钠溶液调节反应液到中性，浑浊液冷却到0℃，保温10h，抽滤得到腺嘌呤湿固体，烘干得到腺嘌呤38.2g，收率94.4％，纯度99.2％。过滤掉腺嘌呤盐酸盐后的母液浓缩掉水，加入乙醇混合均匀，再一次浓缩，浓缩至无溶剂，反复三次。然后加入乙醇溶解，过滤掉不溶物，浓缩掉大量乙醇，剩余乙醇溶液-10℃结晶，晶体50℃真空烘干获得D-核糖40.9g，收率91.01％，纯度99.4％。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (29)

1.一种制备D-核糖和碱基的方法，其特征在于，包括以下水解步骤：将碱基核苷在无机酸的催化下水解，得到含有D-核糖和碱基的水解产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碱基核苷是通过发酵步骤得到的，所述发酵步骤包括利用菌株对葡萄糖溶液进行发酵，以得到含有所述碱基核苷的发酵产物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述菌株为枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、或产氨短杆菌。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述碱基核苷为嘌呤核苷。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述嘌呤核苷包括次黄嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、或其任意混合物。
6.根据前述任一权利要求中所述的方法，其特征在于，所述水解步骤中的所述碱基为嘌呤。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述嘌呤为次黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤、或其任意混合物。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括在得到所述发酵产物之后除去所述菌株。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述除去所述菌株的步骤包括在加入无机酸之前除去所述发酵产物中的所述菌株，或在加入无机酸进行水解之后除去所述水解产物中的所述菌株。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述除去所述菌株的步骤包括对所述发酵产物进行微滤，或者对所述水解产物进行微滤。
11.根据权利要求2-10中任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵步骤中的所述碱基核苷无需经过纯化即可进入所述水解步骤进行水解。
12.根据前述任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述无机酸选自以下组的一种或多种酸：磷酸、硫酸、盐酸、硝酸。
13.根据前述任一权利要求所述方法，其特征在于，所述无机酸为浓酸。
14.根据前述任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述无机酸与所述碱基核苷的质量比为0.2～5：1。
15.根据前述任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述发酵步骤中的所述发酵的反应温度为30-40℃，发酵时间为40-60小时。
16.根据前述任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述水解步骤中的所述水解的反应温度为0～70℃，反应时间为0.5～65小时。
17.根据前述任一权利要求所述的方法，其特征在于，其进一步包括以下分离步骤：分离得到所述水解产物中的所述碱基和所述D-核糖。
18.根据权利要求17中所述的方法，其特征在于，所述分离步骤包括将所述水解产物的温度降至-10～25℃以允许所述碱基的无机酸盐析晶。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述碱基的无机酸盐的析晶时间为0～20小时。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于，进一步包括用pH调节剂将所述分离的析晶出的碱基无机酸盐调节至中性，冷却，得到碱基。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述碱基为次黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤、或其任意混合物。
22.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于，所述分离步骤进一步包括在分离所述析晶出的碱基无机酸盐之后，用pH调节剂将剩余的所述水解产物的pH调节至中性。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述pH调节剂包括氨水、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钾、碳酸钾、或碳酸氢钾。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其特征在于，所述分离步骤还包括以下浓缩步骤：浓缩所述D-核糖。
25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述浓缩步骤包括除去所述pH中性的所述水解产物中的溶剂，以及任选地，加入有机溶剂溶解所述D-核糖。
26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂包括乙醇、甲醇、或其混合溶剂。
27.根据权利要求2-26中任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵步骤中得到的碱基核苷的产率为50-80g/L。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法制备得的D-核糖和碱基。
29.根据权利要求28所述的碱基，其特征在于，所述碱基为次黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤、或其任意混合物。
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