CN111394300A - 一种大规模干细胞培养方法和设备 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种大规模干细胞培养方法，该方法包括以下步骤：将3D微胶囊溶胀，3D微胶囊呈蜂巢状，直径为0.5‑10mm，微囊的孔径为10nm‑10000nm；将单细胞悬液接种于溶胀后的3D微胶囊，干细胞的接种密度为1‑8×105个/ml，再用扩增培养基对干细胞进行扩增培养，培养条件如下：静态培养1‑3天，静态培养时的搅拌速度调至50‑70RPM、pH调至7.0、DO50％、温度为37±1℃，每隔2天补加一次培养基，灌流培养3‑5天，灌流培养时的灌流流速由0.8vvd升至2vvd，调节搅拌速度升至100rpm，每隔2天补加一次培养基；用3D微胶囊溶解剂进行解囊；收获扩增细胞；本发明提供的大规模干细胞培养方法能够解决大规模培养时细胞难以收获的问题，且使用该方法培养的干细胞增殖效果好、活率高，收获时间短。

Description

一种大规模干细胞培养方法和设备
技术领域
本发明属于干细胞技术领域，特别涉及一种大规模干细胞培养方法和设备。
背景技术
干细胞是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的原始的未分化细胞，是形成哺乳类动物的各组织器官的原始细胞，干细胞的用途非常广泛，涉及到医学的多个领域，现有的干细胞培养多是在实验室小规模培养，当扩大规模时，收获困难，因此急需一种能够易于收获的大规模干细胞培养的方法。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供了一种大规模干细胞培养方法。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供了一种大规模干细胞培养方法，该方法包括以下步骤：
将3D微胶囊溶胀，3D微胶囊呈蜂巢状，直径为0.5-10mm，微囊的孔径为10nm-10000nm；
将单细胞悬液接种于溶胀后的3D微胶囊，干细胞的接种密度为1-8×105个/ml，再用扩增培养基对干细胞进行扩增培养，培养条件如下：静态培养1-3天，静态培养时的搅拌速度调至50-70RPM、pH调至7.0、DO50％、温度为37±1℃，每隔2天补加一次培养基，灌流培养3-5天，灌流培养时的灌流流速由0.8vvd升至2vvd，灌流流速的上升速度为1-3vvd/h，调节搅拌速度升至100rpm，每隔2天补加一次培养基；
用3D微胶囊溶解剂进行解囊；
收获扩增细胞。
其中，扩增培养基包括所有用于细胞扩增的培养基，当待培养的干细胞为间充质干细胞时，培养基优选为DMEM/F12培养基，本发明提供的3D微胶囊支持多种贴附依赖性细胞(贴壁细胞)、兼性贴壁细胞等绝大多数细胞类型的高效生产和收获，包括：成纤维型细胞(内皮细胞、间充质细胞、成骨细胞、心肌细胞、软骨细胞等)、上皮型细胞(皮肤细胞、表皮衍生物、消化管上皮细胞等)、游走型细胞(巨噬细胞、肿瘤细胞等)、多形性型细胞(神经元细胞、神经胶质细胞等)等,扩增细胞的收获方法根据具体情况而定，如采用ATF2细胞截留设备收获，本发明采用以上方法能够提高细胞大规模培养时的细胞得率。
进一步地，将单细胞悬液接种于溶胀后的3D微胶囊采用的是旋转培养的方式接种，其中，旋转培养的搅拌速度为30-50r/min。
