CN111393470A - 一种蛋黄卵磷脂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药领域，具体涉及一种蛋黄卵磷脂及其制备方法。本发明提供的蛋黄卵磷脂，具有特定含量的磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺，可以用于制备高质量的脂质体；同时本发明提供的蛋黄卵磷脂的制备方法，具有操作简单、生产能耗低、提取成本低、有效成分的转移率高、生产过程安全、易于工业化大生产等优点。

Description

一种蛋黄卵磷脂及其制备方法
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及一种蛋黄卵磷脂及其制备方法。
背景技术
卵磷脂有狭义和广义之分，狭义的卵磷脂是指磷脂酰胆碱(PC)；广义的卵磷脂，即商业上常指的“卵磷脂”是各种磷脂的混合物，是一类主要由磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酸(PA)等组成，具有明显生理活性的重要物质，目前已经广泛用于医药、食品、化工等领域。卵磷脂除少量人工合成外，主要来源是从天然植物或动物蛋粉中提取得到，如从大豆提取的大豆磷脂或从蛋黄中提取得到的蛋黄卵磷脂。
蛋黄卵磷脂在提取工艺上，目前主要有溶剂提取法和超临界CO2萃取法。
CN1733777A公开了一种高纯度蛋黄卵磷脂的制备方法，包括1)新鲜蛋黄先用丙酮脱脂，真空抽滤，滤饼用酒精提取，合并滤液，真空浓缩得到粗磷脂；2)经钝化的氧化铝用甲醇湿法装柱，先用甲醇冲洗；3)粗磷脂用甲醇溶解后加入层析柱，并开始收集流出液；4)待卵磷脂开始穿透后用纯甲醇冲洗，收集流出液；5)流出液经薄层色谱TCL分析后合并卵磷脂馏份，经真空浓缩、冻干后可得到纯度大于95％的卵磷脂；6)最后用含氨水的甲醇溶液再生柱子，再用甲醇冲洗后可重新进样。该方法由于比较复杂，所用甲醇溶剂毒性很大，尤其是柱层析不利于工业化大生产。
CN101057630A公开了一种利用生物酶制剂制取蛋黄卵磷脂的工艺，但该方法尚不能工业化；CN101029057A公开了一种蛋黄卵磷脂的制备方法，该方法是以禽蛋为原料，分离出蛋黄搅拌成蛋黄液，用食用酒精提取，分离出提取液，将提取液浓缩、脱水得卵磷脂初品，将卵磷脂初品再进行超临界CO2萃取，脱除中性脂肪，制得脱除中性脂肪的卵磷脂，但该方法得到的蛋黄卵磷脂纯度仍然不能满足医药用途的苛刻要求。
CN103224514A公开了一种高纯度蛋黄卵磷脂的生产工艺，其特征在于该工艺包括下述步骤：A、将蛋打破，分离蛋黄，得到的蛋黄加入85-95重量％乙醇浸取，搅拌后，静置，然后加入石油醚，搅拌后静置，低温下过滤、减压浓缩，加入丙酮除杂，过滤，用丙酮冲洗至冲洗液无色，得蛋黄卵磷脂粗品；B、将步骤A得到的蛋黄卵磷脂粗品添加无水乙醇∶石油醚体积比为2-5∶1的混合溶剂，然后用微波辐射1-3分钟，搅拌，离心后取上清液，减压蒸馏浓缩，得到蛋黄卵磷脂浓缩物；C、将步骤B得到的蛋黄卵磷脂浓缩物加入85-95％乙醇，搅拌直至完全溶解，调节溶液温度为20-35℃，加入吸附剂，所述溶液与吸附剂的重量比为1∶0.1-0.5，搅拌吸附5-10小时，过滤，去除吸附剂得到滤液，所得滤液重复上述吸附操作，获取最终滤液；D、将步骤C得到的最终滤液，在低温下脱溶，得到回收的乙醇和固形物，分离固形物，并使用丙醇洗涤，真空干燥后得到目的产物。
《中国药典2015版》规定了蛋黄卵磷脂(供注射用)中“含磷脂酰胆碱应不得少于68％，含磷脂酰乙醇胺应不得过20.0％，含磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺总量不得少于80％”。从药典的规定可以看出卵磷脂中磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的含量是影响脂质体的关键因素；WO8803797A1提供一种含有97％-98％的磷脂酰胆碱等成分而不含磷脂酰乙醇胺的磷脂组合物，可以与包括抗肿瘤活性化合物等成分形成更稳定的脂质体。
已有研究表明，蛋黄卵磷脂是制备脂质体的关键成分，磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的含量是决定制备脂质体所用的成膜材料蛋黄卵磷脂性质的关键，本发明通过对蛋黄卵磷脂中成分含量及制备方法的进一步深入研究，提供了一种特定比例的蛋黄卵磷脂及其制备方法，使得在制备脂质体时可以具有更好的成膜性、高包封率和稳定性好等优势。
发明内容
本发明提供了一种蛋黄卵磷脂，其特征为：蛋黄卵磷脂中磷脂酰胆碱的重量百分比含量为85-95％，磷脂酰乙醇胺的重量百分比含量为1-6％。
优选地，蛋黄卵磷脂中磷脂酰乙醇胺的重量百分比含量为1-3％，3-6％，1-1.4％或1.4-3％。
本发明提供了一种蛋黄卵磷脂的制备方法，包括以下步骤：
提取：按精制蛋黄(湿粉):无水乙醇＝1Kg:(1.5～2.5)L的比例向搅拌罐中加入精制蛋黄(湿粉)和无水乙醇，匀浆20～50min，离心收集提取液，将滤饼按此过程再提取3-6次，收集提取液并过滤；
吸附：按精制蛋黄(湿粉):中性氧化铝＝1Kg:(0.4～0.7)Kg的比例向过滤后的提取液中加入活化后的中性氧化铝，匀浆40-80min，离心得吸附液；
脱色：按精制蛋黄(湿粉):针剂用活性炭＝1Kg:(0.01～0.02)Kg的比例向吸附液中加入活化后的针剂用活性炭，匀浆50～80min，离心得脱色液；
