CN111394257A

CN111394257A - 一种利用菌菇渣和生鲜牛粪定向发酵制备哈茨木霉菌种的方法

Info

Publication number: CN111394257A
Application number: CN202010204123.2A
Authority: CN
Inventors: 沈其荣; 沈宗专; 李瑞敏; 李�荣; 刘红军
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2020-03-20
Filing date: 2020-03-20
Publication date: 2020-07-10
Anticipated expiration: 2040-03-20
Also published as: CN111394257B

Abstract

本发明公开了一种利用菌菇渣和生鲜牛粪定向发酵制备哈茨木霉菌种的方法。该方法包括向培养基基质中加入液体氨基酸调节起始pH为3.0‑4.0，加水调节含水量至60％～65％，灭菌后接种木霉液体菌种，温度27～30℃进行固体发酵5～8天获得木霉固体菌种；其中，所述的培养基基质包含菇渣和牛粪，菇渣：牛粪的质量比为8～9:1。本发明提供一种利用菌菇渣和生鲜牛粪定向发酵制备高密度木霉菌种的配方及方法，原料包括生鲜牛粪、菌菇渣、砻糠，通过对比不同配比的产孢量筛选出最佳的木霉营养配方，不仅可以以较低成本生产高密度的木霉菌种，而且还提供了菌菇渣及生鲜牛粪的资源化利用的新途径。

Description

一种利用菌菇渣和生鲜牛粪定向发酵制备哈茨木霉菌种的方法

技术领域

本发明属于农业废弃物资源化利用技术领域，涉及一种利用菌菇渣和生鲜牛粪定向发酵制备哈茨木霉菌种的方法。

背景技术

我国是世界上最大的菌菇生产国、消费国和出口国，巨大的菌菇生产带来了大量菌菇渣等农业固体废弃物。我国每年产生的菌菇渣体量高达1500万吨以上。此外，我国奶牛及肉牛养殖场牛粪粪污排放量巨大，造成了巨大的环境污染问题。目前，有部分学者针对菌菇渣及牛粪的资源化利用分别做了一些研究，如中国专利CN105255777B公开了利用生鲜猪粪和蘑菇渣发酵芽孢杆菌生产生物有机肥的方法；CN106396838A公开了利用金针菇渣粉碎后接种搅动芽孢菌液制备蔬菜育苗基质；CN110218105A公开了利用牛粪、菇渣、菌剂等制备生物有机肥的方法。上述报道菇渣及畜禽粪便的资源化利用方向主要涉及制造基质、有机肥及生物有机肥，发酵产品中菌种数量通常偏低(每克干重有机物料中含功能菌数量约2×10⁷CFU)，并未涉及利用菌菇渣及生鲜牛粪直接定向发酵制造高密度菌种配方及工艺。

木霉是自然界中分布较广泛的一种丝状真菌，主要存在于土壤、腐烂的木材及植物残体中，可通过分泌多种植物生长激素提高土壤养分利用率、增强根际定殖能力等机制来发挥促生作用；还可通过分泌金属肽酶、聚酮类化合物等次级代谢产物抑制尖孢镰刀菌的生长及增殖，从而可缓解多种作物的土传枯萎病的发生。目前基于木霉菌种开发的菌剂、生物有机肥、生物育苗基质在促进作物生长、提升抗逆作物抗逆水平等方面展现出了较好的生物学效应。但制约木霉相关产业发展的一个重要因素就是木霉菌种的制造成本居高不下。

菌菇渣质地松梳，纤维素、半纤维素含量较高；考虑到木霉实为腐生型真菌，其依赖降解纤维素、半纤维素等生长这一特性，本专利以菌菇生产后的菇渣及生鲜牛粪为原料进行直接固体发酵制备高密度木霉菌种(每克有机物料干重含功能菌数量大于5×10⁹CFU)，不仅可以以较低成本生产高密度的木霉菌种，而且还提供了菌菇渣及生鲜牛粪的资源化利用的新途径。

发明内容

本发明的目的在于针对生产实践中菌菇渣及生鲜牛粪资源化利用新途径开发及制备木霉高密度菌种的实际问题和需求，提供了一种利用菌菇渣和生鲜牛粪定向发酵制备高密度木霉菌种的配方及方法。

本发明的另一目的是提供该方法制备的产品。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种利用菌菇渣和生鲜牛粪定向发酵制备高密度木霉菌种的方法，向培养基基质中加入液体氨基酸调节起始pH为3.0-4.0，加水调节含水量至60％～65％，灭菌后接种木霉液体菌种，温度27～30℃进行固体发酵5～8天获得木霉固体菌种；其中，所述的培养基基质包含菇渣和牛粪，菇渣：牛粪的质量比为8～9:1。