进一步地，步骤(2)溶胀3D微胶囊的具体操作如下：将3D微胶囊与DMEM/F12培养基搅拌均匀，3D微胶囊在DMEM/F12培养基中的浓度为100-1000g/L，静置3-5h，再将3D微胶囊转移到含10％FBS的DMEM/F12培养基中，含10％FBS的DMEM/F12培养基的体积与DMEM/F12培养基的体积比为1-2:1-2。
进一步地，3D微胶囊的制备方法为：
S1：将重量百分比为1-6wt％的海藻酸钠溶液与重量百分比为0.1-5wt％的明胶溶液以0.1-2:0.1-2的比例混合均匀，制得第一混合溶液；
S2：在第一混合溶液中加入起泡剂混合均匀，起泡剂在第一混合溶液中的浓度为5-100g/L，制得第二混合溶液；
S3：在第二混合溶液中滴加CaCl2溶液，CaCl2溶液与第一混合溶液的体积比为1-2:1-2，制得3D微胶囊溶液；
S4：将3D微胶囊溶液用生理盐水洗涤3-6次，在进行真空干燥，制得干燥3D微胶囊；
S5：将干燥3D微胶囊压扁、灭菌，即得3D微胶囊。
进一步地，3D微胶囊溶解剂包括质量比为0.1-1.0:0.1-2.0:0.1-1.0:0.1-2.0的氨基酸+柠檬酸+柠檬酸钠+EDTA钠盐，氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸)、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、氨基酸、精氨酸和组氨酸中的任意一种。
进一步地，溶解剂的用量与溶胀后的3D微胶囊的体积比为1-2:1-4。
进本发明还提供了一种大规模干细胞培养设备，该设备包括生物反应器、中空纤维过滤器、控制装置和废液瓶，控制装置包括整合于一体的控制主机、磁悬浮离心进样泵、滤液/补液辅助泵组成，中空纤维过滤器用于将废液滤除，将细胞截留在生物反应器中，生物反应器通过第一连接管分别连接有细胞容纳瓶、培养基容纳瓶、3D微胶囊容纳瓶和溶解剂容纳瓶，通过进样管路和回流管路与中控纤维过滤器相连接，中空纤维过滤器通过第二连接管与磁悬浮离心进样泵和滤液/补液辅助泵连接，磁悬浮离心进样泵通过废液管与废液瓶相连接。
进一步地，中空纤维过滤器包括过滤器本体和设置于过滤器本体上的超声回流流量计，过滤器本体的底端分别通过磁悬浮泵泵头与进样压力传感器进样管路相连，靠近过滤器本体的回流管路上依次设有回流压力传感器和无菌取样断口，进样压力传感器和回流压力传感器与控制主机相连接。
进一步地，与磁悬浮离心进样泵连接的第二连接管靠近过滤器本体的一端设有滤液压力传感器，滤液压力传感器与控制主机相连接。
进一步地，生物反应器还连接有自动灌装机。
本发明提供的大规模干细胞培养方法能够解决现有技术中大规模培养干细胞时难以收获的问题，且使用本发明提供的方法培养的干细胞增殖效果好、活率高，收获时间短。
附图说明
图1.为实施例1-3的大规模干细胞培养设备的结构示意图；
其中，生物反应器1、控制装置2、废液瓶3、进样管路4、回流管路5、第二连接管6、废液管7、过滤器本体8、超声回流流量计9、磁悬浮泵泵头10与进样压力传感器11、进样压力传感器12和回流压力传感器13、滤液压力传感器14。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供了一种大规模干细胞培养方法，该方法通过图1所示的设备实现；该培养方法包括以下步骤：将3D微胶囊溶胀，3D微胶囊呈蜂巢状，直径为0.5，微囊的孔径为10nm；