减压浓缩：将脱色液减压浓缩，真空度控制-0.060～-0.100MPa，水温控制50～75℃，去除乙醇后取出浓缩物，得蛋黄卵磷脂(供注射用)。
本发明提供的蛋黄卵磷脂，具有特定含量的磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺，可以用于制备高质量的脂质体；同时本发明提供的蛋黄卵磷脂的制备方法，具有操作简单、生产能耗低、提取成本低、有效成分的转移率高、生产过程安全、易于工业化大生产等优点。
具体实施方式
实施例1蛋黄卵磷脂的制备
380Kg精制蛋黄(湿粉)共提取五次:
称取精制蛋黄(湿粉)380kg加入无水乙醇950L进行匀浆30min，匀浆后离心，收集提取液，保留滤饼后再重复提取四次，合并所得收集提取液；
按精制蛋黄(湿粉):中性氧化铝＝1kg:0.5kg的比例向过滤后的提取液中加入中性氧化铝，匀浆50min后离心收集离心液，得吸附液；
按精制蛋黄(湿粉):针剂用活性炭＝1Kg:0.01Kg的比例向吸附液中加入针剂用活性炭，匀浆50min离心得脱色液；
将脱色液吸入浓缩器中进行真空浓缩，得浓缩液；将浓缩液过滤，收集过滤液；将过滤液用旋转蒸发器减压蒸馏，蒸去乙醇，得蛋黄卵磷脂(供注射用)。
试验例1蛋黄卵磷脂中不同含量磷脂酰乙醇胺制备得到的紫杉醇脂质体成膜性及粒径比较
1.仪器与材料：
蛋黄卵磷脂：南京绿叶制药有限公司生产，批号：S110307，其中：磷脂酰胆碱(PC)含量为90％，磷脂酰乙醇胺(PE)含量为0.11％；
蛋黄卵磷脂：南京绿叶制药有限公司生产，批号：S110314，其中：磷脂酰胆碱(PC)含量为92.7％，磷脂酰乙醇胺(PE)含量为0％；
蛋黄卵磷脂：南京绿叶制药有限公司生产，批号：S110301，其中：磷脂酰胆碱(PC)含量90.80％，磷脂酰乙醇胺(PE)含量为2.99％。
生物显微镜：日本奥林巴斯公司，型号：Olympus CX31
NANO粒度测定仪：马尔文公司，型号：马尔文NANO-ZS
2.试验过程：
2.1紫杉醇脂质体的制备：
试验组1-3：选择不同PE含量的蛋黄卵磷脂分别进行紫杉醇脂质体制备，考察其样品分散性及稳定性，其他制备及试验过程均相同：
称取紫衫醇180mg，磷脂7.2g，胆固醇90mg，溶于乙醇至完全溶解成澄清的溶液，经0.22um滤芯除菌过滤后加入旋转瓶中，置恒温水浴(53℃±2℃)进行减压成干燥脂质膜；在上述形成脂质膜的旋转瓶内加入含有72mg的苏氨酸的40ml的5％葡萄糖溶液，在30℃水浴条件下水化成乳白色的脂质体混悬液，再经挤出装置进行整粒，得粒径符合要求的紫杉醇脂质体混悬液。
2.2检测过程
采用生物显微镜观察脂质体的微观形态；利用NANO测定仪进行粒度检测，具体观测及检测结果见下表1所示：
表1
Figure BDA0002484914950000041
2.3试验结果
由上述试验结果可知：用南京绿叶制药有限公司生产的蛋黄卵磷脂，该蛋黄卵磷脂中在磷脂酰胆碱含量大于85％时，不含PE及PE含量为0.11％制备所得的紫杉醇脂质体，虽然在0时镜检观察样品状态良好均匀，没有析出，但在放置2小时可以观察到析出较多且有少量团聚及细小晶簇结构现象发生，说明在蛋黄卵磷脂中不含PE或者PE含量为0.11％时，样品的稳定性均不好，镜检分散性较差；当PE含量为2.99％时，样品稳定性良好，镜检无析出，分散性好。
试验例2蛋黄卵磷脂中不同含量磷脂酰乙醇胺制备得到的紫杉醇脂质体成膜性及粒径比较
1.仪器与材料：
蛋黄卵磷脂：南京绿叶制药有限公司生产，批号：19070107，其中：磷脂酰胆碱(PC)含量为93.0％，磷脂酰乙醇胺(PE)含量为1.4％。
磷脂酰乙醇胺(PE)：购自Avanti，批号：840021P-500MG-263，含量99.0％；
生物显微镜：日本奥林巴斯公司，型号：Olympus CX31
NANO粒度测定仪：马尔文公司，型号：马尔文NANO-ZS
2.试验过程：
2.1紫杉醇脂质体的制备：
添加磷脂酰乙醇胺(PE)到上述蛋黄卵磷脂中，使其PE含量达到7％，再进行紫杉醇脂质体的制备，考察其样品分散性及稳定性。
紫杉醇脂质体具体制备方法同试验例1。
2.2检测过程
采用生物显微镜观察脂质体的微观形态；利用NANO测定仪进行粒度检测，具体观测及检测结果见下表2所示：
表2
Figure BDA0002484914950000051
2.3试验结果
由上述试验结果可知：当蛋黄卵磷脂中，在磷脂酰胆碱含量大于85％时，PE含量为7％时，制备的紫杉醇脂质体稳定性较差，镜检分散性不好，粒径变化较大，包封率低，无法满足脂质体制剂要求；当蛋黄卵磷脂中PE含量为1.4时，制备的紫杉醇脂质体稳定性较好，粒径比较均一，包封率较高。
试验例3注射用紫杉醇脂质体长期稳定性试验
1、材料
蛋黄卵磷脂：南京绿叶制药有限公司生产，批号及含量如下：
17120407：磷脂酰胆碱(PC)含量87.3％，磷脂酰乙醇胺(PE)1.4％
17120507：磷脂酰胆碱(PC)含量87.7％磷脂酰乙醇胺(PE)含量1.4％
17120607：磷脂酰胆碱(PC)含量88.5％，磷脂酰乙醇胺(PE)含量1.6％
2.试验过程：
2.1制备紫杉醇脂质体
选择上述三个批号的蛋黄卵磷脂，按照试验例1制备方法制备了三批的紫杉醇脂质体，考察长期稳定性(2-8℃)，具体实验结果见表3所示：
表3
Figure BDA0002484914950000061
由稳定性结果可知，三批样品稳定性良好，各项指标均符合质量标准，批间一致性较好。