作为本发明的一种优选，所述的培养基基质为菇渣：牛粪：砻糠配比8:1:1。

作为本发明的一种优选，所述的木霉液体菌种是将木霉接种到PDA培养液中进行液体发酵生产得到的发酵液，发酵液中含菌量≥1×10⁸个/ml；接种量为10ml/100g。

作为本发明的一种优选，所述的起始pH为3.0-3.5。

作为本发明的一种优选，所述的液体氨基酸为由氨基酸水解液加水稀释所得；所述的氨基酸水解液优选通过以下方法制备而成：(1)在密闭容器中先将病死畜禽动物经自动化粉碎、所有固形物和液体自动转入密闭的水解罐后，在初始酸浓度c(1/2H₂SO₄)为3-5mol L^-1、80-100℃和1-2个大气压下水解2-5小时；(2)水解结束待水解罐内溶液冷却至80℃以下时，静置分层，收集中层的氨基酸溶液即为所述的氨基酸水解液。氨基酸水解液含氨基酸和各种肽类物质约10％(g/100ml)及以上。所述的氨基酸水解液也可购买市售产品,效果与上述方法制备的相同。

作为本发明的一种优选，液体氨基酸的加入量为每100g培养基基质加入10-20ml液体氨基酸；进一步优选每100g培养基基质加入10ml液体氨基酸。

作为本发明的一种优选，所述的木霉为保藏号为CGMCC NO.12166的贵州木霉NJAU4742。该菌株已在ZL2018101301042中公开。

作为本发明的一种优选，所述的固体发酵为浅盘发酵，物料厚度为2-4cm，优选2-3cm，进一步优选3cm。

作为本发明的一种优选，所述的固体发酵温度为28℃，环境湿度为70-90％，发酵时间为7天。

按照本发明所述的方法制备的木霉固体菌种。

有益效果：

本发明提供一种利用菌菇渣和生鲜牛粪定向发酵制备高密度木霉菌种的方法，原料包括生鲜牛粪、菌菇渣、砻糠，通过对比不同配比的产孢量筛选出最佳的木霉营养配方，不仅可以以较低成本生产高密度的木霉菌种，而且还提供了菌菇渣及生鲜牛粪的资源化利用的新途径。

附图说明

图1不同配比的混匀体系木霉生长状况及孢子数量柱形图

A：菇渣：牛粪配比9:1；B：菇渣：牛粪配比8:2；C：菇渣：牛粪配比7:3；D：菇渣：牛粪配比6:4。

图2优化体系中木霉生长状况及孢子数量柱形图

A：菇渣：牛粪配比9:1；E：菇渣：牛粪：砻糠配比8:1:1。

图3不同固体发酵液体氨基酸添加量对木霉固体菌种发酵的影响

图4不同固体发酵厚度对木霉固体菌种发酵的影响

图5不同固体发酵含水量对木霉固体菌种发酵的影响

图6不同固体发酵接种量对木霉固体菌种发酵的影响

具体实施方式

实施例1

1.木霉固体菌种的制备

1.1PDA培养基的制备

以配制1L培养基为例：200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮20min后过滤，滤液中加20g普通葡萄糖后定容至1000ml，pH值自然，115℃灭菌30min。

1.2木霉液体菌液的制备

将木霉接种到PDA培养液中，进行液体发酵生产，发酵温度范围28℃，搅拌速度为170转/分钟，发酵时间为96h，使发酵液中含菌量≥1×10⁸个/ml。

1.3固体菌种培养基添加比例

按菇渣：牛粪9:1、菇渣：牛粪8:2、菇渣：牛粪7:3、菇渣：牛粪6:4进行配比，向混匀配比体系中加入液体氨基酸调节起始pH为3.0，按含水量60％加水，115℃、30min灭菌，然后接种木霉液体菌种，温度28℃进行固体发酵获得木霉固体菌种，发酵7天后结束；每个处理三次重复。此时发现，菇渣：牛粪9:1的配方产孢量最高，与菇渣：牛粪8:2的配方存在显著性差异(图1)。

在此基础上对配方进行了优化，向混匀体系中加入更适木霉生长的砻糠。菇渣：牛粪：砻糠的配比为8:1:1，向优化的混匀配比体系中加入液体氨基酸调节起始pH为3.0，按含水量60％加水，115℃、30min灭菌，然后接种木霉液体菌种，温度28℃进行固体发酵获得木霉固体菌种，发酵7天后结束。

相比较牛粪、菇渣的不同配比，菇渣：牛粪：砻糠按8:1:1配比的固体发酵E，产孢量最高，可达5.3×10⁹个/克；菇渣：牛粪按9:1配比的固体发酵A，木霉产孢量次之，为3.55×10⁹个/克；菇渣：牛粪按8：2配比的固体发酵B，木霉菌丝并没有覆盖整个培养体系，产孢量为2.71×10⁹个/克；处理E、A、B之间存在显著性差异；菇渣：牛粪按7:3配比的固体发酵C，木霉菌丝只覆盖了1/3的培养体系，故产孢量比菇渣：牛粪按8：2配比的固体发酵少；菇渣：牛粪按6:4配比的固体发酵D，木霉没有长出菌丝。因此，确定菇渣：牛粪：砻糠按8:1:1配比为最佳的木霉营养配方(图1～2)。