将间充质干细胞接种于溶胀后的3D微胶囊，干细胞的接种密度为1×105个/ml，再用扩增培养基对干细胞进行扩增培养，培养条件如下：静态培养1天，静态培养时的搅拌速度调至50RPM、pH调至7.0、DO50％、温度为37℃，每隔2天补加一次培养基，灌流培养3天，灌流培养时的灌流流速由0.8vvd升至2vvd，灌流流速的上升速度为1vvd/h，调节搅拌速度升至100rpm，每隔2天补加一次培养基；
用3D微胶囊溶解剂进行解囊；
收获扩增细胞；
其中，将单细胞悬液接种于溶胀后的3D微胶囊采用的是旋转培养的方式接种，其中，旋转培养的搅拌速度为30r/min；
溶胀3D微胶囊的具体操作如下：将3D微胶囊与DMEM/F12培养基搅拌均匀，3D微胶囊在DMEM/F12培养基中的浓度为100g/L，静置3h，再将3D微胶囊转移到含10％FBS的DMEM/F12培养基中，含10％FBS的DMEM/F12培养基的体积与DMEM/F12培养基的体积比为1:2；
3D微胶囊的制备方法为：
S1：将重量百分比为1wt％的海藻酸钠溶液与重量百分比为0.1wt％的明胶溶液以0.1:2的比例混合均匀，制得第一混合溶液；
S2：在所述第一混合溶液中加入起泡剂混合均匀，所述起泡剂在所述第一混合溶液中的浓度为5g/L，制得第二混合溶液；
S3：在所述第二混合溶液中滴加CaCl2溶液，所述CaCl2溶液与所述第一混合溶液的体积比为2:1，制得3D微胶囊溶液；
S4：将所述3D微胶囊溶液用生理盐水洗涤3次，在进行真空干燥，制得干燥3D微胶囊；
S5：将所述干燥3D微胶囊压扁、灭菌，即得3D微胶囊；
3D微胶囊溶解剂包括质量比为1:2:1:2的丝氨酸+柠檬酸+柠檬酸钠+EDTA钠盐；
溶解剂的用量与溶胀后的3D微胶囊的体积比为2:1；
其中，图1所示的设备包括生物反应器1、中空纤维过滤器、控制装置2和废液瓶3，控制装置包括整合于一体的控制主机、磁悬浮离心进样泵、滤液/补液辅助泵组成，中空纤维过滤器用于将废液滤除，将细胞截留在生物反应器中，生物反应器通过第一连接管分别连接有细胞容纳瓶、培养基容纳瓶、3D微胶囊容纳瓶和溶解剂容纳瓶，图中未示出，通过进样管路4和回流管路5与中控纤维过滤器相连接，中空纤维过滤器通过第二连接管6与磁悬浮离心进样泵和滤液/补液辅助泵连接，磁悬浮离心进样泵通过废液管7与废液瓶3相连接，中空纤维过滤器包括过滤器本体8和设置于过滤器本体上的超声回流流量计9，过滤器本体的底端分别通过磁悬浮泵泵头10与进样压力传感器11进样管路4相连，靠近过滤器本体8的回流管路5上依次设有回流压力传感器12和无菌取样断口13，进样压力传感器11和回流压力传感器12与控制主机相连接，与磁悬浮离心进样泵连接的第二连接管6靠近过滤器本体8的一端设有滤液压力传感器14，滤液压力传感器14与控制主机相连接，生物反应器1还连接有自动灌装机，图中未示出。