Claims (6)

1.一种蛋黄卵磷脂，其特征为：蛋黄卵磷脂中磷脂酰胆碱的重量百分比含量为85-95％，磷脂酰乙醇胺的重量百分比含量为1-6％。
2.根据权利要求1所述的蛋黄卵磷脂，其特征为：蛋黄卵磷脂中磷脂酰乙醇胺的重量百分比额含量为1-3％。
3.根据权利要求1所述的蛋黄卵磷脂，其特征为：蛋黄卵磷脂中磷脂酰乙醇胺的重量百分比额含量为3-6％。
4.根据权利要求1所述的蛋黄卵磷脂，其特征为：蛋黄卵磷脂中磷脂酰乙醇胺的重量百分比额含量为1-1.4％。
5.根据权利要求1所述的蛋黄卵磷脂，其特征为：蛋黄卵磷脂中磷脂酰乙醇胺的重量百分比额含量为1.4-3％。
6.根据权利要求1-5任一所述的蛋黄卵磷脂的制备方法，包括以下步骤：
(1)按精制蛋黄(湿粉):无水乙醇＝1Kg:(1.5～2.5)L的比例向搅拌罐中加入精制蛋黄(湿粉)和无水乙醇，匀浆20～50min，离心收集提取液，将滤饼按此过程再提取3-6次，收集提取液并过滤；
(2)按精制蛋黄(湿粉):中性氧化铝＝1Kg:(0.4～0.7)Kg的比例向过滤后的提取液中加入活化后的中性氧化铝，匀浆40-80min，离心得吸附液；
(3)按精制蛋黄(湿粉):针剂用活性炭＝1Kg:(0.01～0.02)Kg的比例向吸附液中加入活化后的针剂用活性炭，匀浆50～80min，离心得脱色液；
(4)将脱色液减压浓缩，真空度控制-0.060～-0.100MPa，水温控制50～75℃，去除乙醇后取出浓缩物，得蛋黄卵磷脂(供注射用)。
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CN113173948A (zh) * 2021-04-29 2021-07-27 南京威尔生物科技有限公司 一种通过提取法制备多种型号天然磷脂的生产方法
CN113201009A (zh) * 2021-04-26 2021-08-03 南京威尔生物科技有限公司 一种供注射用磷脂的生产工艺

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