1.4固体发酵液体氨基酸添加量

固体发酵液体氨基酸添加量设置5个处理，分别为0、5％、10％、15％和20％。物料为菇渣：牛粪：砻糠按8:1:1配比。初始pH、含水量、灭菌方式、接种量、温度、湿度、物料厚度以及培养时间同1.3。固体发酵液体氨基酸添加比例对木霉产孢量具有显著的影响。当添加比例低于10％，木霉产孢量随着液体氨基酸添加量比例的增加呈上升趋势；当添加量比例超过10％之后，木霉产孢量随着添加量比例的增加呈下降趋势。上述结果表明10％的液体氨基酸添加量最优(图3)。

1.5固体发酵厚度

固体发酵物料厚度设置5个处理，分别为1、2、3、4和5cm。物料为菇渣：牛粪：砻糠按8:1:1配比。初始pH、液体氨基酸添加量、含水量、灭菌方式、接种量、温度、湿度以及培养时间同1.3。固体发酵物料厚度对木霉产孢量具有显著的影响。在1-3cm以内，木霉产孢量随着物料厚度的增加也呈上升趋势。然而当物料厚度大于3cm之后，木霉产孢量随着物料厚度的增加呈下降趋势，上述结果表明3cm物料厚度最优(图4)。

1.6固体发酵含水量

固体发酵含水量设置5个处理，分别为50％、55％、60％、65％和70％。物料为菇渣：牛粪：砻糠按8:1:1配比。初始pH、液体氨基酸添加量、灭菌方式、接种量、温度、湿度、物料厚度以及培养时间同1.3。固体发酵物料含水量对木霉产孢量具有显著的影响。当含水量低于60％，木霉发酵孢子数量随着含水量的增加呈上升趋势；当物料含水量高于60％之后，木霉发酵孢子数量随着含水量增加呈下降趋势，上述结果表明60％含水量最优(图5)。

1.7固体发酵接种量

固体发酵接种量设置5个处理，分别为5％、7.5％、10％、12.5％和15％。物料为菇渣：牛粪：砻糠按8:1:1配比。初始pH、液体氨基酸添加量、含水量、灭菌方式、温度、湿度、物料厚度以及培养时间同1.3。固体发酵物料接种比例对木霉产孢量具有显著的影响。当接种比例低于10％，木霉产孢量随着接种比例的增加呈上升趋势；当接种比例高于10％之后，木霉产孢量随着接种比例增加没有显著性的差异。为了节约工业生产成本，我们优选10％为接种比例(图6)。

Claims

1.一种利用菌菇渣和生鲜牛粪定向发酵制备高密度木霉菌种的方法，其特征在于向培养基基质中加入液体氨基酸调节起始pH为3.0-4.0，加水调节含水量至60％～65％，灭菌后接种木霉液体菌种，温度27～30℃进行固体发酵5～8天获得木霉固体菌种；其中，所述的培养基基质包含菇渣和牛粪，菇渣：牛粪的质量比为8～9:1。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的培养基基质为菇渣：牛粪：砻糠配比8:1:1。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的木霉液体菌种是将木霉接种到PDA培养液中进行液体发酵生产得到的发酵液，发酵液中含菌量≥1×10⁸个/ml；接种量为10％～15％(ml/100g)，优选10％(ml/100g)。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的起始pH为3.0-3.5。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的液体氨基酸为由氨基酸水解液加水稀释所得；所述的氨基酸水解液优选通过以下方法制备而成：(1)在密闭容器中先将病死畜禽动物经自动化粉碎、所有固形物和液体自动转入密闭的水解罐后，在初始酸浓度c(1/2H₂SO₄)为3-5mol L^-1、80-100℃和1-2个大气压下水解2-5小时；(2)水解结束待水解罐内溶液冷却至80℃以下时，静置分层，收集中层的氨基酸溶液即为所述的氨基酸水解液。氨基酸水解液含氨基酸和各种肽类物质约10％(g/100ml)及以上。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于液体氨基酸的加入量为每100g培养基基质加入10～20ml液体氨基酸。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的木霉为保藏号为CGMCC NO.12166的贵州木霉NJAU4742。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的固体发酵为浅盘发酵，物料厚度为2-4cm，优选2-3cm，进一步优选3cm。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其特征在于所述的固体发酵温度为27～28℃，优选28℃，环境湿度为70-90％，发酵时间为7天。

10.按照权利要求1所述的方法制备的木霉固体菌种。