使用以上设备和方法进行细胞培养时，先将微载体进行溶胀，溶胀3D微胶囊的具体操作如下：将500g的3D微胶囊与1L的DMEM/F12培养基搅拌均匀，3D微胶囊在DMEM/F12培养基中的浓度为100g/L，静置3h，再将3D微胶囊转移到2L含10％FBS的DMEM/F12培养基中，将溶胀后的微胶囊放入3D微胶囊容纳瓶内，将含有20×108个细胞的单细胞悬液放入细胞容纳瓶内，将2L的DMEM/F12培养基放入培养基容纳瓶内，将3D微胶囊溶解剂放入溶解剂容纳瓶内，控制装置中的启动滤液/补液辅助泵，将细胞容纳瓶、3D微胶囊容纳瓶中的单细胞悬液和溶胀后的3D微胶囊通过第一连接管导入5L的生物反应器中进行接种，接种过程中，可通过无菌取样断口取样检测是否接种成功，接种成功后，通过第一连接管导入培养基容纳瓶中的DMEM/F12培养基对细胞进行扩增培养，当扩增完成后，通过第一连接管导入3D微胶囊溶解剂进行解囊，解囊成功后，启动磁悬浮离心进样泵，将生物反应器的内容物导入过滤器本体内进行循环过滤，废液透过过滤器本体内的过滤膜沿第二连接管和废液管进入废液罐，扩增后的细胞留置在生物反应器内，在扩增后的细胞中添加冻存液后即可导入自动灌装机进行灌装，将灌装好的细胞放入液氮环境下保存。
实施例2
本实施例提供了一种大规模干细胞培养方法，该方法通过图1所示的设备实现；该培养方法包括以下步骤：将3D微胶囊溶胀，3D微胶囊呈蜂巢状，直径为5mm，微囊的孔径为5000nm；
将间充质干细胞接种于溶胀后的3D微胶囊，干细胞的接种密度为4×105个/ml，再用扩增培养基对干细胞进行扩增培养，培养条件如下：静态培养2天，静态培养时的搅拌速度调至60RPM、pH调至7.0、DO50％、温度为37℃，每隔2天补加一次培养基，灌流培养4天，灌流培养时的灌流流速由0.8vvd升至2vvd，灌流流速的上升速度为2vvd/h，调节搅拌速度升至100rpm，每隔2天补加一次培养基；
用3D微胶囊溶解剂进行解囊；
收获扩增细胞；
其中，将单细胞悬液接种于溶胀后的3D微胶囊采用的是旋转培养的方式接种，其中，旋转培养的搅拌速度为40r/min；
溶胀3D微胶囊的具体操作如下：将3D微胶囊与DMEM/F12培养基搅拌均匀，3D微胶囊在DMEM/F12培养基中的浓度为500g/L，静置4h，再将3D微胶囊转移到含10％FBS的DMEM/F12培养基中，含10％FBS的DMEM/F12培养基的体积与DMEM/F12培养基的体积比为1:1；
3D微胶囊的制备方法为：
S1：将重量百分比为3wt％的海藻酸钠溶液与重量百分比为3wt％的明胶溶液以1:1的比例混合均匀，制得第一混合溶液；
S2：在所述第一混合溶液中加入起泡剂混合均匀，所述起泡剂在所述第一混合溶液中的浓度为50g/L，制得第二混合溶液；
S3：在所述第二混合溶液中滴加CaCl2溶液，所述CaCl2溶液与所述第一混合溶液的体积比为1:1，制得3D微胶囊溶液；
S4：将所述3D微胶囊溶液用生理盐水洗涤5次，在进行真空干燥，制得干燥3D微胶囊；
S5：将所述干燥3D微胶囊压扁、灭菌，即得3D微胶囊；
3D微胶囊溶解剂包括质量比为1.0:0.1:1.0:0.1的丙氨酸+柠檬酸+柠檬酸钠+EDTA钠盐；
溶解剂的用量与溶胀后的3D微胶囊的体积比为1:1；
其中，图1所示的设备包括生物反应器1、中空纤维过滤器、控制装置2和废液瓶3，控制装置包括整合于一体的控制主机、磁悬浮离心进样泵、滤液/补液辅助泵组成，中空纤维过滤器用于将废液滤除，将细胞截留在生物反应器中，生物反应器通过第一连接管分别连接有细胞容纳瓶、培养基容纳瓶、3D微胶囊容纳瓶和溶解剂容纳瓶，图中未示出，通过进样管路4和回流管路5与中控纤维过滤器相连接，中空纤维过滤器通过第二连接管6与磁悬浮离心进样泵和滤液/补液辅助泵连接，磁悬浮离心进样泵通过废液管7与废液瓶3相连接，中空纤维过滤器包括过滤器本体8和设置于过滤器本体上的超声回流流量计9，过滤器本体的底端分别通过磁悬浮泵泵头10与进样压力传感器11进样管路4相连，靠近过滤器本体8的回流管路5上依次设有回流压力传感器12和无菌取样断口13，进样压力传感器11和回流压力传感器12与控制主机相连接，与磁悬浮离心进样泵连接的第二连接管6靠近过滤器本体8的一端设有滤液压力传感器14，滤液压力传感器14与控制主机相连接，生物反应器1还连接有自动灌装机，图中未示出。
使用以上设备和方法进行细胞培养时，先将微载体进行溶胀，溶胀3D微胶囊的具体操作如下：将5000g的3D微胶囊与10L的DMEM/F12培养基搅拌均匀，静置4h，再将3D微胶囊转移到10L的含10％FBS的DMEM/F12培养基中，将溶胀后的微胶囊放入3D微胶囊容纳瓶内，将含有20×109个细胞的单细胞悬液放入细胞容纳瓶内，将30L的DMEM/F12培养基放入培养基容纳瓶内，将3D微胶囊溶解剂放入溶解剂容纳瓶内，控制装置中的启动滤液/补液辅助泵，将细胞容纳瓶、3D微胶囊容纳瓶中的单细胞悬液和溶胀后的3D微胶囊通过第一连接管导入50L的生物反应器中进行接种，接种过程中，可通过无菌取样断口取样检测是否接种成功，接种成功后，通过第一连接管导入培养基容纳瓶中的DMEM/F12培养基对细胞进行扩增培养，当扩增完成后，通过第一连接管导入3D微胶囊溶解剂进行解囊，解囊成功后，启动磁悬浮离心进样泵，将生物反应器的内容物导入过滤器本体内进行循环过滤，废液透过过滤器本体内的过滤膜沿第二连接管和废液管进入废液罐，扩增后的细胞留置在生物反应器内，在扩增后的细胞中添加冻存液后即可导入自动灌装机进行灌装，将灌装好的细胞放入液氮环境下保存。
实施例3
本实施例提供了一种大规模干细胞培养方法，该方法通过图1所示的设备实现；该培养方法包括以下步骤：将3D微胶囊溶胀，3D微胶囊呈蜂巢状，直径为10mm，微囊的孔径为10000nm；
将间充质干细胞接种于溶胀后的3D微胶囊，干细胞的接种密度为8×105个/ml，再用扩增培养基对干细胞进行扩增培养，培养条件如下：静态培养3天，静态培养时的搅拌速度调至70RPM、pH调至7.0、DO50％、温度为37℃，每隔2天补加一次培养基，灌流培养5天，灌流培养时的灌流流速由0.8vvd升至2vvd，灌流流速的上升速度为3vvd/h，调节搅拌速度升至100rpm，每隔2天补加一次培养基；
用3D微胶囊溶解剂进行解囊；
收获扩增细胞；
其中，将单细胞悬液接种于溶胀后的3D微胶囊采用的是旋转培养的方式接种，其中，旋转培养的搅拌速度为50r/min；
溶胀3D微胶囊的具体操作如下：将3D微胶囊与DMEM/F12培养基搅拌均匀，3D微胶囊在DMEM/F12培养基中的浓度为1000g/L，静置5h，再将3D微胶囊转移到含10％FBS的DMEM/F12培养基中，含10％FBS的DMEM/F12培养基的体积与DMEM/F12培养基的体积比为1:2；
3D微胶囊的制备方法为：
S1：将重量百分比为6wt％的海藻酸钠溶液与重量百分比为5wt％的明胶溶液以0.1:2的比例混合均匀，制得第一混合溶液；
S2：在所述第一混合溶液中加入起泡剂混合均匀，所述起泡剂在所述第一混合溶液中的浓度为100g/L，制得第二混合溶液；
S3：在所述第二混合溶液中滴加CaCl2溶液，所述CaCl2溶液与所述第一混合溶液的体积比为1:2，制得3D微胶囊溶液；
S4：将所述3D微胶囊溶液用生理盐水洗涤6次，在进行真空干燥，制得干燥3D微胶囊；
S5：将所述干燥3D微胶囊压扁、灭菌，即得3D微胶囊；
3D微胶囊溶解剂包括质量比为0.1:2.0:0.1:2.0的甘氨酸+柠檬酸+柠檬酸钠+EDTA钠盐；
溶解剂的用量与溶胀后的3D微胶囊的体积比为1:4；
其中，图1所示的设备包括生物反应器1、中空纤维过滤器、控制装置2和废液瓶3，控制装置包括整合于一体的控制主机、磁悬浮离心进样泵、滤液/补液辅助泵组成，中空纤维过滤器用于将废液滤除，将细胞截留在生物反应器中，生物反应器通过第一连接管分别连接有细胞容纳瓶、培养基容纳瓶、3D微胶囊容纳瓶和溶解剂容纳瓶，图中未示出，通过进样管路4和回流管路5与中控纤维过滤器相连接，中空纤维过滤器通过第二连接管6与磁悬浮离心进样泵和滤液/补液辅助泵连接，磁悬浮离心进样泵通过废液管7与废液瓶3相连接，中空纤维过滤器包括过滤器本体8和设置于过滤器本体上的超声回流流量计9，过滤器本体的底端分别通过磁悬浮泵泵头10与进样压力传感器11进样管路4相连，靠近过滤器本体8的回流管路5上依次设有回流压力传感器12和无菌取样断口13，进样压力传感器11和回流压力传感器12与控制主机相连接，与磁悬浮离心进样泵连接的第二连接管6靠近过滤器本体8的一端设有滤液压力传感器14，滤液压力传感器14与控制主机相连接，生物反应器1还连接有自动灌装机，图中未示出。
使用以上设备和方法进行细胞培养时，先将微载体进行溶胀，溶胀3D微胶囊的具体操作如下：将50000g的3D微胶囊与100L的DMEM/F12培养基搅拌均匀，静置5h，再将3D微胶囊转移到50L的含10％FBS的DMEM/F12培养基中，将溶胀后的微胶囊放入3D微胶囊容纳瓶内，将含有20×1010个细胞的单细胞悬液放入细胞容纳瓶内，将350L的DMEM/F12培养基放入培养基容纳瓶内，将3D微胶囊溶解剂放入溶解剂容纳瓶内，控制装置中的启动滤液/补液辅助泵，将细胞容纳瓶、3D微胶囊容纳瓶中的单细胞悬液和溶胀后的3D微胶囊通过第一连接管导入500L的生物反应器中进行接种，接种过程中，可通过无菌取样断口取样检测是否接种成功，接种成功后，通过第一连接管导入培养基容纳瓶中的DMEM/F12培养基对细胞进行扩增培养，当扩增完成后，通过第一连接管导入3D微胶囊溶解剂进行解囊，解囊成功后，启动磁悬浮离心进样泵，将生物反应器的内容物导入过滤器本体内进行循环过滤，废液透过过滤器本体内的过滤膜沿第二连接管和废液管进入废液罐，扩增后的细胞留置在生物反应器内，在扩增后的细胞中添加冻存液后即可导入自动灌装机进行灌装，将灌装好的细胞放入液氮环境下保存。
对照例1
本对照例提供了一种大规模干细胞培养方法，该方法通过图1所示的设备实现；该培养方法包括以下步骤：将新加坡ESCO商品化纸片载体按照说明进行细胞培养；
按照产品说明书将间充质干细胞接种于新加坡ESCO商品化纸片载体，并用图1所示的设备对其进行扩增；再用对应的溶解剂进行解囊；收获扩增细胞；
其中，图1所示的设备包括生物反应器、中空纤维过滤器、控制装置和废液瓶，控制装置包括整合于一体的控制主机、磁悬浮离心进样泵、滤液/补液辅助泵组成，中空纤维过滤器用于将废液滤除，将细胞截留在生物反应器中，生物反应器通过第一连接管分别连接有细胞容纳瓶、培养基容纳瓶、新加坡ESCO商品化纸片载体容纳瓶和溶解剂容纳瓶，通过进样管路和回流管路与中控纤维过滤器相连接，中空纤维过滤器通过第二连接管与磁悬浮离心进样泵和滤液/补液辅助泵连接，磁悬浮离心进样泵通过废液管与废液瓶相连接，中空纤维过滤器包括过滤器本体和设置于过滤器本体上的超声回流流量计，过滤器本体的底端分别通过磁悬浮泵泵头与进样压力传感器进样管路相连，靠近过滤器本体的回流管路上依次设有回流压力传感器和无菌取样断口，进样压力传感器和回流压力传感器与控制主机相连接，与磁悬浮离心进样泵连接的第二连接管靠近过滤器本体的一端设有滤液压力传感器，滤液压力传感器与控制主机相连接，生物反应器还连接有自动灌装机。
对照例2
本对照例提供了一种大规模干细胞培养方法，该方法通过图1所示的设备实现；该培养方法包括以下步骤：将3D微胶囊溶胀，3D微胶囊呈蜂巢状，直径为0.5，微囊的孔径为10nm；
将间充质干细胞接种于溶胀后的3D微胶囊，干细胞的接种密度为1×105个/ml，再用扩增培养基对干细胞进行扩增培养，培养条件如下：静态培养1天，静态培养时的搅拌速度调至30RPM、pH调至6.5、DO50％、温度为37℃，每隔2天补加一次培养基，灌流培养3天，灌流培养时的灌流流速由0.8vvd升至4vvd，调节搅拌速度升至150rpm，每隔2天补加一次培养基；
用3D微胶囊溶解剂进行解囊；
收获扩增细胞；
其中，将单细胞悬液接种于溶胀后的3D微胶囊采用的是旋转培养的方式接种，其中，旋转培养的搅拌速度为30r/min；
溶胀3D微胶囊的具体操作、3D微胶囊的制备方法、3D微胶囊溶解剂的组成、设备以及操作流程均与实施例1相同。
对照例3
本对照例提供了一种大规模干细胞培养方法，该方法通过图1所示的设备实现；该培养方法包括以下步骤：将3D微胶囊溶胀，3D微胶囊呈蜂巢状，直径为0.5，微囊的孔径为10nm；
将间充质干细胞接种于溶胀后的3D微胶囊，干细胞的接种密度为1×105个/ml，再用扩增培养基对干细胞进行扩增培养，培养条件如下：静态培养1天，静态培养时的搅拌速度调至80RPM、pH调至7.5、DO50％、温度为37℃，每隔2天补加一次培养基，灌流培养3天，灌流培养时的灌流流速由0.3vvd升至1vvd，调节搅拌速度不变，每隔2天补加一次培养基；
用3D微胶囊溶解剂进行解囊；
收获扩增细胞；
其中，将单细胞悬液接种于溶胀后的3D微胶囊采用的是旋转培养的方式接种，其中，旋转培养的搅拌速度为80r/min；
溶胀3D微胶囊的具体操作、3D微胶囊的制备方法、3D微胶囊溶解剂的组成、设备以及操作流程均与实施例1相同。
试验例1
用本发明实施例1-3和对照例1-3提供的方法及设备培养间充质干细胞，其中对照例1-3与实施例1的细胞接种量相同；7天后检测各组细胞培养后的收获细胞的活率和增殖倍数；细胞增殖倍数可采用台盼蓝计数法进行测定，具体方法为：将负载细胞的微胶囊裂解后定容，取0.5ml细胞悬液放入小试管里，再加0.4％台酚蓝染液0.5ml，用吸管轻轻吹打混匀，染色3分钟，然后把悬液摇匀，吸取悬液滴在血球计数板上，蓝色细胞为死细胞；按以下公式计算细胞活率，细胞活率＝(细胞总数-死细胞数)/细胞总数，试验结果如表1。
表1.通过各组方法培养的细胞活率试验结果.
Figure BDA0002429276660000151
Figure BDA0002429276660000161
由表1可知，在收获时间均为7天时，实施例1-3的方法在大规模培养干细胞时的增殖倍数和细胞活率均高于对照例1-3，由此可知，本发明提供的大规模干细胞培养方法能够显著提高细胞活率、细胞增殖倍数以及细胞收获率，显著缩短细胞收获的时间，当用其他微载体替换本发明的3D微胶囊或修改本发明提供的方法中具体的参数时，均会显著降低干细胞大规模培养时的培养效果。
综上，仅为本发明之较佳实施例，不以此限定本发明的保护范围，凡依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆为本发明专利涵盖的范围之内。

Claims (10)

1.一种大规模干细胞培养方法，其特征在于，所述方法主要包括以下步骤：
将3D微胶囊溶胀，所述3D微胶囊呈蜂巢状，直径为0.5-10mm，所述微囊的孔径为10nm-10000nm；
将单细胞悬液接种于溶胀后的3D微胶囊，干细胞的接种密度为1-8×105个/ml，再用扩增培养基对干细胞进行扩增培养，培养条件如下：静态培养1-3天，静态培养时的搅拌速度调至50-70RPM、pH调至7.0、DO50％、温度为37±1℃，每隔2天补加一次培养基，灌流培养3-5天，灌流培养时的灌流流速由0.8vvd升至2vvd，灌流流速的上升速度为1-3vvd/h，调节搅拌速度升至100rpm，每隔2天补加一次培养基；
用3D微胶囊溶解剂进行解囊；
收获扩增细胞。
2.如权利要求1所述的大规模干细胞培养方法，其特征在于，将单细胞悬液接种于溶胀后的3D微胶囊采用的是旋转培养的方式接种，其中，旋转培养的搅拌速度为30-50r/min。
3.如权利要求1所述的大规模干细胞培养方法，其特征在于，步骤(2)所述溶胀3D微胶囊的具体操作如下：将3D微胶囊与DMEM/F12培养基搅拌均匀，3D微胶囊在DMEM/F12培养基中的浓度为100-1000g/L，静置3-5h，再将3D微胶囊转移到含10％FBS的DMEM/F12培养基中，含10％FBS的DMEM/F12培养基的体积与DMEM/F12培养基的体积比为1-2:1-2。
4.如权利要求1所述的大规模干细胞培养方法，其特征在于，所述3D微胶囊的制备方法为：
S1：将重量百分比为1-6wt％的海藻酸钠溶液与重量百分比为0.1-5wt％的明胶溶液以0.1-2:0.1-2的比例混合均匀，制得第一混合溶液；
S2：在所述第一混合溶液中加入起泡剂混合均匀，所述起泡剂在所述第一混合溶液中的浓度为5-100g/L，制得第二混合溶液；
S3：在所述第二混合溶液中滴加CaCl2溶液，所述CaCl2溶液与所述第一混合溶液的体积比为1-2:1-2，制得3D微胶囊溶液；
S4：将所述3D微胶囊溶液用生理盐水洗涤3-6次，在进行真空干燥，制得干燥3D微胶囊；
S5：将所述干燥3D微胶囊压扁、灭菌，即得3D微胶囊。
5.如权利要求1所述的大规模干细胞培养方法，其特征在于，所述3D微胶囊溶解剂包括质量比为0.1-1.0:0.1-2.0:0.1-1.0:0.1-2.0的氨基酸+柠檬酸+柠檬酸钠+EDTA钠盐，所述氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸)、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、氨基酸、精氨酸和组氨酸中的任意一种。
6.如权利要求1所述的大规模干细胞培养方法，其特征在于，所述溶解剂的用量与溶胀后的3D微胶囊的体积比为1-2:1-4。
7.一种大规模干细胞培养设备，其特征在于，所述设备包括生物反应器、中空纤维过滤器、控制装置和废液瓶，所述控制装置包括整合于一体的控制主机、磁悬浮离心进样泵、滤液/补液辅助泵组成，所述中空纤维过滤器用于将废液滤除，将细胞截留在生物反应器中，所述生物反应器通过第一连接管分别连接有细胞容纳瓶、培养基容纳瓶、3D微胶囊容纳瓶和溶解剂容纳瓶，通过进样管路和回流管路与中控纤维过滤器相连接，所述中空纤维过滤器通过第二连接管与磁悬浮离心进样泵和滤液/补液辅助泵连接，所述磁悬浮离心进样泵通过废液管与所述废液瓶相连接。
8.如权利要求7所述的大规模干细胞培养设备，其特征在于，所述中空纤维过滤器包括过滤器本体和设置于过滤器本体上的超声回流流量计，所述过滤器本体的底端分别通过磁悬浮泵泵头与进样压力传感器进样管路相连，靠近所述过滤器本体的回流管路上依次设有回流压力传感器和无菌取样断口，所述进样压力传感器和回流压力传感器与控制主机相连接。
9.如权利要求8所述的大规模干细胞培养设备，其特征在于，与所述磁悬浮离心进样泵连接的第二连接管靠近所述过滤器本体的一端设有滤液压力传感器，所述滤液压力传感器与控制主机相连接。
10.如权利要求7所述的大规模干细胞培养设备，其特征在于，所述生物反应器还连接有自动灌装机。
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